La N-lattoil-fenilalanina migliora la funzione cardiaca in un modello murino di cardiomiopatia diabetica regolando il metabolismo lipidico

Zeyu Zhou; Xiaotong Yang; Wanyu Li; Xiaoli Liu; Xiaojian Wang; Shaojun Wu; Rong Gu

doi:10.3791/72633

Articolo di ricerca

La N-lattoil-fenilalanina migliora la funzione cardiaca in un modello murino di cardiomiopatia diabetica regolando il metabolismo lipidico

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DOI:

10.3791/72633

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1 settembre 2026

Zeyu Zhou¹ , Xiaotong Yang¹ , Wanyu Li¹ , Xiaoli Liu² , Xiaojian Wang³ , Shaojun Wu² , Rong Gu¹

¹Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College, Nanjing University of Chinese Medicine, ²Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University, ³Institute of Advanced Synthesis, School of Chemistry and Molecular Engineering, Nanjing Tech University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive approcci in vivo e in vitro per studiare in che modo l'N-lactoyl-fenilalanina influisce sulla cardiomiopatia diabetica, sul metabolismo lipidico cardiaco e sulla sintesi del colesterolo, con un focus sulla via della proteina chinasi attivata dall'adenosina monofosfato alfa 1/3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima A reduttasi.

Abstract

La cardiomiopatia diabetica (DCM) è una delle complicanze più gravi del diabete. L'N-lattoil-fenilalanina (Lac-Phe), un metabolita endogeno, può promuovere la perdita di peso e migliorare l'omeostasi del glucosio. Questo studio ha cercato di indagare l'effetto terapeutico della Lac-Phe sulla DCM e di approfondirne il meccanismo sottostante. Topi con diabete di tipo 2 e DCM sono stati trattati con Lac-Phe. La Lac-Phe ha potenziato la funzione contrattile cardiaca, attenuato il rimodellamento patologico e ridotto l'accumulo lipidico nel cuore. In vitro, gli effetti della Lac-Phe sono stati studiati in cellule H9c2 stimolate con glucosio ad alta concentrazione e acido palmitico. La Lac-Phe ha ridotto l'accumulo lipidico diminuendo la sintesi del colesterolo nelle cellule H9c2. Dal punto di vista meccanicistico, la Lac-Phe ha promosso la fosforilazione e l'attivazione della proteina chinasi attivata dall'adenosina monofosfato alfa 1 (AMPKα1). Successivamente, l'AMPKα1 attivata ha fosforilato e inibito il suo bersaglio downstream, la 3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima A reduttasi (HMGCR), portando a una riduzione della sintesi del colesterolo e, infine, attenuando lo squilibrio del metabolismo lipidico nelle cellule H9c2. Questi risultati indicano che la Lac-Phe migliora il metabolismo lipidico nelle cellule H9c2 nella DCM attraverso la via AMPKα1/HMGCR, potenziando così la funzione contrattile cardiaca e attenuando il rimodellamento patologico. La Lac-Phe potrebbe rappresentare un approccio terapeutico potenziale per la cardiomiopatia diabetica.

Introduzione

Il diabete è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia persistente¹Negli ultimi due decenni, il diabete è diventato una delle dieci principali cause di morte nel mondo, con oltre sei milioni di persone che muoiono ogni anno a causa del diabete e delle sue complicanze.². La cardiomiopatia diabetica (DCM), una condizione patologica cardiaca causata dal diabete, rappresenta una delle complicanze più gravi associate al diabete³^,⁴. Funziona come fattore di rischio indipendente per lo scompenso cardiaco ed è caratterizzato da alterazioni strutturali e funzionali del miocardio⁵^,⁶, inclusa la fibrosi cardiaca e l'ipertrofia dei cardiomiociti, che portano infine a una disfunzione sia diastolica che sistolica. Sebbene diverse terapie cardiovascolari convenzionali, come βI beta-bloccanti, gli inibitori dell'enzima convertitore dell'angiotensina e i bloccanti del recettore di tipo 1 per l'angiotensina II sono attualmente impiegati nella gestione della miocardiopatia dilatativa (DCM)⁷^,⁸, la loro efficacia rimane subottimale nelle impostazioni cliniche. Poiché i meccanismi alla base della miocardiopatia dilatativa (DCM) non sono stati studiati approfonditamente⁹, al momento non esiste una strategia terapeutica chiara mirata a questa malattia¹⁰^,¹¹. Le manifestazioni cliniche della miocardiopatia dilatativa progrediscono da una disfunzione diastolica asintomatica nella fase iniziale, a una disfunzione sistolica e insufficienza cardiaca clinica nella fase avanzata, fino al decesso¹²^,¹³Pertanto, sussiste un'urgente necessità di esplorare e sviluppare opzioni terapeutiche efficaci per questa condizione.

Un metabolismo lipidico alterato rappresenta una caratteristica fondamentale della miocardiopatia dilatativa (DCM)¹⁴. Nella DCM, l'aumento dei livelli di acidi grassi liberi (FFAs) nel sangue può determinare un'eccessiva captazione di acidi grassi da parte dei cardiomiociti¹⁵^,¹⁶. Il metabolismo degli acidi grassi nei cardiomiociti dipende principalmente dall'ossidazione degli acidi grassi. Nel tempo, l'ossidazione degli acidi grassi nei cardiomiociti non è sufficiente a metabolizzare completamente tutti gli acidi grassi ingeriti, con conseguente accumulo di acidi grassi in eccesso e dei loro metaboliti intermedi all'interno dei cardiomiociti¹⁷. Questo eccessivo carico lipidico induce lipotossicità, altera l'approvvigionamento energetico miocardico e favorisce lo stress ossidativo cardiaco e le risposte infiammatorie, causando infine gravi danni ai cardiomiociti¹⁸^,¹⁹. Pertanto, una regolazione attiva del metabolismo lipidico cardiaco potrebbe rappresentare un potenziale bersaglio terapeutico per la DCM²⁰.

L'N-lattoidrossi-fenilalanina (Lac-Phe) è un metabolita endogeno la cui concentrazione aumenta rapidamente dopo l'esercizio fisico²¹. Da un punto di vista meccanicistico, il Lac-Phe viene sintetizzato dall'enzima citosolico carnosina dipeptidasi 2 (CNDP2) attraverso la condensazione di lattato e fenilalanina. Questo percorso biosintetico è ampiamente distribuito in diversi tipi cellulari, inclusi macrofagi, cellule epiteliali e cellule staminali mesenchimali, che secernono Lac-Phe in circolo in seguito all'attività fisica²². È stato dimostrato che l'amministrazione cronica di Lac-Phe riduce efficacemente l'assunzione di cibo, diminuisce l'obesità e il peso corporeo e migliora l'omeostasi del glucosio²¹. Uno studio recente ha mostrato che il Lac-Phe può migliorare la capacità del metabolismo lipidico dei microglia/macrofagi dopo una lesione del midollo spinale²³. In modo interessante, studi indicano che sia l'amministrazione acuta che cronica della metformina, un farmaco di prima linea per il diabete di tipo 2, possono aumentare i livelli di Lac-Phe e che il Lac-Phe media gli effetti anti-obesità della metformina²². Inoltre, Sha et al. hanno recentemente dimostrato che il Lac-Phe attenua la morte delle cellule miocardiche alleviando la disfunzione mitocondriale, migliorando così lo scompenso cardiaco indotto da costrizione aortica trasversa (TAC)²⁴. L'iperglicemia prolungata e l'obesità sono fattori importanti che contribuiscono alla disregolazione del metabolismo lipidico nella miocardiopatia diabetica (DCM)²⁵. Nel complesso, queste evidenze suggeriscono che il Lac-Phe potrebbe avere un effetto terapeutico potenziale sulla DCM. Tuttavia, ad oggi, il ruolo specifico del Lac-Phe nella DCM non è stato ancora studiato.

In questo studio, abbiamo scoperto che l'amministrazione esogena di Lac-Phe a topi con cardiomiopatia diabetica ha migliorato efficacemente la funzione contrattile cardiaca e attenuato il rimodellamento patologico del cuore. Abbiamo osservato che Lac-Phe migliora la funzione cardiaca nei topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) regolando lo squilibrio del metabolismo lipidico. Lac-Phe riduce l'accumulo di gocce lipidiche (LD) nei cardiomiociti di topi con DCM e diminuisce il contenuto di colesterolo nel cuore. Dal punto di vista meccanicistico, Lac-Phe promuove la fosforilazione e l'attivazione della proteina chinasi AMP-attivata alfa 1 (AMPKα1), favorendo così la fosforilazione della 3-idrossi-3-metilglutaril-coenzima A reduttasi (HMGCR). La fosforilazione di HMGCR ne riduce l'attività, determinando una diminuzione della produzione di colesterolo e migliorando quindi lo squilibrio del metabolismo lipidico nei cardiomiociti. Questi risultati forniscono una base teorica per il potenziale utilizzo di Lac-Phe nel trattamento della DCM.

Protocollo

The animal study protocol was approved by the Institutional Ethics Committee of Nanjing Drum Tower Hospital (Approval Number: 2025AE1065, 26 September 2025) and was conducted in accordance with the guidelines outlined in the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8th Edition), published by the National Institutes of Health of the United States.

Animals

Thirty 5-week-old male C57BL/6J mice were used in this study. After 1 week of adaptive feeding, all mice were housed with access to food and water under an alternating 12 h day-night cycle at a temperature of 22°C ± 2°C and humidity of 40%–60%. An HFD combined with low-dose STZ was used to establish the DCM mouse model (Figure 1A). Four weeks after initiation of high-fat diet (HFD; 60% fat, 20% protein, and 20% carbohydrate) feeding, mice were fasted overnight and subsequently administered streptozotocin (STZ; 8 mg/mL dissolved in citrate buffer, pH 4.5) via intraperitoneal injection at a dosage of 35 mg/kg/day for three consecutive days. Control group mice were fed a control diet (10% fat, 20% protein, and 70% carbohydrate) and received equivalent volumes of citrate buffer. Following 15 additional weeks of high-fat diet maintenance, mice meeting both criteria, random blood glucose of ≥13.3 mmol/L and left ventricular ejection fraction (LVEF) of <55%, were defined as successfully established DCM models. These validated DCM mice were numbered and randomly assigned to the DCM and DCM + Lac-Phe groups using a random number table. Approximately half of the mice failed to develop the model; these animals were euthanized in accordance with animal ethics requirements. In brief, mice were divided into three groups: Control, DCM, and DCM + Lac-Phe (n = 10 for each group). All 10 mice per group underwent echocardiography, body weight measurement, and OGTT. Following the 28-day treatment period, hearts were collected for subsequent analyses. There were 10 mice in each group. Of these, three mice per group were used for transcriptome sequencing, three were used for transmission electron microscopy and histological staining, and three were used for protein expression analysis. The remaining mouse in each group was reserved as a backup. After successful establishment of the DCM model, Lac-Phe was dissolved in normal saline to a final concentration of 10 mg/mL. Mice in the DCM + Lac-Phe group received intraperitoneal Lac-Phe at 50 mg/kg/day in an injection volume of 5 mL/kg, once daily for 28 consecutive days. Mice in the Control and DCM groups were administered an equivalent volume of normal saline as vehicle control.

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Figure 1. Lac-Phe improves cardiac function and pathological remodeling in mice with diabetic cardiomyopathy. (A) Schematic of the HFD/STZ-induced DCM mouse model and Lac-Phe treatment protocol. (B) Body weights of mice in the Control, DCM, and DCM + Lac-Phe groups during the 4-week treatment period; n = 10 per group. (C) Oral glucose tolerance test (OGTT) in the indicated groups; n = 10 per group. (D) Representative echocardiographic images at 0, 2, and 4 weeks of treatment. (E,F) Quantification of left ventricular ejection fraction (LVEF) (E) and fractional shortening (FS) (F); n = 10 per group. (G) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained heart sections. Scale bar = 1 mm. (H,I) Representative Masson’s trichrome staining of heart sections (H) and quantification of fibrotic area (I); n = 3 per group. Scale bar = 50 μm. (J,K) Representative wheat germ agglutinin (WGA) staining of heart sections (J) and quantification of relative cardiomyocyte area (K); n = 3 per group. Scale bar = 20 μm. Data are presented as the mean ± standard deviation. P < 0.05, **P < 0.001. Please click here to view a larger version of this figure.

Cardiac function

Following anesthesia with isoflurane inhalation, mice were secured in a supine position on a temperature-controlled platform (37°C). Left ventricular dimensions and mitral valve blood flow velocity during diastole and systole were measured using an echocardiography machine equipped with a 40 MHz transducer, from which LVEF and shortening fraction (FS) were calculated. Three consecutive cardiac cycles were collected from each mouse.

Cell treatment

H9c2 cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin–streptomycin at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO₂. Cells were passaged every 2–3 days upon reaching 70%–80% confluence. For experiments, cells were seeded in 10 cm dishes and then divided into three groups: Control, high glucose/palmitic acid (HG/PA), and HG/PA + Lac-Phe. Cells in the HG/PA and HG/PA + Lac-Phe groups were first exposed to 0.25 mM palmitic acid and 50 mM glucose for 24 h. Thereafter, cells in the HG/PA + Lac-Phe group were treated with 10 μg/mL Lac-Phe for an additional 24 h while HG/PA exposure was maintained; cells in the HG/PA group received an equivalent volume of PBS under the same HG/PA conditions. In the p-AMPK inhibition experiments, 10 μM AMPK-IN-3 (dissolved in DMSO) was added simultaneously with Lac-Phe for 24 h, and the corresponding control groups received an equal volume of DMSO. For the atorvastatin experiments, H9c2 cells under HG/PA conditions were treated with 10 μM atorvastatin for 24 h, either alone or in combination with 10 μg/mL Lac-Phe.

Histological staining

After 28 days of Lac-Phe administration, mouse hearts were harvested and immersion-fixed in 4% paraformaldehyde (pH 7.4) for 24 h. Fixed cardiac tissues were paraffin-embedded and sectioned into 6-μm-thick slices. Tissue sections were stained with hematoxylin and eosin, wheat germ agglutinin, and Masson’s trichrome. All staining procedures were performed strictly following the manufacturers’ protocols. Whole-slide imaging was performed at 20× magnification using a high-resolution brightfield microscope equipped with a digital camera system.

Western blot analysis

Protein concentration was determined using the Bradford assay. Tissue lysates were resolved by SDS-PAGE on 10% (w/v) acrylamide gels and electrophoretically transferred to polyvinylidene difluoride membranes. Nonspecific binding sites were blocked with 5% bovine serum albumin for 2 h at room temperature. Membranes were then incubated overnight at 4°C with primary antibodies (diluted 1:1,000), followed by six washes with TBST (5 min each) on a shaker. The membranes were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (diluted 1:5,000) for 2 h at room temperature, followed by another six washes with TBST (5 min each). Protein bands were visualized using an enhanced chemiluminescence reagent kit. Quantification of western blot results was performed by densitometric analysis using ImageJ software. All antibodies used in this study are listed in the Table of Materials.

Transcriptomics

Total RNA was isolated from cardiac tissue of C57BL/6J mice using TRIzol Reagent and RNeasy mini kits. RNA quality was evaluated using a 2100 bioanalyzer, demonstrating high RNA purity and integrity. RNA-seq libraries were prepared according to the VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit and sequenced using an Illumina NovaSeq 6000 System (single-read, 150 bp). Differentially expressed genes were identified using DESeq2, with an adjusted P value < 0.05 and an absolute log₂ fold change > 1 considered statistically significant. Gene Ontology (GO) enrichment analysis was conducted on differentially expressed genes, and the significance of enrichment of differentially expressed genes in GO terms was calculated using the hypergeometric distribution algorithm.

Oil Red O staining and LD540 lipid staining

Cardiac tissue was embedded in OCT compound and then cut into 10-μm-thick sections. The frozen sections were equilibrated at room temperature for 30 min and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min. After washing with PBS, the sections were placed in 60% isopropyl alcohol for 15 s and covered with Oil Red O working solution for 30 min. The sections were then treated with 60% isopropyl alcohol for 15 s and washed three times with PBS. For LD540 lipid staining, H9c2 cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min at room temperature. The cells were then incubated with 10 μM LD540 for 30 min at room temperature.

Transmission electron microscopy (TEM)

Fresh mouse heart tissues were cut into 1–2 mm³ pieces, fixed in electron microscope fixative at 4°C for 4 h, then washed with double-distilled water and immersed in ethanol solutions of progressively increasing concentrations. The samples were embedded, sectioned, and then observed under a transmission electron microscope.

Total cholesterol (TC) content

Total cholesterol (TC) levels in serum and H9c2 cell samples were measured using the Amplex Red Cholesterol and Cholesteryl Ester Assay Kit according to the manufacturer’s instructions.

Oral Glucose Tolerance Test (OGTT)

Mice were fasted for 14 h (from 19:00 to 9:00) and gavaged with glucose (20% stock, 2 g/kg). Blood glucose levels were determined using blood collected from the tail vein at 0, 15, 30, 60, and 120 min after gavage.

Cell counting kit-8 (CCK-8) measurement

CCK-8 was used to measure cell viability. H9c2 cells were seeded into 96-well plates at an initial density of 3 × 10⁴ cells/well. After treatment with different concentrations of Lac-Phe under HG/PA conditions for 24 h, 10 μL of the kit reagent was added to 100 μL of culture medium per well, followed by incubation at 37°C for 4 h. The absorbance was measured at 450 nm using a multimode microplate reader to obtain the optical density (OD) value.

Molecular docking

The crystal structures of Lac-Phe and AMPKα1 were downloaded from PubChem²⁶. The molecular docking process was carried out using CB-DOCK2²⁷.

Statistical analysis

All echocardiographic measurements, histological staining, and image quantifications were performed by investigators blinded to group assignment. All data analyses were performed using Prism and SPSS 20.0. Each experiment was repeated at least three times, and the data were presented as the mean ± standard deviation. Homogeneity of variance was assessed using Levene’s test. Normality was confirmed by graphical inspection of residuals. Comparisons among multiple groups were conducted using one-way analysis of variance, followed by Tukey's post hoc test for pairwise comparisons. For OGTT data, two-way repeated-measures ANOVA was used, with group as the between-subjects factor and time as the within-subjects factor, followed by Bonferroni's post hoc test. P < 0.05 was considered statistically significant.

Risultati

Lac-Phe migliora la funzione cardiaca nei topi con cardiomiopatia diabetica

Abbiamo indotto la DCM in topi C57BL/6J utilizzando una dieta ricca di grassi (HFD) in combinazione con iniezioni di STZ (Figura 1A) e assegnati casualmente i topi DCM in cui il modello era stato stabilizzato con successo a un gruppo non trattato (gruppo DCM) e a un gruppo trattato con Lac-Phe, utilizzando i topi C57BL/6J di controllo come controllo negativo. Secondo lo studio di Li et al.²¹abbiamo selezionato la dose terapeutica di Lac-Phe pari a 50 mg/kg. Dopo il corretto completamento della modellizzazione, il gruppo trattato con Lac-Phe ha ricevuto iniezioni esogene di Lac-Phe per quattro settimane, mentre il gruppo non trattato ha ricevuto iniezioni di un volume equivalente di soluzione salina. Rispetto al gruppo con cardiomiopatia diabetica (DCM), i topi con cardiomiopatia diabetica trattati con Lac-Phe hanno mostrato una riduzione significativa del peso corporeo dopo quattro settimane (Figura 1B). Il test di tolleranza orale al glucosio (OGTT) ha rivelato che, rispetto al gruppo di controllo negativo, i topi nel gruppo DCM presentavano livelli ematici di glucosio significativamente più elevati in tutti i punti temporali misurati, indicando un'alterata tolleranza al glucosio. Al contrario, i topi DCM trattati con Lac-Phe mostravano un miglioramento della tolleranza al glucosio (Figura 1C). L'analisi ecocardiografica ha rivelato che, rispetto ai topi del controllo negativo, i topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) presentavano una frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e una frazione di accorciamento (FS) significativamente ridotte (Figura 1D–F). Il trattamento con Lac-Phe ha aumentato la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e la frazione di accorciamento (FS) nei topi con miocardiopatia dilatativa (DCM). L'analisi istopatologica mediante H&La colorazione #38;E ha mostrato un'ipertrofia patologica nel tessuto cardiaco dei topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) rispetto ai topi di controllo (Figura 1G). Il trattamento con Lac-Phe ha notevolmente attenuato l'ipertrofia miocardica. La colorazione con tricromio di Masson ha ulteriormente dimostrato che il Lac-Phe allevia significativamente la fibrosi miocardica nei cuori affetti da miocardiopatia dilatativa (DCM)Figura 1H, I). La colorazione con WGA ha indicato che il Lac-Phe riduce significativamente l'area della sezione trasversale dei cardiomiociti nei cuori con miocardiopatia dilatativa (DCM)Figura 1J, K). Questi esperimenti dimostrano che l'amministrazione esogena di Lac-Phe migliora efficacemente la funzione cardiaca e attenua il rimodellamento patologico nei topi con miocardiopatia dilatativa (DCM).

Lac-Phe migliora il metabolismo lipidico alterato nella miocardiopatia dilatativa

Per chiarire ulteriormente il meccanismo d'azione del Lac-Phe nella miocardiopatia dilatativa (DCM), abbiamo effettuato un'analisi trascrittomico dei tessuti cardiaci di topi. Dopo l'acquisizione dei dati, sono state eseguite analisi dei pathway GO e KEGG. L'analisi GSEA del processo metabolico degli acidi grassi e l'analisi di arricchimento dei pathway KEGG hanno indicato alterazioni nei pathway legati al metabolismo dei lipidi (Figura 2A,B). Per indagare più approfonditamente il modo in cui il Lac-Phe agisce nei cuori dei topi con DCM, abbiamo condotto un'analisi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (Figura 2C,D) per verificare se il trattamento con Lac-Phe modificasse la morfologia ultrastrutturale dei cuori dei topi con DCM. Le immagini TEM hanno rivelato un significativo aumento della densità delle gocce lipidiche (LD) nei cuori dei topi con DCM rispetto ai topi di controllo, mentre la somministrazione di Lac-Phe ha efficacemente ridotto tale densità delle LD. Considerando l'importanza già nota della disregolazione del metabolismo lipidico nella DCM, abbiamo ulteriormente valutato l'accumulo cardiaco di lipidi mediante colorazione con Oil Red O (Figura 2E,F). L'analisi istologica ha dimostrato un marcato aumento dell'accumulo lipidico nei cuori dei topi con DCM, mentre il trattamento con Lac-Phe ha ridotto tale accumulo. Il trattamento con Lac-Phe ha inoltre ridotto il livello di colesterolo totale (TC) nel siero dei topi con DCM (Figura 2G). Per selezionare una dose appropriata di Lac-Phe per gli esperimenti in vitro, abbiamo utilizzato il saggio CCK-8 per misurare la vitalità delle cellule H9c2 trattate con diverse concentrazioni di Lac-Phe in condizioni di alta glucosio/acido palmitico (HG/PA) (Figura 2H). Le cellule H9c2 trattate con Lac-Phe alla concentrazione di 10 μg/mL in condizioni HG/PA hanno mostrato la maggiore sopravvivenza tra le concentrazioni testate. Pertanto, abbiamo scelto la concentrazione di 10 μg/mL di Lac-Phe per gli esperimenti successivi. Le cellule H9c2 esposte a condizioni HG/PA hanno mostrato un significativo accumulo lipidico, come evidenziato dalla colorazione con LD540 e dalla quantificazione della fluorescenza (Figura 2I,J), e anche il contenuto di TC era aumentato (Figura 2K). Il trattamento con Lac-Phe ha invertito questi cambiamenti, riducendo significativamente sia l'accumulo lipidico sia i livelli di TC nelle cellule H9c2. Nel complesso, questi risultati sperimentali dimostrano che il Lac-Phe attenua efficacemente l'accumulo cardiaco di lipidi e migliora la disregolazione del metabolismo lipidico nei topi con DCM, riducendo inoltre l'accumulo lipidico e i livelli di TC nelle cellule H9c2 trattate con HG/PA.

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Figura 2. Lac-Phe migliora il metabolismo lipidico alterato nella cardiomiopatia diabetica. (A) Analisi dell'arricchimento di set di geni (GSEA) del processo metabolico degli acidi grassi nei gruppi Controllo e DCM. (B) Analisi dell'arricchimento dei percorsi KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) confrontando i gruppi DCM e DCM + Lac-Phe. (C) Immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di tessuti cardiaci, con frecce rosse che indicano goccioline lipidiche (LD). Barra della scala = 2 μm. (D) Quantificazione del numero medio di LD per 100 μm²; n = 3 per gruppo. (E,F) Colorazione rappresentativa con Oil Red O di tessuti cardiaci (E) e quantificazione dell'area positiva relativa all'Oil Red O (F); n = 3 per gruppo. Barra della scala = 20 μm. (G) Livelli relativi di colesterolo totale (TC) nel siero dei gruppi indicati; n = 3 per gruppo. (H) Vitalità cellulare misurata mediante saggio CCK-8 in cellule H9c2 trattate con 0, 1, 5, 10 o 20 μg/mL di Lac-Phe in condizioni HG/PA. (I,J) Colorazione rappresentativa con LD540 di cellule H9c2 (I) e quantificazione dell'intensità media di fluorescenza LD540 (J); n = 3 per gruppo. Barre della scala = 200 μm. (K) Livelli di TC in cellule H9c2 dei gruppi indicati; n = 3 per gruppo. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Lac-Phe aumenta la fosforilazione di HMGCR nei cuori di topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) e nelle cellule H9c2

Per identificare potenziali bersagli attraverso cui il Lac-Phe migliora il metabolismo lipidico, abbiamo esaminato le proteine associate alla miocardiopatia dilatativa (DCM) utilizzando GeneCards²⁸ e predetto le proteine che potenzialmente interagiscono con il Lac-Phe mediante SwissTargetPrediction²⁹ (Figura 3A). Confrontando i risultati, abbiamo identificato sei geni bersaglio potenziali (Figura 3B). L’analisi di questi sei geni ha rivelato che HMGCR è un regolatore centrale del metabolismo del colesterolo e svolge inoltre un ruolo chiave nella DCM (Figura 3C)³⁰. Per determinare se il Lac-Phe regola il metabolismo lipidico attraverso HMGCR, abbiamo innanzitutto esaminato il rapporto p-HMGCR/HMGCR nei cuori di topi. L’analisi mediante immunoblotting ha mostrato che il rapporto p-HMGCR/HMGCR era ridotto nei cuori di topi con DCM, mentre il trattamento con Lac-Phe ha aumentato tale rapporto (Figura 3D,E). Questi risultati sono coerenti con un aumento della fosforilazione di HMGCR e una riduzione della sua attività dopo il trattamento con Lac-Phe. Esperimenti in vitro hanno mostrato che, in condizioni di alta glucosio/acido palmitico (HG/PA), il rapporto p-HMGCR/HMGCR era ridotto nelle cellule H9c2, mentre il trattamento con Lac-Phe ha incrementato questo rapporto (Figura 3F,G). Questi risultati dimostrano che il Lac-Phe aumenta la fosforilazione di HMGCR nei cuori di topi con DCM e nelle cellule H9c2 trattate con HG/PA, supportando il coinvolgimento di HMGCR negli effetti del Lac-Phe sul metabolismo lipidico.

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Figura 3. Il Lac-Phe aumenta la fosforilazione di HMGCR nei cuori di topi con cardiomiopatia diabetica e nelle cellule H9c2. (A) Diagramma di Venn che mostra l'intersezione tra le proteine associate alla DCM e le proteine associate al Lac-Phe previste. (B) Sei proteine sovrapposte associate alla DCM e al Lac-Phe. (C) Rete di interazione proteina-proteina che mostra HMGCR all'interno della rete di proteine associate alla DCM. (D,E) Immagini rappresentative di immunoblotting di p-HMGCR e HMGCR in tessuti cardiaci dei gruppi indicati (D) e quantificazione del rapporto p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 per gruppo. (F,G) Immagini rappresentative di immunoblotting di p-HMGCR e HMGCR in cellule H9c2 dei gruppi indicati (F) e quantificazione del rapporto p-HMGCR/HMGCR (G); n = 3 per gruppo. La β-tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. *P < 0,05. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Lac-Phe combinato con atorvastatina migliora il metabolismo dei lipidi nelle cellule H9c2

Per valutare ulteriormente l'effetto di Lac-Phe sul metabolismo lipidico tramite HMGCR, abbiamo utilizzato l'atorvastatina come controllo. Esperimenti in vitro hanno mostrato che, in condizioni di HG/PA, il trattamento combinato con Lac-Phe e atorvastatina ha determinato una maggiore riduzione dell'accumulo lipidico rispetto al trattamento con atorvastatina da sola. La colorazione con LD540 e la quantificazione della fluorescenza hanno dimostrato che il trattamento combinato con Lac-Phe e atorvastatina riduce l'accumulo di gocce lipidiche nelle cellule H9c2 (Figura 4A,B). La misurazione del contenuto di TC ha mostrato un effetto simile (Figura 4C). L'analisi mediante Western blot ha mostrato che il trattamento combinato con Lac-Phe e atorvastatina ha aumentato significativamente il rapporto p-HMGCR/HMGCR (Figura 4D,E). Questi risultati indicano che il trattamento combinato con Lac-Phe e atorvastatina è associato a una riduzione dell'accumulo lipidico e dei livelli di TC, nonché a un aumento della fosforilazione di HMGCR nelle cellule H9c2.

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Figura 4. Lac-Phe in combinazione con atorvastatina migliora il metabolismo dei lipidi nelle cellule H9c2. (A,B) Colorazione rappresentativa con LD540 di cellule H9c2 appartenenti ai gruppi di trattamento indicati (A) e quantificazione dell'intensità media della fluorescenza LD540 (B); n = 3 per gruppo. Barra della scala = 200 μm. (C) Livelli di colesterolo totale (TC) nelle cellule H9c2 appartenenti ai gruppi di trattamento indicati; n = 3 per gruppo. (D,E) Immagini rappresentative di immunoblotting per p-HMGCR e HMGCR in cellule H9c2 appartenenti ai gruppi di trattamento indicati (D) e quantificazione del rapporto p-HMGCR/HMGCR (E); n = 3 per gruppo. β-Tubulina è stata utilizzata come controllo di caricamento. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Lac-Phe aumenta la fosforilazione di AMPKα1

Per approfondire il meccanismo molecolare attraverso cui il Lac-Phe regola HMGCR, abbiamo riesaminato i dati del trascrittoma cardiaco del topo. Mediante analisi KEGG dei dati trascrittomici, abbiamo identificato 160 percorsi differenzialmente arricchiti tra i gruppi DCM e Controllo e 89 percorsi differenzialmente arricchiti tra i gruppi DCM e DCM + Lac-Phe (Figura 5A). Sessanta percorsi si sovrapponevano tra questi due confronti. Tra questi 60 percorsi sovrapposti, abbiamo selezionato il percorso AMPK. AMPK svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del metabolismo lipidico nella DCM³¹. Inoltre, AMPK si trova a monte di HMGCR (Figura 5B). Abbiamo ipotizzato che il Lac-Phe potesse regolare HMGCR modulando AMPK, migliorando così il metabolismo lipidico. Per verificare questa ipotesi, abbiamo innanzitutto eseguito un docking molecolare tra AMPKα1 e Lac-Phe utilizzando CB-DOCK2. I risultati del docking molecolare hanno mostrato che la conformazione di legame prevista con il punteggio migliore tra Lac-Phe e AMPKα1 presentava un'affinità di −7,6 kcal/mol (Figura 5C). Questi risultati suggeriscono una possibile interazione tra Lac-Phe e AMPKα1, ma non dimostrano un legame intracellulare diretto. Per determinare se il Lac-Phe influisce sul percorso AMPK nella DCM, abbiamo analizzato la fosforilazione di AMPKα1 nei cuori di topi con DCM. L'analisi mediante Western blot ha rivelato che il rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 era ridotto nei cuori dei topi con DCM, mentre il trattamento con Lac-Phe ha aumentato tale rapporto (Figura 5D,E). Esperimenti in vitro hanno mostrato che, in condizioni di HG/PA, il rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 era ridotto nelle cellule H9c2, mentre il trattamento con Lac-Phe ha aumentato questo rapporto (Figura 5F,G). Questi risultati indicano che il Lac-Phe aumenta la fosforilazione di AMPKα1 nei cuori di topi con DCM e nelle cellule H9c2 trattate con HG/PA.

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Figura 5. Lac-Phe aumenta la fosforilazione di AMPKα1 nei cuori di topi con cardiomiopatia diabetica e nelle cellule H9c2. (A) Diagramma di Venn che mostra l'intersezione tra i risultati dell'arricchimento dei pathway per i confronti DCM/Controllo e DCM + Lac-Phe/DCM. (B) Schema che illustra la fosforilazione di AMPK e HMGCR e l'inibizione associata della sintesi del colesterolo. (C) Interazione prevista di docking molecolare tridimensionale tra Lac-Phe e AMPKα1; affinità di legame = −7,6 kcal/mol. (D,E) Immagini rappresentative di immunoblotting western di p-AMPKα1 e AMPKα1 in tessuti cardiaci dei gruppi indicati (D) e quantificazione del rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 (E); n = 3 per gruppo. (F,G) Immagini rappresentative di immunoblotting western di p-AMPKα1 e AMPKα1 in cellule H9c2 dei gruppi indicati (F) e quantificazione del rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 (G); n = 3 per gruppo. GAPDH è stato utilizzato come controllo di caricamento. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. *P < 0,05, **P < 0,01. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'inibizione di AMPK riduce la fosforilazione di HMGCR mediata da Lac-Phe e il miglioramento del metabolismo lipidico nelle cellule H9c2

Abbiamo quindi aggiunto un inibitore della p-AMPK a cellule H9c2 sottoposte a trattamento con Lac-Phe. L'inibitore della p-AMPK ha ridotto il rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 (Figura 6A,B) e diminuito il rapporto p-HMGCR/HMGCR (Figura 6C,D). Questi risultati indicano che l'inibizione della fosforilazione dell'AMPK è accompagnata da una ridotta fosforilazione dell'HMGCR durante il trattamento con Lac-Phe. L'inibitore della p-AMPK ha inoltre ridotto l'effetto del Lac-Phe sul metabolismo lipidico. La colorazione con LD540 e la quantificazione della fluorescenza hanno mostrato un aumento dell'accumulo lipidico nelle cellule H9c2 trattate con l'inibitore della p-AMPK rispetto alle cellule trattate con Lac-Phe in assenza di inibizione dell'AMPK (Figura 6E,F). I livelli di TC nelle cellule H9c2 sono aumentati anche in seguito all'inibizione dell'AMPK (Figura 6G). Nel complesso, questi risultati confermano il coinvolgimento della via di segnalazione AMPKα1/HMGCR negli effetti del Lac-Phe sul metabolismo lipidico. Il Lac-Phe ha aumentato la fosforilazione dell'AMPKα1, fenomeno associato a un incremento della fosforilazione dell'HMGCR e a una riduzione dell'accumulo lipidico e dei livelli di TC. L'inibizione dell'AMPK ha attenuato tali effetti nelle cellule H9c2, sostenendo l'ipotesi che il Lac-Phe migliori il metabolismo lipidico attraverso la regolazione della via AMPKα1/HMGCR.

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Figura 6. L'inibizione di AMPK riduce gli effetti di Lac-Phe sulla fosforilazione di HMGCR e sull'accumulo lipidico nelle cellule H9c2. (A,B) Immagini rappresentative di immunoblotting per p-AMPKα1 e AMPKα1 in cellule H9c2 trattate con HG/PA, Lac-Phe e/o AMPK-IN-3 come indicato (A) e quantificazione del rapporto p-AMPKα1/AMPKα1 (B); n = 3 per gruppo. (C,D) Immagini rappresentative di immunoblotting per p-HMGCR e HMGCR in cellule H9c2 provenienti dai gruppi di trattamento indicati (C) e quantificazione del rapporto p-HMGCR/HMGCR (D); n = 3 per gruppo. GAPDH e β-tubulina sono state utilizzate come controlli di caricamento in (A) e (C), rispettivamente. (E,F) Colorazione rappresentativa con LD540 di cellule H9c2 provenienti dai gruppi di trattamento indicati (E) e quantificazione dell'intensità media della fluorescenza LD540 (F); n = 3 per gruppo. Barra della scala = 200 μm. (G) Livelli di colesterolo totale (TC) in cellule H9c2 provenienti dai gruppi di trattamento indicati; n = 3 per gruppo. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nel complesso, i risultati ottenuti negli esperimenti in vivo e in vitro supportano un meccanismo proposto secondo cui il Lac-Phe aumenta la fosforilazione di AMPKα1 e HMGCR, fenomeno associato a una riduzione dei livelli di colesterolo e dell'accumulo lipidico, nonché a un miglioramento della funzione cardiaca e del rimodellamento patologico nella miocardiopatia dilatativa (DCM). Il percorso proposto AMPKα1/HMGCR alla base degli effetti del Lac-Phe è riassunto schematicamente nella Figura 7.

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Figura 7. Meccanismo proposto attraverso cui Lac-Phe migliora il metabolismo dei lipidi nella cardiomiopatia diabetica mediante il pathway AMPK/HMGCR. Schema che illustra il meccanismo proposto secondo cui Lac-Phe promuove AMPKα1 fosforilazione, seguita dalla fosforilazione di HMGCR, associata alla riduzione dell'accumulo di gocce lipidiche e della lipotossicità nella cardiomiopatia diabetica. AMPK, chinasi AMP-attivata; HMGCR, idrossi-metil-glutaril-CoA reduttasi; LD, goccia lipidica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Disponibilità dei dati:

I dati grezzi che supportano i risultati di questo studio sono stati depositati in Zenodo e sono disponibili pubblicamente all'indirizzo https://zenodo.org/records/21991371

Discussione

In questo studio, forniamo evidenze a sostegno di un effetto terapeutico del Lac-Phe sulla MDC. Il Lac-Phe ha migliorato il rimodellamento cardiaco e la disfunzione cardiaca nella MDC, riducendo al contempo la produzione di colesterolo nei cardiomiociti e attenuando lo squilibrio del metabolismo lipidico. Da un punto di vista meccanicistico, il Lac-Phe ha aumentato la fosforilazione di AMPKα1. Successivamente, l'aumento della fosforilazione di AMPKα1 è stato associato a un incremento della fosforilazione e all'inibizione del suo bersaglio downstream HMGCR, portando a una riduzione della sintesi del colesterolo e, in ultima analisi, al miglioramento dello squilibrio del metabolismo lipidico nei cardiomiociti. In sintesi, questo studio dimostra che il Lac-Phe migliora il metabolismo lipidico cardiaco nella MDC attraverso la via di segnalazione AMPK/HMGCR. Un riassunto schematizzato dei principali risultati e del meccanismo proposto è presentato nella Figura 7.

Lo squilibrio del metabolismo lipidico è uno dei fattori chiave che contribuiscono al danno miocardico nella miocardiopatia diabetica (DCM)¹⁵. L'accumulo eccessivo di lipidi nei cardiomiociti porta a lipotossicità, causando disfunzione dei cardiomiociti e rimodellamento cardiaco patologico¹⁶. L'iperglicemia a lungo termine e l'obesità sono fattori importanti che portano a disturbi del metabolismo lipidico²⁵. È stato dimostrato che Lac-Phe è una sostanza endogena in grado di ridurre efficacemente l'assunzione di cibo, diminuire l'obesità e il peso corporeo, e migliorare l'omeostasi del glucosio²¹. Recenti studi hanno inoltre mostrato che Lac-Phe può regolare il metabolismo lipidico nelle microglia/macrofagi durante lesioni del midollo spinale²³, dimostrando che Lac-Phe è in grado di modulare il metabolismo lipidico anche in un altro modello di malattia. In quanto metabolita endogeno, il ruolo di Lac-Phe nelle malattie metaboliche ha suscitato notevole interesse. Tuttavia, il ruolo di Lac-Phe nella DCM non è ancora stato completamente chiarito. Il nostro studio ha evidenziato un ruolo di Lac-Phe nel metabolismo lipidico dei cardiomiociti nella DCM. Mediante analisi trascrittomica, abbiamo osservato che il trattamento con Lac-Phe era associato a modifiche nei percorsi metabolici legati ai lipidi nei cuori di topi con DCM. La colorazione con Oil Red O e le osservazioni al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) hanno confermato una riduzione dell'accumulo lipidico nei cuori di topi con DCM trattati con Lac-Phe. Questi risultati suggeriscono che Lac-Phe esercita effetti cardioprotettivi nella DCM riducendo l'accumulo lipidico cardiaco e attenuando il rimodellamento patologico. Esperimenti in vitro hanno inoltre dimostrato che l'amministrazione di Lac-Phe allevia l'accumulo lipidico in cellule H9c2 esposte a condizioni di alta glucosio/palmitato (HG/PA).

HMGCR è un enzima dipendente da NADPH e limitante della velocità nel percorso del mevalonato³⁰. HMGCR catalizza la conversione dell'HMG-CoA in mevalonato, un passaggio critico nella biosintesi del colesterolo³⁰^,³¹^,³². HMGCR rappresenta un bersaglio terapeutico rilevante per le malattie cardiovascolari e la miocardiopatia dilatativa (DCM)³³. Clinicamente, l'inibizione di HMGCR è un approccio consolidato per ridurre il rischio cardiovascolare³⁴. I nostri dati sperimentali dimostrano che il Lac-Phe aumenta la fosforilazione di HMGCR nei cuori di topi con diabete di tipo 2, coerentemente con l'inibizione dell'attività di HMGCR e una ridotta sintesi del colesterolo. Studi in vitro hanno inoltre mostrato che l'amministrazione di Lac-Phe aumenta la fosforilazione di HMGCR in cellule H9c2 esposte a condizioni di alta glucosio/acido palmitico (HG/PA), accompagnata da livelli ridotti di colesterolo. La combinazione di Lac-Phe con il farmaco ipocolesterolemizzante atorvastatina ha prodotto effetti maggiori rispetto all'atorvastatina da sola nelle condizioni sperimentali analizzate. In cellule H9c2 trattate con atorvastatina, l'aggiunta di Lac-Phe ha aumentato la fosforilazione di HMGCR e ridotto l'accumulo lipidico. Questi risultati supportano la fattibilità di un approccio mirato alla fosforilazione di HMGCR tramite Lac-Phe per ridurre la produzione di colesterolo e ripristinare l'equilibrio del metabolismo lipidico nella DCM. Tuttavia, se il Lac-Phe possa rappresentare una strategia terapeutica sicura ed efficace per i pazienti con DCM richiede ulteriori indagini.

AMPK, un enzima chiave nel metabolismo energetico mitocondriale, riveste un ruolo centrale nello studio delle malattie metaboliche come il diabete³⁵^,³⁶. Attraverso la regolazione della fosforilazione e defosforilazione, AMPK svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo cardiaco dei lipidi. L'AMPK fosforilato rappresenta la sua forma attiva³⁷. L'AMPK fosforilato (p-AMPK) favorisce l'ingresso degli acidi grassi nei mitocondri per l'ossidazione degli acidi grassi (FAO) regolando la CPT-1³⁸. In linea con studi precedenti³⁹, i nostri risultati hanno mostrato che un aumento della fosforilazione di AMPK era associato a un incremento della fosforilazione di HMGCR e a una riduzione della sintesi del colesterolo. Nei topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) indotta da STZ e dieta ricca di grassi (HFD), l'iperglicemia persistente può portare a variazioni nei livelli cardiaci di p-AMPK⁴⁰. Nella fase iniziale del diabete, quando la funzione cardiaca non è ancora alterata, i livelli cardiaci di p-AMPK possono rimanere invariati¹⁰^,³⁷^,⁴¹. Nel diabete avanzato, con iperglicemia persistente per oltre 8 settimane, inizia il rimodellamento cardiaco patologico e i livelli di p-AMPK possono diminuire¹⁰. È stato proposto che il mantenimento dell'attivazione di AMPK rappresenti una strategia efficace per prevenire la DCM¹⁰^,⁴². La metformina, un farmaco ampiamente utilizzato per il trattamento del diabete di tipo 2, è stata dimostrata in grado di attivare la via di AMPK, ma è stata riportata come avente un effetto neutro sul cuore⁴³^,⁴⁴. In modo interessante, sia la somministrazione acuta che cronica di metformina può aumentare i livelli di Lac-Phe²². Queste osservazioni suggeriscono la possibilità che Lac-Phe possa contribuire al segnale metabolico associato all'attivazione di AMPK; tuttavia, lo studio attuale non dimostra che Lac-Phe esogeno produca un effetto più specifico o sicuro rispetto alla metformina.

Nel nostro studio, la fosforilazione di AMPKα1 è risultata notevolmente ridotta nel modello di miocardiopatia dilatativa in fase avanzata, come mostrato nelle Figure 5D,E, un risultato in accordo con ricerche precedenti⁴². L'analisi trascrittomico ha rivelato alterazioni che coinvolgono la via di AMPK nei cuori di topi diabetici di tipo 2 trattati con Lac-Phe, e l'analisi tramite western blot ha mostrato un aumento della fosforilazione di AMPKα1 in seguito al trattamento con Lac-Phe. Il docking molecolare ha suggerito un'interazione potenziale tra Lac-Phe e AMPKα1, risultato in accordo con uno studio recente²³. È importante sottolineare che il docking molecolare da solo non dimostra un legame intracellulare diretto tra Lac-Phe e AMPKα1. Esperimenti in vitro hanno mostrato che il trattamento con l'inibitore di AMPK ha soppresso la fosforilazione di AMPKα1 ed è stato accompagnato da una ridotta fosforilazione di HMGCR. Dopo l'aggiunta dell'inibitore di AMPK, gli effetti di Lac-Phe sono risultati attenuati, in concomitanza con un aumento dell'accumulo lipidico e un incremento del contenuto di colesterolo nelle cellule H9c2. Nel complesso, questi risultati supportano il coinvolgimento della segnalazione AMPKα1/HMGCR negli effetti di Lac-Phe sul metabolismo lipidico. Lac-Phe ha aumentato la fosforilazione di AMPKα1, fenomeno associato a un incremento della fosforilazione di HMGCR, a livelli ridotti di colesterolo e a un minor accumulo lipidico; l'inibizione di AMPK ha attenuato tali effetti.

Questo studio presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti su topi maschi. Sebbene abbiamo dimostrato l'effetto terapeutico del Lac-Phe nella miocardiopatia dilatativa (DCM) in topi C57BL/6J maschi, il sesso rappresenta un fattore importante che influenza le malattie cardiovascolari⁴⁵. Pertanto, non è noto se il Lac-Phe abbia gli stessi effetti nei topi femmina. In secondo luogo, il sequenziamento del trascrittoma è stato eseguito su campioni cardiaci interi, il che potrebbe aver mascherato cambiamenti specifici per tipo cellulare nel cuore dopo il trattamento con Lac-Phe. Il sequenziamento a singola cellula potrebbe fornire informazioni più approfondite sull'eterogeneità cellulare e molecolare alla base degli effetti osservati⁴⁶^,⁴⁷ e rappresenta un approccio alternativo per ulteriori indagini su questa ipotesi. Infine, a causa delle limitazioni dell'apparecchiatura ecografica utilizzata in questo studio, non è stato possibile valutare la funzione diastolica cardiaca nei topi. Sono pertanto necessari ulteriori studi per chiarire gli effetti terapeutici del Lac-Phe sulla DCM, valutare potenziali effetti dipendenti dal sesso, indagare le risposte specifiche per tipo cellulare, analizzare la funzione diastolica e approfondire i meccanismi alla base degli effetti osservati. In sintesi, questo studio fornisce evidenze a sostegno del Lac-Phe come un potenziale metabolita endogeno di interesse per il trattamento della DCM. Inoltre, i nostri risultati supportano un meccanismo proposto secondo cui il Lac-Phe riduce l'accumulo lipidico nei cardiomiociti durante la DCM attraverso la via AMPKα1/HMGCR. In particolare, il Lac-Phe ha aumentato la fosforilazione di AMPKα1, associata a un incremento della fosforilazione di HMGCR, alla riduzione della sintesi del colesterolo e dell'accumulo lipidico e al miglioramento del rimodellamento patologico. Sono necessarie ulteriori indagini per definire l'interazione molecolare tra Lac-Phe e AMPKα1 e per determinare le potenziali applicazioni traslazionali di questi risultati.

Dichiarazioni

Conflitto di interessi:

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Desideriamo esprimere la nostra sincera gratitudine ai ricercatori e al personale del Clinical College dell'Ospedale Nanjing Drum Tower e dell'Ospedale Affiliato della Scuola di Medicina dell'Università di Nanjing per il loro supporto tecnico. Questa ricerca è stata finanziata da contributi della National Natural Science Foundation of China (numero di concessione 81870291 e 82300384), della China Postdoctoral Science Foundation (numero di concessione 2023M731625) e della Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (numero di concessione BK20220175). Ringraziamo inoltre per le risorse e il supporto collaborativo forniti dall'Istituto di Sintesi Avanzata della Nanjing Tech University.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AMPK-IN-3 (inibitore della p-AMPK)	MedChemExpress (MCE)	HY-132921	Utilizzato a 10 μM durante esperimenti di inibizione della AMPK per inibire la segnalazione della AMPK in cellule trattate con Lac-Phe.
Kit per saggio Amplex Red per colesterolo e esteri del colesterolo	Beyotime	S0211S	Utilizzato per determinare i livelli totali di colesterolo in campioni di siero e cellulari H9c2.
Anti-AMPKα1	Cell Signaling Technology	2532; RRID: AB_330331	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi Western blot di AMPKα1.
Anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174; RRID: AB_10622025	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi di GAPDH mediante western blot
Anti-HMGCR	Abcam	ab174830; RRID: AB_2749818	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi Western blot di HMGCR.
Anti-p-AMPKα1 (Thr172)	Cell Signaling Technology	2535; RRID: AB_331250	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi Western blot di AMPK fosforilataα1.
Anti-p-HMGCR (Ser872)	Abcam	ab124350	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi mediante western blot di HMGCR fosforilato.
anticorpo secondario anti-coniglio IgG coniugato con HRP	Cell Signaling Technology	7074; RRID: AB_2099233	Utilizzato a un'escursione 1:5.000 per la rilevazione in immunoblotting.
Anti-β-tubulina	Cell Signaling Technology	2128; RRID: AB_823664	Anticorpo primario utilizzato per l'analisi mediante western blot di β-tubulina
Atorvastatina	MedChemExpress (MCE)	HY-17379	Utilizzato da solo o in combinazione con Lac-Phe per valutare gli effetti sull'accumulo di lipidi, sui livelli totali di colesterolo e sulla fosforilazione di HMGCR in cellule H9c2 trattate con HG/PA.
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7906	Utilizzato al 5% per bloccare il legame non specifico durante l'analisi mediante western blot.
reattivo/sistema per saggio di Bradford	Thermo Fisher Scientific	23200	Utilizzato per determinare la concentrazione delle proteine prima dell'analisi mediante western blot.
Topi C57BL/6J (maschi, 5 settimane di età)	Centro di Ricerca sugli Animali Modello dell'Università di Nanjing	N/A	Utilizzato per stabilire il modello murino di cardiomiopatia diabetica indotto da HFD/STZ.
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Sharebio	SB-CCK8S	Utilizzato per misurare la vitalità delle cellule H9c2 dopo il trattamento.
Tampone citrato	Preparato in laboratorio	N/A	Preparato a pH 4,5 e utilizzato per sciogliere la STZ e come controllo del veicolo corrispondente.
Dieta di controllo (10% grassi, 20% proteine, 70% carboidrati)	Research Diets, Inc.	D12450J	Utilizzato come dieta per i topi del gruppo di controllo.
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	N/A	Utilizzato per il trattamento delle cellule HG/PA e per il test di tolleranza orale al glucosio.
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Utilizzato come solvente per AMPK-IN-3 e come controllo del veicolo corrispondente.
Dulbecco’s modificato di Eagle’mezzo s	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11965092	Utilizzato come mezzo di coltura basale per cellule H9c2.
Macchina per ecocardiografia con trasduttore da 40 MHz	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100 LT; trasduttore da 40 MHz	Utilizzato per misurare le dimensioni del ventricolo sinistro e la velocità del flusso sanguigno attraverso la valvola mitrale e per ricavare la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e la frazione di accorciamento (FS).
Fissativo per microscopio elettronico	ServiceBio	G1102	Utilizzato per fissare il tessuto cardiaco fresco di topo per la microscopia elettronica a trasmissione.
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023	Utilizzato in concentrazioni progressivamente crescenti per la disidratazione durante la preparazione del campione per microscopia elettronica a trasmissione.
siero fetale bovino	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099141	Utilizzato al 10% per integrare il mezzo di coltura delle cellule H9c2.
linea cellulare H9c2	Sunncell	RRID: CVCL_0286	Utilizzato come modello cellulare cardiaco in vitro per esperimenti di trattamento con HG/PA e Lac-Phe.
Colorazione con ematossilina ed eosina	ServiceBio	G1005-1/2	Utilizzato per la valutazione istologica del tessuto cardiaco.
Dieta ad alto contenuto di grassi (60 kcal% di grassi)	Research Diets, Inc.	D12492	Utilizzato con STZ a basso dosaggio per stabilire il modello murino di cardiomiopatia diabetica.
Microscopio a campo chiaro ad alta risoluzione	Leica	DM2500	Utilizzato per l'immagine completa di tessuto cardiaco colorato a 20× ingrandimento
ImageJ	Istituti Nazionali di Sanità	N/A	Utilizzato per la quantificazione densitometrica dei risultati di immunoblotting.
Isoflurano	Sigma-Aldrich	792632	Utilizzato per l'anestesia durante l'ecocardiografia nei topi.
alcol isopropilico	Sigma-Aldrich	I9516	Utilizzato al 60% durante la colorazione con Oil Red O di sezioni cardiache congelate.
Colorazione lipidica LD540	Beyotime	C2050S-1	Utilizzato a 10 μM per colorare i lipidi intracellulari.
Masson’colorazione con tricromia s	ServiceBio	G1006	Utilizzato per la colorazione istologica del tessuto cardiaco.
N-lattato-fenilalanina (Lac-Phe)	MedChemExpress (MCE)	HY-146098	Somministrato a topi con miocardiopatia dilatativa (DCM) e utilizzato per trattare cellule H9c2 esposte a glucosio elevato/acido palmitico (HG/PA).
Soluzione di lavoro di Oil Red O	ServiceBio	G1015-100ML	Utilizzato per colorare i lipidi in sezioni di tessuto cardiaco congelato.
Kit Omni-ECL per chemiluminescenza efficiente della luce	EpiZyme	SQ203L	Utilizzato per la visualizzazione chemiluminescente delle bande proteiche dopo il western blotting.
Acido palmitico	Sigma-Aldrich	P0500	Utilizzato a 0,25 mM con glucosio ad alta concentrazione per stabilire il modello di cellule H9c2 trattate con HG/PA.
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Preparato come soluzione al 4% e utilizzato per fissare tessuti e cellule cardiache prima della colorazione istologica o lipidica.
Penicillina-streptomicina	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Utilizzato al 1% nel mezzo di coltura cellulare H9c2.
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023	Utilizzato per il lavaggio durante le procedure di colorazione e come veicolo corrispondente in esperimenti di trattamento cellulare.
Prism	GraphPad Software	Versione 8.0	Utilizzato per l'analisi statistica dei dati sperimentali.
membrana di trasferimento in PVDF, 0.45 μm	Thermo Fisher Scientific	88518	Utilizzato per il trasferimento elettroforetico delle proteine durante l'analisi di western blot.
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	Utilizzato per l'isolamento/la purificazione di RNA totale da tessuto cardiaco di topo.
Soluzione di cloruro di sodio, 0,9% (soluzione fisiologica)	Sigma-Aldrich	S8776	Utilizzato per solubilizzare Lac-Phe e come controllo del veicolo per i topi Controllo e DCM.
SPSS	IBM	Versione 20.0	Utilizzato per l'analisi statistica dei dati sperimentali.
Streptozotocina (STZ)	Sigma-Aldrich	S0130	Somministrato insieme all'alimentazione con dieta ricca di grassi (HFD) per stabilire il modello murino di cardiomiopatia diabetica.
Tampone TBS Tween-20 (20×)	Thermo Fisher Scientific	28360	Utilizzato per lavare le membrane dopo l'incubazione con l'anticorpo primario e secondario durante l'analisi di western blot.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Utilizzato per incapsulare il tessuto cardiaco prima della preparazione di sezioni congelate per la colorazione con Oil Red O.
Microscopio elettronico a trasmissione	HITACHI	HT7800	Utilizzato per esaminare le modifiche ultrastrutturali nel tessuto cardiaco del topo.
Reagente TRIzol	Invitrogen	15596026	Utilizzato per l'isolamento di RNA totale da tessuto cardiaco murino.
VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit	Vazyme	NR616-01	Utilizzato per preparare librerie RNA-seq per l'analisi transcriptomica.
Wheat germ agglutinin (WGA)	ServiceBio	W7024	Utilizzato per la valutazione istologica del tessuto cardiaco.

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