Piattaforma in inchiostro sacrificale stampata in 3D per l'imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule endoteliali in vasi tortuosi e aneurismi

Sommario

Il protocollo descrive come progettare e assemblare vasi sanguigni in vitro con segmenti tortuosi o aneurismatici, utilizzando una stampante per estrusione oppure applicando manualmente un inchiostro sacrificabile pastorizzato, e come eseguire saggi per il flusso emodinamico e le risposte delle cellule endoteliali.

Abstract

La tortuosità vascolare e gli aneurismi rappresentano rischi sanitari significativi in vari tessuti umani e tipi di vasi sanguigni. Queste alterazioni della forma del vaso causano anomalie nella dinamica del flusso sanguigno, che influenzano notevolmente la funzione endoteliale. I modelli animali di queste condizioni vascolari hanno fornito utili indicazioni in alcuni casi, ma sono costosi da realizzare e limitati alla fisiologia della specie animale utilizzata. A fronte di ciò, i modelli in vitro tridimensionali di organo-su-un-circuito (OOC) si sono affermati come un potente strumento per valutare la funzione vascolare e le risposte endoteliali in cellule umane. Sebbene ciascun modello OOC presenti dei punti di forza, è necessario un sistema accessibile per lo studio della permeabilità del vaso, un indicatore chiave della funzione vascolare nei vasi curvi e negli aneurismi sotto condizioni fisiologiche di shear rate e pressione. Qui, la metodologia presentata consente lo studio delle risposte delle cellule endoteliali umane alle anomalie del flusso in un modello di vaso curvo economico, realizzato mediante una bioprinter entry-level, che produce vasi compatibili con velocità fisiologiche del flusso fluido, studi di permeabilità, microscopia ottica ad alta risoluzione e supporto della matrice extracellulare con rigidità fisiologica.

Introduzione

La morfologia dei vasi sanguigni è un importante indicatore della funzionalità vascolare, poiché la tortuosità vascolare e gli aneurismi rappresentano segni distintivi chiave di diverse malattie e rischi per la salute. La tortuosità vascolare può essere congenita, come nei sindromi di Marfan¹, di Turner² e di Loeys-Dietz³, oppure può svilupparsi in età avanzata come caratteristica distintiva di diverse patologie, tra cui ipertensione, diabete, cancro e possibilmente aterosclerosi^4,5,6. Gli aneurismi dei tessuti arteriosi, inclusi quelli delle arterie carotidea⁷, coronaria⁸, femorale⁹, aortica¹⁰ e cerebrale¹¹, sono associati a morbosità e rischi per la salute a causa di dissezione spontanea o rottura. Oltre a causare irregolarità del flusso e correlata infiammazione endoteliale, la tortuosità vascolare e gli aneurismi possono indicare una disfunzione tissutale e un'infiammazione sottostante. Ad esempio, nei neonati e nei bambini, il sindrome da tortuosità arteriosa è clinicamente predittivo di ictus infantile¹², ipertensione polmonare persistente e dissezione aortica^4,13. Negli adulti, la vasculite retinica si presenta con vasi retinici tortuosi che tendono a ridursi man mano che l'infiammazione sottostante si risolve¹⁴. Il modo in cui la tortuosità viene percepita e tradotta in segnali anomali che guidano il decorso della malattia rimane un argomento attivo di ricerca. Si ritiene che le cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni agiscano come sensori primari in questo processo. Un flusso alterato o lento indotto dalla tortuosità vascolare o dagli aneurismi modifica lo stress di taglio, inducendo cambiamenti endoteliali nella segnalazione infiammatoria¹⁵ e nella funzione di barriera¹⁶. Le cellule endoteliali sono altamente sensibili al flusso fluido attraverso meccanismi che coinvolgono ciglia primarie¹⁷, proteine di adesione meccanosensibili^18,19 e canali ionici^20,21, che attivano segnalazioni in grado di indurre perdite, infiammazione e riprogrammazione endoteliale^22,23,24. Pertanto, metodi per lo studio delle risposte endoteliali alla geometria vascolare tortuosa sono importanti per lo sviluppo di terapie vascolari.

Le funzioni endoteliali nelle patologie vascolari sono state modellate utilizzando modelli animali in vivo, sistemi organ-on-a-chip (OOC) e approcci di biostampa. I modelli murini permettono il controllo dell'espressione di geni noti associati alla malattia e includono la complessità dell'architettura tissutale e della fisiologia, compresi il coinvolgimento delle cellule murali e di quelle immunitarie. I modelli murini di aterosclerosi²⁵, sindrome di Marfan²⁶ e vari aneurismi^27,28,29 forniscono informazioni sulle patologie associate alla disfunzione vascolare. Nonostante questi vantaggi, l'osservazione diretta, la manipolazione sperimentale e la quantificazione delle cellule endoteliali risultano difficili da ottenere, a parte metodi complessivi come il sequenziamento dell'RNA. Inoltre, i modelli animali sollevano considerazioni etiche ed economiche e sono limitati dalla fisiologia specifica della specie.

Sono stati sviluppati diversi approcci in vitro basati su organi su chip (OOC) per studiare le risposte endoteliali umane al flusso laminare e disturbato^30,31,32 sia in sistemi 2D^33,34 che 3D^35,36,37. L'ampia letteratura sugli OOC³⁸ è stata principalmente guidata dall'ingegneria biomedica, con caratteristiche progettuali mirate a rispondere a specifiche domande biomediche. Molti modelli vascolari su chip utilizzano supporti in polidimetilsilossano (PDMS) per controllare l'architettura dei vasi³⁸. Questi modelli permettono un controllo ad alta risoluzione di geometrie complesse e consentono la modellizzazione delle interazioni tra organi e sistema vascolare, inclusi fegato³⁹, cervello⁴⁰ e polmone⁴¹. Tuttavia, permangono alcune limitazioni. La bassa permeabilità del PDMS e di polimeri simili alle macromolecole può ostacolare lo studio della funzione della barriera vascolare. Inoltre, la maggior parte dei PDMS polimerizzati presenta una rigidità di circa 0,8–10 MPa⁴², sebbene formulazioni alternative possano raggiungere intervalli più fisiologici di 8–200 kPa⁴³. Le stime della rigidità della membrana basale vascolare variano da ~350 Pa⁴⁴ a ~70 kPa⁴⁵, a seconda del tipo di vaso e della metodologia di misura, con la maggior parte delle membrane basali vascolari sane comprese nell'intervallo 2–3 kPa⁴⁶. Poiché malattie vascolari come l'aterosclerosi e l'ipertensione sono in parte associate a un aumento della rigidità della matrice extracellulare (ECM)^{47,48,49,50,51}, e le cellule endoteliali rispondono alla rigidità dell'ECM, il controllo della rigidità entro intervalli fisiologici è fondamentale nei modelli in vitro. Approcci OOC più recenti utilizzano substrati fisiologici che permettono geometrie complesse^52,53, incorporano diversi tipi cellulari per riprodurre la funzione d'organo^{39,54,55,56,57}, oppure interazioni immuno-vascolari⁵⁸, modellano strutture vascolari specifiche del paziente^59,60 e supportano lo sviluppo preclinico di farmaci^61,62. In molti modelli microvascolari che coinvolgono interazioni con altri tipi cellulari, le cellule endoteliali formano spontaneamente vasi con geometrie relativamente non controllate⁶³. Al contrario, i sistemi OOC che permettono geometrie vascolari definite sotto flusso controllato richiedono spesso infrastrutture ingegneristiche, materiali ed esperienza specialistica significative^53,64. Sono pertanto necessari metodi robusti accessibili anche a non esperti, per facilitare lo studio del comportamento delle cellule vascolari in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Le piattaforme di bioprinting compatibili con idrogeli di matrice extracellulare fisiologici forniscono modelli in vitro versatili per lo studio della funzione endoteliale attraverso diverse geometrie vascolari⁶⁵. Questi approcci utilizzano o il deposito guidato di idrogeli contenenti cellule endoteliali a forma di vaso sanguigno⁶⁶ oppure un inchiostro sacrificale per generare lumi tubolari aperti incapsulati nella matrice extracellulare, che successivamente può essere sciolto, lasciando un lume che può essere seminato con cellule endoteliali⁵⁴. Sostegni di matrice extracellulare biologicamente compatibili, tra cui gelatina, collagene e fibrina, possono essere modulati in modo da ottenere rigidità simili a quelle della membrana basale vascolare (1–3 kPa⁶⁷) e permettono saggi di permeabilità vascolare analoghi a quelli impiegati in vivo. Sebbene questi approcci non raggiungano la stessa risoluzione di forma e dimensione della fabbricazione in PDMS, è possibile generare vasi curvi, ramificati e stenotici^52,66,68. Tali piattaforme sono quindi particolarmente adatte per modellare geometrie vascolari, inclusi vasi tortuosi ed aneurismatici.

Il metodo qui presentato utilizza un approccio di stampa 3D basato sull'estrusione pneumatica, sul posizionamento tridimensionale a scala micrometrica, sul controllo termico del piatto di stampa e della testina stampante contenente l'inchiostro, e su un inchiostro sacrificabile precedentemente sviluppato per studiare interazioni renali-vascolari su un chip^67,69. L'inchiostro sacrificabile viene stampato con la geometria vascolare desiderata ed immediatamente incorporato nella matrice extracellulare (ECM). Un successivo cambio di temperatura rimuove l'inchiostro, lasciando un lume aperto nell'ECM che viene poi seminato con cellule endoteliali umane. L'ECM di base è composta da gelatina e fibrina, consentendo una rapida gelificazione e la polimerizzazione del fibrinogeno mediata dalla trombina, oltre a fornire una rigidità meccanica adatta a molte membrane basali vascolari. Altri componenti dell'ECM, come la laminina o la fibronectina, possono essere aggiunti per riprodurre meglio la composizione della membrana basale vascolare^70,71,72 e favorire l'adesione endoteliale. Il sistema viene assemblato in camere Rose riutilizzabili⁷³, contenenti supporti metallici, guarnizioni in gomma siliconica e coprioggetti per microscopio ad alta risoluzione, permettendo il collegamento a una pompa per fluidi tramite aghi Luer-lock. In alternativa, le piastre superiore e inferiore possono essere realizzate mediante stampa 3D utilizzando acido polilattico o materiali rinforzati con fibra di carbonio. Il sistema assemblato resiste alle pressioni generate da flussi fisiologici. Una procedura di pastorizzazione migliora inoltre la sterilità dell'inchiostro sacrificabile senza alterarne le proprietà fisiche. Inoltre, un approccio basato su un modello a ago e su bioinchiostro permette la realizzazione di vasi lineari contenenti un'aneurisma, senza l'uso di una bioprinter. I vasi risultanti, dotati di endotelio e con geometria tortuosa o aneurismatica, possono essere analizzati sotto flusso fisiologico mediante microscopia ottica ad alta risoluzione per circa una settimana, consentendo lo studio delle risposte endoteliali acute a variazioni della geometria vascolare.

Un vantaggio fondamentale di questo sistema è la compatibilità con la microscopia ottica. I vasi generati in vitro utilizzando questo protocollo possono essere analizzati con diverse modalità di imaging e sono particolarmente adatti alla microscopia a fluorescenza confocale a disco rotante o a scansione laser. Nella scelta delle condizioni di imaging, è necessario considerare la risoluzione spaziale e temporale, la sensibilità e la distanza di lavoro dell'obiettivo. Per la maggior parte dei vasi generati con questo sistema, l'obiettivo deve avere una distanza di lavoro sufficiente per raggiungere una profondità di circa 100–300 µm rispetto al coprioggetto e per immaginare il punto medio del vaso. Sono richiesti obiettivi ad alta apertura numerica per ottenere immagini ad alta risoluzione di strutture endoteliali, inclusi organelli e adesioni cellulari, e per l'imaging in tempo reale che richiede un'elevata risoluzione temporale, come il tracciamento di microsfere di riferimento in condizioni di flusso. Alcuni saggi che richiedono una cattura fotonica meno efficiente, come le misurazioni della barriera endoteliale basate sulla fluorescenza, possono essere eseguiti utilizzando obiettivi ad apertura numerica più bassa, ad esempio obiettivi a immersione d'aria 10–20×.

Il protocollo descrive la generazione di vasi tortuosi e aneurismatici composti da cellule endoteliali umane in un sistema in vitro che supporta un flusso fisiologico di fluidi e la microscopia ad alta risoluzione. Il flusso di lavoro comprende la progettazione dei vasi, la fabbricazione della camera, la preparazione e la stampa 3D dell'inchiostro sacrificabile, la preparazione della matrice extracellulare e la rimozione dell'inchiostro, la semina e la coltura delle cellule endoteliali sotto flusso, la valutazione della permeabilità vascolare, la mappatura del flusso e la colorazione mediante immunofluorescenza (Figura 1).

Protocollo

1. Progettare il contenitore

1. Selezionare un segmento vascolare che si adatti all'interno della camera compatibile con il microscopio. Per una camera di Rose, mantenere non più di 1,6 cm tra i serbatoi di ingresso e di uscita.
2. Importare l'immagine di angiografia TC con contrasto (Figura 2A), angiografia con risonanza magnetica o angiografia fluoroscopica in ImageJ/FIJI o in un altro programma di analisi delle immagini.
3. Utilizzare lo strumento di misurazione puntuale per definire le coordinate XY lungo il centro assiale del vaso. Esportare le coordinate in un programma di foglio elettronico (Figura 2B).
   NOTA: i file STL derivati da angiografia TC possono essere importati direttamente nella maggior parte dei software per stampanti; tuttavia, la stampa basata su poligoni potrebbe richiedere più passaggi e produrre vasi intrecciati (Figura supplementare 1). Utilizzare G-code diretto per la stampa in un singolo passaggio. Per questo motivo, si preferisce la mappatura delle coordinate e la progettazione in G-code. Vedere l'esempio di G-code nei File supplementari.
4. Modificare le coordinate XY nel foglio elettronico in modo da posizionare il centro del vaso all'origine grafica. Importare il contorno della camera, se necessario, per verificare che la stampa finale rientri all'interno della camera.
5. Utilizzare le coordinate XY del vaso per progettare il vaso nel primo strato di stampa (Figura 2C). Impostare l'altezza del primo strato, comprensivo del vaso e dei serbatoi di ingresso e di uscita adiacenti, a 200µm.
6. Creare serbatoi di ingresso e di uscita che permettano un agevole inserimento dell'ago. Utilizzare serbatoi a forma di diamante quando opportuno per indirizzare in modo efficiente il flusso verso l'ingresso del vaso, minimizzando le turbolenze in entrata (Figura 2).
7. Includere i serbatoi nel primo strato di stampa in modo che rimangano adiacenti al vaso. Aggiungere 5–9 strati sopra lo strato di base per garantire un volume sufficiente per posizionare gli aghi di ingresso e di uscita. Per la progettazione in G-code, i seguenti dettagli sono importanti:
   1. Impostare la testina di stampa e il piano di stampa, quando è disponibile il controllo della temperatura, a 37°C utilizzando il software della stampante o i comandi G-code appropriati all'inizio del file di stampa.
   2. Specificare la testina di stampa o l'estrusore nel G-code quando sono disponibili più testine di stampa. Configurare il G-code per utilizzare coordinate assolute e distanze di estrusione assolute.
   3. Regolare l'altezza dello strato in base alle dimensioni e alla forma dell'ago, alla pressione del flusso dell'inchiostro e alla velocità della testina di stampa. Utilizzare un'altezza dello strato di 200µm per ogni strato dei serbatoi al di sopra del primo strato negli esempi descritti qui.
   4. Utilizzare una pressione di controspinta di 14–17 psi e una velocità della testina di stampa di 6 mm/s (G-code: F360) per i serbatoi. Aumentare la velocità della testina di stampa a 15 mm/s (G-code: F900) per il vaso.
8. Testare ogni nuova progettazione del vaso su un vetrino senza camera prima di stampare il vaso finale.

2. Preparare l'inchiostro sacrificale

1. Aggiungere 2,1 g di polietilene ossido (PEO) a 60 mL di acqua sterile fredda per preparare una soluzione al 3,5% p/v in un contenitore sterile con coperchio contenente una barretta magnetica sterile. Mescolare a 4°C per almeno 48 ore, verificando periodicamente che tutta la polvere si sia sciolta.
   NOTA: Conservare la soluzione di PEO in un contenitore ermetico a 4°C per un massimo di 1 mese.
2. Aggiungere 17,5 g di Pluronic F-127 a 50 mL di acqua sterile fredda per preparare una soluzione al 35% in un contenitore sterile con coperchio contenente una barretta magnetica sterile. Mescolare a 4°C per almeno 48 ore e verificare periodicamente l'incorporazione completa della polvere.
3. Mescolare 11,4 mL di PEO freddo al 3,5% con 28,6 mL di Pluronic F-127 freddo al 35% in un tubo conico sterile da 50 mL. Mescolare per almeno 24 ore a 4°C su un agitatore rotativo.
4. Posizionare il tubo in posizione verticale a 4°C per tutta la notte per permettere alle bolle di risalire fuori dalla soluzione.
5. Collocare il tubo contenente l'inchiostro in un bagno termico e incubare a 63°C per 3 ore. Lasciare il tappo leggermente aperto durante il riscaldamento per consentire all'aria espansa di fuoriuscire.
6. Rimuovere il tubo dal bagno termico e lasciarlo raffreddare gradualmente a temperatura ambiente. Chiudere ermeticamente il tappo dopo che la soluzione si è raffreddata.
7. Porre l'inchiostro pastorizzato sul ghiaccio per 2 ore, agitando delicatamente di tanto in tanto senza introdurre bolle.
8. Rimuovere lo stantuffo della siringa, chiudere il portello dell'ago e riempire la siringa al 60%–70% della sua capacità. Inserire lo stantuffo, capovolgere la siringa, rimuovere il tappo del portello dell'ago ed espellere tutta l'aria intrappolata.
   NOTA: Conservare le siringhe riempite a temperatura ambiente per un massimo di 1 mese.

3. Costruire la camera a rosa e preparare l'impianto idraulico

1. Realizzare le piastre di serraggio superiore e inferiore in alluminio oppure stamparle in 3D utilizzando i file CAD/STL forniti (Figura 2). Includere un foro inferiore smussato sufficientemente ampio per consentire l'accesso a obiettivi con elevata apertura numerica e un bordo di supporto per le viti che comprimano saldamente le coprioggetti contro la guarnizione.
   NOTA: L'alluminio garantisce un migliore trasferimento termico durante la microscopia con piattaforma riscaldata. Le parti in PLA stampate in 3D o rinforzate con fibra di carbonio sono adatte per la prototipazione, ma possono avere un minore trasferimento termico e tendere a deformarsi con riscaldamenti ripetuti.
2. Tagliare il foglio di silicone in modo che corrisponda alle piastre di serraggio di dimensioni 38 mm × 51 mm. Creare la finestra centrale di osservazione utilizzando un punzone da 18 mm.
3. Praticare fori adatti al diametro delle viti selezionate. Sciacquare abbondantemente la guarnizione finita con acqua per rimuovere i residui di silicone.
4. Autoclavare le piastre di serraggio in metallo, le viti, i dadi e le guarnizioni di silicone in un sacchetto chiuso in foglia di alluminio utilizzando un ciclo asciutto di 20 min.
5. Immergere le piastre stampate in 3D in etanolo al 70% per 1 min. Asciugare le piastre in un ambiente sterile.
6. Preparare spezzoni di tubo della lunghezza di 10–30 cm dotati di connettori Luer-lock, pinze per tubo in linea, tubo compatibile con pompa peristaltica, un rubinetto a tre vie, un smorzatore di pulsazioni e un serbatoio per il mezzo a due porte (Figura 3).
7. Sterilizzare i componenti del tubo e del serbatoio resistenti al calore mediante autoclave. Sterilizzare i componenti non adatti all'autoclave mediante esposizione all'etanolo.

4. Preparare i reagenti della matrice extracellulare

1. Aggiungere 12,5 mL di PBS caldo a 37°C a 1 g di fibrinogeno plasmatico umano per preparare una soluzione madre all'80 mg/mL. Incubare a 37°C e agitare delicatamente di tanto in tanto senza vortexare.
2. Lasciare sciogliere il fibrinogeno per 1–2 h, fino a formare una soluzione torbida. Aliquotare la soluzione in provette sterili e conservare a −20°C per un massimo di 3 mesi.
3. Aggiungere 22,5 g di gelatina a 135 mL di PBS sterile in una bottiglia sterile contenente una barretta magnetica. Mescolare per 16 h a 70°C, agitando periodicamente la bottiglia per garantire una completa dissoluzione.
4. Regolare il pH della soluzione di gelatina a 7,5 utilizzando NaOH 1 M. Filtrare sotto vuoto la soluzione ancora calda, aliquotarla e conservarla a 4°C per un massimo di 6 mesi.
   NOTA: Lasciare la gelatina in ammollo (bloom) per almeno 16 h prima della filtrazione. Mantenere la soluzione e l'apparato di filtrazione a 37°C durante la filtrazione sotto vuoto per ridurre al minimo l'intasamento del filtro.
5. Sciogliere la trombina plasmatica umana in PBS sterile fino a ottenere una concentrazione di 1.000 U/mL. Mescolare delicatamente, aliquotare e conservare a −20 °C per un massimo di 1 anno.
6. Sciogliere 300 mg di transglutaminasi in 5 mL di PBS e incubare a 37°C per 1 h con mescolamento occasionale. Filtrare sterilmente la soluzione in una provetta pulita e mantenerla a temperatura ambiente.
   NOTA: Preparare la soluzione di transglutaminasi fresca ogni giorno. Conservare la transglutaminasi in polvere in condizioni disidratate a 4°C.
7. Sciogliere il cloruro di calcio in acqua per preparare una soluzione 1 M. Filtrare sterilmente la soluzione e conservarla a temperatura ambiente per un massimo di 1 anno.

5. Preparare e attivare le piastrine di copertura

1. Immergere coprioggetti puliti nell'etanolo, quindi passarli con attenzione attraverso la fiamma di un becco Bunsen per evaporare l'etanolo.
   ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile. Tenere l'etanolo in quantità elevate lontano dalla fiamma aperta ed eseguire la sterilizzazione alla fiamma seguendo le opportune procedure di sicurezza antincendio di laboratorio.
2. Posizionare i coprioggetti in una griglia in acciaio inossidabile senza provocare crepe o scheggiature al vetro.
3. Immergere i coprioggetti in silano (3-aminopropil) trimetossisilano al 0,5% diluito in acqua per 30–60 min a temperatura ambiente. Applicare un'agitazione delicata durante l'incubazione.
   ATTENZIONE: Manipolare il (3-aminopropil) trimetossisilano utilizzando idonei dispositivi di protezione chimica e controlli ingegneristici.
4. Lavare i coprioggetti con sei ricambi di acqua con agitazione delicata. Evitare che i coprioggetti si stacchino durante il trasferimento della griglia.
5. Rimuovere la griglia dall'acqua, asciugare l'acqua in eccesso e asciugare a 50°C per 30 min.
6. Lasciare raffreddare i coprioggetti a temperatura ambiente mentre si prepara il glutaraldeide allo 0,5% in PBS.
   ATTENZIONE: Il glutaraldeide è tossico e irritante. Preparare e manipolare la soluzione in una cappa chimica adeguata indossando dispositivi di protezione personale idonei.
7. Incubare i coprioggetti nel glutaraldeide allo 0,5% per 60 min con agitazione delicata per minimizzare l'accumulo di bolle e favorire un'attivazione uniforme.
8. Risciacquare i coprioggetti con tre ricambi di acqua sterile e lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente.
   NOTA: Conservare i coprioggetti attivati sotto vuoto in un essiccatore per un massimo di 2 mesi.

6. Rivestire i coprioggetti con lo strato basale della matrice extracellulare

1. Riscaldare 1× PBS, soluzione madre di gelatina e soluzione madre di fibrinogeno a 37°C per 30–60 minuti.
2. Rivestire una piastra di Petri sterile da 15 cm con parafilm pulito, spruzzare la superficie con etanolo al 70%, eliminare l'eccesso e lasciare asciugare all'aria nella cappa biosicura.
3. Aggiungere in sequenza a un tubo conico da 15 mL: 1,68 mL di PBS caldo, 2,5 mL di soluzione madre di gelatina, 12,5 µL di CaCl₂ 1 M, 625 µL di soluzione madre di fibrinogeno e 167 µL di soluzione di transglutaminasi.
4. Collocare la miscela di matrice extracellulare (ECM) in un bagnomaria a 37°C per 30 minuti.
5. Preparare un tubo da 1,7 mL contenente 5 µL di soluzione madre di trombina per ogni coverslip.
6. Aggiungere 400 µL della preparazione di ECM al tubo con trombina e mescolare aspirando e dispensando una volta con la pipetta, minimizzando la formazione di bolle.
7. Dispensare immediatamente 200 µL della miscela sul parafilm sterile e posizionare un coverslip attivato sulla goccia usando pinzette. Premere delicatamente per ottenere una copertura completa.
   NOTA: Completare questo passaggio entro circa 20 secondi dall’unione della miscela di ECM con la trombina.
8. Coprire la piastra di Petri e incubare i coverslip rivestiti per 10 minuti a temperatura ambiente, seguiti da 2 ore a 37°C in un incubatore umidificato.
9. Staccare delicatamente ogni coverslip dal parafilm piegando il parafilm lontano dal coverslip.
10. Posizionare i coverslip appena rivestiti con il lato del gel rivolto verso l’alto in una piastra di Petri pulita, all’interno di un incubatore umidificato, e utilizzarli entro 1 giorno.
11. In alternativa, incubare i coverslip rivestiti tutta la notte in un incubatore non umidificato e utilizzarli entro 2 giorni.

7. Biostampa l'inchiostro sacrificabile e incapsulalo nella matrice extracellulare (ECM)

1. Eseguire stampe di prova prima di stampare il vaso per verificare che l'inchiostro e i parametri di stampa producano le dimensioni desiderate del vaso. Caricare il file di stampa nel software della stampante.
   NOTA: Un ago dispensatore conico da 32 G con inchiostro di Pluronic F127 al 25% e PEO all'1% produce in modo affidabile diametri di vasi fino a circa 150 µm nelle condizioni descritte qui. Ottimizzare la velocità della testina di stampa e la contropressione utilizzando semplici stampe lineari su vetro.
2. Assemblare la piastra di bloccaggio inferiore, il coverslip inferiore rivestito con matrice extracellulare (ECM), la guarnizione in silicone, la piastra di bloccaggio superiore senza il coverslip superiore e le due viti. Posizionare l'assemblaggio in una piastra di Petri da 100 mm coperta e mantenerlo a 37 °C fino all'uso nella stessa giornata.
3. Collegare l'ago di stampa alla siringa contenente l'inchiostro e installare la siringa nella stampante a estrusione pneumatica. Preriscaldare il piano di stampa, la testina di stampa e una piastra riscaldante adiacente a 37 °C.
4. Preparare la matrice ECM come descritto nella Sezione 6 e mantenerla in un bagno termico a 37 °C. Preparare 1,5 mL di matrice per ogni camera Rose in lotti da 5 mL.
5. Aggiungere 5 µL di soluzione madre di trombina in un tubo sterile da 1,7 o 2 mL per ogni camera. Tenere a disposizione ulteriori coverslip attivati e non rivestiti all'interno della cappa a sicurezza biologica.
6. Posizionare la camera contenente il coverslip rivestito con ECM sulla piattaforma della stampante e centrarla sull'origine XY. Abbassare l'ago fino a quando non tocca la superficie di ECM o vetro al centro della finestra della camera e definire questa posizione come origine XYZ.
7. Sollevare l'ago e applicare la pressione massima per riempirlo completamente di inchiostro ed espellere eventuali bolle visibili. Pulire la punta dell'ago con un fazzoletto sterile da laboratorio.
8. Stampare la geometria del vaso e del serbatoio utilizzando il file G-code caricato. Sollevare immediatamente l'ago e rimuovere la camera dopo la stampa.
9. Esaminare il vaso stampato alla ricerca di bolle e discontinuità. Scartare e ristampare qualsiasi struttura che presenti uno di questi difetti.
10. Posizionare la camera sulla piastra riscaldante a 37 °C, rimuovere le viti e la piastra di bloccaggio superiore e mescolare 1 mL di matrice ECM preparata con l'aliquota di trombina mediante un singolo pipettaggio.
11. Trasferire la miscela di ECM attivata nella camera del vaso senza introdurre bolle e posizionare immediatamente un coverslip attivato con la faccia rivolta verso il basso sopra l'ECM. Riposizionare la piastra di bloccaggio superiore e serrare le viti fino a quando non sono ben strette, senza sovraccaricarle.
12. Posizionare la camera completata in una piastra di Petri da 100 mm coperta e incubare a 37 °C per 2 h.

8. Generare un aneurisma utilizzando un modello di filo metallico

1. Inserire aghi da 21 gauge attraverso i lati opposti della guarnizione in silicone e allinearli.
2. Sonicare un filo guida medico in acciaio inossidabile 304 con diametro di 0,0190 pollici in PBS contenente l’1% di BSA in un tubo conico da 15 mL. Rimuovere il filo e lasciarlo asciugare all’aria in una piastra di Petri sterile all’interno di un armadio a sicurezza biologica.
3. Fare passare il filo rivestito con BSA attraverso entrambi gli aghi nella guarnizione (Figura 2). Piegarne leggermente un’estremità sporgente per facilitare la successiva rotazione.
4. Autoclavare l’insieme composto da guarnizione, aghi, filo e piastra di fissaggio racchiuso in un contenitore di carta stagnola.
5. Posizionare l’insieme ago/guarnizione sopra un’immersione attivata e rivestita con matrice extracellulare (ECM).
6. Montare un ago da 21 G su una siringa contenente inchiostro di Pluronic/PEO pastorizzato.
7. Dispensare una piccola goccia di inchiostro sacrificiale sul lato del filo al centro della camera. Applicare una piccola goccia di inchiostro a ogni giunzione tra ago e filo per creare una tenuta.
8. Preparare la miscela di matrice extracellulare (ECM) e assemblare la camera come descritto nei paragrafi 7.10–7.12.
9. Dopo che l’ECM ha gelificato, ruotare delicatamente l’estremità piegata del filo per staccarlo dall’ECM e dall’inchiostro sacrificiale. Estrarre lentamente il filo dal dispositivo.
10. Riempire l’ago di ingresso con PBS utilizzando una pipetta da 200 µL e lasciare defluire il PBS attraverso il lume. Ripetere una volta e procedere al paragrafo 9.

9. Lavare l'inchiostro sacrificale dalla camera del vaso

1. Collegare un tubo a un serbatoio contenente PBS freddo (4 °C) integrato con antibiotici, inserire un rubinetto a tre vie ed estendere il tubo con un connettore maschio Luer-lock e un ago sterile da 23 G.
2. Riempire il tubo di alimentazione con PBS freddo utilizzando la siringa collegata al rubinetto finché il PBS non esce dal lume dell'ago. Chiudere il tubo con una molletta.
3. Riempire un secondo tratto di tubo con PBS e terminarlo con un ago da 23 G. Chiudere il tubo con una molletta e rimuovere la siringa di riempimento.
4. Inserire l'ago di alimentazione attraverso la guarnizione nel serbatoio di ingresso e l'ago di drenaggio nel serbatoio di uscita. Verificare il posizionamento corretto utilizzando un microscopio invertito o un stereomicroscopio.
5. Trasferire l'insieme a 4 °C e posizionare il serbatoio di alimentazione a 30 cm sopra l'ingresso. Posizionare l'uscita a 5–10 cm al di sotto dell'ago di uscita del vaso, sopra un contenitore per rifiuti.
6. Sganciare le mollette ed eseguire il lavaggio con almeno 250 mL di PBS freddo attraverso la camera. Controllare il sistema per perdite e bolle durante il lavaggio.

10. Rivestire e pretrattare la parete luminale del vaso con ulteriori componenti della matrice extracellulare

1. Diluire la fibronectina a 20 µg/mL, la laminina a 10 µg/mL o la matrice della membrana basale a un rapporto di diluizione 1:30 in 3 mL di PBS.
2. Aggiungere transglutaminasi appena preparata al reagente ECM diluito.
3. Lasciare il tubo immediatamente prossimale al vaso collegato all'ingresso e all'uscita.
4. Iniettare lentamente la soluzione di ECM/transglutaminasi attraverso il vaso utilizzando una siringa da 1 mL. Ripetere fino a quando tutti i 3 mL sono passati attraverso il vaso.
5. Chiudere con morsetto i connettori, tappare l'ingresso e l'uscita con tappi Luer sterili e incubare a 37 °C per 1 ora fino a tutta la notte.
6. Sciacquare il vaso con 100 mL di mezzo endoteliale completo contenente penicillina/streptomicina. Chiudere con morsetto i connettori del tubo e tappare le uscite.
   NOTA: Conservare il vaso riempito con mezzo a 4 °C per un massimo di 1 settimana. Assicurarsi che non rimangano bolle all'interno della cavità.

11. Cellularizzare il vaso

1. Incubare la camera contenente il modello del vaso ECM a 37 °C per 2 h. Riscaldare il mezzo endoteliale completo contenente penicillina/streptomicina a 37 °C.
2. Trasformare enzimaticamente le cellule endoteliali da una piastra da coltura da 10 cm o da un’ampolla T75, e neutralizzare la tripsina con mezzo completo. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL e prelevare un’aliquota per il conteggio cellulare.
3. Centrifugare le cellule a 1.000 × g per 5 min. Risospendere il pellet per preparare 150 µL di sospensione cellulare a 5 × 10⁶ cellule/mL.
4. Collegare il tubo di uscita a un serbatoio sterile per rifiuti e mantenere la pinza sul tubo chiusa.
5. Scollegare il tubo di ingresso e rimuovere il mezzo residuo dall’estremità del connettore di ingresso. Tenere il vaso in posizione verticale e pipettare la sospensione cellulare nel connettore.
6. Aprire la pinza di uscita per permettere alla sospensione cellulare di entrare nel vaso. Chiudere nuovamente la pinza di uscita dopo che l’intera sospensione è entrata nella cavità.
7. Aggiungere mezzo completo riscaldato al connettore di ingresso, quindi chiuderlo con un tappo Luer sterile. Scollegare e tappare l’uscita.
8. Incubare la camera in posizione normale a 37 °C per 3 h.
9. Ripetere i punti 11.5–11.8 e incubare la camera capovolta a 37 °C per 3 h.
10. Sciacquare delicatamente il vaso con 1 mL di mezzo completo e incubare a 37 °C per 3 h.
11. Verificare l’adesione endoteliale mediante microscopia, risciacquare delicatamente via le cellule non aderenti con mezzo fresco e incubare a 37 °C per 12–24 h.

12. Coltivare il vaso in condizioni di flusso

1. Riscaldare 200 mL di mezzo completo per 1 h e sottoporlo a degasaggio sotto vuoto utilizzando un’unità di filtro sterile. Riscaldare nuovamente il mezzo in un incubatore umidificato con CO₂.
2. In una cappa a sicurezza biologica sterile, collegare in sequenza l’uscita del serbatoio del mezzo, il rubinetto a tre vie, il tubo della pompa, l’ammortizzatore di impulsi, il trappola per bolle opzionale, il tubo di ingresso, la camera del vaso, il tubo di uscita e il tubo di ritorno al serbatoio del mezzo (Figura 3).
3. Priming dell’intero circuito di flusso con il mezzo, verificando l’assenza di bolle o sacche d’aria.
   NOTA: Riempire di liquido i connettori e i raccordi degli aghi prima del ricollegamento. La formazione di bolle d’aria all’interno di un vaso cellularizzato può causare la perdita di cellule endoteliali a causa di brusche forze di taglio.
4. Trasferire l’assemblaggio in un incubatore a 37 °C e avviare un flusso di 1 dyn/cm² nel vaso. Mantenere questo flusso per 12 h.
5. Aumentare il flusso fino a ottenere 12–16 dyn/cm² e mantenerlo per 18–24 h prima di eseguire i saggi successivi. Per calcolare il flusso necessario per il proprio vaso, determinare la lunghezza del vaso stampato e il diametro medio. Utilizzando un calcolatore online, inserire i parametri determinati, selezionare una sezione trasversale circolare, un mezzo con siero al 10% e una resistenza trascurabile dei tubi (i tubi hanno un diametro molto maggiore rispetto al vaso stampato).
   NOTA: Utilizzare il vaso il più presto possibile dopo il condizionamento al flusso. Una coltura prolungata oltre 1 settimana può causare lacune tra le cellule endoteliali, potenzialmente associate a perdita cellulare o modifiche della matrice extracellulare da parte di proteasi endoteliali.

13. Eseguire il saggio di perdita vascolare

1. Aggiungere BSA marcata con Alexa 647 o dextrano da 10 kDa marcato con Alexa 647 a 35 mL di mezzo completo per ottenere una concentrazione finale di 5 mg/mL. Riscaldare la soluzione a 37 °C.
2. Preincubare il vaso con l'agente in prova, ad esempio 250 ng/mL di TNFα, per 1–2 h e includere lo stesso agente nel mezzo del saggio.
3. Preparare un bagno termico a 37 °C e posizionare la pompa vicino al microscopio. Accendere il microscopio, il software di acquisizione e il sistema di riscaldamento del palchetto, quindi equilibrare il palchetto a 37 °C per 30 minuti prima dell'acquisizione delle immagini.
4. Fermare il flusso nell'incubatore, scollegare la riserva di mezzo di coltura e trasferire la camera e i tubi collegati sul palchetto del microscopio preriscaldato.
5. Collegare la pompa a circa 20 cm di tubo munito di una micropipetta di vetro contenente mezzo non marcato. Inserire il tubo della micropipetta nel mezzo del tracciante fluorescente e posizionare il tubo di uscita in un contenitore di raccolta.
6. Impostare la pompa in modo da ottenere una portata corrispondente a 0,2 mL/min e non avviare il flusso finché l'acquisizione delle immagini non è pronta.
7. Mettere a fuoco la linea mediana del vaso utilizzando l'immagine in contrasto di fase e passare al canale di fluorescenza 647. Avviare il flusso alla portata stabilita nella Sezione 13.6 e acquisire immagini ogni 1–5 minuti in base al tempo di risposta previsto.
8. Generare cromogrammi a partire dalle immagini acquisite e interpolare un coefficiente angolare lineare ai valori di intensità sogliati. Riportare la perdita come la distanza in µm percorsa dal tracciante dalla superficie esterna del vaso per minuto.

14. Mappare il flusso del fluido

1. Vortexare le microsfere fluorescenti da 10 µm per 1 minuto, quindi sottoporle a sonificazione in un bagno ad ultrasuoni per 1 minuto. Diluire le microsfere fino a una concentrazione di 1,8 × 10⁵ microsfere/mL in 10 mL di mezzo completo.
2. Configurare il sistema di flusso sul palchetto del microscopio come descritto nella Sezione 13 per il saggio di perdita vascolare. Includere un recipiente di raccolta per l'effluente e impostare la portata a 0,2 mL/min.
3. Mettere a fuoco il piano centrale del vaso utilizzando un obiettivo con una distanza di lavoro adeguata. Acquisire le immagini alla frequenza massima praticabile consentita dal tempo di esposizione, dalla sensibilità del rivelatore, dall'intensità di eccitazione e dall'efficienza di raccolta della luce.
4. Analizzare la sequenza di immagini in time-lapse utilizzando un software di velocimetria a immagini di particelle.

15. Fissare e immunomarcare il vaso endotelializzato

1. Preparare 40 mL di paraformaldeide al 4% in PBS contenente 10 mM CaCl₂ e 10 mM MgCl₂.
   ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossica. Preparare e manipolare soluzioni contenenti paraformaldeide in una cappa chimica adeguata indossando dispositivi di protezione individuale idonei.
2. Fermare il flusso, chiudere il tubo di ingresso con una pinza, scollegarlo dalla pompa e collegarlo al tubo di aspirazione utilizzato per il saggio di perdita vascolare. Inserire il tubo di aspirazione nel fissativo e lasciare passare 35 mL attraverso il vaso per gravità.
3. Chiudere il tubo con una pinza e incubare il vaso nel fissativo a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Svuotare il vaso per gravità con 25 mL di buffer di permeabilizzazione contenente 0,4% di Triton, 20 mM PIPES a pH 6,1, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA e 5,5 mM glucosio. Chiudere il tubo con una pinza e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Svuotare il vaso con buffer di blocco contenente 1% di BSA, 0,05% di Tween 20, 20 mM Tris a pH 7,4, 140 mM NaCl e 5 mM KCl. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente oppure durante la notte a 4 °C.
6. Diluire l'anticorpo primario selezionato da 1:50 a 1:500 in 100–500 µL di buffer di blocco. Rimuovere il tubo di ingresso e introdurre la soluzione anticorpale utilizzando la procedura descritta nella Sezione 11 per la semina cellulare.
7. Incubare il vaso durante la notte a 4 °C.
8. Ricollegare il tubo di ingresso e svuotare il vaso con 20 mL di PBS.
9. Diluire gli anticorpi secondari appropriati da 1:200 a 1:1.000 nel buffer di blocco e, se necessario, aggiungere la falloidina fluorescente in rapporto 1:250. Introdurre la soluzione utilizzando la procedura descritta nella Sezione 15.6 e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
10. Svuotare il vaso con 40 mL di PBS, chiudere le pinze sui tubi e tappare i tubi.
    NOTA: Conservare il vaso colorato a 4 °C e acquisire le immagini entro 2 settimane.
11. Colorare l'F-actina con falloidina fluorescente, l'apparato di Golgi con anti-GM130 e i nuclei con DAPI.
12. Analizzare le immagini della falloidina utilizzando FibrilTool⁷⁴ per determinare l'orientamento medio delle fibre di stress dell'F-actina.
13. Determinare l'asse tra i centri di massa di ciascun nucleo e l'apparato di Golgi. Analizzare e rappresentare graficamente gli orientamenti risultanti mediante software di calcolo numerico come precedentemente descritto⁷⁵.

Risultati

L'uso di inchiostri sacrificali per stampare diversi tipi di tessuti tubulari è stato ampiamente dimostrato da diversi gruppi, in particolare dal laboratorio di Lewis, che ha realizzato tubuli renali insieme a vasi sanguigni^67,76. Approcci simili sono stati impiegati per stampare strutture alveolari⁷⁷ e tumori vascolarizzati⁷⁸. In questo studio, tali approcci sono stati adattati per generare geometrie vascolari atte a studiare le risposte endoteliali sotto flusso fisiologico (Figura 2). Le geometrie dei vasi sono state convertite a partire da un'immagine vascolare in una mappa di coordinate e successivamente in codice G per definire il percorso di stampa (Figura 2A–C). L'approccio risultante ha permesso la fabbricazione di modelli vascolari per studiare come la funzione endoteliale e l'organizzazione del citoscheletro siano alterate da vasi tortuosi e aneurismi (Figura 2D–G). È stato inoltre integrato un design della camera Rose stampabile in 3D, eliminando la necessità di ricorrere a servizi di tornitura (Figura 2H). Un esempio di file di codice G per la stampa dei vasi è fornito nel File Supplementare 1, mentre i corrispondenti file CAD per la camera Rose e per il supporto da montare sullo stage sono disponibili rispettivamente nel File Supplementare 2 e nel File Supplementare 3. La stampa basata su file STL può richiedere più passaggi della testina di stampa, producendo geometrie vascolari intrecciate con lumi separati (Figura Supplementare 1). La piattaforma risultante è stata progettata per essere accessibile a biologi cellulari specializzati nei vasi sanguigni, anche con competenze minime in bioingegneria, pur supportando pressioni e portate fisiologiche e consentendo l'accesso a microscopia ad alta risoluzione (Figura 2I).

Dopo la fabbricazione del vaso e la sua cellularizzazione, il dispositivo vascolare è stato integrato in un sistema di perfusione a circuito chiuso per consentire una circolazione controllata del mezzo (Figura 3). Il sistema era composto da una pompa peristaltica, un rubinetto a tre vie collegato a una siringa di spurgo, un trappola per bolle, un smorzatore di impulsi, il dispositivo vascolare e un serbatoio del mezzo disposti in sequenza all'interno del circuito di flusso (Figura 3A). Questa configurazione ha permesso al mezzo di circolare in modo continuo attraverso il vaso ingegnerizzato, integrando al contempo componenti per lo spurgo del sistema, la rimozione delle bolle e l'attenuazione delle pulsazioni generate dalla pompa peristaltica. Il sistema assemblato poteva essere utilizzato con il dispositivo vascolare posizionato all'interno dell'apparato sperimentale, come mostrato in Figura 3B, fornendo una configurazione pratica per la successiva perfusione dei vasi cellularizzati in condizioni di flusso controllato.

Una modifica agli approcci precedentemente descritti per gli inchiostri sacrificali è stata la pastorizzazione dell'inchiostro prima della stampa. Questa modifica si è resa necessaria perché l'applicazione dei protocolli pubblicati per la preparazione dell'inchiostro portava a colture contaminate da muffe. Come per altri inchiostri a base di Pluronic utilizzati per questa applicazione, l'inchiostro composto da Pluronic F127 al 25% e PEO all'1% rimane liquido a basse temperature e passa a uno stato gel micellare compatto con l'aumento della temperatura. Questa formulazione presenta una temperatura di transizione di 15 °C, il che risulta conveniente per la creazione di strutture a temperature di incubatore e per la rimozione dell'inchiostro a 4 °C. Analogamente al Pluronic puro, questo materiale mostra un notevole comportamento di thinning sotto sforzo al taglio alla temperatura di stampa (Figura 4A). Tuttavia, anche a basse temperature, l'inchiostro risulta troppo viscoso per la sterilizzazione tramite filtrazione con filtri standard per colture cellulari e vuoto. Sebbene l'inchiostro possa essere sterilizzato mediante pastorizzazione a 70 °C o superiore per 20 s, queste temperature alterano irreversibilmente l'inchiostro e ne riducono la viscosità alla temperatura di stampa (dati non mostrati). Una pastorizzazione a temperatura più bassa e durata maggiore, a 63 °C per >1 h, riduce la contaminazione da funghi e altri microrganismi senza alterare la viscosità complessa dell'inchiostro a temperature adatte alla stampa. La caratterizzazione reologica effettuata con un reometro dotato di geometria cono-piastra da 25 mm ha mostrato che l'inchiostro grezzo e quello pastorizzato presentano viscosità simili in un intervallo di velocità di deformazione alle temperature di stampa (Figura 4B), dimostrando che la pastorizzazione non compromette la stampabilità. L'inchiostro pastorizzato consente inoltre colture vascolari a lungo termine senza la necessità di impiegare farmaci antimicotici, che potrebbero alterare la funzione endoteliale.

Una volta che il vaso è cellularizzato, le cellule endoteliali confluenti dovrebbero rivestire l'intero vaso, come mostrato nella Figura 5, con la proiezione di massima intensità nella Figura 5A e la sezione trasversale nella Figura 5B. Il flusso del mezzo può quindi essere aumentato fino a raggiungere valori fisiologici di sforzo di taglio, che possono essere stimati per vasi approssimativamente circolari utilizzando l'equazione di Hagen-Poiseuille⁷⁹. In pratica, la portata necessaria per ottenere uno sforzo di taglio desiderato può essere stimata tenendo conto della viscosità del mezzo e della resistenza microfluidica. In una tipica coltura 2D in vitro, un flusso del mezzo di 12 dyn/cm² induce la maggior parte dei tipi di cellule endoteliali a orientarsi lungo l'asse del flusso. Questa risposta può essere visualizzata mediante colorazione con falloidina fluorescente dell'F-actina (Figura 5D,E) o mediante l'analisi dell'asse Golgi-nucleo (Figura 5D,F), entrambi i quali mostrano un orientamento anisotropo coerente con la polarizzazione endoteliale, come descritto in precedenza¹⁸. Sebbene sforzi di taglio superiori a 40 dyn/cm² si verifichino in vivo, tali condizioni non sono state modellate in questo caso.

Una conseguenza importante della geometria alterata dei vasi è la variazione del flusso del fluido, a cui le cellule endoteliali rispondono attraverso diversi percorsi di segnalazione^80,81. Sono disponibili diverse metodiche per monitorare la velocità del flusso sanguigno, tra cui l’ecografia Doppler 4D⁸², la risonanza magnetica a flusso 4D⁸³ e l’imaging laser a speckle⁸⁴. Sebbene queste tecniche offrano importanti vantaggi in vivo, può risultare difficile risolvere le differenze locali di flusso all’interno di un singolo vaso. L’elevata apertura numerica dell’imaging fornita da questa piattaforma consente il tracciamento diretto di particelle fluorescenti (Figura 6B) e la mappatura ad alta risoluzione spaziale delle anomalie di flusso indotte dalla curvatura del vaso mediante la velocimetria basata su immagini di particelle (Figura 6C). Ad esempio, si osserva un flusso più lento lungo la curvatura interna del vaso rispetto a quella esterna (Figura 6C), il che potrebbe contribuire a modificare le risposte endoteliali⁸⁵.

Una volta stabilito un vaso confluito, la pervietà e la funzione di barriera possono essere valutate perfondendo macromolecole marcate con fluorocromo, come destrani o proteine, attraverso la luz. I vasi pervi rivestiti con HUVEC resistono al passaggio di destrani marcati con fluorocromo (Figura 6D,F). Al contrario, l'esposizione a stimoli che alterano la barriera, come il TNFα, aumenta la fuoriuscita dal vaso (Figura 6H, J). I tassi locali di fuoriuscita possono essere visualizzati mediante analisi del chimatogramma (Figura 6E,G,I,K). Poiché il chimatogramma rappresenta la distanza sull'asse X e il tempo sull'asse Y, i tassi relativi di fuoriuscita possono essere confrontati quantificando le pendenze delle linee adattate alle intensità di fluorescenza segmentate (Figura 6E,G,I,K). Queste analisi permettono di valutare come la geometria locale del vaso influenzi la funzione di barriera endoteliale in risposta a stimoli definiti.

Un vantaggio fondamentale di questa piattaforma è il migliorato accesso microscopico rispetto a quanto possibile in vivo. Il sistema facilita inoltre l'analisi immunocitochimica dell'organizzazione molecolare endoteliale, in particolare del citoscheletro di actina. Le cellule endoteliali sono molto sottili e in vivo sono circondate da cellule muscolari lisce, il che può complicare la localizzazione specifica delle strutture citoscheletriche all'interno dell'endotelio. Questa piattaforma permette una colorazione e un'analisi semplici di molecole di adesione e di actina filamentosa nelle cellule endoteliali (Figura 5) e supporta analisi multicomponente difficilmente realizzabili in vivo, inclusa la valutazione della polarizzazione e della divisione endoteliale in condizioni di flusso fisiologico (Figura 5D–F). La combinazione di questi saggi su un'unica piattaforma consente un'esame diretto delle relazioni tra geometria vascolare, flusso alterato, funzione di barriera, organizzazione molecolare endoteliale e adesione intercellulare.

Figura 1: Flusso di lavoro per la stampa e l'utilizzo di vasi sanguigni 3D su chip. Diagramma di flusso dei protocolli per la generazione e l'utilizzo di vasi sanguigni 3D su chip. I cerchi neri indicano i numeri dei protocolli corrispondenti. I colori delle caselle indicano la temperatura alla quale ogni protocollo viene eseguito o il campione viene incubato. Il flusso di lavoro comprende la modellazione della forma del vaso, la preparazione dell'inchiostro, la preparazione della matrice extracellulare (ECM), la preparazione della camera, la stampa del vaso, il lavaggio e il rivestimento del vaso, la cellularizzazione, la coltura in flusso, i saggi funzionali e l'analisi istologica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Stampa di vasi e progettazione della camera. I vasi possono essere progettati a partire da immagini vascolari in vivo per riprodurre geometrie vascolari specifiche del paziente. (A) Piccolo vaso coronarico acquisito mediante tomografia computerizzata (CT) con mezzo di contrasto, riprodotto con permesso da Parekh et al.⁸⁶ Barra della scala = 2 mm. (B) Mappa delle coordinate dei punti fiduciali di una porzione del vaso mostrata nel pannello A, generata mediante registrazione dei punti in FIJI. (C) Output in codice G generato dalla mappa delle coordinate utilizzando un software di controllo della stampante. Le coordinate X, Y e Z sono indicate in basso a destra. (D) Schema di una camera Rose contenente un vaso biostampato. La progettazione con dadi a levetta superiori è compatibile con la camera in acido polilattico (PLA) stampata in 3D. (E) Camera Rose contenente un vaso e serbatoi stampati con bioinchiostro sacrificabile su un coverslip rivestito con matrice extracellulare (ECM). Barra della scala = 9 mm. (F) Schema di una camera Rose configurata per il modello di aneurisma. Un filo passato attraverso gli aghi di ingresso e uscita funge da stampo per il vaso, mentre il bioinchiostro sacrificabile depositato sul filo funge da stampo per l’aneurisma. (G) Camera Rose contenente il filo e lo stampo in bioinchiostro sacrificabile su un coverslip rivestito con ECM. (H) Adattatore per microscopio in PLA stampato in 3D (a sinistra) e camera Rose (a destra), che offrono alternative ai componenti in alluminio lavorati meccanicamente. Le pinze metalliche sull'adattatore sono fissate alla piastra dell'adattatore. Barra della scala = 30 mm. (I) Vaso stampato e lavato all'interno di una camera Rose in alluminio montata sullo stativo del microscopio, con aghi e tubi di ingresso e uscita collegati. Barra della scala = 20 mm. Abbreviazioni: CT = tomografia computerizzata; ECM = matrice extracellulare; PLA = acido polilattico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Sistema di flusso di fluido per un vaso cellularizzato in una camera di Rose. (A) Schema della configurazione dei tubi utilizzata per stabilire il flusso di fluido attraverso una camera di Rose contenente un vaso cellularizzato. Le frecce indicano la direzione del flusso. I componenti numerati sono: (1) pompa peristaltica, (2) rubinetto a tre vie con siringa di spurgo, (3) trappola per bolle, (4) smorzatore di impulsi, (5) dispositivo per il vaso e (6) serbatoio del mezzo. Tutti i componenti che vengono a contatto con il mezzo di coltura vengono sterilizzati prima dell'uso. (B) Sistema di flusso di fluido contenente un vaso cellularizzato in una camera di Rose all'interno di un incubatore per colture cellulari. I numeri corrispondono ai componenti mostrati nel pannello A. Gli aghi di ingresso e uscita sono fissati con del nastro adesivo per garantire stabilità. Barra della scala = 40 mm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Caratterizzazione reologica del bioinchiostro sacrificabile. (A) Viscosità al taglio di un inchiostro non pastorizzato al 25% di Pluronic F127/al 1% di polietilene ossido (PEO) in funzione della velocità di taglio a 5 °C, 10 °C, 14,4 °C, 15 °C e 23 °C. (B) Viscosità complessa in funzione della frequenza angolare per inchiostro di Pluronic F127/PEO non pastorizzato e pastorizzato a 25 °C e 37 °C. Abbreviazione: PEO = polietilene ossido. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Imaging e analisi quantitativa di vasi endotelializzati fissati e colorati. (A) Proiezione dell'intensità massima di immagini a fluorescenza confocale a disco rotante di un vaso completamente cellularizzato dopo il semina iniziale e la coltura in condizioni di basso stress di taglio (1 dyn/cm²). Il vaso è stato colorato per VE-caderina (verde), F-actina (rossa) e DNA con DAPI (blu). Barra della scala = 50 µm. (BSezione trasversale ricostruita xz di uno z-stack di immagini a fluorescenza confocale a disco rotante di un vaso completamente cellularizzato, colorato con fallocidina fluorescente per marcare l'actina F (rosso). Barra della scala = 50 µm. (CProiezione dell'intensità massima di uno z-stack di immagini a fluorescenza confocale a disco rotante di un vaso completamente cellularizzato dopo 24 h di flusso a 12 dyn/cm²². L'F-actina è stata marcata con fallocidina fluorescente (rosso). Scala = 100 µm. (DImmagine di fluorescenza confocale a disco rotante di una regione vascolare dopo 24 h di coltura sotto uno stress di taglio di 16 dyn/cm². Il vaso è stato colorato per VE-caderina (giallo), F-actina (magenta), il marcatore del Golgi GM130 (verde) e il DNA con DAPI (blu). La freccia indica la direzione del flusso. Barra della scala = 30 µm. (EQuantificazione rappresentativa dell'orientamento medio dei fiber di stress dal canale F-actina nel pannello D, utilizzando FibrilTool74. Una griglia di 45 regioni, ciascuna con un'area di 1,600 µm², è stato analizzato e le orientazioni medie delle fibre sono mostrate come un istogramma radiale rispetto alla direzione del flusso. (F) Quantificazione rappresentativa dell'asse nucleo-apparato di Golgi dal pannello D come misura della polarizzazione delle cellule endoteliali. I vettori dal centro di ciascun nucleo al centro del corrispondente apparato di Golgi sono riportati come istogramma radiale rispetto alla direzione del flusso; n = 75 vettori. Abbreviazione: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Analisi del flusso di fluido e della fuoriuscita vascolare. (A) Schema della geometria del vaso utilizzata per le analisi nei pannelli da B a K. Le lettere indicano le regioni approssimative del vaso corrispondenti ai rispettivi pannelli. (B) Proiezione temporale codificata a colori di una sequenza di immagini fluorescenti a disco rotante a scansione confocale che mostra sfere fluorescenti in movimento sotto flusso attraverso una regione vascolare curva. Il colore indica il numero di fotogramma da 1 a 100; sono indicate le curvature esterna e interna. (C) Analisi di velocimetria con immagini di particelle (PIV) che mostra la velocità relativa del flusso attraverso la regione vascolare curva. I colori rappresentano la velocità relativa, e le frecce indicano direzione e intensità del flusso. Barra della scala = 50 µm. (D–G) Saggio rappresentativo della barriera vascolare in un vaso non trattato perfuso con dextrano marcato con Alexa 647 da 10 kDa. (D,D′,D″) Immagini di una regione vascolare rettilinea acquisite rispettivamente a 0, 70 e 150 minuti. La linea bianca indica la regione utilizzata per il cinogramma nel pannello E. (E) Cinogramma della regione rettilinea nel pannello D che mostra un tasso di fuoriuscita di 0,39 µm/min, corrispondente alla pendenza della linea tratteggiata. (F,F′,F″) Immagini della regione vascolare curva acquisite a 0, 70 e 150 minuti. La linea bianca indica la regione utilizzata per il cinogramma nel pannello G. Barra della scala = 150 µm. (G) Cinogramma della regione curva nel pannello F che mostra un tasso di fuoriuscita di 1,01 µm/min, corrispondente alla pendenza della linea tratteggiata. (H–K) Saggio rappresentativo della barriera vascolare dopo preincubazione con 250 ng/mL di fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα). (H,H′,H″) Immagini di una regione vascolare rettilinea acquisite rispettivamente a 0, 200 e 400 minuti. La linea bianca indica la regione utilizzata per il cinogramma nel pannello I. Barra della scala = 250 µm. (I) Analisi del cinogramma della regione vascolare rettilinea nel pannello H mostra un tasso di fuoriuscita di 2,1 µm/min, corrispondente alla pendenza della linea tratteggiata. (J,J′,J″) Immagini della regione vascolare curva acquisite a 0, 200 e 400 minuti. La linea bianca indica la regione utilizzata per il cinogramma nel pannello K. Barra della scala = 250 µm. (K) Analisi del cinogramma della regione vascolare curva nel pannello J mostra un tasso di fuoriuscita di 6,7 µm/min, corrispondente alla pendenza della linea tratteggiata. Gli asterischi nei pannelli da D a K identificano le estremità corrispondenti delle linee utilizzate per generare i cinogrammi. Abbreviazioni: PIV = velocimetria con immagini di particelle; TNFα = fattore di necrosi tumorale alfa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Stampa di un vaso mediante programmazione della stampante basata su STL. (A) Immagine in contrasto di interferenza differenziale di un vaso stampato generato mediante programmazione della stampante basata su STL, che guida la testina della stampante a effettuare due passaggi, producendo una struttura di vaso intrecciata. Barra della scala = 250 µm. (B) Rappresentazione 3D del vaso intrecciato lavato e riempito con albumina sierica bovina (BSA) marcata con Alexa 647. È visibile un'intercapedine tra i lumi dei due filamenti intrecciati. Barra della scala = 100 µm. Abbreviazioni: BSA = albumina sierica bovina; STL = linguaggio tessellare standard. Cliccare qui per scaricare questo file.

File Supplementare 1: Codice G per la stampa del vaso. Cliccare qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Disegno CAD della camera Rose. Fare clic qui per scaricare il file.

File supplementare 3: Disegno CAD dell'adattatore per montaggio su palco. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Viene descritto un sistema robusto per la modellizzazione di geometrie vascolari associate a flussi disturbati, inclusi vasi tortuosi, aneurismi e punti di biforcazione. Il metodo consente imaging ad alta risoluzione, mappatura del flusso e valutazione della funzione di barriera vascolare all'interno di una piattaforma accessibile a biologi cellulari con esperienza limitata in bioingegneria. Sebbene l'approccio principale richieda una bioprinter, esistono in commercio stampanti basate sull'estrusione disponibili da sistemi open source a piattaforme più avanzate dotate di più testine di stampa. Le caratteristiche fondamentali della stampante includono il controllo della temperatura della testina e dell'inchiostro, una regolazione precisa della pressione e la temperatura del piano di stampa. Oltre ai vasi tortuosi e ramificati ottenuti mediante bioprinting, il metodo comprende anche un modello di aneurisma che può essere realizzato senza l'uso di una bioprinter. Complessivamente, questi approcci facilitano lo studio della funzione delle cellule endoteliali in vasi tortuosi mediante tecniche di microscopia comunemente disponibili nei laboratori di biologia cellulare.

Sono disponibili numerosi sistemi modello in vitro per lo studio della funzione vascolare^87,88, ciascuno con punti di forza e limitazioni distinti. Il sistema descritto in questo articolo, adattato da lavori precedenti^54,67,69, è particolarmente adatto a indagare gli effetti della tortuosità vascolare sulla funzione endoteliale, poiché consente una modellizzazione diretta delle geometrie dei vasi derivati dai pazienti e una variazione sistematica della curvatura vascolare all'interno di un singolo dispositivo. Altri approcci hanno modellato vasi coronarici di pazienti utilizzando gelatina metacrilata fotopolimerizzabile per generare strutture vascolari in scala ridotta sotto flusso fisiologico⁶⁰. Tali sistemi offrono una modellizzazione accurata dei vasi, analisi del flusso e la possibilità di incorporare strati della tunica media. Tuttavia, le loro dimensioni complessive e i requisiti di supporto in vetro possono limitare l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e i saggi localizzati di perdita. Al contrario, sistemi più piccoli basati sull'autoassemblaggio di cellule endoteliali derivate da iPSC permettono l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione e possono includere sia cellule endoteliali che cellule muscolari lisce vascolari⁸⁹. Tuttavia, questi modelli offrono un controllo minore sulla geometria dei vasi e può risultare difficile stabilire flussi elevati e alte velocità di taglio. Il sistema attuale rappresenta quindi un approccio intermedio pratico che combina una geometria vascolare definita con l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione della tortuosità vascolare.

Un vantaggio principale di questa piattaforma è la capacità di generare vasi contenenti sia regioni curve che rettilinee, consentendo un confronto diretto della geometria locale del vaso all'interno dello stesso campione mentre altre variabili sperimentali rimangono costanti, come mostrato nella Figura 6. Un altro vantaggio è la possibilità di utilizzare immagini di vasi ottenute da pazienti mediante angiografia o tomografia computerizzata con mezzo di contrasto. Il limite principale nella riproduzione di vasi paziente è rappresentato dalle dimensioni. Vasi con diametro inferiore a 150µm sono difficili da stampare in modo riproducibile, mentre segmenti vascolari che si estendono per più di alcuni centimetri richiedono camere di montaggio più grandi. I segmenti vascolari dovrebbero inoltre rimanere relativamente piatti nella terza dimensione, in modo da poter essere stampati sullo strato di matrice di base e mantenuti entro la distanza di lavoro dell'obiettivo durante l'analisi microscopica.

In lavori futuri, il sistema qui descritto potrebbe essere ulteriormente modificato per modellare malattie come l'aterosclerosi, in cui la geometria del vaso può contribuire alla fisiopatologia. Cellule endoteliali geneticamente modificate o ulteriori tipi cellulari, inclusi le cellule muscolari lisce e le cellule immunitarie, potrebbero essere incorporate per aumentare la complessità fisiologica. L'inclusione di cellule muscolari lisce al di sotto dello strato endoteliale, come dimostrato in sistemi più semplici, potrebbe fornire ulteriori informazioni sulle interazioni tra muscolo liscio ed endotelio nella tortuosità vascolare e nelle malattie⁹⁰. Ulteriori modifiche potrebbero includere cellule tumorali per studiare l'intravasazione^68,91 e l'influenza della tortuosità su questo processo. La piattaforma potrebbe inoltre essere utilizzata per esaminare come il flusso alterato modifichi le risposte infiammatorie^92,93 e possibilmente contribuisca a complicanze vascolari associate a infezioni come il COVID-19⁹⁴. Data l'ampia partecipazione della vascolarizzazione nella salute e nelle malattie umane, sistemi accessibili come questo potrebbero facilitare ulteriori indagini sulla funzione endoteliale in diversi contesti patologici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(3-Aminopropil)trimetossisilano (APTMS), 97%	Sigma-Aldrich	281778	Utilizzato per la silanizzazione e l'attivazione di coprioggetti in vetro prima dell'ancoraggio della matrice extracellulare (ECM).
Siringa sterile da 1 mL	Fisher Scientific	14-823-434	Utilizzata per la somministrazione di reagenti, il rivestimento di contenitori e la manipolazione di fluidi.
Soluzione salina tamponata al fosfato 1x (PBS)	Thermo Fisher Scientific	J61196.AP	Utilizzata per la preparazione dei reagenti, i lavaggi e lo spurgo dei contenitori.
Siringa sterile da 10 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizzata per la preparazione dei reagenti e il trasferimento di fluidi.
Tubi conici da 15 mL con tappo	Fisher Scientific	05-538-59A	Utilizzati per la preparazione dei reagenti, la manipolazione cellulare e lo stoccaggio delle soluzioni.
Piatto di Petri in polistirene da 150 mm	Fisher Scientific	FB0875714	Utilizzato come contenitore sterile per il lavoro o l'incubazione.
Ago da 21G	Fisher Scientific	14-817-227	Utilizzato per la preparazione del modello del vaso e l'accesso alla camera.
Ago da 23G	Fisher Scientific	14-817-237	Utilizzato per le connessioni di ingresso e uscita del vaso durante lo spurgo e la perfusione.
Ago dispensatore trasparente conico da 27G	Nordson	7018417	Utilizzato per l'estruzione dell'inchiostro sacrificabile e la visualizzazione delle bolle d'aria durante la stampa.
Siringa sterile da 3 mL	Fisher Scientific	14-955-459	Utilizzata per il trasferimento di fluidi e la somministrazione di reagenti. Verificare il numero di catalogo poiché il numero fornito è elencato anche per la siringa da 10 mL.
Filo guida medico in acciaio inossidabile 304, diametro 0,0190 pollici	Component Supply	GWX-0190-36	Utilizzato come modello rimovibile per il lume rettilineo nel modello di aneurisma basato su filo.
Tubi conici da 50 mL con tappo	Fisher Scientific	05-526B	Utilizzati per la preparazione, il mescolamento, la pastorizzazione e lo stoccaggio dei reagenti.
Anticorpo secondario anti-topo Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A32723TR	Anticorpo secondario fluorescente utilizzato per l'immunomarcatura.
Anticorpo secondario anti-coniglio Alexa 555	Thermo Fisher Scientific	A-21428	Anticorpo secondario fluorescente utilizzato per l'immunomarcatura.
Albumina bovina marcata con Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A34785	Tracciante macromolecolare fluorescente utilizzato per saggi sulla barriera vascolare e sulle perdite.
Destrano marcato con Alexa 647, 10 kDa	Thermo Fisher Scientific	D22914	Tracciante fluorescente utilizzato per valutare la funzione della barriera endoteliale e le perdite vascolari.
Falloidina marcata con Alexa 647	Thermo Fisher Scientific	A22287	Utilizzata per etichettare fluorescentemente l'F-actina per l'analisi dell'immagine del citoscheletro e dell'orientamento.
Albumina, siero bovino, frazione V, priva di acidi grassi	Sigma-Aldrich	126575-10GM	Utilizzata per il bloccaggio e la preparazione di soluzioni contenenti proteine.
Antibiotico-antimicotico, 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Supplemento antimicrobico opzionale per la matrice extracellulare (ECM) e il mezzo di coltura.
Anticorpo anti-GM130, clone 4A3	Sigma-Aldrich	MABT1363	Anticorpo primario utilizzato per etichettare l'apparato di Golgi per l'analisi della polarità endoteliale.
Anticorpo monoclonale anti-VE-caderina da coniglio, D87F2	Abcam	65707	Anticorpo primario utilizzato per visualizzare le giunzioni intercellulari endoteliali.
Cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	C7902	Utilizzato nella preparazione della matrice extracellulare (ECM) e nei tamponi di fissazione. Verificare se il reagente previsto è cloruro di calcio anidro o idrato.
Kit di connettori	World Precision Instruments	504954	Connettori Luer-a-tubo utilizzati per assemblare il circuito di perfusione microfluidico.
Porta-coprioggetti per colorazione	Electron Microscopy Sciences	72240	Utilizzato per tenere i coprioggetti durante la pulizia, la silanizzazione, l'attivazione e i lavaggi.
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021-100G	Componente del tampone di permeabilizzazione utilizzato durante l'immunomarcatura.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Colorante nucleare fluorescente utilizzato per l'imaging cellulare e l'analisi della polarità.
Piastra riscaldante digitale	Fisher Scientific	11-475-028	Utilizzata per mantenere la camera del vaso e i reagenti a circa 37 °C durante il montaggio.
Sale tetrasodico di EGTA	Sigma-Aldrich	E8145-10G	Agente chelante utilizzato nel tampone di permeabilizzazione.
Connettore Luer femmina con attacco barbato per tubo con diametro interno di 1/16 pollici	Scientific Commodities Inc.	BB330A	Utilizzato per connettere i tubi all'interno del circuito microfluidico.
Luer femmina con attacco barbato da 1/16 pollici di diametro interno, CrystalVu QC	Fisher Scientific	01-000-123	Utilizzato per le connessioni tra tubi e camera del vaso.
Fibrinogeno	Sigma-Aldrich	F8630	Componente della matrice extracellulare (ECM) utilizzato con gelatina e trombina per formare l'idrogel di supporto del vaso. Verificare la fonte: il manoscritto descrive fibrinogeno da plasma umano, mentre la tabella fornita indica plasma bovino.
Smorzatore di impulsi fluidi	Darwin Microfluidics	SE-D1606-3NB-PC-31	Utilizzato per ridurre le fluttuazioni pulsanti generate dalla pompa peristaltica.
Striscia in gomma siliconica per industria alimentare ad alta temperatura	McMaster-Carr	8417K51	Utilizzata per fabbricare la guarnizione per la camera Rose.
Gelatina da pelle di suino, resistenza al gel 300, tipo A	Sigma-Aldrich	G2500	Componente principale della matrice extracellulare (ECM) utilizzato per formare l'idrogel che circonda il lume del vaso.
Coprioggetto in vetro, No. 1,5	VWR	EN-MAS-25X25-1-5-CS	Supporto per microscopia ad alta risoluzione e superficie della camera.
Glutaraldeide, 25%	Electron Microscopy Sciences	16220	Diluita per l'attivazione dei coprioggetti prima dell'ancoraggio della matrice extracellulare (ECM).
Kit di crescita-BBE	ATCC	PCS-100-040	Kit di supplementi utilizzato con il mezzo basale per cellule vascolari per la coltura di cellule endoteliali.
Kit di crescita-VEGF	ATCC	PCS-100-041	Supplemento per la crescita endoteliale utilizzato con il mezzo basale per cellule vascolari quando richiesto.
Fibronectina da plasma umano	Sigma-Aldrich	FC010	Rivestimento opzionale della matrice extracellulare (ECM) luminale utilizzato per promuovere l'attacco endoteliale.
Pinza per tubo in linea	Sigma-Aldrich	Z503371-1PAK	Utilizzata per arrestare e regolare il flusso attraverso il tubo durante la manipolazione e l'incubazione della camera.
Pompa peristaltica Ismatec Reglo Digital	Masterflex	78018-12	Utilizzata per generare un flusso controllato di fluido attraverso i vasi cellularizzati.
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	Rivestimento opzionale della matrice extracellulare (ECM) luminale per la modifica dell'adesione e della polarizzazione endoteliale.
Assortimento di connettori Luer-a-tubo	World Precision Instruments	504954	Utilizzato per connettere tubi, siringhe e componenti di ingresso/uscita della camera. Duplicato del numero di catalogo del kit di connettori; mantenere una sola voce se identici.
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M2393-100G	Componente dei tamponi di fissazione e permeabilizzazione.
Connettore Luer maschio con attacco barbato scorrevole per tubo con diametro interno di 1/16 pollici	Scientific Commodities Inc.	BB329A	Utilizzato per le connessioni dei tubi microfluidici.
Attacco Luer maschio, diametro interno 1/16 pollici	World Precision Instruments	13160-100	Utilizzato per connettere i tubi a siringhe e componenti della camera.
Matrigel	Sigma-Aldrich	CLS356234-1EA	Rivestimento opzionale della matrice extracellulare (ECM) luminale utilizzato per l'attacco endoteliale.
Tappi per bottiglie per mezzo	Fisher Scientific	05-719-310	Tappi a due fori utilizzati per costruire serbatoi sterili per il mezzo di coltura nel circuito di flusso.
Tubo in silicone farmaceutico Nalgene, diametro interno 1/16 pollici	Thermo Fisher Scientific	8600-0020	Tubo flessibile utilizzato nei circuiti di perfusione e spurgo microfluidici.
Parafilm	Electron Microscopy Sciences	70990-125	Utilizzato come superficie non aderente durante la polimerizzazione dei rivestimenti della matrice extracellulare (ECM) sui coprioggetti.
PBS, 10x, pH 7,4	Thermo Fisher Scientific	70011044	Tampone concentrato utilizzato per preparare soluzioni di PBS operative.
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Supplemento antibiotico utilizzato nel mezzo di coltura endoteliale e nelle soluzioni di spurgo.
PIPES	Sigma-Aldrich	P1851-25G	Componente tampone della soluzione di permeabilizzazione.
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Componente termoresponsivo dell'inchiostro sacrificabile.
Rubinetto a tre vie in policarbonato con Luer maschio	Fisher Scientific	NC9593742	Utilizzato per l'adescamento, l'interruzione e il controllo dei percorsi dei fluidi nel circuito di perfusione.
Polietilene ossido (PEO)	Sigma-Aldrich	372781	Componente polimerico della formulazione dell'inchiostro sacrificabile.
Mixer rotativo	Fisher Scientific	88861050	Utilizzato per mescolare l'inchiostro sacrificabile PEO/Pluronic a 4 °C.
Vasca per colorazione con unità scorrevole	MSE Supplies	DWK90020	Utilizzata per il lavaggio, la colorazione o l'incubazione dei reagenti sui coprioggetti.
Coprioggetto quadrato, No. 2, 25 mm x 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS285525-1000EA	Coprioggetto della camera; il vetro più spesso No. 2 offre una maggiore resistenza alla rottura ed è compatibile con obiettivi ad aria o ad acqua adeguati.
Ago dispensatore smussato in acciaio inossidabile, 21 G, 1 pollice	Component Supply	NE-212PL	Utilizzato per la somministrazione di fluidi o la costruzione del modello di vaso basato su filo.
Unità filtranti a vuoto Steriflip	MilliporeSigma	SE1M179M6	Utilizzate per filtrare sterilmente la gelatina calda e altre soluzioni compatibili.
Siringhe di plastica sterili da 5 mL	Allevi	PSYR5-S	Utilizzate per caricare l'inchiostro sacrificabile per la stampa ad estrusione pneumatica.
Trombina, plasma umano, alta attività	Sigma-Aldrich	605195	Utilizzata per avviare la polimerizzazione del fibrinogeno durante la formazione del gel della matrice extracellulare (ECM).
Transglutaminasi	Moo Gloo	1201	Enzima di cross-linking utilizzato durante la preparazione e la modifica della matrice extracellulare (ECM) a base di gelatina/fibrina.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648466	Detergente utilizzato per la permeabilizzazione delle cellule endoteliali prima dell'immunomarcatura.
Enzima TrypLE Express, 1x, rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific	12605010	Reagente di dissociazione cellulare utilizzato per raccogliere le cellule endoteliali prima della semina del vaso.
Tween 20	Sigma-Aldrich	11332465001	Componente detergente del tampone di bloccaggio per l'immunomarcatura.
Mezzo basale per cellule vascolari	ATCC	PCS-100-030	Mezzo basale utilizzato per la coltura di cellule endoteliali e gli esperimenti di perfusione.