Flusso di lavoro ottimizzato per la visualizzazione delle superfici del lievito per l'evoluzione diretta delle proteasi

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'evoluzione diretta delle proteasi virali in Saccharomyces cerevisiae utilizzando un sistema di selezione basato sulla visualizzazione delle superfici. Descrive la progettazione della libreria di inserti di DNA e della cassetta del substrato, l'elettroporazione ottimizzata per un'elevata efficienza di trasformazione, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per la scindimento della proteasi e il sequenziamento di varianti arricchite.

Abstract

L'evoluzione diretta imita il naturale processo evolutivo in un ambiente di laboratorio rapido e controllato per evolvere proteine con funzioni o caratteristiche desiderabili. Lo screening di un ampio bacino di geni mutanti codificanti per proteine consente la selezione funzionale delle varianti desiderate per applicazioni in biotecnologia, medicina e biologia sintetica. Utilizzando questo protocollo, eseguiamo un'evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae per ingegnerizzare varianti proteasi con alta specificità per una sequenza di substrato non nativa. Mostriamo queste varianti proteasi sulla superficie cellulare del lievito per facilitare la selezione delle varianti desiderate tramite il filtraggio cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) su più cicli di arricchimento. Quattro elementi chiave della cassetta del substrato sono co-espressi con la libreria proteasi: una proteina di fusione composta da (i) la subunità del recettore di adesione del lievito Aga2, (ii) sequenze di selezione e (iii) contro-selezione del substrato, (iv) sequenze di tag epitopici e una sequenza opzionale di segnale di recupero del reticolo endoplasmatico (ER). Le cellule di lievito in cui è spezzata solo la sequenza del substrato di selezione vengono isolate utilizzando FACS multicolore tramite anticorpi anti-epitopi fluorescenti (marcati con isotiocianato di ficoeritrina/fluoresceina). Qui forniamo dettagli del protocollo ottimizzato passo dopo passo per condurre una campagna di evoluzione proteasi, inclusa la progettazione della libreria di inserimenti di DNA e la progettazione di cassette di substrato, l'elettroporazione delle cellule di lievito con alta efficienza di trasformazione (fino a^10,9 trasformanti per microgrammo di DNA), la selezione, l'arricchimento e il sequenziamento basati su FACS di varianti evolute. Dimostriamo il nostro protocollo di evoluzione diretta evolvendo la proteasi di inclusione nucleare A (TEVp) del virus dell'incisione del tabacco (TEVp) dal taglio della sua sequenza naturale del substrato, ENLYFQ↓S, alla taglienza di una nuova sequenza, ENLYFE↓S.

Introduzione

Le proteasi cisteiniche della famiglia Potyviridae, in particolare le proteasi di inclusione nucleare A (NIa), rappresentano una fonte in gran parte inesplorata di endopeptidasi specifiche per sequenza. Con oltre 3.800 membri caratteristici della famiglia, le proteasi NIa tagliano una sequenza distinta di substrato composta da sette amminoacidi. La famiglia dei potyvirali offre un insieme diversificato di proteasi per ingegnerizzare sistemi di controllo proteico programmabili, costruire circuiti genetici ortogonali basati su proteasi e sviluppare strumenti biotecnologici specifici per^{sequenza 1,2}. Nonostante questa naturale diversità, solo due proteasi NIa, TEVp e proteasi del virus macchiato nelle vene del tabacco (TVMVp), sono state accuratamente caratterizzate e ingegnerizzate per un uso di laboratorio e biotecnologico^{di vasta gamma 3,4}. Questo toolkit limitato di proteasi limita lo spazio di progettazione per circuiti multicomponenti che richiedono attività proteasi^{ortogonali 5}, motivando così gli sforzi per espandere e caratterizzare ulteriormente le proteasi NIa attraverso l'evoluzione^{diretta 6,7}.

La visualizzazione superficiale dei lieviti è emersa come una delle piattaforme più potenti per l'evoluzione diretta, permettendo lo screening ad alta produttività delle biblioteche proteiche tramite la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS^)6,7. Ad esempio, il sistema di screening del reticolo endoplasmatico del lievito (YESS) accoppia l'attività proteasi alla visualizzazione superficiale attraverso la via secretoria di S. cerevisiae ^6,7. Il sistema YESS è stato applicato per ingegnerizzare nuove specificità proteasi-substrato e ha dimostrato utilità per campagne evolutive dirette su più round. In questo sistema, le varianti proteasi sono co-espresse con una proteina di fusione contenente una cassetta del substrato di scindimento con marcatori epitopici, e l'ancora superficiale Aga1p è espressa nel ceppo di lievito EBY100. La marcatura differenziale con anticorpi fluorescenti distingue le cassette a substrato non tagliate esposte sulla superficie cellulare. Questo meccanismo di visualizzazione dipendente dall'attività è direttamente compatibile con la selezione iterativa basata su FACS per librerie di 10,⁷ o più^{varianti 6,7}.

Un prerequisito fondamentale per l'evoluzione diretta è la capacità di introdurre librerie varianti su scala sufficiente per ottenere una copertura adeguata dello spazio di sequenza target. Per librerie di mutagenesi a saturazione del sito che coprono più posizioni amminoacidiche, sono necessarie rese di trasformazione di 10⁸ a 10⁹ trasformanti unici per garantire che la diversità introdotta nella libreria sia ben rappresentata nella popolazione ordinata. Esistono diversi metodi per introdurre DNA esogeno in S. cerevisiae, ciascuno con limiti di capacità di produzione distinti. Il metodo convenzionale di trasformazione chimica utilizza acetato di litio/DNA portatore monofilato/glicole polietilenico (LiAc/ssDNA/PEG) grazie alla sua semplicità e accessibilità. Tuttavia, tipicamente raggiunge efficienze di trasformazione di soli 10⁴–10^{unità formattrici di 6} colonie (CFU) per microgrammo di DNA, non raggiungendo la variazione di sequenza necessaria per grandi campagne^{bibliotecarie 8}. Al contrario, il metodo di elettroporazione applica un campo elettrico ad alta tensione per permeabilizzare transitoriamente la membrana cellulare e facilitare l'assorbimento del DNA. L'elettroporazione raggiunge costantemente le più alte efficienze di trasformazione tra i metodi di trasformazione disponibili, con protocolli ottimizzati che riportano risultati di 10⁸–10^{9 CFU 9}. È stato osservato che l'efficienza dell'elettroporazione in S. cerevisiae è criticamente sensibile alla fase di crescita cellulare, alla massa del DNA e alla composizione del tamponetto, fornendo un quadro che da allora è stato ampiamente adattato per l'evoluzione diretta su scala^{di biblioteca 9}.

Il protocollo descritto qui utilizza il ceppo di S. cerevisiae EBY100, un ceppo ospite ampiamente adottato per la visualizzazione superficiale del lievito. EBY100 è stato progettato da Boder e Wittrup integrando una cassetta di espressione AGA1 sotto il controllo del promotore GAL1 indotto dal galattosio nel locus cromosomico AGA1 dello ceppo parentale carente di proteasi BJ5465¹⁰. La varietà è disponibile commercialmente presso l'ATCC (numero di catalogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portatore del genotipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Di conseguenza, sia Aga1p che la fusione a cassetta Aga2p-substrato vengono espresse dallo stesso promotore indotto dal galattoso, assicurando che le due subunità siano co-indotte e si assemblino nel complesso Aga1p–Aga2p legato al disolfuro che ancora la fusione mostrata alla parete cellulare.

Nonostante l'uso diffuso di EBY100 nelle applicazioni di visualizzazione del lievito, nessun protocollo pubblicato è stato ottimizzato sistematicamente per elettroporare questo ceppo a rese su scala biblioteca. I parametri specifici di EBY100, come la fase ottimale di crescita al raccolto, la composizione del mezzo durante la sottocoltura e la relazione quantitativa tra densità ottica iniziale a 600 nm (OD₆₀₀) ed efficienza di trasformazione, devono essere rigorosamente caratterizzati e ottimizzati. Qui, riportiamo che l'efficienza della trasformazione in EBY100 aumenta monotonamente con l'OD₆₀₀ della coltura al raccolto, con cellule nella fase finale di logaritmia che producono tassi di trasformazione sostanzialmente più elevati rispetto a quelle raccolte nella fase logaritmica iniziale. Abbiamo valutato parametri critici del protocollo, inclusi i valori iniziali di OD₆₀₀ all'inoculazione, l'uso di 2 × di mezzo di Estratto di Lievito Peptone Destrosio (YPD) per le sottocolture, formulazioni di tampone per elettroporazione e condizioni di crescita post-elettroporazione. Il protocollo qui presentato fornisce un flusso di lavoro ottimizzato passo dopo passo (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) per preparare celle EBY100 elettrocompetenti ed eseguire elettroporazioni di librerie di DNA ad alta efficienza, con tassi di trasformazione costantemente superiori a 10,9 CFU. Per convalidare questo protocollo, abbiamo condotto una campagna completa di evoluzione diretta per ingegnerizzare TEVp con specificità di clivagge alterata su quattro cicli di selezione e arricchimento basati su FACS. Il sequenziamento di varianti arricchite di proteasi ha confermato una sostanziale diversificazione nei residui miri all'interno della tasca di legame del substrato della proteasi, dimostrando che il protocollo fornisce una copertura sufficiente dello spazio della sequenza per supportare campagne evolutive produttive. Questo protocollo sarà di ampia utilità per i ricercatori che utilizzano EBY100 per l'evoluzione diretta basata sulla visualizzazione della superficie del lievito e per lo screening ad alto rendimento compatibile con FACS di proteasi,^{anticorpi 9}, chinasi¹¹ e recettori¹², tra le altre proteine.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto S. cerevisiae ricombinanti sono stati condotti in conformità con le politiche e le procedure del Comitato per la Biosicurezza Istituzionale e la Sicurezza Chimica dell'Università del Texas a Dallas. I ceppi ricombinanti di lievito sono stati gestiti secondo il contenimento di Biosicurezza Livello 1 (BSL-1) in conformità con le pratiche microbiologiche istituzionali consolidate. Elettroporazione, coltura e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) sono state eseguite in conformità con le procedure di biosicurezza istituzionali approvate. Le colture di lievito e i consumabili contaminati sono stati decontaminati e smaltiti come rifiuti biopericolosi in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Preparazione del vettore e dell'inserto

1. Generazione di librerie di proteasi potyvirali tramite mutagenesi a saturazione del sito
   1. La progettazione utilizza software di progettazione di sequenze che sovrappongono oligonucleotidi diretti e inversi da 30 a 50 mer, per generare una libreria mutante di proteasi. Si sostituisce il codone di tipo selvatico nell'oligonucleotide corrispondente con un codone degenere NNS, dove N rappresenta A, T, G o C, e S rappresenta G o C, per le posizioni mirate alla mutagenesi.
   2. Progetta la sovrapposizione di 3′ tra ogni coppia di oligonucleotidi avanti e inversi con una temperatura di fusione (Tm) di 55–60 °C. Progettare il primo e l'ultimo oligonucleotidi in modo che contengano una sovrapposizione di 50 nt con il vettore di visualizzazione superficiale del lievito oltre i siti di restrizione.
   3. Assicurarsi che almeno un'estremità dell'inserto si sovrappone esattamente a un'estremità del vettore linearizzato per facilitare la ricombinazione^{omologa 13}. Evitare i vuoti tra oligonucleotidi^{adiacenti 14}.
   4. Sospensa gli oligo a 100 μM con H_2Odeionizzato. In un tubo sterile da 1,5 mL, si combinano 0,5 μL di ciascun oligo per un volume finale di 200 μL (concentrazione finale di 250 nM per ciascun oligo).
   5. Impostare una reazione PCR con i componenti elencati nella Tabella 1 per assemblare la libreria di proteasi, utilizzando le condizioni di termociclo nella Tabella 2.
   6. Impostare una seconda reazione PCR utilizzando gli oligo più esterni in direzione avanti e indietro (Tabella 3) utilizzando il primo prodotto PCR assemblato come modello. Amplifica il prodotto come mostrato nella Tabella 4.
   7. Eseguire il secondo prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% con bromuro di etidio (0,5 μg/mL) a 240 V per 30 minuti. Eliminare la banda corrispondente alla lunghezza attesa del DNA.
      NOTA: ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un mutageno e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Smaltire gel, tamponi e materiali di consumo contenenti bromuro di etidio come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le linee guida istituzionali di sicurezza.
   8. Purifica usando un kit di estrazione gel. Elute 50 μL di H_2Odeionizzato.
   9. Misura la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Conservare il DNA a −20 °C.
      NOTA: Ogni reazione da 50 μL della^{seconda PCR} produrrebbe circa 0,5–1,0 μg di DNA totale. Poiché ogni elettroporazione richiede 12 μg della libreria proteasi (cioè l'inserimento), si ingrandisce le reazioni di conseguenza.
2. Assemblaggio della cassetta a substrato
   1. Prepara le piastre LB-agar e i mezzi liquidi LB-cloranfenicol. Vedi le ricette nella Tabella 5.
   2. Progettare un insieme di oligonucleotidi a 30 mer sovrapposti in direzione avanti e indietro per l'assemblaggio delle cassette del substrato. Progetta le estremità 5′ di ogni oligonucleotide inverso e l'oligonucleotide frontale del frammento successivo per abbinarle con 4 nucleotidi.
   3. Risospendere gli oligo liofilizzati a 100 μM usando H_2Odeionizzato.
   4. Mescola i reagenti come nella Tabella 6.
   5. Usa il programma di ciclaggio nella Tabella 7 per ricottare e fosforilare la miscela oligo.
   6. Diluire gli oligo annealizzati 4 volte in H_2Odeionizzato per raggiungere una concentrazione finale di 1,25 μM.
   7. Combinare la miscela di oligo annealed con il vettore (ad esempio, pDD1523), seguendo la Tabella 8.
   8. Esegui l'assemblaggio Golden Gate, seguendo il programma di ciclismo nella Tabella 9.
      NOTA: Ad esempio, il plasmide pDD1523 ha un sito di restrizione di tipo II (BsmBI) a valle del promotore GAL1/10. Un assemblaggio riuscito consente l'induzione al galattosio della cassetta^{substrato 7}.
   9. Trasforma il plasmide risultante in E. coli.
   10. Cellule a placca su agar LB con l'antibiotico corrispondente. Incubare per 16–18 ore a 37 °C.
   11. Scegli le colonie isolate e inoculale in 5 mL di mezzo LB. Incubare durante la notte (16–18 ore) a 37 °C con scuotimento (220 rpm).
   12. Estrae plasmidi da colture notturne utilizzando un kit miniprep per plasmidi.
   13. Misura la concentrazione del plasmide usando uno spettrofotometro, poi invia il sequenziamento.
3. Linearizzazione del vettore di visualizzazione del lievito
   1. Linearizzare il plasmide di visualizzazione del lievito, ad esempio digerire pDD1524 con enzimi di restrizione SphI e PstI per preparare il vettore di visualizzazione del lievito contenente la cassetta substrato per l'elettroporazione. Mescola i reagenti elencati nella Tabella 10 e incuba a 37 °C per 1 ora.
   2. Fai funzionare il prodotto di digestione restrizionale su un gel di agarosio all'1% a 240 V per 30 minuti. Rimuovere la banda corrispondente alla lunghezza prevista del DNA e purificare utilizzando un kit di estrazione in gel.
      NOTA: Ogni digestione di restrizione da 50 μL produrrebbe circa 0,5–1,0 μg di DNA totale. Poiché ogni elettroporazione richiede 4 μg di vettore linearizzato, si ingrandisce di conseguenza le reazioni di digestione.

2. Elettroporazione

Nota: Segui le procedure di sicurezza istituzionale per la gestione di materiali biologici e reagenti, indossa DPI adeguati e smaltire i rifiuti biologici e chimici in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Preparazione di tamponi, lastre e mezzi (2 giorni prima dell'elettroporazione)
   1. Preparare il materiale di crescita (1 × YPD; 2 × YPD; Acidi Casamino Destrosio Sintetici, SDCAA+; e Acidi Casamino Galactosici Sintetici, SGCAA+), lastre (YPD e SDCAA), tampone di elettroporazione e acqua sterile seguendo le ricette della Tabella 5. Conserva a 4 °C.
2. Preparazione di una lastra striata di EBY100.
   1. Stira il lievito EBY100 su agar YPD da una scorta di glicerolo. Coltiva a 30 °C per 2 giorni.
   2. Conserva il piatto a 4 °C dopo la crescita.
      NOTA: Una piastra striata rimane utilizzabile fino a 1 mese; Segna la data della striatura sulla targa.
3. Preparazione della pre-coltura di EBY100 (1 giorno prima dell'elettroporazione)
   1. Prepara 125 mL di 1 × YPD in una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL.
   2. Prepara 25 mL di 1 × YPD in un tubo conico da 50 mL. Utilizzando una punta di micropipetta, raccogli cellule EBY100 dalla piastra coltivata per 2 giorni. Successivamente, trasferire le cellule del lievito dalla punta della pipetta al tubo conico contenente 1 × YPD.
      NOTA: La striscia di cellule dovrebbe formare una striscia di circa 1–2 mm di lunghezza.
   3. Rimuovi la punta della micropipetta e fai un vortice sul tubo conico per garantire una miscelazione adeguata.
   4. Prepreparare una pre-coltura da 150 mL trasferendo 25 mL di 1 × YPD contenente le cellule del lievito nella fiaschetta da 500 mL contenente 125 mL di 1 × YPD. Vortice per mescolare.
   5. Utilizzando uno spettrofotometro, misura l'OD₆₀₀ preparando due microcuvette con un percorso di 1 cm: una con 1 mL di 1 × YPD come controllo a vuoto e un'altra con 1 mL della pre-coltura
   6. Coltivare 150 mL di pre-coltura durante la notte (16–20 ore) a 30 °C con oscillazioni orbitali a 270 giri al minuto.
4. Preparazione della sottocoltura al livello iniziale_{desiderato 600} (il giorno dell'elettroporazione)
   1. Preparare il tampone di condizionamento e il mezzo di crescita esterna, come descritto nella Tabella 5.
   2. Misura il OD₆₀₀ della pre-coltura notturna (OD₆₀₀ previsto è 17–22). Per rimanere nell'intervallo lineare dello spettrofotometro, misurare una diluizione 1:20 della pre-coltura.
   3. Calcola il volume di pre-coltura necessario per inoculare una sottocoltura da 100 mL. Si raccomanda una sottocultura iniziale OD₆₀₀ di 3,0–4,0.
   4. Diluire la coltura al livello iniziale_{desiderato di 600} in 100 mL di 2 × YPD in una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL.
   5. Incubare la sottocultura da 100 mL a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min per 4 ore.
5. Preparazione dei mezzi durante incubazioni di 4 ore
   1. Tieni pronti il tampone di elettroporazione gelato e l'acqua sterile (dal passo 2.1.1).
   2. Prepara il tampone di condizionamento (100 mL), seguendo la ricetta della Tabella 5. Usa 20 mL di buffer di condizionamento per ogni trasformazione; Scala di conseguenza. Conserva a temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: ATTENZIONE: Il buffer condizionante contiene ditiotreitolo (DTT) e acetato di litio (LiAc), che sono irritanti chimici che possono causare irritazione della pelle e degli occhi. Indossare DPI appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza, e maneggiare questi reagenti in conformità con le procedure istituzionali di sicurezza chimica. Smaltire le soluzioni inutilizzate e i tamponi esauriti come rifiuti chimici in conformità con le linee guida istituzionali.
   3. Preparare il mezzo di crescita (50 mL): Mescolare insieme 25 mL di 2 × YPD e 25 mL di 1 M di sorbitolo. Usa 8 mL di materiale di crescita per ogni trasformazione. Conserva a temperatura ambiente (20–23 °C).
6. Preparazione delle cellule di lievito elettrocompetenti dopo incubazione di 4 ore.
   1. Dividere la sottocultura da 100 mL in due tubi conici da 50 mL. Raccogli le celle centrifugando a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decanta il mezzo. Tieni le celle sul ghiaccio fino al completamento del passaggio 2.6.4.
   2. Sospezione delicata di ogni pellet cellulare con 25 mL di acqua sterile ghiacciata. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decantare il substrato.
   3. Ripeti il passo 2.6.2.
   4. Sospendere delicatamente ogni pellet cellulare con 25 mL di tampone di elettroporazione gelato. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decantare il substrato.
   5. Rimuovere le cellule dal ghiaccio e risospendere delicatamente ogni pellet cellulare con 10 mL di tampone di condizionamento a temperatura ambiente (20–23 °C). Poi, si raccoglie in una singola fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL e si incuba a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min per 30 minuti.
   6. Versare le celle in un tubo da 50 mL. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti. Scendere i media.
   7. Sospezione delicata del pellet cellulare con 50 mL di tampone di elettroporazione gelido. Centrifuga a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decanta il substrato.
   8. Risospendere il pellet cellulare a un volume finale di 1 mL aggiungendo circa 100–200 μL di buffer di elettroporazione. Tieni le cellule sul ghiaccio fino all'elettroporazione.
      NOTA: Le celle elettrocompetenti possono essere congelate (cioè poste in un congelatore a –80 °C) e utilizzate successivamente senza una significativa perdita di efficienza elettroporativa.
7. Elettroporazione, crescita e placcatura
   1. Cuvette/e di elettroporazione pre-raffreddamento con una dimensione di 0,2 cm sul ghiaccio.
   2. Trasferire 380 μL del pellet sospeso in un tubo sterile da 1,5 mL. Mescola con 4 μg di DNA plasmidico oppure con 4 μg di vettore plasmidico linearizzato e 12 μg di inserto. Mescola delicatamente con la pipetta.
      NOTA: Per massimizzare il numero di cellule elettroporate, le concentrazioni di DNA vettore e inserito dovrebbero idealmente essere di 700–800 ng/μL. Se le concentrazioni sono inferiori, usa un concentratore a vuoto.
   3. Trasferire la sospensione nella cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata. Resta sul ghiaccio per 5 minuti.
   4. Strofina i lati della cuvetta dopo 5 minuti con una salvietta da laboratorio senza pelucchi per eliminare l'umidità residua, che potrebbe causare archi durante l'elettroporazione. Evita bolle o celle sopra le piastre metalliche della cuvetta, poiché potrebbero anche causare archi elettrici. Per mantenere la temperatura fredda della cuvetta, non toccare gli elettrodi della piastra.
   5. Prepara 8 mL di mezzo di crescita in un tubo conico da 50 mL.
   6. Elettroporare le celle con le seguenti impostazioni: tensione di 2,5 kV, capacità di 25 μF e resistenza di 200 Ω⁹. L'intervallo di costante di tempo accettabile è di 2,8–4,5 ms.
      NOTA: ATTENZIONE: L'elettroporazione coinvolge impulsi elettrici ad alta tensione. Assicurati che le cuvette siano ben posizionate e segui le istruzioni operative del produttore. Smaltire le cuvette di elettroporazione usate come rifiuti biopericolosi secondo le linee guida istituzionali.
   7. Inondare immediatamente la cuvetta con circa 200 μL di mezzo di crescita dal tubo conico e trasferire le celle elettroporate nel tubo conico da 50 mL. Aggiungere altri 200–350 μL di mezzo di crescita finché non rimane più liquido visibile nella cuvetta.
   8. Incubare il tubo conico di 50 mL delle cellule elettroporate in 8 mL di mezzo di crescita a 30 °C senza scuotere per 1 ora. Inverti il tubo ogni 15 minuti per mescolare.
   9. Prendere le celle tramite centrifugazione a 1.500 × g, 25 °C per 3 minuti. Poi decantare i media.
   10. Risospendere le cellule in un substrato di dropout di lievito appropriato per mantenere la selezione delle cellule trasformate. Per i plasmidi contenenti il marcatore di selezione TRP1, si risospendono le cellule in 250 mL di SDCAA+ (che non contiene triptofano) per recuperare selettivamente il lievito che ha mantenuto il plasmide.
   11. Incubare durante la notte (16–20 ore) a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri al minuto.

3. Induzione, colorazione e selezione citometrica a flusso delle cellule del lievito

1. Induzione della libreria proteasi e della cassetta substrato (1 giorno prima dello smistamento)
   1. Misura OD₆₀₀ come nello step 2.4.2 dopo la crescita notturna dei trasformanti nei mezzi dropout.
   2. Aliquota 12 mL di trasformanti di lievito e centrifuga a 3.200 × g per 5 minuti.
   3. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di induzione SGCAA+ a un OD₆₀₀ di 0,5. Calcola il volume di risospensione richiesto usando l'equazione di diluizione, C₁V₁ = C₂V₂.
   4. Trasferire in una fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL e far crescere durante la notte per 18–24 ore a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min.
2. Colorazione con anticorpi fluorescenti (il giorno dello smistamento)
   1. Misura OD₆₀₀ di cellule post-induzione. Usa due cuvette: una con 1 mL di SGCAA+ e l'altra con 950 μL di SGCAA+ mescolato con 50 μL di celle. Moltiplica il valore misurato_{di OD 600} per 20 per ottenere il vero OD₆₀₀ delle celle post-induzione.
   2. Normalizzare ogni campione a 3 × 10⁷ cellule per la colorazione degli anticorpi e la selezione FACS. Usare C₁V₁ = C₂V₂ per calcolare il volume di celle da trasferire dalla fiaschetta di induzione.
      NOTA: Per la mutagenesi di saturazione NNS a quattro siti, la dimensione teorica della libreria è di 10^{a 6} varianti. Per campionare sufficientemente la libreria, scherma almeno 10 volte la dimensione della libreria, ovvero 10^{celle da 7} . Esempio: se desiderato_{C 1}V₁ = 3 × 10⁷ celle e C₂ = post-induzione OD₆₀₀ di 6 (cioè 6 × 10⁷ celle/mL), allora aliquota 500 μL di celle indotte (cioè, V₂ = 3 × 10⁷ celle / 6 × 10⁷ celle/mL = 500 μL).
   3. Trasferire il volume calcolato delle celle in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti.
   4. Rimuovere il surnatant e risospendere in 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + 0,5% albumina bovina (BSA).
   5. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti e ripetere il passo 3.2.4.
   6. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti, e nel frattempo completare il passaggio 3.2.7.
   7. Prepara una miscela di colorazione anticorpale in un tubo da 1,5 mL contenente anti-HA fluoresceina isotiocianato (FITC) (0,5 μg/10⁷ cellule), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/^{10 7} cellule) e PBS + 0,5% di BSA (100 μL/10⁷ cellule). Tieni il tubo sul ghiaccio.
   8. Rimuovi il surnatiante e risospendi con la miscela di macchie. Usa 300 μL della miscela di colorante ogni 3 × 10⁷ celle. Non fare un vortice sul tubo; Solo invertendo o facendo un flick.
   9. Tieni le celle sul ghiaccio al buio per 1 ora dopo la rispensione.
3. Lavaggio post-macchia
   1. Centrifuga le cellule colorate a 5.000 × g per 5 minuti. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in PBS contenente lo 0,5% di BSA usando 0,5 mL ogni 1 ×^{10 7} celle (ad esempio, 500 μL per 1 × 10⁷ celle o 1,5 mL per 3 × 10⁷ cellule).
   2. Centrifuga a 5.000 × g, 5 minuti. Rimuovere il soprantantante, risospesdere in 750 μL di PBS + 0,5% di BSA.
   3. Trasferire altri 750 μL di PBS + 0,5% di BSA in un tubo di raccolta da 10 mL.
4. FACS
   1. Esegui l'avvio e la preparazione necessaria del citometro per un nuovo esperimento.
   2. Crea tre dot-plot. Nel primo dot-plot, seleziona il nome dell'asse X per mostrare il canale dell'area di scatter frontale (FSC-A) e il nome dell'asse Y per mostrare il canale dell'area di scattering laterale (SSC-A).
      NOTA: Questo faciliterà la selezione delle cellule vive.
   3. Mantieni il nome dell'asse X per visualizzare il canale FSC-A mentre si cambia il canale dell'asse Y per mostrare l'altezza di diffusione diretta (FSC-H) sul secondo dot-plot.
      NOTA: Questo faciliterà la selezione dei singoli.
   4. Seleziona il nome dell'asse X per visualizzare il canale PE e il nome dell'asse Y per mostrare il canale FITC sul terzo dot-plot.
   5. Esegui il controllo negativo sul citometro utilizzando i canali 530/30 nm (FITC) e 585/42 nm (PE). Eseguire la selezione utilizzando un ugello da 70 μm a una pressione di guaina di 70 psi. Acquisire campioni a una velocità di 4000–5000 eventi/s.
   6. Disegna una porta poligonale attorno alla popolazione principale di cellule di lievito intatte per escludere detriti e piccole particelle con segnali bassi di FSC-A e SSC-A nel primo dot-plot (FSC-A contro SSC-A).
   7. Singole gate su un grafico FSC-H contro FSC-A all'interno di questa porta, selezionando la popolazione lineare che mostra una relazione proporzionale tra FSC-H e FSC-A. Escludere gli eventi che si discostano dalla distribuzione lineare e corrispondono a doppietti e aggregati di celle.
      NOTA: Il terzo dot-plot per PE rispetto a FITC mostrerà un gruppo diagonale di punti per il controllo negativo (cioè, cellule di lievito che esprimono la cassetta del substrato intatto).
   8. Preleva i campioni e seleziona le cellule di lievito in base ai valori desiderati di PE/FITC in un tubo di raccolta (o più tubetti). Analizzare un numero totale di celle corrispondenti ad almeno 10 volte la dimensione teorica della libreria per garantire una rappresentazione adeguata di tutte le varianti (ad esempio, analizzare ~1 × 10⁷ celle per una libreria con diversità teorica di ~1 × 10⁶ varianti).
   9. Posiziona la porta di ordinamento sotto la diagonale PE/FITC della popolazione di controllo negativa.
      NOTA: Porte più rigide migliorano l'arricchimento delle varianti desiderate ma riducono il recupero cellulare.
5. Dopo il FACS
   1. Tubo di raccolta centrifuga a 3.200 × g per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando 1 mL, e risospendere 5 mL di PBS.
      NOTA: Lasciare 1 mL di sovrantante, poiché la pellet cellulare sul fondo non sarà visibile dopo la centrifugazione.
   2. Centrifuga ancora a 3.200 × g per 5 minuti. Rimuovi il soprandante, lasciando 1 mL. Risospendere con 4 mL di SDCAA+.
   3. In una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL, aggiungi 15 mL di SDCAA+. Trasferire le celle sospese dal passaggio 3.5.2 in questa fiaschetta.
   4. Incubare durante la notte per 18–24 ore a 30 °C con oscillazioni orbitali a 270 giri al minuto.
   5. Ripeti i passaggi 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 per ogni ciclo di evoluzione diretta.

4. Recupero e sequenziamento dei plasmidi di singoli cloni

1. Coltivare colonie individuali
   1. Creare un stock di glicerolo mescolando 500 μL della coltura liquida dopo il passaggio 3.5.4 e 500 μL di glicerolo sterile al 50%, ottenendo una soluzione di stock di glicerolo al 25%. Vortice per mescolare accuratamente le cellule.
   2. Conserva nel congelatore a -80 °C durante la notte. Per la conservazione a lungo termine, trasferire nell'azoto liquido.
   3. Raschiare il calcio di glicerolo usando una punta sterile da 1000 μL e mescolarlo in 100 μL di SDCAA+. Impiatta questa miscela su una piastra SDCAA e incubala capovolta a 30 °C.
   4. Raccogli le colonie dopo 3 giorni e coltivale durante la notte in 1,5 mL di SDCAA+ in tubi da 14 mL.
2. Esegui un miniprep di lievito per estrarre i plasmidi
   1. Pelletare la coltura notturna centrifugando a 16.000 × g per 1 minuto e risospendere 200 μL di Soluzione 1 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito.
   2. Aggiungi 5 μL di soluzione enzimatica litica (5 U/μL).
   3. Incubare in un incubatore a 37 °C per 4 ore su un mixer end-to-end.
   4. Esegui un ciclo di congelamento-scongelamento congelando a -80 °C per 20 minuti e scongelando a 42 °C per 10 minuti in un bagno d'acqua.
   5. Aggiungi 200 μL di Soluzione 2 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito, mescola invertendo 2–3 volte e lascia riposare per 5 minuti.
   6. Aggiungi 400 μL di Soluzione 3 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito e mescola invertendo 2–3 volte. Centrifuga a 16.000 × g per 5 minuti.
   7. Purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit di purificazione con una colonna di alta capacità di legame al DNA.
      NOTA: A causa della grande quantità di DNA genomico di lievito tagliato proveniente dalle cellule lisate, è necessario utilizzare una colonna a base di silice con maggiore capacità di legame al DNA (35 μg) invece di una colonna di purificazione del DNA plasmidico del lievito a capacità inferiore (5 μg⁾¹⁵.
   8. Misura la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Le rese di DNA sono di 10–30 ng/μL.
3. Trasformano plasmidi purificati in cellule di E. coli chimicamente competenti
   1. Prepara il substrato SOC, seguendo la ricetta nella Tabella 5, e i piatti di LB-cloranfenicole. Inoltre, preriscalda un bagno d'acqua a 42 °C.
   2. Riscalda una piastra di LB-cloranfenicolo per ogni plasmide a 37 °C per 20 minuti.
   3. Estrai un tubo di celle chimicamente competenti dal congelatore a –80 °C e scongelalo sul ghiaccio.
   4. Aliquota 30 μL di cellule competenti per ogni plasmide in un tubo da 1,5 mL su ghiaccio.
   5. Pipetta 3 μL di plasmide in cellule competenti. Passa un po' per mescolare e lascia riposare per 5 minuti sul ghiaccio.
   6. Esegui lo shock termico incubando brevemente le cellule nel bagno d'acqua a 42 °C per 40 secondi.
   7. Incubare sul ghiaccio per 2 minuti.
   8. Aggiungere 300 μL di mezzo SOC alle cellule e incubare per 15 minuti a 37 °C a 220 giri/min.
   9. Placca 50–100 μL di celle competenti trasformate su piastre preriscaldate.
   10. Incubare le piastre a 37 °C capovolte per 18 ore.
4. Raccolta delle colonie
   1. Aggiungi 5 mL di substrato LB-cloranfenicole liquido a tubi di coltura da 14 mL a fondo rotondo.
   2. Scegli una colonia usando una punta sterile da 1000 μL e immergila in un tubo di coltura.
   3. Posizionare i tubi in uno shaker (220 giri/min, angolo 30°–45° per massimizzare l'aerazione) a 37 °C per 18 ore.
5. Estrazione dei plasmidi da colture liquide batteriche
   1. Centrifuga le colture liquide a 3.200 × g per 4 minuti. Fai decant il soprantantante.
   2. Estrarre i plasmidi dalle colture notturne utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi.
   3. Misurare la concentrazione dei plasmidi purificati utilizzando uno spettrofotometro.
6. Invia plasmidi per il sequenziamento
   NOTA: Utilizzare servizi come il sequenziamento dei nanopori a plasmidi interi o, in alternativa, il sequenziamento Sanger con un primer che affianca la regione mutagenizzata.

Risultati

La costruzione efficiente delle biblioteche è fondamentale per garantire una copertura adeguata dello spazio mutazionale. Per evitare la perdita di rare varianti funzionali, il numero di trasformanti dovrebbe raggiungere almeno il 10×-100× la dimensione teorica della libreria. Poiché l'efficienza di trasformazione in S. cerevisiae è influenzata dalla concentrazione cellulare ed è più alta nelle celle di fase^{logaritmica iniziale-media 16}, abbiamo ottimizzato la densità cellulare iniziale prima dell'elettroporazione. Le colture di lievito sono state sottocolte con valori iniziali di OD₆₀₀ variabili da 1,0 a 4,0 e incubate per 4 ore (n = 2–4 esperimenti biologici indipendenti), dopo di che i valori finali di_{OD 600} sono stati mappati sulla curva di crescita di S. cerevisiae per confermare che le cellule rimanevano nella fase di crescita a metà logaritmotecnia (Figura 5A, Figura supplementare 1).

L'elettroporazione di queste colture con 4 μg di DNA plasmidico (n = 2 esperimenti biologici indipendenti) ha mostrato che l'efficienza della trasformazione differiva significativamente nelle condizioni iniziali di OD₆₀₀ (ANOVA unidirezionale, p = 8,92 × 10⁻⁷). Rispetto alle colture iniziate a OD₆₀₀ = 1,0, tutte le densità cellulari iniziali più elevate produssero efficienze di trasformazione significativamente maggiori (test di confronto multiplo di Dunnett; OD₆₀₀ = 1,5, aggiustato p = 0,0020; OD₆₀₀ ≥ 2.0, aggiustato p < 0.0001), con la massima efficienza di trasformazione osservata a un OD₆₀₀ iniziale di 4.0. Per sfruttare la naturale capacità delle cellule di lievito di eseguire la ricombinazione omologa, abbiamo anche elettroporato 4 μg del vettore plasmidico linearizzato e 12 μg dell'inserto (cioè la libreria proteasi) nelle cellule del lievito (n = 2 esperimenti biologici indipendenti). L'efficienza della trasformazione differiva significativamente tra le condizioni iniziali di OD₆₀₀ testate (ANOVA unidirezionale, p = 0,0023). Rispetto alle colture avviate a OD₆₀₀ = 1,0, le efficienze di trasformazione erano significativamente maggiori a OD₆₀₀ = 3,0 (aggiustato p = 0,0018), 3,5 ( aggiustato p = 0,0062) e 4,0 ( aggiustato p = 0,0024) (test di confronti multipli di Dunnett). Abbiamo osservato la massima efficienza di trasformazione a una densità iniziale di sottocultura moderata (OD₆₀₀ = 3,0), indicando un equilibrio ottimale tra competenza cellulare ed efficienza di ricombinazione in queste condizioni (Figura 5B). Rispetto alla trasformazione solo plasmidi, la co-elettroporazione di un vettore linearizzato e un inserto di libreria proteasi (n = 2 repliche biologiche indipendenti) ha prodotto efficienze di trasformazione significativamente più elevate nelle condizioni iniziali di OD₆₀₀ testate (ANOVA bidirezionale sulle efficienze di trasformazione trasformate log10, p = 9,40 × 10⁻¹²). In media, la co-elettroporazione ha prodotto un aumento medio di 121 volte dell'efficienza di trasformazione (IC 95%, 63–233 volte) rispetto alla trasformazione solo plasmide (Figura 5B).

Durante una corsa FACS di cellule di lievito contenenti la libreria di proteasi mutanti e la cassetta di selezione del substrato (Figura 6A), le cellule mostreranno o una cassetta troncata o una proteasi che ancora taglia il substrato di controselezione (Q1), esprimeranno varianti proteasi non funzionali (Q2), o esprimeranno varianti proteasi che tagliano con successo solo il substrato di selezione (Q3). Le cellule di lievito che esprimevano varianti non funzionali sono apparse come una popolazione dominante distribuita lungo la diagonale nei grafici PE rispetto ai grafici FITC, riflettendo la co-ritenzione di entrambi i segnali (Figura 6A, Q2). Al contrario, le varianti funzionali che spaccavano il substrato di selezione risparmiando il substrato nativo (contro-selezione) formavano una popolazione distinta fuori diagonale caratterizzata da un'intensità del segnale PE alta e da media-bassa (Figura 6A, Q3). L'applicazione di una strategia di gating rigorosa per isolare questa popolazione fuori diagonale ha portato a un progressivo arricchimento delle varianti funzionali nei cicli successivi di ordinamento¹⁰. Questo arricchimento si osserva visivamente come un cluster sempre più definito di celle separato dal gruppo diagonale (Figura 6B, da sinistra a destra). Se non si osserva una popolazione distinta fuori diagonale, ciò può indicare bassa qualità della libreria, espressione insufficiente o condizioni di colorazione subottimali. Come controllo negativo, la Figura 6C,D mostra cellule di lievito elettroporate, indotte e non colorate e i corrispondenti istogrammi di fluorescenza FITC e PE.

All'interno della popolazione arricchita fuori diagonale, le sottopopolazioni possono essere ulteriormente risolte in base all'intensità del FITC. Le celle che mostrano un segnale FITC medio possono essere ordinate separatamente da quelle con un segnale FITC basso. Il sequenziamento di queste popolazioni distinte ha rivelato profili di mutazione unici (Tabella 11), indicando che le diverse efficienze di scindimento sono associate a diverse varianti proteasi.

Figura 1: Preparazione vettoriale e inserimento. (A) Generazione di librerie di proteasi potyviral tramite mutagenesi a saturazione del sito. (B) Assemblaggio e integrazione della cassetta del substrato nel vettore di visualizzazione del lievito (pDD1523). (C) Linearizzazione del vettore di visualizzazione del lievito (pDD1524) tramite digestione restrizionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Elettroporazione della cassetta substrato e della libreria di proteasi mutanti amplificate da PCR in celle EBY100 competenti. (Scatola a tratteggiamenti) Circularizzazione in vivo del plasmide contenente sia proteasi che cassetta substrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Induzione, colorazione e selezione citometrica a flusso delle cellule di lievito. (A) Induzione della libreria proteasi e della cassetta substrato. (B) Colorazione con anticorpi fluorescenti: colorazione con anticorpi anti-HA fluoresceina isotiocianato (FITC) e anti-FLAG ficoeritrina (PE). (C) Le cellule colorate vengono ordinate tramite Filtrazione Cellulare Attivata dalla Fluorescenza (FACS). (D) Recupero di cellule selezionate per FACS in mezzi di selezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Recupero dei plasmidi e sequenziamento delle cellule di lievito selezionate. (A) Impiccatura delle cellule di lievito selezionate. (B) Estrazione di plasmidi da singole colonie di lievito. (C) Trasformazione da E. coli dei plasmidi estratti. (D) Estrazione di plasmidi da singole colonie di E. coli . (E) Sequenziamento nanoporo dei plasmidi estratti. Icone di fiaschette e tubi adattate rispettivamente da DBCLS ed Helicase 11 tramite Bioicons (https://bioicons.com) e adattate secondo i termini della Licenza Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Curve di crescita del lievito in diversi mezzi di crescita e l'influenza della densità ottica iniziale a 600 nm (OD₆₀₀) di sottocoltura sull'efficienza dell'elettroporazione del lievito. (A) Curve di crescita del lievito in 1 × Estratto di Peptone Destrosio (YPD), 2 × YPD, Agar di Casaminoacidi Destrosici Sintetici senza antibiotici (SDCAA-) e Agar di Casaminoacidi Destrosio Sintetici con antibiotici (SDCAA+). (B) Efficienza di trasformazione del lievito elettroporato con un vettore plasmidico di 4 μg a vari sottocolture iniziali OD₆₀₀, e l'efficienza di trasformazione usando vettore linearizzato (4 μg) e inserto della libreria proteasi (12 μg) agli stessi valori iniziali di OD₆₀₀ . I dati in (A) sono presentati come OD₆₀₀ ± SD da due esperimenti biologici indipendenti (n = 2). I dati in (B) sono presentati come numero medio di trasformanti per elettroporazione su un asse y logaritmico, con repliche biologiche individuali mostrate come cerchi (n = 2). La significatività statistica per gli esperimenti di ottimizzazione plasmide e di elettroporazione vettore più inserto è stata determinata utilizzando ANOVA unidirezionale sulle efficienze di elettroporazione trasformate log10, seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett utilizzando OD₆₀₀ = 1,0 come controllo. ns, non significativi; p < 0,01 (**); p < 0,0001 (****). La significatività statistica della differenza tra efficienze di trasformazione solo plasmide e vettore più inserto è stata determinata utilizzando ANOVA bidirezionale sulle efficienze di trasformazione trasformate log10. p < 0,0001 (****). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Arricchimento basato su Fluorescenza Activated Cell Sorting (FACS) dei cloni di lievito. (A) Rappresentazione schematica della strategia di gate. Le cellule erano divise in tre regioni: Q1, cellule basse di ficoeritrina (PE); Q2, PE alto/fluoresceina isotiocianato (FITC) - cellule elevate; e Q3, cellule PE-alte con fluorescenza FITC da bassa a intermedia. Le celle all'interno di Q3 sono state raccolte per l'arricchimento. (B) Grafici rappresentativi FACS di una campagna evolutiva indipendente che mostrano round sequenziali di ordinamento con una stringenza crescente di gating FITC. Cellule a FITC medio e basso sono state raccolte separatamente per il sequenziamento. Le percentuali indicano la frazione di cellule di lievito singole vive all'interno della popolazione portata. (C) Grafico rappresentativo FACS che mostra cellule di lievito elettroporate e non colorate come controllo negativo. (D) Istogrammi delle intensità di fluorescenza FITC-A (sinistra) e PE-A (destra) corrispondenti ai dati mostrati in (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Miscela di reazione per l'amplificazione PCR al primo turno della libreria proteasi. Composizione della reazione PCR utilizzata per l'amplificazione al primo ciclo della libreria proteasi, incluse le concentrazioni finali e le quantità di ciascun reagente in una reazione da 50 μL. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Condizioni di ciclaggio per l'amplificazione PCR al primo turno della libreria proteasi. Il programma di ciclo termico è stato utilizzato per l'amplificazione PCR al primo turno della libreria di proteasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Miscela di reazione per l'amplificazione PCR al secondo ciclo della libreria proteasi. Composizione della reazione PCR utilizzata per l'amplificazione del secondo ciclo della libreria proteasi, incluse le concentrazioni finali e le quantità di ciascun reagente in una reazione da 50 μL. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Condizioni di ciclo per l'amplificazione PCR al secondo ciclo della libreria proteasi. Il programma di ciclo termico veniva utilizzato per l'amplificazione PCR al secondo round della libreria di proteasi. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Mezzi e reagenti per l'elettroporazione e la crescita del lievito. Descrizione tabulare della massa richiesta da ciascun componente chimico per formulare quantità specifiche di 1 × e 2 × Estratto di lievito di Peptone Destrosio (YPD), tampone di elettroporazione, tampone di condizionamento, mezzi di escrescenza, Casaminoacidi Dextrosio Sintetici con antibiotici (SDCAA+), Casaminoacidi Galactosi Sintetici con antibiotici (SGCAA+), Mezzi per Brodo di Lisogenesi (LB), Mezzi LB-cloranfenicol, Medici Super Ottimali (SOB) e Super Ottimale Brodo con Mezzi di Repressione Catabolitica (SOC). Sono incluse istruzioni per la preparazione delle soluzioni stock, come 2 M Sorbitolo, 1 M ditiotreitolo (DTT) e 2 M acetato di litio (LiAc). Sono fornite istruzioni aggiuntive per la preparazione delle lastre di agar SDCAA, LB e YPD. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 6: Miscela di reazione per ricottura e fosforilazione degli oligos. Composizione della miscela di reazione utilizzata per il ricottura e la fosforilazione simultanea degli oligonucleotidi per l'assemblaggio su cassette del substrato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 7: Condizioni di ciclo per la ricottura e la fosforilazione degli oligos. Programma di temperatura utilizzato per il ricottura degli oligonucleotidi e la fosforilazione per l'assemblaggio di cassette su substrato. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 8: Miscela di reazione per l'assemblaggio Golden Gate di plasmide di cassetta e vettore in forma di substrato. Composizione della reazione di assemblaggio Golden Gate utilizzata per legare la cassetta substrato nel plasmide vettoriale. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 9: Condizioni di ciclo per l'assemblaggio Golden Gate di substrato, cassetta e plasmide vettoriale. Programma di ciclo termico utilizzato per l'assemblaggio del Golden Gate. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 10: Miscela di reazione per la linearizzazione del plasmide vettoriale. Composizione della reazione di digestione di restrizione utilizzata per linearizzare il plasmide vettoriale prima della costruzione della biblioteca. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 11: Risultati del sequenziamento nanoporo delle varianti TEVp che tagliano ENLYFES. I plasmidi sono stati estratti dalle cellule del lievito dopo la quarta e ultima sessione FACS. Le mutazioni in ogni clone sono mostrate rispetto alla sequenza di tipo selvatico. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare 1: Relazione tra densità di coltura iniziale e finale di EBY100 durante la sottocoltura. Le colture EBY100 sono state sottocolte con valori iniziali variabili di OD₆₀₀ , e la OD_{finale 600} è stata misurata dopo l'incubazione in condizioni di crescita identiche (30 °C, 220 rpm). La densità finale di coltura aumentò linearmente con l'aumento del diametro diametro dimensionale_{iniziale 600} (R² = 0,969, p = 5,77 × 10⁻⁵). I punti dati rappresentano le medie ± SD di (n = 2–4) repliche biologiche indipendenti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Progettazione razionale della libreria mutagenesi TEVp. Rappresentazione cartoon del TEVp (PDB ID: 1LVB) con i quattro residui (oro) <5Å di distanza dal residuo P1 (viola) mirato alla mutagenesi di saturazione del sito. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

L'evoluzione diretta è un metodo ad alto rendimento che utilizza cicli iterattivi di diversificazione e selezione per identificare proteine con funzione biochimica potenziata^{o nuova 17}. In questo protocollo, dettagliamo un flusso di lavoro ottimizzato per evolvere il riconoscimento proteasi-substrato utilizzando un sistema di visualizzazione cella-superficie in S. cerevisiae. Il sistema di visualizzazione superficiale mappa l'attività proteasi a un fenotipo rilevabile basato sulla fluorescenza, consentendo l'arricchimento basato su FACS dei cloni desiderati. Forniamo i passaggi dettagliati per l'assemblaggio di cassette di biblioteche di proteasi e substrati, elettroporazione ad alta efficienza, gating e ordinamento FACS e sequenziamento finale delle varianti proteasi.

Uno dei passaggi più essenziali nell'evoluzione diretta è garantire una sufficiente diversità bibliotecaria e una copertura di potenziali^{mutazioni 17}. I nostri esperimenti di efficienza di elettroporazione mostrano che una sottocultura iniziale OD₆₀₀ di 3,0 produce la massima efficienza di trasformazione, superando^10,9 CFU. Questa scala, ottenuta con l'elettroporazione ottimizzata del lievito, supera notevolmente quella dei metodi convenzionali di trasformazione chimica e consente una copertura adeguata di ampie librerie^{combinatorie 8,9}. Un accurato gating e un ordinamento FACS sono essenziali per separare celle che mostrano le proprietà di taglio desiderate da quelle che mostrano clivagatura non specifica. Durante più cicli di selezione basata su FACS, la strategia di gating diventa sempre più rigida per arricchire selettivamente le varianti proteasi desiderate. Se il gating è troppo ampio, le celle indesiderate possono essere selezionate insieme alle varianti desiderate. Un gating rigoroso (ad esempio, soglie sempre più basse per il segnale FITC tra i round) permette alla popolazione cellulare di arricchirsi per varianti proteasi con maggiore specificità e attività verso la nuova sequenza del substrato^{bersaglio 10}. In linea con le campagne^{precedenti 7,18}, abbiamo effettuato la mutagenesi NNS-codon di quattro residui nella tasca di legame al substrato del TEVp che interagiscono con il residuo P1 del substrato, Q (T146, D148, H167, S170) (Figura Supplementare 2). I grafici FACS mostrati nella Figura 6B rappresentano un singolo esperimento di ordinamento rappresentativo che illustra la strategia di gating e il flusso di lavoro di arricchimento. Curiosamente, i risultati della nostra campagna hanno prodotto varianti TEVp con un diverso insieme di mutazioni amminoacidiche (Tabella 11). Questi risultati supportano una caratteristica chiave dell'evoluzione della proteasi: molteplici percorsi evolutivi possono portare allo stesso obiettivo.

Modifiche e strategie di risoluzione dei problemi possono essere necessarie durante l'esecuzione degli esperimenti. Ad esempio, durante l'elettroporazione, lavorare sul ghiaccio quando necessario e risospendere attentamente i pellet cellulari ad ogni passaggio garantisce che le cellule siano vive e sane prima dell'elettroporazione. Le cellule del lievito sono delicate durante tutte le fasi di elettroporazione fino alla fase di recupero della crescita esterna. Inoltre, potrebbe essere necessaria la modifica del fluido della guaina FACS per prevenire la floculazione delle cellule del lievito. Il liquido per guaine è comunemente usato nelle macchine FACS e può contenere conservanti che inibiscono la crescita batterica e fungina. Pertanto, il liquido della guaina può essere sostituito con PBS puro per prevenire la morte cellulare durante la smistamento.

Il sistema di visualizzazione della superficie del lievito richiede proteine correttamente ripiegate per attraversare con successo la via secretoria. Alcune varianti di proteasi possono perdere attività a causa di un ripiegamento errato, portando a falsi positivi durante la selezione del FACS causati da clivellamento non specifico o fluorescenza di fondo. Fonti ben caratterizzate di falsi positivi meritano di essere notate per campagne basate su plasmidi come questa. Poiché la clivatura viene letta come perdita del tag epitopico C-terminale, qualsiasi mutazione che interrompa quel tag produce lo stesso fenotipo a basso FITC di un evento genuino di sfaldura; tali mutazioni del tag sorgono durante la ricombinazione omologa su larga scala e possono arricchirsi attraverso i successivi turni di smistamento. L'integrazione cromosomica della cassetta a substrato costante ha recentemente dimostrato di mitigare questo^{problema 19}. Il protocollo si basa sull'uso di una libreria di inserti mantenendo costante il vettore (contenente la cassetta del substrato). Pertanto, questo protocollo non è adatto a chi desidera evolvere sia librerie di proteasi che di substrati.

La piattaforma YESS ha aperto una via generale per riprogrammare la specificità^{proteasi-substrato 18}. I miglioramenti recenti includono: l'aggiunta di controllo enzimatico/substrato titolabile in YESS2.0⁷, accoppiamento al sequenziamento di nuova generazione, abilitazione di profilazione di specificità^{ad alta risoluzione 20} e integrazione cromosomica dei reporter per ridurre il rumore di espressione e i falsi positivi¹⁹. Altre strategie ortogonali, come l'evoluzione continua assistita dai fagi, sono state applicate nell'ingegneria della specificità proteasi per bersagli^{terapeutici 21}. Questi strumenti hanno trovato applicazioni oltre l'ingegneria delle proteasi TEV, come la profilazione ad alta risoluzione della proteasi principale SARS-CoV-2 per guidare la progettazione²² dell'inibitore. Un fattore cruciale di qualsiasi campagna di questo tipo è generare abbastanza trasformanti da coprire grandi librerie combinatorie (>10⁹), che non erano state ottimizzate sistematicamente nella ceppa EBY100 S. cerevisiae . Definendo le condizioni della fase di crescita e di elettroporazione che guidano la trasformazione EBY100 sopra^10,9 CFU, questo protocollo elimina quel collo di bottiglia, consentendo uno screening completo basato su FACS di milioni di varianti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagents
10 mM dNTP Mix	NEB	N0447S	PCR reactions (Tables 1, 3)
10X PBS, pH 7.4	Fisher	BP3994	Staining buffer base (Steps 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction Buffer	NEB	B9027S	Sold separately; also included with Q5 polymerase
Agar, Bacto	BD Difco	281230-500g	SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500	Gel Electrophoresis
Anti-FLAG PE Antibody	BioLegend	637309	FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG
Anti-HA Tag Antibody [FITC]	GenScript	A01621	FACS staining; FITC-conjugated anti-HA
Bacto Casamino Acids	BD Difco	223120	SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L
Bacto Peptone / Tryptone	RPI	T60060-10000.0	LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V	Sigma-Aldrich	126575-10GM	0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)	NEB	R0739S	Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)
Calcium chloride solution (1M)	Sigma-Aldrich	21115-100mL	Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)
ColiRollers® Plating Beads	Sigma-Aldrich	71013-3	Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121ºC, 15 psi, for 15 mins.
D-Galactose	Thermo Fisher	A12813.30	250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)
D-Sorbitol	Thermo Fisher	1327300.10	Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)
Dextrose (D-Glucose), anhydrous	Sigma-Aldrich	G8270-1KG	YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	Sigma	Y0626-250G	6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)
Difco YPD Broth (pre-mixed)	BD	242820-500g	Pre-made YPD alternative; 500 g
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-1G	Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 μL, store −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit	Omega Bio-tek	D6492-02	PCR product cleanup
E.Z.N.A. Gel Extraction Kit	Omega Bio-tek	D2500-01	Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-tek	D6942-02	Plasmid purification (Step 4.2)
Glycerol (≥99%)	Fisher	BP229-4	50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	SDCAA+ and SGCAA+: 50 μg/mL final; replaces Sigma K0879-5G
KLD Enzyme Mix	NEB	M0554S	Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis
KLD Reaction Buffer	NEB	B0554A	Used with KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	E. coli liquid culture
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)	Thermo Fisher	A17921.30	Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)	RPI	L24020-2000.0	E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino Acids	Sigma	2240-500GM	Alternative casamino acids source
pDD1523	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524	Zenodo	10.5281/zenodo. 20746804	pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI	SDCAA+, SGCAA+: 1X final
PstI-HF (5000 U)	NEB	R3140S	Vector linearization (Table 10); use HF version
Q5 HF DNA Polymerase	NEB	M0492S	High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start
Q5 High GC Enhancer	NEB	B9028A	For high GC-content PCR reactions
Q5 Hot Start DNA Polymerase	NEB	M0491L	PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)	NEB	B6004S	Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)
SalI-HF	NEB	R3138L	Additional restriction enzyme
SOC Medium	NEB	B9020S	Post-transformation recovery
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S271-1	LB / SOB media preparation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500	Media pH adjustment
Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S9763-500G	SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)
Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous	VWR (BDH)	BDH4542-1KGP	SDCAA plates, SCAA media: 62 mM; replaces NaH2PO4·H2O monohydrate
SphI-HF (1000 U)	NEB	R3182S	Vector linearization in tandem with PstI-HF (Table 10)
Streptomycin	Life Technologies / Sigma	S6501-5g	Antibiotic
T4 DNA Ligase Buffer (10X)	NEB	B0202S	Table 6
T4 Polynucleotide Kinase (500 U)	NEB	M0201S	Table 6
T7 DNA Ligase (3000 U/mL)	NEB	M0318S	Table 8
Yeast Extract	RPI	Y20020-5000.0	YPD (10 g/L) and LB/SOB media
Zymolyase (1000 U)	Zymo Research	E1004-A	Yeast cell wall digestion for plasmid extraction (Step 4.2.2)
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II	Zymo Research	D2004	Yeast plasmid extraction; includes Solutions 1, 2, 3 (Step 4.2)
ZymoPURE II Plasmid Midi Kit	Zymo Research	D4201-B	Mid-scale plasmid prep; for larger-volume preparations
Equipment and Consumables
Disposable Cuvettes, 1.5 mL	Fisher	14-955-127	For measuring OD600 of liquid cultures
Erlenmeyer Flask, 125 mL	VWR	10536-912	Pre-culture and conditioning incubation
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	10536-914	Yeast subculture
Erlenmeyer Flask, 250 mL	VWR	75809-646	Wide-mouth variant
Erlenmeyer Flask, 500 mL	VWR	10536-926	Main pre-culture flask (Step 2.3.1, 2.4.3)
Falcon 50 mL Conical Tubes	Falcon	352070	Cell washes, centrifugation throughout protocol
Flow Cytometry Sorter: BD Fusion	BD Biosciences	FACSAria Fusion Flow Cytometer (catalog number not applicable)	For Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	Bio-Rad	1652086	For electroporation of electrocompetent EBY100
GenePulser Xcell Electroporation System	Bio-Rad	1652660	INSTRUMENT; 2.5 kV, 25 μF, 200 Ω (Step 2.7.6)
New Brunswick Innova 40R - Benchtop Orbital Shaker	Eppendorf	M12990084	For yeast liquid culture incubation
Petri Dishes, 100 mm	Fisher	FB0875712	YPD and SDCAA agar plates
SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer	Molecular Devices	SpectraMax QuickDrop	For measuring OD600 of liquid cultures and DNA concentration
Vacufuge plus	Eppendorf	2231001204	For concentrating DNA
Software
BD FACSDiva (Version: 8.0)	BD Biosciences	https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software	Collection of tools for flow cytometer and application setup, data acquisition, and data analysis
Benchling (Version: Web-based platform, continuous release)	Benchling, Inc.	https://www.benchling.com/	Sequence design software
SnapGene (Version: 8.0.1)	SnapGene, Inc.	https://www.snapgene.com/	Sequence design software