Articolo metodologico

Attivazione meccanica dei macrofagi indotta dalla peristalsi

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DOI:

10.3791/72607

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18 agosto 2026

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1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'allestimento e il funzionamento di un bioreattore brevettato per studi di meccano-immunomodulazione. Utilizzando un bioreattore personalizzato in grado di riprodurre forze fisiologiche, dimostriamo qui che i macrofagi sviluppano una risposta proinfiammatoria nettamente distinta alla stimolazione meccanica.

Abstract

L'infiammazione è un processo complesso che contribuisce sia alle malattie acute che croniche. È modulata da una cascata di segnali biochimici e biophysici che portano all'attivazione delle cellule immunitarie. I macrofagi rappresentano un tipo primario di cellula immunitaria coinvolta in numerose condizioni infiammatorie, tra cui cancro, fibrosi e malattie autoimmuni. I metodi tradizionali per lo studio dell'attivazione dei macrofagi prevedono la stimolazione biochimica mediante citochine o chemochine definite, che inducono i macrofagi verso stati pro- o anti-infiammatori estremi. Evidenze recenti indicano che anche i segnali biophysici, oltre a quelli biochimici presenti nei tessuti, svolgono un ruolo nell'attivazione dei macrofagi. Uno di questi segnali meccanici diffusi è la peristalsi, costituita da deformazioni multiasiali e da stress di taglio, che si verifica nel tratto gastrointestinale, nell'utero, nelle vie aeree in via di sviluppo e negli ureteri. In questo studio, abbiamo verificato l'ipotesi che la peristalsi possa attivare i macrofagi. Nel presente protocollo viene descritto l'utilizzo di un biorreattore peristaltico per indagare l'attivazione meccanica dei macrofagi. Membrane di polidimetilsilossano sono state rivestite con fibronectina per migliorare l'adesione dei macrofagi. Macrofagi derivati da midollo osseo murino immortalizzati (iBMDM) sono stati seminati su membrane rivestite con fibronectina e mantenuti come controlli statici oppure esposti alla peristalsi per 4 h. La peristalsi ha attivato i macrofagi, con differenze significative nell'espressione genica di Il6 (50,9 volte rispetto ai controlli statici; p < 0.0001, t-test) e Nos2 (19,8 volte rispetto ai controlli statici; p = 0,0046). Curiosamente, non sono stati osservati cambiamenti significativi in Chil3 (1,22 volte rispetto ai controlli statici; p = 0,9726) oppure Mrc1 (1,16 volte rispetto ai controlli statici; p = 0.9810) rispetto ai controlli statici, indicando che la meccanica è il fattore principale che guida l'attivazione proinfiammatoria. I risultati attuali supportano il concetto di meccano-immunomodulazione dei macrofagi, in particolare in risposta alla meccanica della peristalsi, prevalente in numerosi tessuti basati su muscolatura liscia.

Introduzione

I macrofagi sono cellule immunitarie innata che svolgono ruoli essenziali nella difesa dell'ospite, nel rimodellamento dei tessuti e nella regolazione dell'infiammazione attraverso la fagocitosi e la secrezione di citochine1,2,3,4. A seconda degli stimoli presenti nel microambiente in vivo, i macrofagi indifferenziati (M0) possono polarizzarsi in modo plastico verso fenotipi pro-infiammatori (M1) o anti-infiammatori/pro-riparatori (M2)5,6. I modelli in vitro vengono tipicamente utilizzati per isolare questi diversi stimoli, al fine di comprendere meglio i complessi meccanismi che guidano la polarizzazione dei macrofagi. I macrofagi classici attivati M1 sono generalmente indotti in vitro da stimoli biochimici come il lipopolisaccaride (LPS) e l'interferone gamma (IFN-γ), con conseguente aumento dell'espressione di mediatori infiammatori quali la ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), l'interleuchina-6 (IL6) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α)7,8. I macrofagi alternativamente attivati M2 sono comunemente indotti dall'esposizione all'interleuchina-4 (IL-4) e all'interleuchina-13 (IL-13), promuovendo risposte di rimodellamento tissutale e di guarigione delle ferite8,9. I macrofagi M2 sono ulteriormente suddivisi in fenotipi M2a, M2b e M2c in base a percorsi di attivazione distinti e a profili di espressione di marcatori di superficie10,11. Sebbene la regolazione biochimica della polarizzazione dei macrofagi sia stata ampiamente caratterizzata sia nei sistemi in vivo che in vitro, i macrofagi risiedono in microambienti altamente dinamici che contengono anche significativi stimoli biomeccanici12. Oltre alle citochine e chemochine solubili, i macrofagi sono esposti alla matrice extracellulare e alle interazioni cellula-cellula, alla rigidità del substrato, allo stress meccanico da taglio, alla pressione idrostatica e alla deformazione ciclica del tessuto12,13,14. Essendo cellule meccanosensibili, i macrofagi possono modificare i loro fenotipi infiammatori in risposta a questi stimoli fisici, evidenziando l'importanza della meccanobiologia nella regolazione immunitaria.

Una crescente mole di letteratura ha dimostrato che stimoli meccanici isolati in vitro possono influenzare in modo significativo gli stati di attivazione dei macrofagi (Figura 1). L'esposizione a substrati più rigidi aumenta la polarizzazione M1 e la produzione di citochine infiammatorie rispetto a substrati più morbidi, che inducono invece un fenotipo pro-riparativo15,16,17,18,19,20. Analogamente, lo sforzo di taglio del fluido modula il fenotipo del macrofago in modo dipendente dall'intensità: livelli bassi di flusso interstiziale tendono spesso a favorire un'attivazione pro-riparativa21,22, mentre sforzi di taglio più elevati, simili ai valori riscontrati nelle arterie, possono indurre risposte pro-infiammatorie23,24,25,26,27,28. Modelli in vitro di stiramento ciclico progettati per imitare la meccanica dei tessuti muscoloscheletrici, miocardici, polmonari e intestinali hanno inoltre mostrato un aumento dell'espressione di mediatori infiammatori, sebbene i risultati varino a seconda dell'entità, durata, frequenza e dimensionalità della forza applicata29,30,31,32. Inoltre, la meccanosensibilità dei macrofagi varia tra specie e fonti cellulari, sottolineando l'importanza di selezionare modelli sperimentali appropriati per gli studi di meccanobiologia13,14.

Diagramma di attivazione dei macrofagi; stimoli biochimici e biomeccanici; cambiamenti fenotipici; fattori di stress.
Figura 1: Schema che illustra gli stimoli biochimici e biomeccanici in vitro per l'attivazione dei macrofagi verso stati pro-infiammatori o pro-riparatori. I macrofagi possono essere stimolati in vitro verso uno stato pro-infiammatorio mediante l'aggiunta di stimoli chimici, come il lipopolisaccaride (LPS) e l'interferone γ (IFN-γ), oppure attraverso l'esposizione a stimoli meccanici, tra cui stress di taglio, aumento della rigidità, deformazione indotta da stiramento uniaxiale ciclico e statico elevato, compressione e deformazione indotta da compressione multiasse. I macrofagi possono essere indotti verso uno stato pro-riparatore aggiungendo in vitro stimoli chimici come l'interleuchina-13 (IL-13) e l'IL-4. Possono inoltre assumere uno stato pro-riparatore quando esposti a stimoli meccanici quali stress di taglio oscillante, flusso interstiziale, substrati morbidi o livelli bassi di deformazione ciclica uniaxiale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Oltre a studiare singolarmente stimoli meccanici isolati, è importante proseguire in questa direzione per iniziare a esaminare l'impatto di forze fisiche combinate, dal momento che i macrofagi in vivo sono comunemente esposti a combinazioni di forze simultanee. La peristalsi rappresenta un ambiente meccanico complesso di questo tipo, costituito da una deformazione ciclica multiasiale e da uno sforzo di taglio del fluido generati contemporaneamente dalla contrazione della muscolatura liscia33. Questi meccanismi sono presenti in diversi sistemi organici, tra cui il tratto gastrointestinale, le vie aeree in via di sviluppo, il sistema vascolare, l'utero e gli ureteri34,35,36. In modo significativo, la funzione peristaltica è spesso alterata in malattie infiammatorie come fibrosi, malattie infiammatorie intestinali, cancro e disturbi di rimodellamento delle vie aeree, tutte caratterizzate da un'infiammazione mediata in larga misura dai macrofagi33,37,38,39. Nonostante il ruolo riconosciuto dei macrofagi in queste patologie, permane una lacuna fondamentale nella comprensione di come le forze meccaniche peristaltiche influenzino direttamente l'attivazione dei macrofagi.

Questo protocollo descrive l'utilizzo di un sistema bioreattore a peristalsi per studiare la meccano-immunomodulazione dei macrofagi in condizioni meccaniche fisiologicamente rilevanti. Rispetto ai tradizionali sistemi di coltura statica o alle piattaforme di stimolazione meccanica monofunzionali, questo metodo consente l'applicazione simultanea di deformazioni cicliche multiasiali e di stress di taglio fluido, riproducendo in modo più fedele il microambiente meccanico in vivo dei tessuti basati sul muscolo liscio. In questo protocollo, macrofagi murini immortalizzati derivati dal midollo osseo (iBMDMs) coltivati nei bioreattori in condizioni peristaltiche hanno mostrato un aumento dei marcatori di attivazione M1, senza tuttavia evidenziare alcuna tendenza verso l'attivazione M2. Questi risultati dimostrano che la meccanica peristaltica è sufficiente a modulare il comportamento infiammatorio dei macrofagi e supporta il concetto più ampio di meccano-immunomodulazione nei tessuti esposti a forze dinamiche generate dal muscolo liscio. Questo metodo è particolarmente indicato per ricercatori che studiano la meccanobiologia, l'infiammazione, l'ingegneria tissutale, la fisiologia gastrointestinale, lo sviluppo polmonare, la fibrosi e altre patologie in cui i macrofagi sono esposti a microambienti meccanici complessi. Con un'accurata assemblaggio, una calibrazione costante e un monitoraggio continuo, gli utilizzatori possono garantire prestazioni riproducibili del bioreattore ed evitare i limiti comuni di questa tecnica.

Protocollo

Il protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema di bioreattore brevettato40 per studi di meccano-immunomodulazione. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura cellulare

  1. Mantenere macrofagi derivati dal midollo osseo murino immortalizzati (iBMDMs) in RPMI 1640 completo integrato con FBS inattivato termicamente al 10%, buffer HEPES al 1%, piruvato di sodio all'1% e penicillina-streptomicina all'1%, a 37 °C con aggiunta di 5% di CO2.

2. Fabbricazione del polidimetilsilossano (PDMS)

  1. Pesare e mescolare la base e l'agente indurente del kit dell'elastomero di silicone in rapporto 10:1 (p/p).
  2. Mescolare la miscela per 5 min per garantire un'omogeneizzazione uniforme.
  3. Versare con attenzione il PDMS miscelato in una piastra Petri quadrata da 100 mm x 15 mm fino a quando il PDMS raggiunge un'altezza di 3 mm.
  4. Posizionare le piastre Petri con il PDMS in un desiccante.
  5. Depurare sotto vuoto per 1 h per rimuovere le bolle d'aria.
  6. Rimuovere il PDMS dal desiccante e verificare che non siano presenti bolle d'aria.
  7. Trasferire le membrane di PDMS non indurite in un forno preriscaldato a 60 ˚C e indurirle per 4 h.
  8. Rimuovere le membrane di PDMS dal forno e lasciarle raffreddare sul banco di lavoro per tutta la notte.
  9. Dopo 18–24 h, staccare con cura le membrane di PDMS indurite dalle piastre Petri e tagliarle per ottenere membrane di PDMS di dimensioni 70 mm x 40 mm x 3 mm.

3. Sterilizzazione della membrana in PDMS

  1. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, risciacquare le membrane in PDMS con etanolo al 70% e posizionarle direttamente sulla superficie della cappa a sicurezza biologica (BSC) (Supplementary Figure 1).
  2. Sterilizzare con raggi UV per 10 minuti, quindi trasferire la membrana in PDMS in una piastra di coltura da 90 mm non trattata per colture cellulari, con il lato esposto ai raggi UV rivolto verso l'alto.
    NOTA: Assicurarsi di afferrare il PDMS solo dai lati e mai incrociare le mani sopra la superficie del PDMS per ridurre il rischio di contaminazione.
  3. Per gli esperimenti di peristalsi, utilizzare le membrane in PDMS nelle loro dimensioni originali.
  4. Per condizioni di coltura statica, tagliare ogni membrana in PDMS di 70 mm x 40 mm in due metà uguali di 35 mm x 40 mm.

4. Rivestimento con fibronectina delle membrane in PDMS

  1. All'interno di una cappa a flusso laminare, preparare un volume sufficiente di soluzione sterile di fibronectina 0,5 mg/mL in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per aggiungere 100 µL per membrana.
  2. Dispensare 100 µL di questa soluzione di rivestimento al centro di ciascuna membrana in PDMS, assicurandosi che l'area rivestita sia perfettamente allineata con la zona di contatto tra la membrana in PDMS e la vite.
    NOTA: Utilizzare la punta della pipetta per stendere delicatamente la soluzione in uno strato sottile e uniforme.
  3. Lasciare le membrane in PDMS rivestite all'interno della piastra per colture, con il coperchio aperto, per 45 minuti per consentire l'adsorbimento.
    NOTA: Mantenere lo sportello della cappa aperto per garantire un flusso d'aria continuo.
  4. Trascorsi 45 minuti, aspirare la soluzione di fibronectina residua da ciascuna membrana.
  5. Risciacquare delicatamente le membrane con 1 mL di PBS sterile.

5. Semina delle cellule iBMDM sulla membrana in PDMS

  1. Quando le cellule iBMDM coltivate in una fiasca T25 raggiungono una confluenza del 70%–80%, trattarle con tripsina per staccarle dalla superficie.
  2. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e preparare una densità cellulare di 100.000 cellule/mL nel mezzo di coltura.
  3. Seminare su ciascuna membrana in PDMS rivestita con fibronectina 1 mL della sospensione cellulare preparata per ogni membrana.
  4. Per ogni esperimento, seminare almeno una membrana statica e una membrana peristaltica per garantire un confronto parallelo tra le condizioni.
  5. Collocare le membrane in PDMS seminate in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO2 per almeno 24 h, per consentire l'adesione cellulare sia nelle condizioni statiche che peristaltiche (Supplementary Figure 1B).

6. Biorreattore

  1. Realizzare il biorreattore utilizzando i file di progettazione assistita da computer (CAD) e le specifiche fornite nel brevetto del biorreattore (US12522795)40 oppure ottenere un'unità preassemblata dagli autori.

7. Assemblaggio e calibrazione del circuito Arduino

  1. Costruzione del circuito
    1. Assemblare il circuito di controllo su una basetta sperimentale utilizzando potenziometri, resistori, transistor e collegamenti conduttivi come mostrato nella Figura 2 Supplementare.
    2. Installare l'ambiente di sviluppo integrato Arduino (IDE) sul computer e aprire un nuovo sketch.
    3. Impostare la velocità del motore a 5 giri al minuto (RPM) e la pompa peristaltica a 28 mL/min.
    4. Collegare la scheda Arduino al computer tramite USB e caricare il codice fornito nel File Supplementare 1 utilizzando il pulsante di caricamento nell'IDE.
      NOTA: Il LED di Arduino diventerà arancione durante il caricamento e tornerà verde una volta pronto all'esecuzione. Al termine del caricamento, Arduino eseguirà automaticamente il programma quando sarà alimentato.
  2. Calibrazione del motore
    1. Avviare il motore e contare le rotazioni per 1 minuto utilizzando un cronometro.
      NOTA: Regolare il parametro di velocità del motore nel codice Arduino secondo necessità per raggiungere 5 RPM.
    2. Ricaricare il codice dopo ogni regolazione finché non si raggiunge la velocità desiderata.
  3. Calibrazione della pompa
    1. Fare funzionare la pompa per 30 secondi e misurare la massa raccolta per verificare una portata di 28 mL/min (~14 g in 30 s).
    2. Regolare il potenziometro e ripetere finché l'output in 30 secondi non è costantemente vicino a 14 g.
  4. Dopo aver calibrato sia il motore che la pompa, accoppiarli a un'unità di biorreattore.
    NOTA: L'insieme motore–pompa–biorreattore calibrato è ora pronto per l'uso sperimentale (Figura 2).

Schema del bioreattore per l'allestimento della coltura di macrofagi; analisi di imaging e PCR per i risultati dello studio cellulare.
Figura 2: Schema del montaggio del bioreattore a peristalsi e delle analisi successive. Le cellule iBMDM vengono seminate su una membrana in PDMS rivestita con fibronectina, posizionata all'interno del bioreattore. Dopo 4 h di esposizione alla peristalsi o di mantenimento come controlli statici, le cellule vengono raccolte per analisi successive, incluse qPCR, colorazione immunofluorescente e imaging. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

8. Assemblaggio e configurazione del biorreattore peristaltico

  1. Preparazione dei componenti
    1. Raccogliere tutti i componenti necessari, tra cui bottiglia per mezzo, tappo della bottiglia, tappo superiore della bottiglia per mezzo stampato in 3D, tappo superiore del bioreattore stampato in 3D, fondo del bioreattore stampato in 3D, alberino di avvitamento stampato in 3D, fascette stringicavo (tre per bioreattore), pinze a ganascia regolabile, pinze diagonali, piastre da coltura tessutale da 150 mm, grasso siliconico e supporto motore stampato in 3D. Spruzzare ciascun componente con etanolo al 70% prima di posizionarlo all'interno della cappa a flusso laminare.
    2. Posizionare il motore CC, la pompa peristaltica e un'ulteriore lunghezza di tubo per pompa all'interno della cappa a flusso laminare.
    3. Chiudere il coperchio della cappa a flusso laminare e accendere la lampada UV per 10 minuti per sterilizzare tutti i componenti (Figura supplementare 1C).
  2. Verifica dell'adesione cellulare e della vitalità
    1. Esaminare entrambe le membrane in PDMS con coltura statica e con peristalsi al microscopio. Confermare >80% di adesione cellulare su superfici PDMS rivestite con fibronectina e analisi della morfologia cellulare per valutare la vitalità.
    2. Acquisire immagini rappresentative delle cellule prima dell'assemblaggio, se necessario.
  3. Preparazione di controlli statici
    1. Aspirare 1 mL di mezzo RPMI completo da ciascuna membrana statica.
    2. Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI completo fresco a ciascuna membrana.
    3. Etichettare le piastre come statiche e riposizionarle nell'incubatrice.
  4. Assemblaggio del bioreattore peristaltico
    1. Aggiungere 15 mL di mezzo in ciascuna bottiglia del mezzo designata per l'uso in biorreattore.
    2. Attaccare i tappi dei flaconi per il mezzo dotati di tappi per bottiglie stampati in 3D (contenenti porte di ingresso/uscita) ai flaconi del mezzo. Metterli da parte.Supplementare Figura 1D).
    3. Assemblare la base del biorreattore.
      1. Inserire il dispositivo a vite 3D nella cavità centrale del fondo del biorreattore.
      2. Inserire il motore CC nella fessura del motore situata nella parte inferiore del biorreattore.
      3. Assicurarsi che l'albero motore si inserisca saldamente nel foro centrale del disco di trasmissione della vite stampato in 3D.
      4. Fare scivolare il supporto del motore in posizione per stabilizzare il motore.
  5. Posizionare il biorreattore parzialmente assemblato in una piastra per colture cellulari da 150 mm per facilitare il trasferimento dalla cappa a flusso laminare all'incubatrice una volta completato l'assemblaggio (Supplementare Figura 1E).
  6. Applicare uno strato sottile di grasso siliconico alle scanalature della vite dove la membrana in PDMS entrerà in contatto con la vite. Questo permette alla vite di ruotare facilmente, riducendo l'attrito.
  7. Caricamento della membrana in PDMS seminata con cellule
    1. Trasferire con attenzione le membrane in PDMS seminate con cellule e dotate di peristalsi dall'incubatore nella cappa a flusso laminare.
    2. Aspirare il mezzo da ogni membrana e posizionare la membrana nel bioricettore con la superficie seminata di cellule rivolta verso l'alto, opposta all'interfaccia ingrassata del dispositivo a vite.
    3. Posizionare la parte superiore del bioreattore in modo che l'incavo della camera cellulare sia allineato con la membrana in PDMS. Inserire la parte superiore nelle scanalature guida della base del bioreattore.
  8. Fissaggio del bioreattore
    1. Fissare la parte superiore e inferiore del bioreattore utilizzando fascette stringitubi e pinze diagonali.
    2. Tagliare la parte eccedente del serracavo con le pinze.
  9. Connessioni fluidiche e configurazione del sistema
    1. Allineare la pompa peristaltica in modo che il suo connettore metallico sia rivolto nella stessa direzione del connettore del motore.
    2. Collegare il tubo della pompa più vicino al biorreattore alla porta di ingresso più prossima al motore sulla sommità del biorreattore. Inserire completamente il tubo sull'ugello di ingresso.
    3. Immergere l'estremità opposta di questo tubo all'interno della bottiglia del mezzo di coltura.
    4. Utilizzando il tratto aggiuntivo di tubo della pompa, collegare un'estremità al beccuccio di uscita del coperchio del biorreattore e posizionare l'altra estremità all'interno della bottiglia del mezzo, al di sopra del livello del mezzo, per consentire la ricircolazione senza riflussoSupplementare Figura 1F).
  10. Incubazione e operazioni
    1. Posizionare l'intero montaggio del biorreattore (all'interno della piastra da 150 mm) all'interno dell'incubatrice (Supplementare Figura 1G) e mantenere la scheda elettronica/Arduino all'esterno, collegata all'alimentazione.
    2. Collegare le pinze a coccodrillo
      1. Pompa: positivo a positivo, negativo a negativo.
      2. Motore: invertire la polarità secondo il progetto del circuito.
    3. Posizionare piatti di Petri sterili vuoti nell'incubatrice per il successivo campionamento.
    4. Far funzionare il sistema di bioreattore peristaltico per 4 h (o per il tempo desiderato)Supplementare Figura 1H) in condizioni standard di coltura nell'incubatore.

9. Smontaggio del biorreattore

  1. Aprire l'incubatrice e sollevare il tubo di ingresso dalla bottiglia del mezzo per permettere all'aria di entrare nel sistema e far defluire completamente il mezzo residuo dal biorreattore.
  2. Una volta interrotto il flusso del mezzo, scollegare i cavi del motore e/o della pompa dalla scheda circuitale per arrestare il movimento meccanico.
  3. Spostare l'intero assemblaggio del biorreattore all'interno della cappa a flusso laminare, rimuovere i tubi, tagliare i fascettini e sollevare il coperchio del biorreattore.
  4. Aspirare il mezzo residuo dalla membrana in PDMS e trasferire la membrana nuovamente nella stessa piastra di Petri utilizzata durante la preparazione.
  5. Verificare l'adesione e la vitalità delle cellule valutando la morfometria cellulare mediante microscopio per colture cellulari, quindi procedere con le analisi successive secondo necessità.

10. Analisi successiva

  1. Prelevamento campioni per qPCR
    1. All'interno della cappa a flusso laminare, etichettare tubi microcentrifughi da 1,5 mL con identificatori dei campioni, inclusi tipo cellulare e condizione sperimentale.
    2. Verificare la presenza delle cellule sul PDMS mediante microscopio per colture cellulari, sia nelle condizioni statiche che in quelle di peristalsi.
    3. Aspirare il mezzo residuo da ciascuna membrana in PDMS.
    4. Preparare frescamente il buffer di lisi per RNA aggiungendo β-mercaptoetanolo al Buffer RLT in rapporto 1:100.
    5. Aggiungere 370 µL di Buffer RLT + β-mercaptoetanolo a ciascuna membrana in PDMS per lisare le cellule.
    6. Utilizzando una spatola sterile per cellule, raschiare con decisione la zona seminata di cellule sulla membrana in PDMS per staccare tutte le cellule.
    7. Trasferire circa 350 µL del lisato nel rispettivo tubo da 1,5 mL.
    8. Procedere con l'estrazione dell'RNA o conservare i campioni a -80 °C fino all'uso successivo.
    9. Decontaminare la cappa a flusso laminare.
      NOTA: Il Buffer RLT e il β-mercaptoetanolo devono essere maneggiati seguendo le rispettive schede di sicurezza (SDS) e smaltiti nei contenitori appropriati per rifiuti pericolosi.
  2. Colorazione immunofluorescente
    1. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) a ciascuna membrana e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
    2. Aspirare la PFA e smaltirla nel contenitore designato per rifiuti pericolosi.
    3. Aggiungere 1 mL di PBS a ciascuna membrana per rimuovere il fissativo residuo.
    4. Proseguire con il protocollo di colorazione immunofluorescente appropriato ai marcatori bersaglio.

11. Pulizia dei bioreattori e delle componenti associate

  1. Nebulizzare tutti i componenti del biorreattore che entrano in contatto con il mezzo, le cellule o le membrane in PDMS con etanolo al 70%, inclusi i raccordi di ingresso e di uscita del biorreattore.
  2. Aspirare qualsiasi mezzo residuo dalla bottiglia del mezzo, quindi risciacquare l'interno nebulizzando abbondantemente etanolo al 70% e aspirando nuovamente.
  3. Rimuovere tutti i componenti sanificati dalla cappa a flusso laminare e conservarli in un'area pulita designata.
  4. Per le bottiglie del mezzo:
    1. Pulire con candegina al 20%, agitare e versare il contenuto nel lavandino con l'acqua in corso.
    2. Spazzolare con aceto diluito 1:10, lavare con sapone e acqua ultrapura, quindi risciacquare con etanolo al 70% e far asciugare capovolte.
    3. Pulire i tappi delle bottiglie del mezzo e gli inserti della pompa con etanolo al 70%.
  5. Pulizia delle pompe peristaltiche
    1. Preparare becker da 250 mL contenenti rispettivamente (1) etanolo al 70%, (2) acqua ultrapura, oppure (3) un contenitore vuoto per i rifiuti.
    2. Collegare la pompa con il tubo in un circuito chiuso e alimentarla tramite la scheda a circuito controllata da Arduino.
    3. Fare funzionare la pompa con etanolo al 70% per 1 minuto, quindi con acqua ultrapura per 1 minuto, scaricando il tutto nel becher vuoto per i rifiuti.

Risultati

Questo protocollo aveva lo scopo di dimostrare un metodo riproducibile per determinare in che modo le forze meccaniche peristaltiche modulano direttamente l'attivazione dei macrofagi. Prima degli esperimenti con il biorreattore, si è verificato che i iBMDM polarizzassero in modo appropriato in risposta a condizioni standard di stimolazione biochimica. Seguendo questo protocollo, le membrane in PDMS sono state rivestite con fibronectina e seminate con iBMDM. Le cellule sono state lasciate aderire per 24 h prima dell'ispezione visiva, per confermare un'adesione riuscita, una distribuzione uniforme sulla superficie della membrana e la vitalità, evidenziata dalla morfologia irregolare a "uovo fritto" descritta dal fornitore (Figura 3A,B). Le membrane con scarsa adesione, semina non uniforme o segni di distacco cellulare sono state escluse dagli esperimenti, poiché queste condizioni possono generare una stimolazione meccanica inconsistente e una segnalazione variabile a valle. Le membrane correttamente seminate sono state assemblate nel sistema del biorreattore per subire stimolazione peristaltica oppure mantenute come controlli statici. Dopo 4 h di coltura, i campioni sono stati rivalutati per confermare che le cellule fossero rimaste aderenti dopo la stimolazione meccanica (Figura 3C,D). Dopo aver confermato il mantenimento cellulare in tutte le condizioni, l'attivazione dei macrofagi è stata valutata mediante qPCR e colorazione immunofluorescente.

L'analisi di qPCR è stata eseguita per valutare i cambiamenti nell'espressione dei geni associati al fenotipo M1 proinfiammatorio, Il6, Nos2e CD40, nonché i geni associati a M2, Chil3 e Mrc1 (Tabella 1). Questi risultati hanno dimostrato che la stimolazione peristaltica ha favorito l'attivazione dei macrofagi verso un fenotipo proinfiammatorio. La coltura peristaltica ha aumentato significativamente Il6 espressione di 50,9 volte rispetto ai controlli statici (p < 0,0001, non accoppiato t-test) e Nos2 espressione di 19,8 volte (p = 0,0046, test t non appaiato) (Figura 4A). Cd40 l'espressione era aumentata anche di 7,7 volte, anche se questo cambiamento non era significativo (p = 0,1106, test t non appaiato)Figura 4A). Al contrario, non sono stati osservati cambiamenti significativi in Chil3 (1,22 volte rispetto ai controlli statici; p = 0,9726, non appaiato t-test) oppure Mrc1 (1,16 volte rispetto ai controlli statici; p = 0,9810, test non appaiato t-test) (Figura 4B). Nel complesso, questi risultati indicano che le forze peristaltiche applicate hanno promosso in modo preferenziale l'attivazione dei macrofagi di tipo proinfiammatorio piuttosto che le vie di attivazione alternativa.

Per valutare ulteriormente la polarizzazione dei macrofagi, è stata eseguita una colorazione immunofluorescente utilizzando anticorpi contro il marcatore pan-macrofagico F4/80 e contro il marcatore associato all'M1 CD40 (Figura 5A) o il marcatore associato all'M2 YM1/YM2 (Figura 5B). I campioni sono stati controcolorati con DAPI e analizzati con impostazioni di acquisizione identiche per consentire il confronto tra le diverse condizioni. L'intensità media della fluorescenza (MFI) è stata quantificata per ciascun marcatore e normalizzata rispetto al segnale corrispondente di F4/80 presente nella stessa immagine. I macrofagi peristaltici hanno mostrato un valore di MFI normalizzato per CD40 pari a 1,74 ± 0,72, corrispondente a un aumento del 64,80% rispetto ai controlli statici, sebbene tale aumento non fosse statisticamente significativo (Figura 5C). In accordo con i risultati ottenuti mediante qPCR, non sono state osservate variazioni significative nell'espressione normalizzata di YM1/YM2 dopo stimolazione peristaltica, con un aumento di soli il 5% rispetto ai controlli statici (Figura 5D). Questi risultati rappresentativi dimostrano che il protocollo induce riproducibilmente una risposta predominantemente proinfiammatoria nei macrofagi mediante stimolazione meccanica esclusivamente.

Confronto della dispersione cellulare, statico vs. peristalsi, a 0 h e 4 h; analisi delle immagini al microscopio.
Figura 3: Le immagini in campo chiaro mostrano la conferma visiva dell'adesione cellulare prima e dopo la peristalsi. Immagini in campo chiaro di cellule su membrane in PDMS sia in condizioni statiche (A,C) che con peristalsi (B,D), acquisite prima dell'allestimento del bioreattore (t = 0 h) e al termine dell'esperimento (t = 4 h). Le barre della scala = 200 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico a barre dell'espressione genica; variazione del fold change in M1 e M2 con condizioni statiche rispetto a condizioni peristaltiche.
Figura 4: L'analisi dell'espressione genica mostra l'attivazione proinfiammatoria dei macrofagi tramite stimolazione peristaltica Variazione dell'espressione genica in termini di fold change di (A) Marcatori M1 Il6, Nos2 e CD40, e (B) Marcatori M2 Chil3 e Mrc1. *p < 0.05, ****p < 0,0001, ns = non significativo. Tutti i dati sono espressi come media ± DS; n = 3 per ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Esperimento di polarizzazione dei macrofagi; marcatori CD40, YM1/2, microscopia a fluorescenza, grafico di analisi dati.
Figura 5: La colorazione immunofluorescente conferma l'attivazione proinfiammatoria dei macrofagi dopo l'attivazione della peristalsi. Immagini immunofluorescenti rappresentative di macrofagi marcati per il marcatore pan-macrofago F4/80 (verde) e per (A) i marcatori M1 CD40 (rosa) oppure (B) i marcatori M2 YM1/YM2 (rosso). Le barre della scala = 20 µm. (C) Quantificazione dell'intensità media di fluorescenza (MFI) di CD40 normalizzata rispetto a F4/80. (D) Quantificazione dell'MFI di YM1/YM2 normalizzata rispetto a F4/80. Tutti i dati sono espressi come media ± DS; n = 3 per ogni gruppo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

GenePrimerSequenza (5′–3′)
GapdhFAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GapdhRGGGGTCGTTGATGGCAACA
Chil3FCAG GTC TGG CAA TTC TTC TGA A
Chil3RGTC TTG CTC ATG TGT GTA AGT GA
Nos2FGGA GTG ACG GCA AAC ATG ACT
Nos2RTCG ATG CAC AAC TGG GTG AAC
Mrc1FCTC TGT TCA GCT ATT GGA CGC
Mrc1RTGG CAC TCC CAA ACA TAA TTT GA
Il-6FTCTATACCACTTCACAAGTCGGA
Il-6RGAA TTG CCA TTG CAC AAC TCT TT
Cd40FTTGTTGACAGCGGTCCATCTA
Cd40RGCCATCGTGGAGGTACTGTTT

Tabella 1: Sequenze dei primer per i geni analizzati con qPCR.

Figura supplementare 1: Flusso di lavoro per la preparazione del PDMS, l'assemblaggio del bioreattore e l'allestimento della perfusione. (A) Preparazione del PDMS nella cappa a flusso laminare. (B) Semina cellulare. (C) Sterilizzazione UV dei componenti del bioreattore. (D) Assemblaggio del bioreattore. (E) Bioreattore fissato. (F) Collegamento della pompa. (G) Allestimento nell'incubatore a 0 h. (H) Allestimento nell'incubatore a 4 h. Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 2: Circuito del biorreattore con basetta sperimentale, pompa, motore e cablaggio. Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 1: Codice Arduino per il bioricettore. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

L'attuale comprensione di come le forze peristaltiche influenzino la funzione dei macrofagi rimane limitata, nonostante la diffusa presenza di una peristalsi disregolata nelle malattie infiammatorie. Sebbene singoli stimoli meccanici come lo stress di taglio e la deformazione ciclica siano noti per modulare l'attivazione dei macrofagi, gli effetti della deformazione multiasiale e del flusso fluido simultanei, che insieme costituiscono la peristalsi, non sono stati ampiamente studiati nel contesto della meccanobiologia dei macrofagi. Il protocollo qui descritto fornisce una piattaforma riproducibile per studiare come queste forze meccaniche combinate regolino il comportamento infiammatorio dei macrofagi in condizioni fisiologicamente rilevanti. Utilizzando questo sistema, si è dimostrato che l'esposizione a stimolazione peristaltica per 4 h promuove un fenotipo di macrofago prevalentemente proinfiammatorio, caratterizzato da un aumento significativo dell'espressione di Il6 e Nos2.

È importante notare che la meccanosensibilità dei macrofagi dipende fortemente dall'entità, dalla frequenza e dalla durata della forza applicata12,13,14. Studi precedenti che hanno analizzato stimoli meccanici isolati hanno dimostrato che gli stati di attivazione dei macrofagi variano notevolmente in base a questi parametri. Pertanto, studi futuri dovrebbero esaminare un intervallo più ampio di condizioni peristaltiche, inclusi strain e stress di taglio modificati e un tempo maggiore sotto stimolazione meccanica, al fine di definire meglio lo spettro delle risposte dei macrofagi indotte dalla meccanica peristaltica. Inoltre, lo studio presenta una limitazione legata alla scelta di concentrarsi sulla peristalsi come input meccanico, piuttosto che sullo stress di taglio del fluido o sullo strain ciclico presi singolarmente. Studi futuri potrebbero utilizzare questa piattaforma di bioreattore per esplorare l'attivazione dei macrofagi in funzione di diversi input meccanici, mantenendo un approccio rigoroso e unico. L'ampliamento di questi studi potrebbe aiutare a identificare le soglie meccaniche che favoriscono fenotipi infiammatori o pro-riparativi in diversi contesti tissutali.

La meccanosensibilità dei macrofagi dipende fortemente anche dalla rigidità e dalla topografia del substrato. È importante notare che la rigidità del PDMS scelto per questo studio potrebbe influenzare l'attivazione dei macrofagi indipendentemente dagli effetti delle forze peristaltiche15,16,17,18,19. Per controllare la rigidità come variabile, abbiamo confrontato i macrofagi esposti alla peristalsi con macrofagi coltivati su PDMS di rigidità equivalente in condizioni statiche. Studi futuri potrebbero controllare ulteriormente la rigidità come variabile modificando il rapporto del PDMS, utilizzando materiali aggiuntivi per il substrato o coltivando i macrofagi in una piastra per colture cellulari 2D a scopo comparativo. Inoltre, sebbene non abbiamo modificato la topografia del PDMS, il nostro dispositivo consente futuri studi su questa variabile.

Un punto di forza fondamentale di questo protocollo è la sua adattabilità a un'ampia gamma di studi sull'infiammazione. Sebbene questo lavoro utilizzi macrofagi derivati dal midollo osseo immortalizzati (iBMDMs), il sistema può essere facilmente modificato per accogliere macrofagi primari, monociti, macrofagi residenti nei tessuti o sistemi di co-coltura multicellulari. Ad esempio, potrebbero essere inclusi cellule epiteliali, stromali o muscolari lisce per riprodurre in modo più accurato il microambiente cellulare del tratto gastrointestinale, dell'utero o degli ureteri. Inoltre, la composizione della matrice extracellulare può essere personalizzata in base al tessuto di interesse modificando il rivestimento applicato alla membrana in PDMS. In questo studio, la fibronectina si è rivelata necessaria per mantenere l'adesione degli iBMDM durante la stimolazione peristaltica, mentre i rivestimenti in collagene I e collagene IV hanno determinato un notevole distacco cellulare. Tuttavia, i rivestimenti ottimali della matrice potrebbero variare a seconda dell'origine dei macrofagi o della configurazione della co-coltura. Di conseguenza, una rigorosa validazione dell'adesione cellulare nei punti di controllo raccomandati è fondamentale per garantire stimolazioni meccaniche riproducibili e analisi successive attendibili.

Diversi aspetti tecnici sono essenziali per l'implementazione corretta di questo protocollo, tra cui la manutenzione periodica, che contribuisce a prevenire i guasti più comuni. Un assemblaggio accurato e la sigillatura del biorreattore mediante fascette stringitubi sono particolarmente importanti, poiché una sigillatura incompleta potrebbe causare perdite di mezzo, alterazioni dei profili di stress e deformazione meccanica, rischio di contaminazione o perdita di vitalità cellulare. Inoltre, pompe e motori richiedono una calibrazione stabile per mantenere una stimolazione peristaltica riproducibile, e il regolare lavaggio dei tubi della pompa con etanolo e acqua ultrapura previene l'accumulo di residui. Infine, le cellule seminate sulle membrane in PDMS devono essere controllate per verificarne l'adesione adeguata e una confluenza dell'80% prima del posizionamento nel biorreattore. Nel complesso, queste operazioni di risoluzione dei problemi e i vincoli del sistema evidenziano la necessità di un assemblaggio accurato, una calibrazione costante e un monitoraggio continuo per garantire prestazioni riproducibili del biorreattore.

Nel complesso, questo protocollo fornisce una piattaforma versatile e fisiologicamente rilevante per lo studio della meccano-immunomodulazione in ambienti meccanici dinamici complessi. Permettendo l'applicazione simultanea di deformazione ciclica multiasiale e stress di taglio fluido, questo sistema migliora i tradizionali modelli in vitro basati su una singola forza e offre uno strumento prezioso per lo studio dell'infiammazione nei tessuti guidati dal muscolo liscio. L'approccio potrebbe essere ampiamente applicabile a indagini su malattie gastrointestinali, fibrosi, cancro e altre patologie in cui i macrofagi sono esposti a microambienti meccanici dinamici.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Science Foundation Award Number 2440798. Figura 1 e Figura 2 sono state create con una versione con licenza di BioRender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tripsina-EDTA allo 0,25%Fisher25200056
Provette microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5510
Piastre di Petri da 100 mm x 15 mmFisher50-190-0276
Piastre colturali da 150 mmFisherFB012925
Paraformaldeide al 4%Santa Cruzsc-281692
Piastre colturali da 90 mmFisherFB012923
Anticorpo Alexa Fluor 488 Anti-F4/80Abcamab204266
Anticorpo Alexa Fluor 647 Anti-CD40Abcamab275158
Arduino UnoAmazonB008GRTSV6
BreadboardAmazon
Buffer RLTQiagen79216
Spazzola per celluleFisher353087
DAPIMilliporeSigma50-874-10001
EssiccatoreMilliporeSigmaZ119008
Pinze diagonaliAmazon
Siero fetale bovinoInnovative Biosciences11-01-500
FibronectinaMilliporeSigmaF1141-1MG
Buffer HEPESFisher (Gibco)15630080
iBMDMApplied Biological Materials Inc. (abm)T0673
Motore RobotshopFT-SPARK16-360
Anticorpo PE Anti-Ym-1 + Ym-2Abcamab211621
Penicillina-StreptomicinaFisher15140122
Pompa peristalticaDigiKey1150
Soluzione salina tamponata al fosfatoFisher14190250
Filamento PLAAmazonB0D7ZYCVTY
Potenziometro B1K 1K OhmAmazon‎B0CZ747F6F
RPMI 1640Fisher11875085
Grasso siliconicoAmazonB000XBH9HI
Pinze regolabiliAmazon
Piruvato di sodioCytiva HycloneSH3023901
Kit di elastomero siliconico Sylgard 184FisherNC9285739
Flacone colturale T-25Fisher229331
TransistoreDigiKeyIRF520NPBF-ND
Cablaggio/Clip a coccodrilloAmazon
Ferma cavi da 18 polliciAmazon
β-mercaptoetanoloFisherAC125472500

Riferimenti

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