Il miR‑486‑3p è sottoregolato nei pazienti con infarto cerebrale acuto e sindrome da apnea ostruttiva del sonno, correla negativamente con la gravità della malattia e con i marcatori infiammatori e predice una prognosi sfavorevole a 1 anno, sostenendo il suo potenziale come biomarcatore diagnostico e prognostico.
Articolo di ricerca
Studio di coorte retrospettivo sui livelli di miR-486-3p nel sangue periferico di pazienti con infarto cerebrale acuto e sindrome delle apnee ostruttive del sonno
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infarto cerebrale acuto (ACI) complicato da sindrome delle apnee ostruttive nel sonno (OSAS) comporta un elevato rischio di recidiva di ictus e di morte, tuttavia biomarcatori efficaci per questa condizione comorbida rimangono limitati. Questo studio di coorte retrospettivo ha arruolato 270 pazienti con ACI tra novembre 2020 e dicembre 2023, suddivisi nel gruppo ACI (n = 100, indice apnea-ipoapnea [AHI] < 5) e nel gruppo ACI con OSAS (n = 170, AHI ≥ 5), con quest'ultimo ulteriormente stratificato in sottogruppi lieve (5 ≤ AHI < 15, n = 60), moderato (15 ≤ AHI < 30, n = 75) e grave (AHI ≥ 30, n = 35). L'espressione sierica di miR‑486‑3p è stata misurata mediante RT‑qPCR, mentre i marcatori infiammatori, inclusi il fattore di necrosi tumorale‑α (TNF‑α), la proteina C reattiva (PCR) e il fattore inducibile da ipossia‑1α (HIF‑1α), sono stati quantificati mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). Il valore diagnostico di miR‑486‑3p è stato valutato mediante analisi della curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore), e la sua rilevanza prognostica è stata analizzata tramite analisi di sopravvivenza di Kaplan‑Meier e modelli di regressione di Cox. Il miR-486-3p risultava marcatamente più basso nel gruppo comorbido e mostrava un'elevata capacità diagnostica (AUC = 0,927). In particolare, si osservava una chiara tendenza dose-dipendente nei sottogruppi per gravità di OSAS, con riduzione progressiva di miR‑486‑3p e aumento graduale di TNF‑α e PCR dal grado lieve al grave. Le analisi di correlazione di Spearman hanno rivelato una correlazione negativa tra miR‑486‑3p e AHI, punteggio NIHSS, TNF‑α e PCR. Al follow-up a 1 anno, i pazienti con bassa espressione di miR‑486‑3p presentavano esiti funzionali significativamente peggiori rispetto a quelli con alta espressione. La regressione di Cox multivariata ha confermato miR‑486‑3p come fattore protettivo indipendente per la prognosi a 1 anno. Questi risultati suggeriscono che miR‑486‑3p potrebbe rappresentare un nuovo biomarcatore diagnostico e prognostico nei pazienti con ACI e OSAS, probabilmente attraverso il suo ruolo regolatorio nell'infiammazione sistemica, e giustificano ulteriori validazioni in coorti prospettiche più ampie.
Introduzione
La sindrome delle apnee ostruttive nel sonno (OSAS) è una condizione comune caratterizzata da interruzioni ripetute della respirazione durante il sonno1. L'OSAS è spesso associata a comorbidità come disturbi metabolici, cardiovascolari, renali, polmonari e neuropsichiatrici2. Oltre alle sue associazioni generali con malattie cardiovascolari e metaboliche, l'OSAS rappresenta una minaccia specifica e grave nell'ictus ischemico acuto, complicando fino al 70% dei casi e aumentando il rischio di deterioramento neurologico, mortalità e ictus ricorrente3,4,5. L'infarto cerebrale acuto (ACI) costituisce la forma più comune di ictus. Sebbene negli ultimi anni siano stati compiuti notevoli progressi nel trattamento dell'ACI, la maggior parte dei pazienti soffre ancora di gravi disabilità o addirittura muore6. L'interazione sinergica tra ACI e OSAS peggiora il danno ischemico e l'infiammazione sistemica, aumentando in modo significativo il rischio di recidiva dell'ictus, disabilità e mortalità. Di conseguenza, identificare biomarcatori affidabili per la diagnosi precoce e la gestione di questa condizione comorbida ad alto rischio è di importanza fondamentale.
I microRNA (miRNA) hanno mostrato notevoli potenzialità come biomarcatori negli ultimi anni. Tra questi, miR-486-3p riveste grande importanza nelle malattie neurovascolari. Ricerche precedenti hanno dimostrato che l'espressione di miR-486-3p è inibita nell'apnea ostruttiva del sonno (OSA)7. Inoltre, il trattamento con esosomi contenenti la glicoproteina del virus della rabbia-miR-486-3p può alleviare i disturbi neurocomportamentali, l'edema cerebrale, i danni alla barriera ematoencefalica e la neurodegenerazione8, indicando che miR-486-3p svolge un ruolo nel danno cerebrale. Dopo un ictus ischemico acuto (ACI), le microglia nei tessuti cerebrali danneggiati si attivano, favorendo la secrezione di citochine infiammatorie5. L'OSAS provoca sintomi di ipossia intermittente, portando all'attivazione del sistema nervoso simpatico e allo stress ossidativo, innescando così una reazione sistemica a cascata di tipo infiammatorio9. miR-486-3p è strettamente correlato all'infiammazione10. Queste evidenze suggeriscono che miR-486-3p potrebbe fungere da collegamento molecolare tra l'ipossia correlata all'OSAS, l'infiammazione sistemica e il recupero post-ictus.
Tuttavia, il suo profilo di espressione, l'accuratezza diagnostica e il significato prognostico nei pazienti con ACI associati a OSAS non sono stati sistematicamente indagati, e rimane sconosciuto se esso correla con la gravità di OSAS o con mediatori infiammatori in modo dose-dipendente. Per colmare queste lacune, lo studio ha valutato il valore diagnostico di miR-486-3p per OSAS nei pazienti con ACI, ne ha esaminato la relazione dose-dipendente con la gravità di OSAS e con i marcatori infiammatori (TNF-α, CRP e HIF-1α), e ne ha valutato l'utilità prognostica per gli esiti funzionali a un anno. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio completo a dimostrare che miR-486-3p potrebbe fungere da biomarcatore diagnostico e prognostico innovativo per la comorbidità ACI-OSAS, potenzialmente attraverso la regolazione dell'infiammazione sistemica.
Protocollo
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Xuzhou (numero di approvazione: XYFY2024-KL238-01) ed è stato esentato dall'obbligo di ottenere un consenso informato aggiuntivo dai pazienti. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Pazienti e campioni
Questo studio è stato uno studio di coorte retrospettivo. Da novembre 2020 a dicembre 2023, un totale di 270 pazienti sottoposti a intervento di ACI presso l'Ospedale affiliato dell'Università Medica di Xuzhou sono stati reclutati consecutivamente. Il processo di selezione dei pazienti è riassunto nella Figura Supplementare 1. I pazienti idonei sono stati identificati mediante screening giornaliero di tutti i nuovi ricoveri nell'unità ictus. L'insorgenza dei sintomi entro 72 ore prima del ricovero è stata verificata esaminando le cartelle cliniche del servizio di emergenza e confermata da un neurologo certificato tramite anamnesi del paziente e colloquio con i familiari. La dimensione del campione è stata calcolata in base alla capacità di rilevare una differenza significativa nei livelli di miR-486-3p tra i gruppi. Assumendo una dimensione dell'effetto (effect size) di 0,5, un livello di significatività bilaterale (α) di 0,05 e una potenza statistica (1-β) dello 0,80, era richiesto un minimo di 64 pazienti per gruppo. Le dimensioni finali dei gruppi riflettono il reclutamento effettivo e la maggiore prevalenza di OSAS nella popolazione ictus, piuttosto che un'assegnazione predeterminata. I pazienti con ACI associato a OSAS sono stati sottoposti a follow-up prognostico per un periodo di 1 anno.
I criteri di inclusione erano: (1) Ictus ischemico acuto con insorgenza dei sintomi entro 72 ore prima del ricovero, confermato mediante risonanza magnetica. (2) Capacità di comprendere e completare i questionari dello studio e le valutazioni neurologiche. (3) La gravità dell'ictus è stata valutata mediante la scala del National Institutes of Health per l'ictus (NIHSS) al momento del ricovero. Quando il punteggio NIHSS è <5, viene classificato come ictus lieve; quando il punteggio NIHSS è compreso tra 5 e 20, viene considerato un ictus di gravità moderata. I principali criteri di esclusione includevano anamnesi di tumori maligni, grave disabilità fisica preesistente o disturbi psichiatrici, insufficienza cardiaca, polmonare o renale grave, interventi chirurgici maggiori o traumi nei 3 mesi precedenti, infezioni in atto o malattie autoimmuni; ictus precedente nei 6 mesi; terapia immunosoppressiva; e diagnosi o trattamento pregresso di OSAS (inclusa la terapia con pressione positiva continua delle vie aeree).
Per la conferma mediante risonanza magnetica, tutti i pazienti sono stati sottoposti a una risonanza magnetica cerebrale standard su sistema da 3,0 T, comprendente le seguenti sequenze: pesata in T1, pesata in T2, recupero dell'inversione con soppressione del liquido (FLAIR), imaging pesato in diffusione (DWI) e mappatura del coefficiente di diffusione apparente (ADC). Un'infarto acuto è stato definito dalla presenza di un segnale iperintenso in DWI con corrispondente segnale ipointenso in ADC. Tutte le risonanze magnetiche sono state interpretate da due neuroradiologi esperti, in cieco rispetto ai dati clinici, con le divergenze risolte per consenso. Il punteggio NIHSS è stato attribuito all'ammissione da neurologi certificati, prima di qualsiasi trattamento trombolitico o endovascolare.
Sangue venoso a digiuno è stato prelevato tra 24 e 48 ore dall'insorgenza dell'ictus, dopo un digiuno notturno di almeno 8 ore. I prelievi di sangue sono stati eseguiti tra le 6:00 e le 8:00 per ridurre al minimo le variazioni circadiane. Sono stati raccolti complessivamente 5 mL di sangue venoso periferico in provette sottovuoto rivestite con EDTA. Entro 2 ore dal prelievo, i campioni di sangue sono stati centrifugati a 1.500 × g per 15 minuti a 4 °C mediante una centrifuga refrigerata. Il sopranatante sierico è stato accuratamente frazionato in provette microcentrifuga da 1,5 mL prive di RNasi e immediatamente conservato a −80 °C fino all'estrazione dell'RNA. Sono stati rigorosamente evitati cicli ripetuti di congelamento-scongelamento; tutti i campioni sono stati sottoposti al massimo a un solo ciclo di congelamento-scongelamento prima dell'analisi.
Raggruppamento dei pazienti
I partecipanti sono stati raggruppati in base ai loro punteggi di AHI ottenuti dalla polisonnografia. Tutte le registrazioni sono state effettuate nel laboratorio del sonno dell'ospedale tra le 22:00 e le 6:00, per una durata minima di 7 h. I canali fisiologici monitorati includevano: elettroencefalografia (EEG; sei canali), elettrooculografia (EOG; due canali), elettromiografia (EMG; mento e tibiali anteriori bilaterali), elettrocardiografia (ECG; un derivazione singola), flusso aereo nasale (termistore e trasduttore di pressione), sforzo respiratorio toracico e addominale (plestimografia induttiva respiratoria) e pulsossimetria (SpO2). Il tecnico specializzato in studi del sonno ha calcolato l'AHI. La classificazione delle fasi del sonno e degli eventi respiratori è stata eseguita manualmente da un tecnico del sonno certificato secondo il manuale di scoring dell'American Academy of Sleep Medicine (AASM) del 2012, utilizzando il software Somnolyzer 24×7. Secondo i criteri diagnostici ampiamente accettati dell'American Academy of Sleep Medicine, un AHI di 5 o più eventi per ora rappresenta la soglia standard per la diagnosi di OSA. Pertanto, i partecipanti con un AHI < 5 sono stati classificati nel gruppo ACI (n = 100), mentre coloro con un AHI ≥ 5 sono stati classificati nel gruppo ACI combinato con OSAS (n = 170). Tra coloro con AHI ≥ 5 (gruppo ACI combinato con OSAS, n = 170), i pazienti sono stati ulteriormente stratificati in tre sottogruppi di gravità basati su criteri stabiliti: OSAS lieve (5 ≤ AHI < 15, n = 60), OSAS moderata (15 ≤ AHI < 30, n = 75) e OSAS grave (AHI ≥ 30, n = 35). Questa stratificazione ha permesso di valutare la relazione dose-dipendente tra carico ipossico, espressione di miR-486-3p e marcatori infiammatori. I pazienti con trattamento pregresso per OSAS (ad esempio CPAP) non sono stati inclusi nello studio per evitare interferenze con la misurazione basale dell'AHI.
Valutazione della prognosi
Il punto temporale a 1 anno permette la risoluzione degli effetti acuti e la manifestazione del carico ipossico cumulativo dell'OSAS, fornendo una finestra robusta per valutarne l'impatto prognostico. La prognosi clinica dei pazienti con ACI associato a OSAS è stata valutata mediante la scala di Rankin modificata (mRS) dopo l'esordio della malattia. Tutte le valutazioni mRS sono state effettuate da neurologi certificati, precedentemente sottoposti a un training standardizzato, utilizzando un modulo strutturato per l'intervista mRS. L'affidabilità tra valutatori è stata verificata con un coefficiente kappa >0,85. La valutazione al follow-up è stata condotta mediante una visita programmata in ambulatorio. Per i pazienti impossibilitati a presentarsi di persona, è stata effettuata un'intervista telefonica strutturata da un'infermiera di ricerca esperta, utilizzando un copione standardizzato. Tutti i valutatori erano a conoscenza cieca dei livelli di miR-486-3p e dello stato di OSAS dei pazienti. Per mantenere la coerenza tra le valutazioni ambulatoriali e telefoniche, entrambi i formati hanno utilizzato lo stesso questionario strutturato e tutti i valutatori hanno completato un'esercitazione di calibrazione prima dello studio. I pazienti con punteggi da 0 a 2 sono stati assegnati al gruppo con buona prognosi, mentre quelli con punteggi da 3 a 6 al gruppo con prognosi sfavorevole. Nessun paziente è andato perso al follow-up. SAQLI, ESS, TNF-α e HIF-1α sono stati valutati come variabili prognostiche, piuttosto che utilizzati per definire i gruppi prognostici. NIHSS, SAQLI ed ESS sono stati somministrati da personale di ricerca addestrato. SAQLI ed ESS sono stati somministrati come questionari compilati dall'intervistatore in una stanza tranquilla.
Indice di punteggio
NIHSS è una scala quantitativa per l'ictus11, in cui punteggi più elevati indicano una maggiore gravità dell'ACI. SAQLI è un questionario sulla qualità della vita in pazienti con OSA su una scala da 1 a 7, in cui punteggi più alti indicano una qualità della vita peggiore, che comprende attività quotidiane, interazioni sociali, stati emotivi, sintomi e sintomi correlati al trattamento12. ESS viene utilizzato per valutare la sonnolenza diurna auto-riferita dai pazienti, con un intervallo di punteggio compreso tra 0 e 24; un punteggio > 10 indica sonnolenza diurna13.
Estrazione dell'RNA e trascrizione inversa
L'RNA totale è stato estratto da 200 µL di siero utilizzando il reagente TRIzol. In breve, i campioni di siero sono stati mescolati con 800 µL di TRIzol, incubati a temperatura ambiente per 5 min e centrifugati a 12.000 × g per 15 min a 4 °C. Sono stati aggiunti 200 µL di cloroformio, la miscela è stata agitata vigorosamente per 15 s, incubata per 3 min e centrifugata nuovamente a 12.000 × g per 15 min a 4 °C. La fase acquosa è stata trasferita in una provetta nuova e l'RNA è stato precipitato con 500 µL di isopropanolo, incubato a −20 °C per 1 h e centrifugato a 12.000 × g per 10 min a 4 °C. Il pellet di RNA è stato lavato con etanolo al 75%, essiccato all'aria e risolubilizzato in 20 µL di acqua priva di RNasi. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate mediante uno spettrofotometro a microvolume, accettando un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 per le analisi successive. L'integrità dell'RNA è stata verificata mediante elettroforesi su gel di agarosio.
La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando 500 ng di RNA totale con il Reverse Transcription Kit in un volume di reazione totale di 20 µL, usando primer esameri casuali secondo il protocollo del produttore. La reazione di trascrizione inversa è stata effettuata a 25 °C per 10 min, 42 °C per 60 min e 70 °C per 5 min. Il cDNA risultante è stato conservato a −20 °C fino all'uso.
RT-qPCR
L'espressione di miR-486-3p è stata rilevata utilizzando un kit per PCR in tempo reale basato sul SYBR Green per la quantificazione di microRNA su un sistema di PCR quantitativa in tempo reale (qPCR). La miscela di reazione conteneva 10 µL di Master Mix 2× SYBR Green, 2 µL di stampo cDNA (diluito 1:5), 1 µL di ciascun primer (10 µM) e acqua priva di nucleasi fino a un volume finale di 20 µL. Le sequenze dei primer sono le seguenti (da 5'-3'): miR-486-3p-forward: TCGGCAGCGGGGCAGCUCAGU, reverse: CTCAACTGGTGTCGTGGA; e U6-forward: CTCGCTTCGGCAGCACA, reverse: AACGCTTCACGAATTTGCGT. Le condizioni di amplificazione in qPCR erano: 95 °C per 2 min, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 60 s. Ogni campione è stato analizzato in triplicato e in ogni corsa è stato incluso un controllo senza stampo. La specificità dell'amplificazione è stata confermata mediante analisi della curva di denaturazione da 60 °C a 95 °C. La soglia del ciclo (Ct) è stata determinata automaticamente dal software QuantStudio 6 Pro (v1.5) utilizzando l'impostazione della soglia predefinita. Il livello di miR-486-3p è stato calcolato con il metodo 2-ΔΔCT e normalizzato rispetto a U6. U6 è stato convalidato come gene di riferimento stabile nei nostri campioni di siero mediante l'algoritmo NormFinder per garantire coerenza tra i gruppi. I coefficienti di variazione inter-assay e intra-assay erano <5%.
ELISA
Le concentrazioni sieriche di proteina C reattiva (CRP), TNF-α e HIF-1α sono state determinate utilizzando un kit ELISA. Le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. In breve, i campioni sierici sono stati scongelati sul ghiaccio e diluiti 1:2 con il tampone di diluizione fornito. I campioni e gli standard sono stati aggiunti a piastre pre-ricoperte a 96 pozzetti (100 µL/pozzetto) e incubati per 2 h a 37°C. Dopo aver lavato quattro volte con 300 µL di tampone di lavaggio, sono stati aggiunti 100 µL di anticorpo di rilevamento biotinilato e incubati per 1 h a 37°C. Dopo un ulteriore lavaggio, sono stati aggiunti 100 µL di streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP) e incubati per 30 min a 37°C al buio. È stato quindi aggiunto il substrato cromogeno (tetrametilbenzidina, 100 µL) e incubato per 15 min a 37°C al riparo dalla luce. La reazione è stata arrestata con 50 µL di soluzione di arresto e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Le concentrazioni sono state calcolate a partire dalle curve standard ottenute con concentrazioni note di proteine ricombinanti. Ogni campione è stato misurato in duplicato e il valore medio è stato utilizzato per l'analisi. In ogni piastra sono stati inclusi campioni di controllo qualità forniti dal produttore; i risultati sono stati accettati solo se i valori del controllo qualità rientravano nell'intervallo specificato dal produttore.
Controllo di qualità e riproducibilità
Tutti i saggi di laboratorio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) per la RT-qPCR e con gli standard di reporting appropriati per il saggio ELISA. I principali strumenti sono stati calibrati secondo le tempistiche indicate dai produttori. In ogni serie di prove di RT-qPCR e di ELISA sono stati inclusi campioni di controllo positivo e negativo al fine di monitorare la variabilità tra piastre. Tutti i dati sono stati registrati e gestiti utilizzando Microsoft Excel, e l'autore corrispondente fornirà i protocolli sperimentali dettagliati e i dati grezzi su richiesta ragionevole.
Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando SPSS 23.0 e un software statistico e di grafica. La distribuzione normale è stata valutata mediante il test di Shapiro–Wilk. Le variabili continue sono riportate come media ± DS o mediana (IQR) e sono state confrontate con il test t o il test di Mann–Whitney U, a seconda delle circostanze. Le variabili categoriche sono state confrontate con il test χ2. Le correlazioni sono state esaminate mediante analisi di Pearson o di Spearman, in base alla distribuzione dei dati. Il valore predittivo è stato determinato utilizzando la curva ROC e verificato con una validazione incrociata a 5 ripiegamenti. Il valore soglia ottimale per miR-486-3p è stato determinato massimizzando l'indice di Youden. Sono state utilizzate analisi di correlazione di Pearson e di Spearman per valutare le correlazioni. Per l'analisi prognostica, i pazienti sono stati stratificati in base all'espressione mediana di miR‑486‑3p; le curve di Kaplan–Meier con il test del log-rank sono state utilizzate per confrontare gli esiti di sopravvivenza tra i gruppi. Le variabili con P < 0,1 nella regressione univariata di Cox sono state inserite nel modello multivariato di Cox. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Caratteristiche basali nel gruppo ACI e nel gruppo ACI combinato con OSAS
Come mostrato nella Tabella 1, il gruppo ACI era composto da 68 maschi e 32 femmine, con un'età media di 62,84 ± 12,65 anni, mentre il gruppo ACI combinato con OSAS includeva 116 maschi e 54 femmine, con un'età media di 61,31 ± 11,25 anni. Il gruppo ACI combinato con OSAS presentava valori significativamente più elevati di AHI, punteggi NIHSS e livelli di PCR. Tuttavia, i due gruppi mostravano distribuzioni comparabili per età, sesso, BMI, ipertensione, diabete mellito (DM), cardiopatia, dislipidemia, fumo, consumo di alcol, trombolisi e classificazione TOAST.
Variazioni di miR-486-3p e dei marcatori infiammatori nei sottogruppi di gravità dell'OSAS
Per valutare la relazione dose-dipendente tra la gravità dell'OSAS e le alterazioni molecolari, abbiamo suddiviso i 170 pazienti con ACI e OSAS in sottogruppi di lieve (5 ≤ AHI < 15, n = 60), moderata (15 ≤ AHI < 30, n = 75) e grave (AHI ≥ 30, n = 35) gravità in base ai criteri dell'AHI. Come mostrato in Figura 1A–C, è stato osservato un chiaro andamento graduale tra i quattro gruppi (ACI, lieve, moderata e grave OSAS). In particolare, l'espressione di miR-486-3p è diminuita progressivamente dal gruppo ACI al sottogruppo con OSAS grave (Figura 1A, P < 0,001 vs. gruppo ACI). Al contrario, i livelli sierici di TNF-α e PCR sono aumentati in modo progressivo con la gravità dell'OSAS (Figura 1B,C, P < 0,001 vs. gruppo ACI). Questi risultati indicano che il carico ipossico imposto dall'OSAS è associato a una soppressione graduale di miR-486-3p e a un parallelo incremento dell'infiammazione sistemica.
Valore diagnostico di miR-486-3p per OSAS in pazienti con ACI
miR-486-3p potrebbe avere un valore diagnostico significativo nell'ACI associato a OSAS, con un AUC di 0,927 (valore di cutoff ottimale pari a 0,845), e una sensibilità e specificità rispettivamente del 92,94% e del 79,00% (Figura 1D). Per valutare la robustezza del modello diagnostico ed escludere possibili casi di overfitting, è stata effettuata una validazione incrociata a 5 ripiegamenti (5‑fold cross‑validation) per l'analisi ROC di miR‑486‑3p. Come mostrato nel Tabella Supplementare 1, l'AUC medio sui cinque ripiegamenti è stato di 0,928 (con un intervallo compreso tra 0,847 e 0,969), valore altamente coerente con l'AUC apparente di 0,927 ottenuto dall'analisi originale. La sensibilità e specificità medie sono state rispettivamente dell'88,83% e dell'87,00%.
Correlazioni tra miR-486-3p e gravità dell'ictus e marcatori infiammatori nell'ACI combinata con OSAS
Nel gruppo ACI con OSAS, le analisi di correlazione di Spearman hanno rivelato che l'espressione di miR-486-3p era significativamente negativamente correlata al punteggio NIHSS (Figura 2A), alla TNF-α (Figura 2B) e alla PCR (Figura 2C).
Indicatori prognostici nei gruppi con prognosi favorevole e sfavorevole
I pazienti con ACI associata a OSAS sono stati suddivisi in un gruppo con prognosi favorevole e un gruppo con prognosi sfavorevole in base ai punteggi mRS. Come mostrato nella Tabella 2, i punteggi mRS, SAQLI ed ESS, nonché i livelli di HIF-1α e TNF-α, erano aumentati nel gruppo con prognosi sfavorevole.
Valore prognostico di miR-486-3p per gli esiti a un anno nei pazienti con ACI combinato a OSAS
I risultati della curva di Kaplan-Meier hanno indicato che livelli elevati di miR-486-3p erano associati a una buona prognosi, mentre livelli bassi erano associati a una prognosi sfavorevole (Figura 2D). Nell'analisi univariata, l'espressione di miR-486-3p e il punteggio NIHSS si sono dimostrati associati agli esiti clinici. Altre variabili, tra cui il punteggio SAQLI (P = 0,078), HIF-1α (P = 0,086), TNF-α (P = 0,072), età (P = 0,082), DM (P = 0,067), cardiopatia (P = 0,065) e AHI (P = 0,069), hanno mostrato associazioni marginalmente significative con la prognosi ed sono state anch'esse incluse nell'analisi multivariata di Cox. Nell'analisi multivariata, miR-486-3p è rimasto un fattore protettivo indipendente (HR = 0,437, IC 95%: 0,278–0,684, P < 0,001), mentre la cardiopatia (HR = 1,822, IC 95%: 1,070–3,104, P = 0,027) e il punteggio NIHSS (HR = 1,597, IC 95%: 1,008–2,529, P = 0,046) si sono rivelati fattori di rischio indipendenti per esiti clinici sfavorevoli (Tabella 3).
Riassunto dei risultati
In sintesi, lo studio attuale ha dimostrato che miR‑486‑3p è significativamente ridotto nei pazienti con ictus ischemico acuto (ACI) affetti da sindrome delle apnee ostruttive nel sonno (OSAS) e presenta un'elevata accuratezza diagnostica per l'identificazione dell'OSAS in questa popolazione. È stata osservata una chiara relazione dose-dipendente nei sottogruppi di gravità dell'OSAS, con una riduzione progressiva di miR‑486‑3p e un aumento graduale dei marcatori infiammatori (TNF‑α e PCR) dal grado lieve al grado grave di OSAS. Le analisi di correlazione hanno inoltre confermato che miR‑486‑3p è negativamente associato sia alla gravità dell'ictus (NIHSS) sia all'infiammazione sistemica. In modo significativo, un'espressione bassa di miR‑486‑3p ha predetto esiti funzionali sfavorevoli a un anno, e la regressione di Cox multivariata ha identificato miR‑486‑3p come un fattore protettivo indipendente dopo aggiustamento per possibili fattori confondenti, inclusi NIHSS e AHI. Nel complesso, questi risultati sostengono l'ipotesi che miR‑486‑3p possa fungere da biomarcatore diagnostico e prognostico innovativo per la comorbidità ACI-OSAS, potenzialmente attraverso il suo ruolo regolatorio nell'infiammazione sistemica.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili nel File Supplementare 1, che include le caratteristiche alla baseline, i livelli di espressione di miR‑486‑3p, le misurazioni ELISA e i dati di follow-up a 1 anno relativi al punteggio mRS per tutti i pazienti arruolati.
Figura 1: Variazioni dell'espressione di miR-486-3p e dei marcatori infiammatori nei sottogruppi di gravità di ACI combinata a OSAS e prestazioni diagnostiche di miR-486-3p per OSAS. (A) Espressione relativa di miR-486-3p nel gruppo ACI e nei sottogruppi di ACI combinata a OSAS. (B) Concentrazione sierica combinata di TNF-α. (C) Concentrazione sierica di CRP nel gruppo ACI (AHI < 5, n=100) e nei sottogruppi con OSAS lieve (5 ≤ AHI < 15, n=60), moderata (15 ≤ AHI < 30, n=75) e grave (AHI ≥ 30, n=35). (D) Curva ROC di miR-486-3p per discriminare i pazienti con ACI e OSAS da quelli senza OSAS. ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Correlazioni di miR-486-3p con la gravità dell'ictus e i marcatori infiammatori, e il suo valore prognostico per gli esiti a un anno. (A–C) Analisi di correlazione di Spearman tra l'espressione di miR-486-3p e il punteggio NIHSS, TNF-α e PCR. (D) Curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier per la probabilità di prognosi favorevole al follow-up a un anno, stratificate per il valore mediano dell'espressione di miR-486-3p. ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Variabile | ACI (n=100) | ACI e OSAS (n=170) | Valore P | |
| Età (anni) | 62,84 ± 12,65 | 61,31 ± 11,25 | 0,303 | |
| Sesso (maschio/femmina) | 68/32 | 116/54 | 0,968 | |
| IMC (kg/m2) | 24,74 ± 3,57 | 25,02 ± 3,47 | 0,531 | |
| Ipertensione, n (%) | 74 (74%) | 134 (78,82%) | 0,365 | |
| DM, n (%) | 22 (22%) | 43 (25,29%) | 0,543 | |
| Cardiopatia, n (%) | 13 (13%) | 25 (14,71%) | 0,698 | |
| AHI (volte/h) | 2,07 ± 1,42 | 19,95 ± 9,19 | < 0,001*** | |
| Punteggio NIHSS | 1,70 ± 1,18 | 4,05 ± 1,73 | < 0,001*** | |
| PCR (ng/mL) | 2,03 ± 0,17 | 3,01 ± 0,27 | < 0,001*** | |
| Grado di ACI (lieve/moderato) | 99/1 | 69/101 | < 0,001*** | |
| Dislipidemia (sì/no) | 52/48 | 96/74 | 0,478 | |
| Fumo (sì/no) | 48/52 | 91/79 | 0,382 | |
| Alcol (sì/no) | 40/60 | 87/83 | 0,076 | |
| Trombolisi (sì/no) | 38/62 | 81/89 | 0,124 | |
| TOAST | 0,487 | |||
| Cardioembolismo (n) | 22 | 36 | ||
| Occlusione dei piccoli vasi (n) | 18 | 28 | ||
| Aterosclerosi delle arterie di grosso calibro (n) | 13 | 25 | ||
| Ictus di eziologia indeterminata (n) | 5 | 19 | ||
| Ictus di altra eziologia determinata (n) | 42 | 62 | ||
Tabella 1: Caratteristiche basali dei pazienti con ACI con e senza OSAS. I dati sono espressi come media ± DS per le variabili continue o come n (%) per le variabili categoriali. I valori di P sono stati calcolati utilizzando il t-test indipendente per le variabili continue e il test chi-quadrato per le variabili categoriali. ACI, infarto cerebrale acuto; OSAS, sindrome da apnea ostruttiva del sonno; BMI, indice di massa corporea; DM, diabete mellito; AHI, indice apnea-ipoapnea; NIHSS, Scala per l'ictus dei National Institutes of Health; PCR, proteina C reattiva; TOAST, Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment.
| Variabile | Prognosi favorevole (n=97) | Prognosi sfavorevole (n=73) | Valore P |
| Punteggio mRS | 0.88 ± 0.84 | 4.55 ± 1.08 | < 0.001*** |
| Punteggio SAQIL | 2.59 ± 1.17 | 3.12 ± 1.48 | 0.009** |
| Punteggio ESS | 8.69 ± 2.76 | 10.05 ± 2.79 | 0.002** |
| HIF-1α (pg/mL) | 1159.94 ± 277.86 | 1283.88 ± 445.15 | 0.027* |
| TNF-α (pg/mL) | 121.4 ± 12.87 | 128.4 ± 11.67 | < 0.001*** |
Tabella 2: Indicatori prognostici nei gruppi con prognosi favorevole e sfavorevole di pazienti con ACI e OSAS. I pazienti sono stati suddivisi in gruppi con prognosi favorevole (mRS 0–2, n = 97) e prognosi sfavorevole (mRS 3–6, n = 73) in base ai punteggi mRS a 1 anno. I dati sono espressi come media ± DS. I valori di P sono stati calcolati utilizzando il test t indipendente. mRS, scala di Rankin modificata; SAQLI, indice di qualità della vita per apnea notturna di Calgary; ESS, scala di sonnolenza di Epworth; HIF‑1α, fattore inducibile da ipossia‑1α; TNF‑α, fattore di necrosi tumorale‑α.
| Variabile | HR | IC 95% univariato | P | HR | IC 95% multivariato | P | ||
| Inferiore | Superiore | Inferiore | Superiore | |||||
| miR-486-3p | 0,442 | 0,228 | 0,679 | <0,001 | 0,437 | 0,278 | 0,684 | <0,001 |
| Punteggio SAQLI | 0,628 | 0,375 | 1,053 | 0,078 | 0,713 | 0,416 | 1,22 | 0,217 |
| Punteggio ESS | 0,922 | 0,595 | 1,429 | 0,718 | ||||
| HIF-1α | 0,694 | 0,457 | 1,053 | 0,086 | 0,802 | 0,523 | 1,229 | 0,311 |
| TNF-α | 1,469 | 0,966 | 2,233 | 0,072 | 1,494 | 0,978 | 2,284 | 0,063 |
| Età | 1,445 | 0,955 | 2,188 | 0,082 | 1,29 | 0,845 | 1,97 | 0,238 |
| Sesso | 0,829 | 0,534 | 1,285 | 0,401 | ||||
| BMI | 1,196 | 0,786 | 1,821 | 0,402 | ||||
| Iperensione | 0,754 | 0,465 | 1,222 | 0,252 | ||||
| DM | 1,512 | 0,972 | 2,351 | 0,067 | 1,246 | 0,79 | 1,965 | 0,343 |
| Cardiopatia | 1,611 | 0,971 | 2,673 | 0,065 | 1,822 | 1,07 | 3,104 | 0,027 |
| AHI | 1,468 | 0,97 | 2,222 | 0,069 | 1,125 | 0,734 | 1,725 | 0,588 |
| Punteggio NIHSS | 1,588 | 1,027 | 2,455 | 0,037 | 1,597 | 1,008 | 2,529 | 0,046 |
| Dislipidemia | 1,178 | 0,776 | 1,788 | 0,442 | ||||
| Fumo | 0,895 | 0,593 | 1,35 | 0,596 | ||||
| Alcol | 1,116 | 0,738 | 1,689 | 0,603 | ||||
| Trombolisi | 1,259 | 0,834 | 1,902 | 0,272 | ||||
Tabella 3: Analisi di regressione di Cox univariata e multivariata per la prognosi sfavorevole a 1 anno nei pazienti con ACI e OSAS. HR, rapporto di rischio; CI, intervallo di confidenza; SAQLI, indice di qualità della vita per apnea notturna di Calgary; ESS, scala di sonnolenza di Epworth; HIF‑1α, fattore inducibile da ipossia‑1α; TNF‑α, fattore di necrosi tumorale‑α; BMI, indice di massa corporea; DM, diabete mellito; AHI, indice di apnea‑ipopnea; NIHSS, scala dell'ictus dei National Institutes of Health. Le variabili con P < 0,1 nell'analisi univariata sono state inserite nel modello di Cox multivariato.
Figura supplementare 1: Diagramma di flusso della selezione dei pazienti e della stratificazione per sottogruppi.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 1: Validazione incrociata a cinque ripetizioni per la validazione interna del valore diagnostico di miR‑486‑3p. AUC, area sotto la curva; CI, intervallo di confidenza. L'AUC media, la sensibilità e la specificità sono state calcolate come media aritmetica delle cinque ripetizioni.Cliccare qui per scaricare il file.
File Supplementare 1: I dati grezzi che supportano i risultati di questo studio.Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
I pazienti con OSAS sperimentano un ripetuto collasso e ostruzione delle vie aeree, che porta a ipossia intermittente (IH) e sonnolenza eccessiva diurna (EDS), condizioni in grado di causare danni neuronali14. L'OSA è molto diffusa dopo l'ACI, interessando circa il 72% dei pazienti, e peggiora significativamente il rischio cardiovascolare15L'ACI costituisce uno spettro di deficit neurologici derivanti da ischemia e ipossia cerebrale localizzata secondarie a un'insufficiente perfusione16L'ipossia intermittente, centrale nella patogenesi dell'OSAS, probabilmente sinergizza con il danno ischemico dell'ACI, amplificando il danno cerebrale. Tuttavia, le ricerche focalizzate specificamente su questo stato comorbido ad alto rischio sono scarse. Evidenze crescenti indicano che le miRNA svolgono ruoli fondamentali nella patogenesi sia dell'OSAS che dell'ACI.17,18È stato precedentemente osservato che il miR-486-3p potrebbe essere associato all'OSAS e all'ACI. Pertanto, abbiamo indagato il miR-486-3p come possibile collegamento molecolare tra OSAS e ACI. È importante notare che questa coorte è stata arruolata da novembre 2020 a dicembre 2023, un periodo che comprende la pandemia di COVID-19. Evidenze accumulate indicano che l'infiammazione sistemica persistente indotta dall'infezione da SARS-CoV-2 potrebbe aggravare il danno neuronale e favorire la progressione delle lesioni neurodegenerative.19,20Tuttavia, lo studio attuale non si concentra sull'infezione da SARS-CoV-2/COVID-19 e i nostri obiettivi e disegno della ricerca non sono correlati al COVID-19. È stato riscontrato un livello significativamente più basso di miR-486-3p sierico nell'ACI combinata con OSAS, fornendo una prima evidenza clinica del suo ruolo in questa comorbidità e sottolineando la necessità di ulteriori studi.
Il punteggio NIHSS può valutare la gravità di un ictus11. L'AHI nella polisonnografia è comunemente utilizzato per diagnosticare l'OSAS, e maggiore è il punteggio AHI, più grave risulta l'OSAS21. Date le sfide cliniche e logistiche associate alla polisonnografia, identificare biomarcatori accessibili per l'apnea ostruttiva del sonno nei pazienti con ictus è fondamentale22. I risultati attuali hanno indicato che il miR-486-3p presenta un notevole potenziale diagnostico per l'OSAS associata a ictus ischemico acuto, poiché i suoi livelli correlano in modo inverso sia con il punteggio AHI che con quello NIHSS, riflettendo così la gravità della malattia.
Da un punto di vista metodologico, questo studio dimostra la fattibilità dell'integrazione tra profilazione molecolare e fenotipizzazione clinica quantitativa in un singolo coorte, al fine di valutare simultaneamente l'accuratezza diagnostica, le relazioni dose-risposta e il valore prognostico. Questo approccio integrato potrebbe rappresentare un riferimento per futuri studi sulla scoperta di biomarcatori nelle comorbidità associate all'ictus, in cui complesse interazioni tra numerosi percorsi fisiopatologici spesso complicano le analisi tradizionali basate su un singolo endpoint.
L'ipossia intermittente (IH) è un tratto distintivo dell'OSAS e induce infiammazione e danno tissutale attivando vie di segnalazione pro-infiammatorie23. In modo critico, questo stato infiammatorio interagisce con e peggiora la patogenesi dell'ACI, in cui l'infiammazione post-ischemica media il danno cerebrale secondario24,25. Mediatori infiammatori chiave come il TNF-α e la PCR sono aumentati in entrambe le condizioni, collocandosi al crocevia delle cascate infiammatorie indotte dall'ipossia e innescate dall'ischemia, rendendoli molecole fondamentali nella patologia comorbida di ACI e OSA26,27,28. Pertanto, sono state rilevate le concentrazioni sieriche di TNF-α e PCR in pazienti con ACI associato a OSAS. In questo studio, le correlazioni negative osservate tra i livelli sierici di miR-486-3p e i livelli di TNF-α e PCR nell'ACI associato a OSAS suggeriscono un possibile legame tra questo miRNA e lo stato infiammatorio sistemico caratteristico di questa condizione comorbida.
L'OSAS ha un effetto molto negativo sulla qualità della vita, e il SAQLI è un questionario specifico per la qualità della vita in caso di OSA29. La sonnolenza diurna eccessiva (EDS) è un sintomo comune dell'OSAS, e l'OSAS associato all'EDS porta a un numero maggiore di eventi avversi e a una prognosi peggiore30. L'ESS è comunemente utilizzato per determinare la gravità della sonnolenza diurna31. Nell'OSAS, episodi ricorrenti di ipossia intermittente (IH) sono considerati un fattore di rischio indipendente per le malattie vascolari32. Inoltre, lo stress ossidativo derivante dall'IH può portare a complicanze come osteoporosi, aumento del rischio cardiovascolare e alterazioni neurologiche33. Pertanto, questo studio ha esaminato anche l'espressione di HIF-1α. Il riscontro di livelli elevati di HIF-1α nel gruppo con prognosi sfavorevole di ACI associato a OSAS è in linea con la fisiopatologia dell'ipossia intermittente cronica nell'OSAS. Inoltre, i risultati hanno mostrato che miR-486-3p e TNF-α erano correlati con la prognosi nell'ACI associato a OSAS, e livelli bassi di miR-486-3p erano associati a una prognosi sfavorevole. Questo suggerisce una potenziale cascata in cui l'HIF-1α indotto dall'IH sopprime miR-486-3p, contribuendo così alla upregolazione di mediatori infiammatori come il TNF-α, peggiorando ulteriormente il danno cerebrale nell'ACI.
Lo studio presenta ancora alcune limitazioni. Lo studio è limitato dall'assenza di gruppi di controllo (sani, solo OSAS), il che esclude la definizione di un intervallo normale per il miR-486-3p e la distinzione tra modifiche specifiche della comorbilità e quelle dell'OSAS da sola. Pertanto, lavori futuri dovranno includere questi gruppi per mappare completamente il profilo di espressione del miR-486-3p. Inoltre, non è sufficiente dedurre il meccanismo regolatorio specifico del miR-486-3p basandosi unicamente sulla correlazione. Verificheremo ulteriormente il suo meccanismo molecolare in esperimenti futuri.
Da un punto di vista traslazionale, l'elevata accuratezza diagnostica e il valore prognostico indipendente del miR‑486‑3p suggeriscono diverse potenziali applicazioni cliniche. Come biomarcatore basato sul sangue, potrebbe essere integrato nell'iter diagnostico routinario dell'ictus per identificare i pazienti con ACI che presentano OSAS sottostante, facilitando una precoce referenza alla polisonnografia e un intervento tempestivo. Il monitoraggio dei livelli di miR‑486‑3p durante le fasi acuta e subacuta potrebbe aiutare a seguire la dinamica infiammatoria e a stratificare i pazienti in base al rischio prognostico, consentendo strategie di riabilitazione personalizzate. Queste prospettive traslazionali richiedono ulteriori indagini in studi prospettici multicentrici. Nel complesso, il miR-486-3p potrebbe partecipare all'ACI associata a OSAS regolando i fattori infiammatori e possiede valore diagnostico e prognostico nell'ACI combinata con OSAS.
Dichiarazioni
Questo studio è stato finanziato da «Ricerca sulle tecnologie di prevenzione e trattamento dell'ictus» (n. WKZX2023CZ0143).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scanner di risonanza magnetica 3,0 T | Siemens Healthineers, Germania | MAGNETOM Skyra | Imaging cerebrale per la conferma di infarto cerebrale acuto |
| Microplacche ELISA a 96 pozzetti | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Cina | XBS-PLATE | Reazione antigene-anticorpo per la rilevazione mediante ELISA |
| Linee guida cliniche AASM per i disturbi respiratori del sonno | American Academy of Sleep Medicine | linea guida completa 2020 | Criteri standardizzati diagnostici per l'AHI e di stratificazione della gravità dell'OSAS |
| Indice di Qualità della Vita per l'Apnea Notturna di Calgary (SAQLI), versione cinese validata | Università di Calgary | Edizione tradotta del 2021 | Valutazione della qualità della vita nei pazienti con ACI complicata da OSAS |
| Tubi da prelievo venoso sotto vuoto EDTA-K2 da 5 mL | BD Biosciences, USA | 367863 | Prelievo di sangue venoso periferico per la separazione del siero |
| Scala della Sonnolenza di Epworth (ESS), versione cinese validata | Johns Hopkins University | Edizione rivista del 2018 | Valutazione della sonnolenza diurna nei pazienti con ictus |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software, USA | Versione 9.4.1 | Diagrammi di dispersione, boxplot, visualizzazione della curva ROC |
| Kit ELISA per CRP umana | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Cina | XBS-H001 | Rilevamento quantitativo della proteina C reattiva sierica |
| HIF-1 umanoα Kit ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Cina | XBS-H007 | Rilevamento quantitativo del fattore inducibile dall'ipossia-1 siericoα |
| TNF umanoα Kit ELISA | Shenzhen Xinbosheng Biological Co., Ltd., Shenzhen, Cina | XBS-H003 | Rilevamento quantitativo del TNF siericoα fattore infiammatorio |
| IBM SPSS Statistics 23.0 | IBM, Armonk, NY, USA | Versione 23.0 | Tutte le analisi statistiche (test t, correlazione, ROC, Kaplan–Meier, regressione di Cox |
| Spettrofotometro per micropiastre | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | Multiskan FC | Lettura dell'assorbanza per piastre ELISA a 450 nm |
| miR-486-3p & Primer per qPCR U6 | Sangon Biotech, Shanghai, Cina | Sintesi personalizzata | Amplificazione del gene bersaglio e del gene di riferimento per qPCR |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen GmbH, Hilden, Germania | 218073 | Amplificazione mediante PCR quantitativa in tempo reale di miR-486-3p e U6 |
| Scala del ictus del NIH (NIHSS), versione cinese validata | Istituto Nazionale dei Disturbi Neurologici e dell'Accidenti Cerebrovascolari (NINDS), USA | Edizione clinica standard | Valutazione iniziale della gravità neurologica nei pazienti con ictus ischemico acuto |
| Software per la valutazione del sonno PSG | BMC Medical Co., Ltd., Cina | v3.2 | Valutazione preliminare automatizzata dei disturbi respiratori durante il sonno |
| Sistema QuantStudio 6 Pro per PCR in tempo reale | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | QuantStudio 6 Pro | Amplificazione mediante RT-qPCR, acquisizione della curva di denaturazione, registrazione dei valori di Ct |
| Software QuantStudio per PCR in tempo reale | Applied Biosystems, USA | v1.7 | Esportazione dei dati grezzi di qPCR, analisi dei valori Ct |
| Centrifuga da banco refrigerata | Xiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., Hunan, Cina | TDZ5-WS | Separazione del siero dal sangue intero (2700 × g 4 °C) |
| Kit di Trascrizione Inversa RevertAid RT | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1691 | Trascrizione inversa del miRNA sierico in cDNA |
| Tubi microcentrifuga da 1,5 mL privi di RNasi | Axygen, USA | MCT-150-C | Aliquotamento e conservazione del siero separato |
| Reagente TRIzol per l'isolamento dell'RNA | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15596026 | Estrazione totale di RNA da campioni di siero umano |
| Congelatore a temperatura ultra-bassa | Haier Biomedical, Shandong, Cina | DW-86L388 | Lungo termine di conservazione dei campioni di siero a −80 °C |
| Monitor per polisonnografia YH-600B | BMC Medical Co., Ltd., Pechino, Cina | YH-600B | Monitoraggio del sonno notturno e calcolo dell'AHI per la diagnosi di OSAS |
Riferimenti
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