Articolo metodologico

Misurazione della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA mediante il saggio DR-white in Drosophila melanogaster

53 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

14 agosto 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

In questo articolo

Sommario

Il saggio DR-white è un saggio genetico reporter versatile per rilevare gli esiti della riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA nell'organismo multicellulare Drosophila melanogaster.

Abstract

Gli studi tradizionali sulla riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono spesso limitati a indagini biochimiche o a sistemi unicellulari (ad esempio, cellule, lieviti). Per facilitare lo studio della riparazione delle DSB in un organismo multicellulare, utilizziamo il saggio DR-white in Drosophila melanogaster. Il saggio DR-white è un saggio reporter semplice ma versatile per la riparazione delle DSB, che contiene una singola sequenza di riconoscimento per I-SceI, scindibile mediante l'espressione della meganucleasi I-SceI. L'espressione di I-SceI può essere indotta costitutivamente, mediante shock termico o tramite altri promotori, consentendo indagini sulla riparazione specifica per tessuto o stadio di sviluppo. Un vantaggio principale del saggio è la capacità di distinguere gli esiti della riparazione che coinvolgono ricombinazione omologa (HR), giunzione non omologa di estremità (NHEJ) e appaiamento di filamenti singoli (SSA). Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per il consolidato saggio DR-white, inclusa una procedura passo dopo passo per indurre DSB nella linea germinale premiotica e analizzare fenotipicamente gli eventi di riparazione mediante valutazione della prole. Vengono inoltre descritte analisi molecolari degli eventi di riparazione mediante reazione a catena della polimerasi (PCR), sequenziamento e lo script R Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). Questo protocollo rappresenta uno strumento utile per lo studio dei meccanismi genetici e molecolari della riparazione del DNA in un modello organismo.

Introduzione

L'integrità genomica è frequentemente messa a rischio da lesioni del DNA, tra cui le rotture a doppio filamento (DSB) sono particolarmente tossiche. Se non riparate, queste rotture possono portare a perdita genetica, riarrangiamenti cromosomici e morte cellulare1. Le cellule hanno quindi sviluppato diversi percorsi per riparare le DSB. La ricongiunzione non omologa dei capi (NHEJ) lega direttamente i due estremi della DSB, potenzialmente introducendo indel nel sito di rottura; l'appaiamento a singolo filamento (SSA) sfrutta sequenze complementari adiacenti al sito di rottura per la riparazione, causando delezioni nel sito di rottura; mentre la ricombinazione omologa (HR) utilizza una sequenza omologa come stampo per la riparazione2,3.

Storicamente, gli studi sulla riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) si sono limitati a saggi biochimici4 o a sistemi monocellulari, come batteri5,6, lieviti7,8 e colture cellulari di mammiferi9,10. Sebbene questi modelli siano stati fondamentali per identificare le proteine chiave della riparazione e i loro meccanismi, mancano della complessità biologica di un organismo multicellulare. Drosophila melanogaster si è affermata come un modello multicellulare popolare per lo studio della riparazione del DNA. Tuttavia, molti saggi attuali sono specifici per determinate vie di riparazione11; si basano su ampie aberrazioni cromosomiche, come l’eccisione dell’elemento P12; oppure richiedono analisi molecolari lunghe e laboriose13. Il saggio DR-white affronta queste difficoltà fornendo un semplice reporter genetico della riparazione del DNA in Drosophila14. Questo studio presenta un flusso di lavoro completo, pratico e dettagliato, passo dopo passo, per eseguire saggi genetici e molecolari volti a misurare la riparazione delle DSB del DNA utilizzando il ben consolidato saggio DR-white.

Il saggio utilizza due ripetizioni dirette del gene Drosophila white (w), che conferisce il colore rosso selvatico degli occhi (Figura 1). Entrambe le copie sono non funzionali: la prima, Sce.white, contiene un'inserzione che porta la sequenza di riconoscimento della meganucleasi I-SceI in un sito SacI di tipo selvatico e introduce un codone di stop prematuro; la seconda, iwhite, è troncata sia all'estremità 5’ che a quella 3’ e funge da stampo per la riparazione mediante ricombinazione omologa (HR). Un transgene Drosophila yellow (y+), che conferisce il colore bruno selvatico del corpo, è presente tra le due ripetizioni di white. Poiché la cassetta DR-white è integrata in un ceppo mutante y w, le mosche DR-white presentano fenotipicamente corpo di colore bruno selvatico e occhi bianchi mutanti.

I DSB possono essere indotti in Sce.white incrociando moscerini DR-white con moscerini portatori di un transgene I-SceI. La riparazione dei DSB nella linea germinale premeiotica può essere misurata analizzando la progenie di un incrocio test. La riparazione mediante NHEJ produce il fenotipo parentale con corpo marrone e occhi bianchi (Figura 1A), mentre la riparazione mediante HR ripristina la sequenza selvatica di white, generando progenie con corpo marrone e occhi rossi (Figura 1B). La riparazione del DSB mediante SSA o un ricombinazione mitotica determina la perdita del transgene yellow interposto, producendo moscerini con corpo giallo e occhi bianchi (Figura 1C). Per analizzare gli esiti di riparazione nelle cellule somatiche, abbiamo adattato l'algoritmo Tracking Indels by DEcomposition (TIDE) per rilevare specificamente la riparazione mediante NHEJ con elaborazione e mediante HR nel saggio DR-white15,16.

Il saggio DR-white offre diversi vantaggi rispetto ai saggi di riparazione del DNA precedentemente stabiliti in Drosophila. Poiché le rotture vengono generate e riparate nella linea germinale, gli esiti della riparazione possono essere facilmente rilevati mediante analisi fenotipica. Allo stesso tempo, il saggio è estremamente versatile. Sebbene sia progettato principalmente per misurare la riparazione mediante ricombinazione omologa (HR), può rilevare tutte e tre le vie di riparazione. Abbiamo inoltre sviluppato due ulteriori modelli di riparazione funzionali (Figura 2). Il modello iwhite.mu contiene 28 polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) silenziosi e produce anche prole con occhi rossi (Figura 2A), facilitando lo studio della lunghezza dei tratti di conversione genica (GCT) e della riparazione HR tra sequenze divergenti14.  Il modello iwhiteΔ9 presenta una delezione di nove paia di basi nel sito SacI di tipo selvaggio e dà origine a prole con occhi arancioni (Figura 2B). Questa caratteristica consente ai ricercatori di tracciare la riparazione HR a partire da modelli distinti, una peculiarità unica del saggio DR-white15.

Protocollo

1. Saggio DR-white

  1. Cross genetici (Figura 3A)
    NOTA: Per protocolli standard di coltura e genetica di Drosophila, consultare "Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics" di Ralph J. Greenspan17. Le informazioni sul genotipo delle linee sono riportate nella Tabella dei materiali.
    1. Mantenere le mosche a 25 °C con cicli luce/buio di 12 h su alimento standard per Drosophila, cospargendo lievito attivo.
    2. Impostare cinque provette per shock termico incrociando 8–10 femmine vergini DR-white con 3–5 maschi portatori di un transgene I-SceI (Incrocio 1, Figura 3A) per provetta.
      NOTA: Possono essere utilizzati diversi transgeni I-SceI a seconda dell'applicazione. In questo protocollo, è stato utilizzato il transgene hsp70-I-SceI per l'induzione mediante shock termico11. Per evitare un'espressione "perdita" di I-SceI nelle generazioni precedenti, è fondamentale assicurarsi che i transgeni DR-white e I-SceI siano combinati nella stessa mosca solo in questa generazione.
    3. Nello stesso giorno, impostare bottiglie di espansione di una linea y w. Queste saranno le mosche test. Tre bottiglie di espansione sono sufficienti per circa 60–80 incroci test.
    4. Coltivare le provette per shock termico e le bottiglie di espansione y w a 25 °C per 3 giorni.
    5. Il terzo giorno, trasferire le provette per shock termico e le bottiglie di espansione y w su alimento fresco per costituire un set di riserva.
  2. Shock termico/induzione di DSB
    NOTA: Se non si utilizza un transgene I-SceI inducibile mediante shock termico, passare al passaggio 1.2.5, che di solito viene eseguito 3 giorni dopo il passaggio 1.1.5.
    1. Lasciare invecchiare le provette per shock termico per 3 h a 25 °C per assicurare che tutte le prole abbiano superato la transizione materno- zigotica.
    2. Sottoporre le provette originali a shock termico in un bagno d'acqua a 38 °C per 1 h. Assicurarsi che il livello dell'acqua sia almeno all'altezza della base della palla di cotone in modo che le larve non possano arrampicarsi sopra il livello dell'acqua.
    3. Monitorare la temperatura del bagno d'acqua ogni 15 min e mantenerla entro 38 ± 0,5 °C poiché gli esiti di induzione e riparazione dipendono dalla durata e dalla temperatura dello shock termico.
    4. Riportare le provette a 25 °C.
    5. Il giorno successivo, aggiungere 1/3 di un tovagliolo da laboratorio piegato nell'alimento per assorbire l'eccesso di umidità. Se l'alimento è secco, aggiungere circa 100 µL di acqua al tovagliolo da laboratorio. Aggiungere una palla di cotone alle bottiglie di espansione y w.
    6. Coltivare le provette sottoposte a shock termico per ulteriori 6 giorni a 25 °C, o fino a quando le mosche iniziano a schiudersi.
    7. Eliminare le provette di riserva e le bottiglie di espansione 3 giorni dopo il trasferimento. Aggiungere una palla di cotone alle bottiglie di espansione y w di riserva circa 4 giorni dopo l'eliminazione.
      NOTA: Se necessario, le provette di riserva possono essere sottoposte a shock termico come descritto ai passaggi 1.2.1–1.2.6 ed elaborate come indicato di seguito.
  3. Incroci test
    1. Raccogliere mosche sottoposte a shock termico portatrici dei transgeni DR-white e I-SceI per 4–5 giorni dopo l'inizio della schiusa per ridurre il bias legato allo stadio di sviluppo.
      NOTA: Le mosche correttamente sottoposte a shock termico portatrici dei transgeni DR-white e I-SceI presentano occhi a mosaico a causa di eventi di riparazione embrionali e larvali che si sono sviluppati nei tessuti adulti. L'estensione del mosaico non è sempre correlata agli eventi di riparazione nella linea germinale e pertanto non deve essere un fattore determinante nella selezione delle mosche sperimentali per gli incroci test (passaggio 1.3.3).
    2. Raccogliere femmine vergini y w per 5 giorni. Raccogliere 5 femmine vergini per ogni numero previsto di campioni. Raccogliere dalle bottiglie di espansione di riserva non appena iniziano a schiudersi.
    3. Impostare le provette test incrociando un maschio sottoposto a shock termico con 4–5 femmine vergini y w (Incrocio 2; Figura 3A). Selezionare i maschi casualmente dal campione raccolto al passaggio 1.3.1 per ridurre il bias legato allo stadio di sviluppo. Coltivare gli incroci test a 25 °C.
      NOTA: Per evitare il crossing over tra DR-white e I-SceI, si analizzano comunemente le linee germinali maschili; tuttavia, possono essere analizzate anche le prole femminili. Se si analizzano le prole femminili, le provette test dell'Incrocio 2 vengono impostate in un rapporto 2 femmine:5 y w maschi e coltivate per 5–6 giorni (passaggio successivo) per assicurare produttività.
    4. Verificare la produttività 4 giorni dopo l'allestimento delle provette test per valutare quando devono essere eliminate.
      NOTA: Verificare che siano state deposte abbastanza uova per garantire almeno 20 prole analizzabili, ma evitare che le colture si sovrappongano, altrimenti le mosche potrebbero rimanere impigliate nell'alimento.
    5. Quando le provette test sono pronte (entro 4–5 giorni dopo l'instaurazione degli incroci test), eliminare le mosche e aggiungere 1/3 di un tovagliolo da laboratorio piegato nell'alimento per assorbire l'eccesso di umidità.
      NOTA: I maschi possono essere raccolti in questo momento se sono richieste ulteriori analisi (ad esempio, genotipizzazione molecolare).
    6. Coltivare le provette test per ulteriori 5–6 giorni a 25 °C.
  4. Analisi fenotipica
    NOTA: Per ogni condizione di ciascun esperimento genetico (ad esempio, mutanti omozigoti e controlli eterozigoti) vengono impostate circa 25 provette test. Ogni esperimento genetico viene ripetuto 2–3 volte e i dati delle singole provette vengono raggruppati.
    1. Analizzare la prole dell'Incrocio 2 (Figura 3A) per circa 9 giorni dopo che le prime mosche iniziano a schiudersi.
    2. Anestetizzare le mosche utilizzando CO2 oppure trasferendole in una provetta vuota senza alimento e congelandole a -20 °C per almeno 30 min.
      NOTA: Se le mosche vengono congelate, possono essere analizzate anche alcuni giorni dopo.
    3. Posizionare le mosche su un tappetino per mosche e analizzarle per i fenotipi appropriati (Figura 3A). Includere solo le provette con almeno 20 mosche analizzate nel set di dati.
      1. Per l'analisi, innanzitutto selezionare le mosche portatrici del cassetto DR-white (utilizzando la fluorescenza positiva per la proteina fluorescente rossa [RFP+] come marcatore), quindi valutare il colore degli occhi e del corpo.
      2. Il transgene y+ legato al cassetto DR-white determina un colore del corpo marrone intermedio che non è completamente selvatico. Per distinguere tra No DSB/NHEJ (corpo marrone; y+ w-) e SSA (corpo giallo; y- w-), confrontare le mosche con la prole y w che non possiede il cromosoma DR-white (RFP-). Gli eventi SSA avranno lo stesso colore giallo di queste mosche. Classificare come No DSB/NHEJ le mosche più scure (più marroni) rispetto a queste.
        NOTA: Deviazioni dai fenotipi descritti nella Figura 3A  potrebbero indicare contaminazione, e la provetta non deve essere analizzata. Sebbene si possano analizzare mosche morte intere, quelle danneggiate devono essere scartate se i fenotipi non possono essere determinati.

2. Analisi TIDE (Figura 4)

  1. Estrazione del DNA genomico (gDNA)18
    1. Raccogliere moscerini (o larve) sottoposti a shock termico che portano entrambi i transgeni DR-white e I-SceI, come progenie dell'Incrocio 1 (Figura 3A).
    2. Posizionare un singolo moscerino in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL e congelare rapidamente (ad esempio, in un bagno di ghiaccio secco/etanolo o azoto liquido).
      ATTENZIONE: Manipolare il ghiaccio secco, l'azoto liquido, l'etanolo, l'isopropanolo e altri prodotti chimici utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e seguendo le procedure di sicurezza istituzionali.
      PUNTO DI PAUSA:  I campioni possono essere conservati a -80 °C e processati in un secondo momento se necessario. Se si analizzano moscerini o larve, utilizzare un singolo moscerino o una singola larva per campione. Se si analizzano tessuti più piccoli (ad esempio, cervelli, dischi immaginali), raggruppare i campioni per aumentare il rendimento di DNA.
    3. Omogeneizzare ciascun campione in 50 µL di Buffer A (100 mM Tris-Cl, pH 7,5; 100 mM etilendiamminotetraacetico [EDTA]; 100 mM cloruro di sodio; 0,5% sodio dodecilsolfato [SDS]) utilizzando un omogeneizzatore elettrico.
    4. Incubare i campioni in bagno termico a 65 °C per 30 minuti.
    5. Aggiungere 100 µL di Buffer B (1,4 M acetato di potassio, 4,3 M cloruro di litio) a ciascun campione e mescolare brevemente capovolgendo le provette.
      NOTA: Se si utilizzano moscerini interi, potrebbero essere necessari volumi maggiori per omogeneizzare completamente i campioni. In tal caso, mantenere un rapporto volumetrico di 1:2 tra Buffer A e Buffer B.
    6. Incubare i campioni sul ghiaccio per almeno 30 minuti.
    7. Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    8. Trasferire 125 µL del sopranatante chiarificato in nuove provette microcentrifuga da 1,5 mL. Evitare qualsiasi precipitato.
    9. Aggiungere 100 µL di isopropanolo al 100% a temperatura ambiente per ogni 125 µL di sopranatante e mescolare brevemente capovolgendo le provette.
    10. Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    11. Aspirare il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet di DNA.
      NOTA: Il pellet di DNA potrebbe non essere visibile a questo stadio. Annotare l'orientamento delle provette durante il caricamento nella microcentrifuga e aspirare dalla faccia opposta rispetto a dove ci si aspetta che si formi il pellet.
    12. Lavare i pellet con 250 µL di etanolo al 70% freddo, quindi mescolare brevemente capovolgendo delicatamente le provette.
    13. Centrifugare i campioni a circa 16.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
    14. Aspirare il sopranatante, avendo cura di non disturbare il pellet.
      NOTA: Il pellet potrebbe risultare più visibile dopo il lavaggio con etanolo. In caso contrario, consultare la Nota del Passaggio 2.1.11.
    15. Lasciare le provette scoperte a temperatura ambiente per far evaporare l'eventuale etanolo residuo. Evitare un'essiccazione eccessiva del pellet, altrimenti potrebbe non ricostituirsi completamente.
    16. Aggiungere 20 µL di acqua priva di nucleasi e lasciare i pellet in ricostituzione per tutta la notte a 4 °C.
      PUNTO DI PAUSA: Se il pellet di DNA non si è completamente disciolto, è possibile aggiungere ulteriore acqua.
    17. Il giorno successivo, capovolgere delicatamente le provette e misurare la concentrazione di DNA. Conservare i campioni a -20 °C se non si procede immediatamente all'analisi.
      NOTA: Per l'estrazione da un singolo moscerino, i rendimenti sono tipicamente di circa 100 ng/µL. È fondamentale ottenere campioni di alta qualità. Il rapporto di assorbanza A260/A280 dovrebbe essere compreso tra 1,7 e 2,0. Valori al di fuori di questo intervallo indicano la presenza di contaminanti come proteine. Il rapporto A260/A230 dovrebbe essere compreso tra 2,0 e 2,2. Valori al di fuori di questo intervallo indicano contaminanti come etanolo e sali del buffer. Campioni con rendimenti bassi o scarsa qualità possono portare a un'ampia cattiva amplificazione PCR.
  2. Reazione a catena della polimerasi (PCR)
    1. Amplificare la regione Sce.white mediante PCR utilizzando 100 ng di gDNA e i primer DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) e DR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC), seguendo le istruzioni del produttore. Includere un campione di controllo di moscerino DR-white (ovvero, ceppo parentale DR-white, senza presenza del transgene I-SceI). Utilizzare le seguenti condizioni di termociclaggio: 94 °C per 3 min; {94 °C per 30 s; touchdown a 66 °C (-0,5 °C/ciclo) per 30 s; 72 °C per 30 s} x 16 cicli; {94 °C per 30 s; 58 °C per 30 s; 72 °C per 30 s} x 20 cicli; 72 °C per 5 min; mantenere a 12 °C.
      NOTA: Se si utilizza un reagente diverso, potrebbe essere necessario adattare le condizioni di termociclaggio.
    2. Caricare circa 2 µL del prodotto PCR su un gel diagnostico in agarosio al 1% in tampone tris-acetato-EDTA (TAE) per confermare l'amplificazione di Sce.white. La dimensione attesa dell'amplicone è di circa 1,7 kb.
    3. Purificare gli ampliconi Sce.white mediante PCR e misurare la concentrazione di DNA.
    4. Sequenziare il prodotto PCR purificato utilizzando il primer DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      NOTA: Di norma sequenziamo 40 ng di prodotto PCR purificato, ma questa quantità potrebbe variare in base alle istruzioni del servizio di sequenziamento.
  3. Analisi TIDE
    NOTA: La maggior parte degli errori derivanti dall'uso dello script R TIDE è dovuta a un formato del codice non corretto.
    1. Scaricare i pacchetti R richiesti (ovvero, sangerseqR e Biostrings) da Bioconductor.org. Utilizzare la barra di ricerca per individuare l'ultima versione di ciascun pacchetto.
    2. Analizzare i cromatogrammi di sequenza per assicurarsi che siano di buona qualità. Analizzare solo cromatogrammi con poco o nessun rumore di fondo prima del sito di rottura.
    3. Scaricare i file di traccia di sequenza (con estensione .ab1) e inserire tutti i file di traccia in una singola cartella del computer. Semplificare il più possibile i nomi dei file di sequenza (ad esempio, F1, Het2, Hom3) per facilitare le modifiche allo script nei passaggi successivi.
    4. Aprire lo script R TIDE (File Supplementare 1) nell'ambiente di sviluppo integrato RStudio (IDE; vedere la Tabella dei Materiali). Nel riquadro Source, individuare la riga che inizia con Control <- (File Supplementare 2A) e inserire esattamente il nome del file della sequenza di controllo così come salvato, compresa l'estensione .ab1, tra virgolette.
      NOTA: La “sequenza di controllo” è la sequenza ottenuta dalla PCR del ceppo parentale DR-white senza transgene I-SceI o induzione.
    5. Trovare la riga che inizia con samplename <- c( e inserire ciascun nome di file della sequenza tra parentesi (File Supplementare 2A). Includere l'estensione .ab1, inserire ciascun nome di file tra virgolette separate e separare i nomi con virgole.
    6. Salvare il file dello script R TIDE modificato nella stessa cartella dei file di sequenza da analizzare. Mantenere il nome del file semplice per evitare errori nei passaggi successivi.
    7. Nell'IDE, navigare fino alla cartella TIDE utilizzando la scheda File nel riquadro Output (File Supplementare 2B).
    8. Fare clic sul menu a discesa Altro e selezionare Apri Nuovo Terminale Qui (File Supplementare 2C). Un nuovo terminale si aprirà nel riquadro Console (in basso a sinistra).
    9. Nel terminale appena aperto, digitare “R” e premere Invio (File Supplementare 2D).
    10. Una volta avviato R nel terminale, eseguire lo script R TIDE digitando source("TIDE_analysis.R") e premere Invio (File Supplementare 2E). Il terminale eseguirà lo script e produrrà una rappresentazione grafica (File Supplementare 2F) e un file .csv contenente i dati grezzi per ciascun campione (File Supplementare 2G e File Supplementare 3). I file di output vengono salvati nella stessa cartella dello script R e dei file di sequenza.
      NOTA: Se lo stesso script R viene eseguito nuovamente, eventuali nuovi file .csv generati sovrascriveranno quelli precedenti. Se si eseguono più analisi sugli stessi file, creare una copia della cartella.
    11. Analizzare i dati aprendo ciascun file .csv.
      1. Interpretare i dati grezzi come proporzioni di indel nella sequenza del campione. La conversione genica per ricombinazione omologa dalla sequenza di riconoscimento I-SceI alla sequenza wild-type SacI produce la delezione canonica di 23 pb; lo script riporta questo valore HR su una riga separata in fondo all'output (File Supplementare 2G). Il valore 0-indel rappresenta l'assenza di DSB o NHEJ senza indel. Sommare tutti gli altri valori di indel per ottenere NHEJ con elaborazione. La somma di NHEJ con elaborazione e HR rappresenta il numero totale di eventi di riparazione di DSB rilevabili.
      2. Calcolare le proporzioni delle vie di riparazione tra gli eventi di riparazione di DSB rilevabili utilizzando le seguenti equazioni:
        Proporzione di NHEJ con elaborazione = (NHEJ con elaborazione) / (NHEJ con elaborazione + HR)
        Proporzione di HR = (HR) / (NHEJ con elaborazione + HR)
        NOTA: Per ogni condizione di ciascun esperimento genetico (ad esempio, mutanti omozigoti e controlli eterozigoti) vengono utilizzati circa 10–15 campioni. Ogni esperimento genetico viene ripetuto 2–3 volte e i dati individuali vengono raggruppati.

Risultati

Drosophila richiesta di Rad51 per la riparazione mediante ricombinazione omologa

Esperimenti sulla linea germinale di successo producono le classi fenotipiche previste mostrate nella Figura 3A e almeno 20 prole valutabili per ogni provetta. Fenotipi inattesi o meno di 20 prole valutabili indicano contaminazione o produttività insufficiente e devono essere esclusi come specificato al passaggio 1.4.3. Per l'analisi TIDE, i campioni di successo producono un amplicone di circa 1,7 kb e cromatogrammi con scarso rumore di fondo prima del sito di rottura; il DNA a basso rendimento o contaminato e cromatogrammi rumorosi sono subottimali e non devono essere analizzati.

Quando si utilizza il DR-bianco saggio con una sorgente induttibile di I-SceI mediante shock termico, la frequenza di riparazione HR in moscerini di tipo selvatico è del 38,5 ± 1,2% (media ± SEM), mentre l'SSA si verifica circa nel 3,2 ± 0,35%Figura 3B e File Supplementare 4). Rad51 (codificata dall'omologo spnA in Drosophila) è necessario per il passaggio di invasione del filamento nella ricombinazione omologa14,19Pertanto, la perdita di Rad51 dovrebbe risultare in una ricombinazione omologa inefficiente. In effetti, in un DmRad51-/- in condizioni di controllo, la riparazione HR si riduce all'1,3 ± 0,4%, con un conseguente aumento della riparazione SSA (34,5 ± 1,8%); Figura 3B e File Supplementare 4)14. Ciò è molto probabilmente dovuto al fatto che eventi di riparazione destinati alla ricombinazione omologa vengono invece riparati mediante l'appaiamento di filamenti singoli di bianco sequenze ripetute

Drosophila CtIP contribuisce a una riparazione HR efficiente nei tessuti somatici

L'algoritmo TIDE consente la misurazione della scelta del percorso di riparazione nelle cellule somatiche. In un contesto non mutante, la NHEJ con elaborazione si verifica nel 59,0% degli eventi di riparazione rilevabili, mentre la HR si verifica nel 41,0% (Figura 4B e File Supplementare 4). CtIP svolge un ruolo importante nell'avvio della riparazione HR promuovendo la resezione degli estremi del DNA20. Di conseguenza, in un contesto DmCtIP-/-, la scelta del percorso HR è notevolmente ridotta nelle cellule somatiche, passando dal 41,0% nei controlli eterozigoti al 10,9% nei mutanti omozigoti (Figura 4B e File Supplementare 4)16. Questo suggerisce che in Drosophila, CtIP contribuisce alla riparazione HR, ma non è essenziale per tale processo.

Schema del saggio DR-white che mostra i percorsi di riparazione del DNA; metodi HR, NHEJ, SSA con elementi genici Sce.white.
Figura 1: Saggio reporter di DSB DR-white e risultati della riparazione. Il saggio Direct Repeat of white contiene due copie non funzionali del gene white: Sce.white (con un'inserzione di 23 pb contenente il sito di riconoscimento I-SceI e che introduce un codone di stop prematuro) e iwhite (sequenza donatrice troncata alle estremità 5′ e 3′). L'incrocio di moscerini contenenti DR-white e un transgene I-SceI produce una rottura a doppio filamento (DSB) specifica per sito, analizzabile a livello fenotipico o molecolare. I fenotipi risultanti sono: (A) progenie con occhi bianchi (y+ w−), indicante assenza di DSB, ricombinazione omologa intersister o NHEJ; (B) progenie con occhi rossi (y+ w+), indicante ricombinazione omologa intracromosomica che ripristina la sequenza wild-type SacI dalla sequenza donatrice iwhite; e (C) progenie con corpo giallo e occhi bianchi (y− w−), indicante SSA o ricombinazione mitotica (CO). Figura adattata da Do et al.14. Abbreviazioni: CO = crossover; DR-white = Direct Repeat of white; DSB = doppia rottura del filamento (double-strand break); HR = ricombinazione omologa (homologous recombination); NHEJ = giunzione non omologa delle estremità (nonhomologous end joining); SSA = annealing della singola catena (single-strand annealing). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Schema di editing genico: ricombinazione omologa, scissione I-SceI, DR-white.mu, DNA, iwihiteΔ9, siti SacI.
Figura 2: Varianti del saggio DR-white. (A) Il saggio DR-white.mu contiene 28 SNP silenti nella sequenza donatrice iwhite.mu, determinando una divergenza di sequenza del 1,4% tra le ripetizioni dirette. La conversione genica di singoli polimorfismi varia tra gli eventi di ricombinazione omologa (HR) e può essere determinata mediante sequenziamento. (B) Il saggio DR-white con il donatore iwhiteΔ9 distingue la ricombinazione interomologa da quella intracromosomica. La ricombinazione omologa (HR) proveniente dal donatore intracromosomico iwhite ripristina la sequenza wild-type di SacI e produce progenie con occhi rossi. L'HR proveniente dal donatore interomologo iwhiteΔ9 produce progenie con occhi arancioni poiché la delezione di 9 pb riduce l'espressione di white. La figura è stata adattata da Do et al.14 e Fernandez et al.15. Abbreviazioni: DSB = interruzione a doppio filamento; HR = ricombinazione omologa; SNP = polimorfismo a singolo nucleotide. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Vie di riparazione genica in Drosophila, diagramma di incroci genetici, analisi del grafico a barre della distribuzione della prole.
Figura 3: Flusso di lavoro sperimentale per il rilevamento degli esiti della riparazione di rotture a doppio filamento (DSB) nella linea germinale premeiotica. (A) L'incrocio 1 combina il reporter DR-white (o un suo derivato) con un transgene I-SceI (in questo esempio, sul secondo cromosoma). La prole che contiene sia il saggio DR-white che il transgene I-SceI mantiene gli eventi di riparazione nei tessuti germinale e somatico. Per analizzare singoli eventi di riparazione nella linea germinale premeiotica, la prole portatrice di entrambi i transgeni viene incrociata con moscerini tester y w (incrocio 2), e la prole viene analizzata come descritto nella Figura 1. (B) Singoli eventi di riparazione di DSB nella linea germinale di moscerini wild-type (n = 106 linee germinali) e in mutanti omozigoti per DmRad51 (n = 46 linee germinali). **P < 0,01; ****P < 0,0001 mediante ANOVA a due vie seguita dal test multiplo di confronti di Sidak. Le barre rappresentano le medie; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). I dati sono stati rianalizzati da Do et al.14. Abbreviazioni: ANOVA = analisi della varianza; CO = ricombinazione (crossover); DSB = rottura a doppio filamento; HR = ricombinazione omologa; NHEJ = giunzione di estremità non omologa; SEM = errore standard della media; SSA = appaiamento a singolo filamento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Processo di editing genetico mediante sequenziamento Sanger con analisi TIDE; include un grafico di confronto tra metodi di riparazione.
Figura 4: Flusso di lavoro sperimentale per il rilevamento degli esiti della riparazione di rotture a doppio filamento (DSB) mediante l'analisi Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE). (A) Drosofile portatrici del transgene DR-white e di un transgene indotto I-SceI vengono analizzate mediante estrazione di DNA genomico (gDNA), amplificazione PCR del sito della DSB, sequenziamento Sanger e analisi TIDE con uno script R. (B) Dati rappresentativi ottenuti da mutanti DmCtIP-/- (n = 23) e controlli eterozigoti DmCtIP+/- (n = 31). Gli eventi di riparazione rilevabili sono calcolati come ricombinazione omologa (HR) più NHEJ con elaborazione, escludendo l'assenza di DSB e NHEJ senza indel. ****P < 0,0001 mediante ANOVA a due vie seguita dal test multiplo di confronti di Sidak. Le barre rappresentano le medie; le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). I dati sono stati ri-analizzati da Thomas et al.16. Abbreviazioni: ANOVA = analisi della varianza; DSB = rottura a doppio filamento; gDNA = DNA genomico; HR = ricombinazione omologa; NHEJ = giunzione non omologa delle estremità; PCR = reazione a catena della polimerasi; SEM = errore standard della media; TIDE = Tracking of Indels by DEcomposition. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File Supplementare 1: Script R TIDE per l'identificazione di inserzioni e delezioni nei cromatogrammi di sequenza rispetto a un controllo senza DSB. Il nome del file di controllo modificabile dall'utente, i nomi dei file campione e la sequenza bersaglio di I-SceI sono indicati verso la fine dello script. Gli input richiesti, i file di output e la loro interpretazione sono descritti nella sezione 2.3. Sono necessari i pacchetti sangerseqR e Biostrings.Cliccare qui per scaricare il file.

File supplementare 2: Guida con screenshot passo dopo passo al flusso di lavoro dello script R di TIDE. I pannelli illustrano le operazioni del software descritte nella sezione 2.3.Clicca qui per scaricare questo file.

File Supplementare 3: Esempio di output di TIDE e calcoli degli eventi di riparazione. Il valore 0-indel rappresenta l'assenza di DSB o NHEJ senza indel; la riga HR separata rappresenta il prodotto canonico con delezione di 23 pb; tutti gli altri percentuali di indel vengono sommati come NHEJ con elaborazione. La riparazione totale rilevabile viene calcolata come somma di HR e NHEJ con elaborazione.Cliccare qui per scaricare questo file.

File Supplementare 4: Dati grezzi alla base della Figura 3B e della Figura 4B, organizzati in fogli di lavoro modificabili separati. Questi dati sono stati riesaminati a partire dagli studi precedentemente pubblicati citati nelle legende delle figure corrispondenti.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La versatilità del sistema DR-white è un fattore fondamentale che contribuisce al suo impatto passato e futuro nel campo della riparazione del DNA. In primo luogo, la sequenza di integrazione attB all'interno del costrutto reporter DR-white consente ai ricercatori di indirizzare il reporter in numerose posizioni all'interno del genoma di Drosophila21, con diverse linee già disponibili22. In secondo luogo, la disponibilità di diversi transgeni I-SceI, come l'espressione indotta dallo shock termico tramite il promotore hsp70 (questo studio), l'espressione costitutiva tramite il promotore ubiquitin23 e l'espressione germinale premiotica tramite il promotore Bam24, offre numerosi contesti sviluppati e specifici per tessuto per esplorare la riparazione delle DSB. Indipendentemente dal transgene I-SceI utilizzato, gli incroci genetici devono essere pianificati attentamente per assicurare che il transgene I-SceI venga introdotto soltanto nell'incrocio finale, al fine di garantire un'induzione corretta delle DSB. È importante notare che le frequenze di riparazione possono variare notevolmente a seconda della posizione genomica del DR-white e/o del transgene I-SceI utilizzato. Esperimenti futuri potrebbero ulteriormente confrontare le posizioni genomiche e i transgeni I-SceI per determinare se sia il contesto genico o la specificità tissutale a guidare la riparazione delle DSB.

Un vantaggio particolare del saggio DR-white e dei suoi derivati è che possono identificare la riparazione delle DSB tramite ricombinazione omologa, NHEJ con elaborazione e, nella maggior parte dei casi, SSA. Sebbene progettato per rilevare fenotipicamente eventi di riparazione nella linea germinale, il sistema consente anche l'analisi di tessuti somatici mediante l'analisi algoritmica TIDE. Nonostante questi vantaggi, esistono alcune limitazioni di questo saggio che devono essere considerate. In particolare, il saggio DR-white potrebbe sottostimare le frequenze di HR. Come in altri saggi con reporter genetici che utilizzano DSB indotte da nucleasi, la riparazione tramite HR da un cromatidio sorella (HR intersorella) è indistinguibile da un evento senza DSB o da NHEJ senza elaborazione. Pertanto, almeno alcuni eventi della classe Nessuna DSB/NHEJ potrebbero in realtà essere eventi di HR. Considerando questa limitazione, i risultati che confrontano fattori genetici (come linee mutanti) devono essere interpretati con cautela. Altre limitazioni del saggio includono l'impossibilità di quantificare eventi premiotici che non hanno prodotto prole vitale. Ad esempio, eventi di DSB che potrebbero non essere stati riparati e che hanno portato alla morte cellulare non verranno rilevati nella prole. Sebbene la fertilità complessiva possa rappresentare una misura qualitativa della morte cellulare nella linea germinale, potrebbero essere necessari saggi cellulari (come il TUNEL). Inoltre, l'analisi con lo script R TIDE fornisce soltanto la proporzione di eventi rilevabili in una popolazione cellulare. Per determinare gli esiti specifici delle sequenze di indel, è necessario il sequenziamento di singoli eventi di riparazione mediante sequenziamento multiplex del DNA.

Il saggio DR-white ha già avuto un impatto profondo nello studio della riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB). La sua applicazione ha identificato fattori che contribuiscono alla riparazione delle DSB in organismi multicellulari, tra cui l'età25, il sesso26, la posizione della DSB22,26, la posizione della sequenza donatrice15, il ciclo cellulare e il tipo di tessuto26. Inoltre, abbiamo utilizzato questo saggio per identificare diverse proteine che influenzano la scelta della via di riparazione e/o la riparazione di sequenze divergenti in Drosophila, tra cui Msh627, Blm28, Rif116 e CtIP16,29. In effetti, l'ampio utilizzo di Drosophila come organismo modello genetico, dotato di proteine di riparazione del DNA conservate, fornisce un sistema semplice e multicellulare per indagare i fattori genetici, cellulari e organizzativi che contribuiscono alla riparazione delle DSB in contesti biologici complessi.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari o non finanziari da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo metodo è stato sviluppato mentre J.R.L. era titolare di una borsa di ricerca AFAR della American Federation for Aging Research. Questo lavoro è stato inoltre sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences (1R15GM110454 e 1R15GM129628) assegnato a J.R.L. Le figure sono state realizzate con l'assistenza di BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pestelli da 0,5 mL privi di RNAse/DNAseFisher Scientific12141363Per l'omogeneizzazione dei campioni per l'estrazione di DNA genomico
Palline di cotoneGenesee Scientific51-101Per la coltura standard di Drosophila
Incubatore refrigerato con Peltier per DrosophilaShel LabSRI6PFPer la coltura standard di Drosophila
Stirpe di Drosophila: y[1] w[1]Bloomington Drosophila  Stock CenterRRID:BDSC 1495
Stirpe di Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} LaRocque LabN/ACreata dal LaRocque lab mediante ricombinazione standard della stirpe RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) del Bloomington Drosophila Stock Center; disponibile su richiesta all'autore corrispondente
Stirpe di Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/ASaggio DR-white integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente
Stirpe di Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]LaRocque LabN/ASaggio DR-white.mu integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente
Stirpe di Drosophila: y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]LaRocque LabN/ADonatore iwhiteΔ9 integrato nella stirpe RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C); disponibile su richiesta all'autore corrispondente
Chiusure per bottiglie per Drosophila FlugsGenesee Scientific49-100Per la coltura standard di Drosophila
Stereomicroscopio fluorescente (RFP)TriTech ResearchSMT1-FLPer il trasferimento e il selezionamento standard di Drosophila "fly pushing" in base alla fluorescenza
Tappetino FlyStuff per DrosophilaGenesee Scientific59-172Per il trasferimento standard di Drosophila "fly pushing"
KimwipesKimberly-Clarke06-666A
Bagno termostatato MyBath 4LMidwest ScientificMB-2000-4Per lo shock termico 
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYPer la quantificazione del DNA
Mezzo Nutri-fly Bloomington FormulationGenesee Scientific66-121Per la coltura standard di Drosophila
Omogeneizzatore con motore cordless Pellet PestleDWK Life SciencesK749540-0000Per l'omogeneizzazione dei campioni per l'estrazione di DNA genomico
Bottiglie in polipropileneGenesee Scientific32-130Per la coltura standard di Drosophila
Provette in polistireneGenesee Scientific32-116Per la coltura standard di Drosophila, inclusa l'applicazione di shock termico
Primer/oligonucleotide DR-white_8fN/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficienteN/A5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
Primer/oligonucleotide DR-white_8aN/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficienteN/A5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
Primer/oligonucleotide DR-white_9fN/A; qualsiasi servizio di sintesi di oligonucleotidi è sufficienteN/A5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R StudioPositVersione 2023.06.1+524Versione scaricabile gratuita; qualsiasi versione di R Studio è accettabile, anche se i dati presentati sono stati analizzati con la  versione 2023.06.1+524
Pacchetti R Studio: BiostringsBioconductor.org (Versione 3.24)Versione 2.76.0Lo script R chiederà all'utente di installare questo pacchetto
Pacchetti R Studio: sangerseqRBioconductor.org (Versione 3.24)Versione 1.44.0Lo script R chiederà all'utente di installare questo pacchetto
SapphireAMP Fast PCRTakaraRR350B
StereomicroscopioLeicaM60Per il trasferimento standard di Drosophila "fly pushing"
Wizard SV Gel and PCR Clean up PromegaA9281

Riferimenti

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Rotture del DNA a doppio filamentoriparazione delle DSBricombinazione omologagiunzione delle estremit non omologheannealing a filamento singolomeganucleasi I SceIanalisi PCRanalisi TIDE
Video in arrivo

Articoli correlati