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Articolo metodologico

Flusso di lavoro ottimizzato per la visualizzazione delle superfici del lievito per l'evoluzione diretta delle proteasi

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DOI:

10.3791/72559

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4 agosto 2026

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1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Department of Biological Sciences, The University of Texas at Dallas, 3Center for Systems Biology, The University of Texas at Dallas

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro ottimizzato per l'evoluzione diretta delle proteasi virali in Saccharomyces cerevisiae utilizzando un sistema di selezione basato sulla visualizzazione delle superfici. Descrive la progettazione della libreria di inserti di DNA e della cassetta del substrato, l'elettroporazione ottimizzata per un'elevata efficienza di trasformazione, la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per la scindimento della proteasi e il sequenziamento di varianti arricchite.

Abstract

L'evoluzione diretta imita il naturale processo evolutivo in un ambiente di laboratorio rapido e controllato per evolvere proteine con funzioni o caratteristiche desiderabili. Lo screening di un ampio bacino di geni mutanti codificanti per proteine consente la selezione funzionale delle varianti desiderate per applicazioni in biotecnologia, medicina e biologia sintetica. Utilizzando questo protocollo, eseguiamo un'evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae per ingegnerizzare varianti proteasi con alta specificità per una sequenza di substrato non nativa. Mostriamo queste varianti proteasi sulla superficie cellulare del lievito per facilitare la selezione delle varianti desiderate tramite il filtraggio cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) su più cicli di arricchimento. Quattro elementi chiave della cassetta del substrato sono co-espressi con la libreria proteasi: una proteina di fusione composta da (i) la subunità del recettore di adesione del lievito Aga2, (ii) sequenze di selezione e (iii) contro-selezione del substrato, (iv) sequenze di tag epitopici e una sequenza opzionale di segnale di recupero del reticolo endoplasmatico (ER). Le cellule di lievito in cui è spezzata solo la sequenza del substrato di selezione vengono isolate utilizzando FACS multicolore tramite anticorpi anti-epitopi fluorescenti (marcati con isotiocianato di ficoeritrina/fluoresceina). Qui forniamo dettagli del protocollo ottimizzato passo dopo passo per condurre una campagna di evoluzione proteasi, inclusa la progettazione della libreria di inserimenti di DNA e la progettazione di cassette di substrato, l'elettroporazione delle cellule di lievito con alta efficienza di trasformazione (fino a10,9 trasformanti per microgrammo di DNA), la selezione, l'arricchimento e il sequenziamento basati su FACS di varianti evolute. Dimostriamo il nostro protocollo di evoluzione diretta evolvendo la proteasi di inclusione nucleare A (TEVp) del virus dell'incisione del tabacco (TEVp) dal taglio della sua sequenza naturale del substrato, ENLYFQ↓S, alla taglienza di una nuova sequenza, ENLYFE↓S.

Introduzione

Le proteasi cisteiniche della famiglia Potyviridae, in particolare le proteasi di inclusione nucleare A (NIa), rappresentano una fonte in gran parte inesplorata di endopeptidasi specifiche per sequenza. Con oltre 3.800 membri caratteristici della famiglia, le proteasi NIa tagliano una sequenza distinta di substrato composta da sette amminoacidi. La famiglia dei potyvirali offre un insieme diversificato di proteasi per ingegnerizzare sistemi di controllo proteico programmabili, costruire circuiti genetici ortogonali basati su proteasi e sviluppare strumenti biotecnologici specifici persequenza 1,2. Nonostante questa naturale diversità, solo due proteasi NIa, TEVp e proteasi del virus macchiato nelle vene del tabacco (TVMVp), sono state accuratamente caratterizzate e ingegnerizzate per un uso di laboratorio e biotecnologicodi vasta gamma 3,4. Questo toolkit limitato di proteasi limita lo spazio di progettazione per circuiti multicomponenti che richiedono attività proteasiortogonali 5, motivando così gli sforzi per espandere e caratterizzare ulteriormente le proteasi NIa attraverso l'evoluzionediretta 6,7.

La visualizzazione superficiale dei lieviti è emersa come una delle piattaforme più potenti per l'evoluzione diretta, permettendo lo screening ad alta produttività delle biblioteche proteiche tramite la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)6,7. Ad esempio, il sistema di screening del reticolo endoplasmatico del lievito (YESS) accoppia l'attività proteasi alla visualizzazione superficiale attraverso la via secretoria di S. cerevisiae 6,7. Il sistema YESS è stato applicato per ingegnerizzare nuove specificità proteasi-substrato e ha dimostrato utilità per campagne evolutive dirette su più round. In questo sistema, le varianti proteasi sono co-espresse con una proteina di fusione contenente una cassetta del substrato di scindimento con marcatori epitopici, e l'ancora superficiale Aga1p è espressa nel ceppo di lievito EBY100. La marcatura differenziale con anticorpi fluorescenti distingue le cassette a substrato non tagliate esposte sulla superficie cellulare. Questo meccanismo di visualizzazione dipendente dall'attività è direttamente compatibile con la selezione iterativa basata su FACS per librerie di 10,7 o piùvarianti 6,7.

Un prerequisito fondamentale per l'evoluzione diretta è la capacità di introdurre librerie varianti su scala sufficiente per ottenere una copertura adeguata dello spazio di sequenza target. Per librerie di mutagenesi a saturazione del sito che coprono più posizioni amminoacidiche, sono necessarie rese di trasformazione di 108 a 109 trasformanti unici per garantire che la diversità introdotta nella libreria sia ben rappresentata nella popolazione ordinata. Esistono diversi metodi per introdurre DNA esogeno in S. cerevisiae, ciascuno con limiti di capacità di produzione distinti. Il metodo convenzionale di trasformazione chimica utilizza acetato di litio/DNA portatore monofilato/glicole polietilenico (LiAc/ssDNA/PEG) grazie alla sua semplicità e accessibilità. Tuttavia, tipicamente raggiunge efficienze di trasformazione di soli 104–10unità formattrici di 6 colonie (CFU) per microgrammo di DNA, non raggiungendo la variazione di sequenza necessaria per grandi campagnebibliotecarie 8. Al contrario, il metodo di elettroporazione applica un campo elettrico ad alta tensione per permeabilizzare transitoriamente la membrana cellulare e facilitare l'assorbimento del DNA. L'elettroporazione raggiunge costantemente le più alte efficienze di trasformazione tra i metodi di trasformazione disponibili, con protocolli ottimizzati che riportano risultati di 108–109 CFU 9. È stato osservato che l'efficienza dell'elettroporazione in S. cerevisiae è criticamente sensibile alla fase di crescita cellulare, alla massa del DNA e alla composizione del tamponetto, fornendo un quadro che da allora è stato ampiamente adattato per l'evoluzione diretta su scaladi biblioteca 9.

Il protocollo descritto qui utilizza il ceppo di S. cerevisiae EBY100, un ceppo ospite ampiamente adottato per la visualizzazione superficiale del lievito. EBY100 è stato progettato da Boder e Wittrup integrando una cassetta di espressione AGA1 sotto il controllo del promotore GAL1 indotto dal galattosio nel locus cromosomico AGA1 dello ceppo parentale carente di proteasi BJ546510. La varietà è disponibile commercialmente presso l'ATCC (numero di catalogo MYA-4941; depositante K.D. Wittrup), portatore del genotipo MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). Di conseguenza, sia Aga1p che la fusione a cassetta Aga2p-substrato vengono espresse dallo stesso promotore indotto dal galattoso, assicurando che le due subunità siano co-indotte e si assemblino nel complesso Aga1p–Aga2p legato al disolfuro che ancora la fusione mostrata alla parete cellulare.

Nonostante l'uso diffuso di EBY100 nelle applicazioni di visualizzazione del lievito, nessun protocollo pubblicato è stato ottimizzato sistematicamente per elettroporare questo ceppo a rese su scala biblioteca. I parametri specifici di EBY100, come la fase ottimale di crescita al raccolto, la composizione del mezzo durante la sottocoltura e la relazione quantitativa tra densità ottica iniziale a 600 nm (OD600) ed efficienza di trasformazione, devono essere rigorosamente caratterizzati e ottimizzati. Qui, riportiamo che l'efficienza della trasformazione in EBY100 aumenta monotonamente con l'OD600 della coltura al raccolto, con cellule nella fase finale di logaritmia che producono tassi di trasformazione sostanzialmente più elevati rispetto a quelle raccolte nella fase logaritmica iniziale. Abbiamo valutato parametri critici del protocollo, inclusi i valori iniziali di OD600 all'inoculazione, l'uso di 2 × di mezzo di Estratto di Lievito Peptone Destrosio (YPD) per le sottocolture, formulazioni di tampone per elettroporazione e condizioni di crescita post-elettroporazione. Il protocollo qui presentato fornisce un flusso di lavoro ottimizzato passo dopo passo (Figura 1A–C, Figura 2, Figura 3A–D, Figura 4A–E) per preparare celle EBY100 elettrocompetenti ed eseguire elettroporazioni di librerie di DNA ad alta efficienza, con tassi di trasformazione costantemente superiori a 10,9 CFU. Per convalidare questo protocollo, abbiamo condotto una campagna completa di evoluzione diretta per ingegnerizzare TEVp con specificità di clivagge alterata su quattro cicli di selezione e arricchimento basati su FACS. Il sequenziamento di varianti arricchite di proteasi ha confermato una sostanziale diversificazione nei residui miri all'interno della tasca di legame del substrato della proteasi, dimostrando che il protocollo fornisce una copertura sufficiente dello spazio della sequenza per supportare campagne evolutive produttive. Questo protocollo sarà di ampia utilità per i ricercatori che utilizzano EBY100 per l'evoluzione diretta basata sulla visualizzazione della superficie del lievito e per lo screening ad alto rendimento compatibile con FACS di proteasi,anticorpi 9, chinasi11 e recettori12, tra le altre proteine.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti che hanno coinvolto S. cerevisiae ricombinanti sono stati condotti in conformità con le politiche e le procedure del Comitato per la Biosicurezza Istituzionale e la Sicurezza Chimica dell'Università del Texas a Dallas. I ceppi ricombinanti di lievito sono stati gestiti secondo il contenimento di Biosicurezza Livello 1 (BSL-1) in conformità con le pratiche microbiologiche istituzionali consolidate. Elettroporazione, coltura e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) sono state eseguite in conformità con le procedure di biosicurezza istituzionali approvate. Le colture di lievito e i consumabili contaminati sono stati decontaminati e smaltiti come rifiuti biopericolosi in conformità con le linee guida istituzionali.

1. Preparazione del vettore e dell'inserto

  1. Generazione di librerie di proteasi potyvirali tramite mutagenesi a saturazione del sito
    1. La progettazione utilizza software di progettazione di sequenze che sovrappongono oligonucleotidi diretti e inversi da 30 a 50 mer, per generare una libreria mutante di proteasi. Si sostituisce il codone di tipo selvatico nell'oligonucleotide corrispondente con un codone degenere NNS, dove N rappresenta A, T, G o C, e S rappresenta G o C, per le posizioni mirate alla mutagenesi.
    2. Progetta la sovrapposizione di 3′ tra ogni coppia di oligonucleotidi avanti e inversi con una temperatura di fusione (Tm) di 55–60 °C. Progettare il primo e l'ultimo oligonucleotidi in modo che contengano una sovrapposizione di 50 nt con il vettore di visualizzazione superficiale del lievito oltre i siti di restrizione.
    3. Assicurarsi che almeno un'estremità dell'inserto si sovrappone esattamente a un'estremità del vettore linearizzato per facilitare la ricombinazioneomologa 13. Evitare i vuoti tra oligonucleotidiadiacenti 14.
    4. Sospensa gli oligo a 100 μM con H2Odeionizzato. In un tubo sterile da 1,5 mL, si combinano 0,5 μL di ciascun oligo per un volume finale di 200 μL (concentrazione finale di 250 nM per ciascun oligo).
    5. Impostare una reazione PCR con i componenti elencati nella Tabella 1 per assemblare la libreria di proteasi, utilizzando le condizioni di termociclo nella Tabella 2.
    6. Impostare una seconda reazione PCR utilizzando gli oligo più esterni in direzione avanti e indietro (Tabella 3) utilizzando il primo prodotto PCR assemblato come modello. Amplifica il prodotto come mostrato nella Tabella 4.
    7. Eseguire il secondo prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% con bromuro di etidio (0,5 μg/mL) a 240 V per 30 minuti. Eliminare la banda corrispondente alla lunghezza attesa del DNA.
      NOTA: ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un mutageno e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione individuale (DPI) appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza. Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Smaltire gel, tamponi e materiali di consumo contenenti bromuro di etidio come rifiuti chimici pericolosi in conformità con le linee guida istituzionali di sicurezza.
    8. Purifica usando un kit di estrazione gel. Elute 50 μL di H2Odeionizzato.
    9. Misura la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Conservare il DNA a −20 °C.
      NOTA: Ogni reazione da 50 μL dellaseconda PCR produrrebbe circa 0,5–1,0 μg di DNA totale. Poiché ogni elettroporazione richiede 12 μg della libreria proteasi (cioè l'inserimento), si ingrandisce le reazioni di conseguenza.
  2. Assemblaggio della cassetta a substrato
    1. Prepara le piastre LB-agar e i mezzi liquidi LB-cloranfenicol. Vedi le ricette nella Tabella 5.
    2. Progettare un insieme di oligonucleotidi a 30 mer sovrapposti in direzione avanti e indietro per l'assemblaggio delle cassette del substrato. Progetta le estremità 5′ di ogni oligonucleotide inverso e l'oligonucleotide frontale del frammento successivo per abbinarle con 4 nucleotidi.
    3. Risospendere gli oligo liofilizzati a 100 μM usando H2Odeionizzato.
    4. Mescola i reagenti come nella Tabella 6.
    5. Usa il programma di ciclaggio nella Tabella 7 per ricottare e fosforilare la miscela oligo.
    6. Diluire gli oligo annealizzati 4 volte in H2Odeionizzato per raggiungere una concentrazione finale di 1,25 μM.
    7. Combinare la miscela di oligo annealed con il vettore (ad esempio, pDD1523), seguendo la Tabella 8.
    8. Esegui l'assemblaggio Golden Gate, seguendo il programma di ciclismo nella Tabella 9.
      NOTA: Ad esempio, il plasmide pDD1523 ha un sito di restrizione di tipo II (BsmBI) a valle del promotore GAL1/10. Un assemblaggio riuscito consente l'induzione al galattosio della cassettasubstrato 7.
    9. Trasforma il plasmide risultante in E. coli.
    10. Cellule a placca su agar LB con l'antibiotico corrispondente. Incubare per 16–18 ore a 37 °C.
    11. Scegli le colonie isolate e inoculale in 5 mL di mezzo LB. Incubare durante la notte (16–18 ore) a 37 °C con scuotimento (220 rpm).
    12. Estrae plasmidi da colture notturne utilizzando un kit miniprep per plasmidi.
    13. Misura la concentrazione del plasmide usando uno spettrofotometro, poi invia il sequenziamento.
  3. Linearizzazione del vettore di visualizzazione del lievito
    1. Linearizzare il plasmide di visualizzazione del lievito, ad esempio digerire pDD1524 con enzimi di restrizione SphI e PstI per preparare il vettore di visualizzazione del lievito contenente la cassetta substrato per l'elettroporazione. Mescola i reagenti elencati nella Tabella 10 e incuba a 37 °C per 1 ora.
    2. Fai funzionare il prodotto di digestione restrizionale su un gel di agarosio all'1% a 240 V per 30 minuti. Rimuovere la banda corrispondente alla lunghezza prevista del DNA e purificare utilizzando un kit di estrazione in gel.
      NOTA: Ogni digestione di restrizione da 50 μL produrrebbe circa 0,5–1,0 μg di DNA totale. Poiché ogni elettroporazione richiede 4 μg di vettore linearizzato, si ingrandisce di conseguenza le reazioni di digestione.

2. Elettroporazione

Nota: Segui le procedure di sicurezza istituzionale per la gestione di materiali biologici e reagenti, indossa DPI adeguati e smaltire i rifiuti biologici e chimici in conformità con le linee guida istituzionali.

  1. Preparazione di tamponi, lastre e mezzi (2 giorni prima dell'elettroporazione)
    1. Preparare il materiale di crescita (1 × YPD; 2 × YPD; Acidi Casamino Destrosio Sintetici, SDCAA+; e Acidi Casamino Galactosici Sintetici, SGCAA+), lastre (YPD e SDCAA), tampone di elettroporazione e acqua sterile seguendo le ricette della Tabella 5. Conserva a 4 °C.
  2. Preparazione di una lastra striata di EBY100.
    1. Stira il lievito EBY100 su agar YPD da una scorta di glicerolo. Coltiva a 30 °C per 2 giorni.
    2. Conserva il piatto a 4 °C dopo la crescita.
      NOTA: Una piastra striata rimane utilizzabile fino a 1 mese; Segna la data della striatura sulla targa.
  3. Preparazione della pre-coltura di EBY100 (1 giorno prima dell'elettroporazione)
    1. Prepara 125 mL di 1 × YPD in una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL.
    2. Prepara 25 mL di 1 × YPD in un tubo conico da 50 mL. Utilizzando una punta di micropipetta, raccogli cellule EBY100 dalla piastra coltivata per 2 giorni. Successivamente, trasferire le cellule del lievito dalla punta della pipetta al tubo conico contenente 1 × YPD.
      NOTA: La striscia di cellule dovrebbe formare una striscia di circa 1–2 mm di lunghezza.
    3. Rimuovi la punta della micropipetta e fai un vortice sul tubo conico per garantire una miscelazione adeguata.
    4. Prepreparare una pre-coltura da 150 mL trasferendo 25 mL di 1 × YPD contenente le cellule del lievito nella fiaschetta da 500 mL contenente 125 mL di 1 × YPD. Vortice per mescolare.
    5. Utilizzando uno spettrofotometro, misura l'OD600 preparando due microcuvette con un percorso di 1 cm: una con 1 mL di 1 × YPD come controllo a vuoto e un'altra con 1 mL della pre-coltura
    6. Coltivare 150 mL di pre-coltura durante la notte (16–20 ore) a 30 °C con oscillazioni orbitali a 270 giri al minuto.
  4. Preparazione della sottocoltura al livello inizialedesiderato 600 (il giorno dell'elettroporazione)
    1. Preparare il tampone di condizionamento e il mezzo di crescita esterna, come descritto nella Tabella 5.
    2. Misura il OD600 della pre-coltura notturna (OD₆₀₀ previsto è 17–22). Per rimanere nell'intervallo lineare dello spettrofotometro, misurare una diluizione 1:20 della pre-coltura.
    3. Calcola il volume di pre-coltura necessario per inoculare una sottocoltura da 100 mL. Si raccomanda una sottocultura iniziale OD600 di 3,0–4,0.
    4. Diluire la coltura al livello inizialedesiderato di 600 in 100 mL di 2 × YPD in una fiaschetta Erlenmeyer da 500 mL.
    5. Incubare la sottocultura da 100 mL a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min per 4 ore.
  5. Preparazione dei mezzi durante incubazioni di 4 ore
    1. Tieni pronti il tampone di elettroporazione gelato e l'acqua sterile (dal passo 2.1.1).
    2. Prepara il tampone di condizionamento (100 mL), seguendo la ricetta della Tabella 5. Usa 20 mL di buffer di condizionamento per ogni trasformazione; Scala di conseguenza. Conserva a temperatura ambiente (20–23 °C).
      NOTA: ATTENZIONE: Il buffer condizionante contiene ditiotreitolo (DTT) e acetato di litio (LiAc), che sono irritanti chimici che possono causare irritazione della pelle e degli occhi. Indossare DPI appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza, e maneggiare questi reagenti in conformità con le procedure istituzionali di sicurezza chimica. Smaltire le soluzioni inutilizzate e i tamponi esauriti come rifiuti chimici in conformità con le linee guida istituzionali.
    3. Preparare il mezzo di crescita (50 mL): Mescolare insieme 25 mL di 2 × YPD e 25 mL di 1 M di sorbitolo. Usa 8 mL di materiale di crescita per ogni trasformazione. Conserva a temperatura ambiente (20–23 °C).
  6. Preparazione delle cellule di lievito elettrocompetenti dopo incubazione di 4 ore.
    1. Dividere la sottocultura da 100 mL in due tubi conici da 50 mL. Raccogli le celle centrifugando a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decanta il mezzo. Tieni le celle sul ghiaccio fino al completamento del passaggio 2.6.4.
    2. Sospezione delicata di ogni pellet cellulare con 25 mL di acqua sterile ghiacciata. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decantare il substrato.
    3. Ripeti il passo 2.6.2.
    4. Sospendere delicatamente ogni pellet cellulare con 25 mL di tampone di elettroporazione gelato. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decantare il substrato.
    5. Rimuovere le cellule dal ghiaccio e risospendere delicatamente ogni pellet cellulare con 10 mL di tampone di condizionamento a temperatura ambiente (20–23 °C). Poi, si raccoglie in una singola fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL e si incuba a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min per 30 minuti.
    6. Versare le celle in un tubo da 50 mL. Centrifugare a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti. Scendere i media.
    7. Sospezione delicata del pellet cellulare con 50 mL di tampone di elettroporazione gelido. Centrifuga a 4 °C e 1.500 × g per 3 minuti, poi decanta il substrato.
    8. Risospendere il pellet cellulare a un volume finale di 1 mL aggiungendo circa 100–200 μL di buffer di elettroporazione. Tieni le cellule sul ghiaccio fino all'elettroporazione.
      NOTA: Le celle elettrocompetenti possono essere congelate (cioè poste in un congelatore a –80 °C) e utilizzate successivamente senza una significativa perdita di efficienza elettroporativa.
  7. Elettroporazione, crescita e placcatura
    1. Cuvette/e di elettroporazione pre-raffreddamento con una dimensione di 0,2 cm sul ghiaccio.
    2. Trasferire 380 μL del pellet sospeso in un tubo sterile da 1,5 mL. Mescola con 4 μg di DNA plasmidico oppure con 4 μg di vettore plasmidico linearizzato e 12 μg di inserto. Mescola delicatamente con la pipetta.
      NOTA: Per massimizzare il numero di cellule elettroporate, le concentrazioni di DNA vettore e inserito dovrebbero idealmente essere di 700–800 ng/μL. Se le concentrazioni sono inferiori, usa un concentratore a vuoto.
    3. Trasferire la sospensione nella cuvetta di elettroporazione pre-raffreddata. Resta sul ghiaccio per 5 minuti.
    4. Strofina i lati della cuvetta dopo 5 minuti con una salvietta da laboratorio senza pelucchi per eliminare l'umidità residua, che potrebbe causare archi durante l'elettroporazione. Evita bolle o celle sopra le piastre metalliche della cuvetta, poiché potrebbero anche causare archi elettrici. Per mantenere la temperatura fredda della cuvetta, non toccare gli elettrodi della piastra.
    5. Prepara 8 mL di mezzo di crescita in un tubo conico da 50 mL.
    6. Elettroporare le celle con le seguenti impostazioni: tensione di 2,5 kV, capacità di 25 μF e resistenza di 200 Ω9. L'intervallo di costante di tempo accettabile è di 2,8–4,5 ms.
      NOTA: ATTENZIONE: L'elettroporazione coinvolge impulsi elettrici ad alta tensione. Assicurati che le cuvette siano ben posizionate e segui le istruzioni operative del produttore. Smaltire le cuvette di elettroporazione usate come rifiuti biopericolosi secondo le linee guida istituzionali.
    7. Inondare immediatamente la cuvetta con circa 200 μL di mezzo di crescita dal tubo conico e trasferire le celle elettroporate nel tubo conico da 50 mL. Aggiungere altri 200–350 μL di mezzo di crescita finché non rimane più liquido visibile nella cuvetta.
    8. Incubare il tubo conico di 50 mL delle cellule elettroporate in 8 mL di mezzo di crescita a 30 °C senza scuotere per 1 ora. Inverti il tubo ogni 15 minuti per mescolare.
    9. Prendere le celle tramite centrifugazione a 1.500 × g, 25 °C per 3 minuti. Poi decantare i media.
    10. Risospendere le cellule in un substrato di dropout di lievito appropriato per mantenere la selezione delle cellule trasformate. Per i plasmidi contenenti il marcatore di selezione TRP1, si risospendono le cellule in 250 mL di SDCAA+ (che non contiene triptofano) per recuperare selettivamente il lievito che ha mantenuto il plasmide.
    11. Incubare durante la notte (16–20 ore) a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri al minuto.

3. Induzione, colorazione e selezione citometrica a flusso delle cellule del lievito

  1. Induzione della libreria proteasi e della cassetta substrato (1 giorno prima dello smistamento)
    1. Misura OD600 come nello step 2.4.2 dopo la crescita notturna dei trasformanti nei mezzi dropout.
    2. Aliquota 12 mL di trasformanti di lievito e centrifuga a 3.200 × g per 5 minuti.
    3. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di induzione SGCAA+ a un OD600 di 0,5. Calcola il volume di risospensione richiesto usando l'equazione di diluizione, C1V1 = C2V2.
    4. Trasferire in una fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL e far crescere durante la notte per 18–24 ore a 30 °C con vibrazioni orbitali a 270 giri/min.
  2. Colorazione con anticorpi fluorescenti (il giorno dello smistamento)
    1. Misura OD600 di cellule post-induzione. Usa due cuvette: una con 1 mL di SGCAA+ e l'altra con 950 μL di SGCAA+ mescolato con 50 μL di celle. Moltiplica il valore misuratodi OD 600 per 20 per ottenere il vero OD600 delle celle post-induzione.
    2. Normalizzare ogni campione a 3 × 107 cellule per la colorazione degli anticorpi e la selezione FACS. Usare C1V1 = C2V2 per calcolare il volume di celle da trasferire dalla fiaschetta di induzione.
      NOTA: Per la mutagenesi di saturazione NNS a quattro siti, la dimensione teorica della libreria è di 10a 6 varianti. Per campionare sufficientemente la libreria, scherma almeno 10 volte la dimensione della libreria, ovvero 10celle da 7 . Esempio: se desideratoC 1V1 = 3 × 107 celle e C2 = post-induzione OD600 di 6 (cioè 6 × 107 celle/mL), allora aliquota 500 μL di celle indotte (cioè, V2 = 3 × 107 celle / 6 × 107 celle/mL = 500 μL).
    3. Trasferire il volume calcolato delle celle in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti.
    4. Rimuovere il surnatant e risospendere in 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) + 0,5% albumina bovina (BSA).
    5. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti e ripetere il passo 3.2.4.
    6. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti, e nel frattempo completare il passaggio 3.2.7.
    7. Prepara una miscela di colorazione anticorpale in un tubo da 1,5 mL contenente anti-HA fluoresceina isotiocianato (FITC) (0,5 μg/107 cellule), anti-FLAG ficoeritrina (PE) (0,05 μg/10 7 cellule) e PBS + 0,5% di BSA (100 μL/107 cellule). Tieni il tubo sul ghiaccio.
    8. Rimuovi il surnatiante e risospendi con la miscela di macchie. Usa 300 μL della miscela di colorante ogni 3 × 107 celle. Non fare un vortice sul tubo; Solo invertendo o facendo un flick.
    9. Tieni le celle sul ghiaccio al buio per 1 ora dopo la rispensione.
  3. Lavaggio post-macchia
    1. Centrifuga le cellule colorate a 5.000 × g per 5 minuti. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet in PBS contenente lo 0,5% di BSA usando 0,5 mL ogni 1 ×10 7 celle (ad esempio, 500 μL per 1 × 107 celle o 1,5 mL per 3 × 107 cellule).
    2. Centrifuga a 5.000 × g, 5 minuti. Rimuovere il soprantantante, risospesdere in 750 μL di PBS + 0,5% di BSA.
    3. Trasferire altri 750 μL di PBS + 0,5% di BSA in un tubo di raccolta da 10 mL.
  4. FACS
    1. Esegui l'avvio e la preparazione necessaria del citometro per un nuovo esperimento.
    2. Crea tre dot-plot. Nel primo dot-plot, seleziona il nome dell'asse X per mostrare il canale dell'area di scatter frontale (FSC-A) e il nome dell'asse Y per mostrare il canale dell'area di scattering laterale (SSC-A).
      NOTA: Questo faciliterà la selezione delle cellule vive.
    3. Mantieni il nome dell'asse X per visualizzare il canale FSC-A mentre si cambia il canale dell'asse Y per mostrare l'altezza di diffusione diretta (FSC-H) sul secondo dot-plot.
      NOTA: Questo faciliterà la selezione dei singoli.
    4. Seleziona il nome dell'asse X per visualizzare il canale PE e il nome dell'asse Y per mostrare il canale FITC sul terzo dot-plot.
    5. Esegui il controllo negativo sul citometro utilizzando i canali 530/30 nm (FITC) e 585/42 nm (PE). Eseguire la selezione utilizzando un ugello da 70 μm a una pressione di guaina di 70 psi. Acquisire campioni a una velocità di 4000–5000 eventi/s.
    6. Disegna una porta poligonale attorno alla popolazione principale di cellule di lievito intatte per escludere detriti e piccole particelle con segnali bassi di FSC-A e SSC-A nel primo dot-plot (FSC-A contro SSC-A).
    7. Singole gate su un grafico FSC-H contro FSC-A all'interno di questa porta, selezionando la popolazione lineare che mostra una relazione proporzionale tra FSC-H e FSC-A. Escludere gli eventi che si discostano dalla distribuzione lineare e corrispondono a doppietti e aggregati di celle.
      NOTA: Il terzo dot-plot per PE rispetto a FITC mostrerà un gruppo diagonale di punti per il controllo negativo (cioè, cellule di lievito che esprimono la cassetta del substrato intatto).
    8. Preleva i campioni e seleziona le cellule di lievito in base ai valori desiderati di PE/FITC in un tubo di raccolta (o più tubetti). Analizzare un numero totale di celle corrispondenti ad almeno 10 volte la dimensione teorica della libreria per garantire una rappresentazione adeguata di tutte le varianti (ad esempio, analizzare ~1 × 107 celle per una libreria con diversità teorica di ~1 × 106 varianti).
    9. Posiziona la porta di ordinamento sotto la diagonale PE/FITC della popolazione di controllo negativa.
      NOTA: Porte più rigide migliorano l'arricchimento delle varianti desiderate ma riducono il recupero cellulare.
  5. Dopo il FACS
    1. Tubo di raccolta centrifuga a 3.200 × g per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il surnatante, lasciando 1 mL, e risospendere 5 mL di PBS.
      NOTA: Lasciare 1 mL di sovrantante, poiché la pellet cellulare sul fondo non sarà visibile dopo la centrifugazione.
    2. Centrifuga ancora a 3.200 × g per 5 minuti. Rimuovi il soprandante, lasciando 1 mL. Risospendere con 4 mL di SDCAA+.
    3. In una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL, aggiungi 15 mL di SDCAA+. Trasferire le celle sospese dal passaggio 3.5.2 in questa fiaschetta.
    4. Incubare durante la notte per 18–24 ore a 30 °C con oscillazioni orbitali a 270 giri al minuto.
    5. Ripeti i passaggi 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 per ogni ciclo di evoluzione diretta.

4. Recupero e sequenziamento dei plasmidi di singoli cloni

  1. Coltivare colonie individuali
    1. Creare un stock di glicerolo mescolando 500 μL della coltura liquida dopo il passaggio 3.5.4 e 500 μL di glicerolo sterile al 50%, ottenendo una soluzione di stock di glicerolo al 25%. Vortice per mescolare accuratamente le cellule.
    2. Conserva nel congelatore a -80 °C durante la notte. Per la conservazione a lungo termine, trasferire nell'azoto liquido.
    3. Raschiare il calcio di glicerolo usando una punta sterile da 1000 μL e mescolarlo in 100 μL di SDCAA+. Impiatta questa miscela su una piastra SDCAA e incubala capovolta a 30 °C.
    4. Raccogli le colonie dopo 3 giorni e coltivale durante la notte in 1,5 mL di SDCAA+ in tubi da 14 mL.
  2. Esegui un miniprep di lievito per estrarre i plasmidi
    1. Pelletare la coltura notturna centrifugando a 16.000 × g per 1 minuto e risospendere 200 μL di Soluzione 1 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito.
    2. Aggiungi 5 μL di soluzione enzimatica litica (5 U/μL).
    3. Incubare in un incubatore a 37 °C per 4 ore su un mixer end-to-end.
    4. Esegui un ciclo di congelamento-scongelamento congelando a -80 °C per 20 minuti e scongelando a 42 °C per 10 minuti in un bagno d'acqua.
    5. Aggiungi 200 μL di Soluzione 2 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito, mescola invertendo 2–3 volte e lascia riposare per 5 minuti.
    6. Aggiungi 400 μL di Soluzione 3 da un kit di purificazione per plasmidi di lievito e mescola invertendo 2–3 volte. Centrifuga a 16.000 × g per 5 minuti.
    7. Purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit di purificazione con una colonna di alta capacità di legame al DNA.
      NOTA: A causa della grande quantità di DNA genomico di lievito tagliato proveniente dalle cellule lisate, è necessario utilizzare una colonna a base di silice con maggiore capacità di legame al DNA (35 μg) invece di una colonna di purificazione del DNA plasmidico del lievito a capacità inferiore (5 μg)15.
    8. Misura la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro. Le rese di DNA sono di 10–30 ng/μL.
  3. Trasformano plasmidi purificati in cellule di E. coli chimicamente competenti
    1. Prepara il substrato SOC, seguendo la ricetta nella Tabella 5, e i piatti di LB-cloranfenicole. Inoltre, preriscalda un bagno d'acqua a 42 °C.
    2. Riscalda una piastra di LB-cloranfenicolo per ogni plasmide a 37 °C per 20 minuti.
    3. Estrai un tubo di celle chimicamente competenti dal congelatore a –80 °C e scongelalo sul ghiaccio.
    4. Aliquota 30 μL di cellule competenti per ogni plasmide in un tubo da 1,5 mL su ghiaccio.
    5. Pipetta 3 μL di plasmide in cellule competenti. Passa un po' per mescolare e lascia riposare per 5 minuti sul ghiaccio.
    6. Esegui lo shock termico incubando brevemente le cellule nel bagno d'acqua a 42 °C per 40 secondi.
    7. Incubare sul ghiaccio per 2 minuti.
    8. Aggiungere 300 μL di mezzo SOC alle cellule e incubare per 15 minuti a 37 °C a 220 giri/min.
    9. Placca 50–100 μL di celle competenti trasformate su piastre preriscaldate.
    10. Incubare le piastre a 37 °C capovolte per 18 ore.
  4. Raccolta delle colonie
    1. Aggiungi 5 mL di substrato LB-cloranfenicole liquido a tubi di coltura da 14 mL a fondo rotondo.
    2. Scegli una colonia usando una punta sterile da 1000 μL e immergila in un tubo di coltura.
    3. Posizionare i tubi in uno shaker (220 giri/min, angolo 30°–45° per massimizzare l'aerazione) a 37 °C per 18 ore.
  5. Estrazione dei plasmidi da colture liquide batteriche
    1. Centrifuga le colture liquide a 3.200 × g per 4 minuti. Fai decant il soprantantante.
    2. Estrarre i plasmidi dalle colture notturne utilizzando un kit di purificazione dei plasmidi.
    3. Misurare la concentrazione dei plasmidi purificati utilizzando uno spettrofotometro.
  6. Invia plasmidi per il sequenziamento
    NOTA: Utilizzare servizi come il sequenziamento dei nanopori a plasmidi interi o, in alternativa, il sequenziamento Sanger con un primer che affianca la regione mutagenizzata.

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Risultati

La costruzione efficiente delle biblioteche è fondamentale per garantire una copertura adeguata dello spazio mutazionale. Per evitare la perdita di rare varianti funzionali, il numero di trasformanti dovrebbe raggiungere almeno il 10×-100× la dimensione teorica della libreria. Poiché l'efficienza di trasformazione in S. cerevisiae è influenzata dalla concentrazione cellulare ed è più alta nelle celle di faselogaritmica iniziale-media 16, abbiamo ottimizza...

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Discussione

L'evoluzione diretta è un metodo ad alto rendimento che utilizza cicli iterattivi di diversificazione e selezione per identificare proteine con funzione biochimica potenziatao nuova 17. In questo protocollo, dettagliamo un flusso di lavoro ottimizzato per evolvere il riconoscimento proteasi-substrato utilizzando un sistema di visualizzazione cella-superficie in S. cerevisiae. Il sistema di visualizzazione superficiale mappa l'attività proteasi a un fenoti...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto. I dati grezzi che supportano questo protocollo, inclusi file FASTQ per sequenziamento nanopore, file di citometria a flusso (FCS) e dati sorgente usati per generare le figure e tabelle, e plasmidi pDD1523 e pDD1524, sono stati depositati in Zenodo e sono disponibili pubblicamente al numero 10.5281/zenodo.20746804

Ringraziamenti

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Dingal per i loro consigli, la loro esperienza e le discussioni. Ringraziamo inoltre l'UTD Flow Cytometry Core per l'infrastruttura e il supporto. L'M.B.L. è sostenuto dalla Borsa di Studio per Laureati Eugene McDermott della UTD. Questa ricerca è stata finanziata da un UTD Startup Fund e da premi dei National Institutes of Health-NIGMS al laboratorio del P.C.D.P.D. (R35GM150967).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
10 mM dNTP MixNEBN0447SReazioni PCR (Tavole 1, 3)
10X PBS, pH 7.4FisherBP3994Buffer base per colorazione (Passaggi 3.2–3.3)
5X Q5 Reaction BufferNEBB9027SVenduto separatamente; incluso anche con la polimerasi Q5
Agar, BactoBD Difco281230-500gPiatti di agar SDCAA (Tabella 5); 15 g/L
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagentsBP160-500Elettroforesi su gel
Anti-FLAG PE AntibodyBioLegend637309Colorazione FACS; anti-FLAG PE-coniugata
Anti-HA Tag Antibody [FITC]GenScriptA01621Colorazione FACS; anti-HA FITC-coniugata
Bacto Casamino AcidsBD Difco223120Media SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tabella 5); 5 g/L
Bacto Peptone / TryptoneRPIT60060-10000.0Preparazione media LB/SOB; 20 g/L in YPD (Tabella 5)
BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction VSigma-Aldrich126575-10GM0,5% in PBS; buffer di colorazione (Passaggi 3.2–3.3)
BsmBI-v2 (200 U)NEBR0739SMontaggio Golden Gate del soggetto cassette (Tabella 8)
Calcium chloride solution (1M)Sigma-Aldrich21115-100mLBuffer per elettroporazione: 1 mM finale (Tabella 5)
ColiRollers® Plating BeadsSigma-Aldrich71013-3Sterilizzare mettendo in bottiglie di reagenti e autoclavare a 121ºC, 15 psi, per 15 minuti.
D-GalattosioThermo FisherA12813.30250 g; 20% w/v stock per induzione SGCAA+ (Tabella 5)
D-SorbitoloThermo Fisher1327300.10Buffer per elettroporazione (1 M) e media di crescita (Tabella 5)
Dextrosio (D-Glucosio), anidroSigma-AldrichG8270-1KGYPD, SDCAA+, 20% w/v destrosio stock (Tabella 5)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino AcidsSigmaY0626-250G6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabella 5)
Difco YPD Broth (pre-misto)BD242820-500gYPD pre-confezionato alternativo; 500 g
DL-Dititreitolo (DTT)Sigma-AldrichD0632-1GBuffer di condizionamento: 10 mM finale; aliquotare 250 μL, conservare −20°C
E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification KitOmega Bio-tekD6492-02Pulizia del prodotto PCR
E.Z.N.A. Gel Extraction KitOmega Bio-tekD2500-01Purificazione del gel post-PCR e digestione con restrizione (Passaggi 1.1.8, 1.3.2)
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-tekD6942-02Purificazione del plasmide (Passaggio 4.2)
Glicerina (≥99%)FisherBP229-4Stock al 50% v/v per stock in glicerolo (Passaggio 4.1.1)
Kanamycin SulfateFisherBP906-5SDCAA+ e SGCAA+: 50 μg/mL finale; sostituisce Sigma K0879-5G
KLD Enzyme MixNEBM0554SKinase-Ligase-DpnI; mutagenesi diretta dal sito
KLD Reaction BufferNEBB0554AUsato con KLD Enzyme Mix
LB Broth (Lennox)Sigma-AldrichL3022-1KGColtura liquida E. coli
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc·2H2O)Thermo FisherA17921.30Buffer di condizionamento: 0,1 M finale; aggiungere prima del DTT (Tabella 5)
Luria Agar (Luria-Bertani Agar)RPIL24020-2000.0Piatti di E. coli; sostituisce Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG
OmniPur Casamino AcidsSigma2240-500GMAlternativa casamino acidi
pDD1523Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP
pDD1524Zenodo10.5281/zenodo. 20746804pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS
Penicillin-Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-CISDCAA+, SGCAA+: 1X finale
PstI-HF (5000 U)NEBR3140SLinearizzazione del vettore (Tabella 10); utilizzare la versione HF
Q5 HF DNA PolymeraseNEBM0492SPolimerasi ad alta fedeltà; alternativa a Q5 Hot Start
Q5 High GC EnhancerNEBB9028APer reazioni PCR ad alto contenuto GC
Q5 Hot Start DNA PolymeraseNEBM0491LMontaggio e amplificazione PCR (Tavole 1, 3)
rCutSmart Buffer (10X)NEBB6004SFornito con PstI-HF e SphI-HF (Tabella 10)
SalI-HFNEBR3138LEnzima di restrizione aggiuntivo
SOC MediumNEBB9020SRecupero post-trasformazione
Sodium Chloride (NaCl)FisherS271-1Preparazione media LB / SOB
Sodium Hydroxide (NaOH)FisherS318-500Aggiustamento del pH

Riferimenti

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