Lo studio è stato condotto in conformità con i requisiti etici dell'Ospedale Popolare di Shanghai Quarto, Scuola di Medicina, Università di Tongji, ed è stato approvato dal Comitato per la Revisione Istituzionale (Numero di approvazione: 2026013-001). I denti umani estratti utilizzati nello studio sono stati raccolti da pazienti sottoposti a estrazione dentale per motivi ortodontici o parodontali. A tutti i partecipanti è stato richiesto un consenso informato scritto prima della raccolta dei campioni. Per la realizzazione dello studio non è stata effettuata alcuna ulteriore procedura clinica. Lo studio è stato condotto nel rispetto dei requisiti istituzionali per l'utilizzo di denti umani estratti.
Preparazione del campione e criteri di selezione
Un totale di 141 denti permanenti monoradicolati (incisivi mandibolari e premolari) recentemente estratti è stato ricevuto dal Dipartimento di Stomatologia, affiliato all'Università Tongji presso lo Shanghai Fourth People’s Hospital. Tutti i denti erano stati rimossi per motivi ortodontici o parodontali. Il consenso informato è stato ottenuto da ciascun paziente. Sono stati inclusi nello studio i denti con radici di almeno dieci millimetri, misurate mediante sonda parodontale, denti integri senza lesioni cariose o fratture, formazione radicolare completa e curvatura radicolare inferiore ai dieci gradi secondo il metodo di Schneider. Sono stati esclusi i denti con canali multipli, calcificazione canalare, riassorbimento interno o trattamento endodontico pregresso. Dopo l'estrazione, tutti i residui visibili di tartaro e tessuto molle sono stati rimossi mediante un curetto parodontale. I denti sono quindi stati conservati in soluzione salina allo 0,9% a 4°C fino all'uso, per prevenire la disidratazione, e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti entro tre mesi dall'estrazione. I campioni sono stati assegnati ai gruppi sperimentali secondo una sequenza predeterminata di allocazione alternata. In particolare, i campioni sono stati assegnati sequenzialmente a ciascun gruppo in maniera alternata finché non è stata raggiunta la dimensione campionaria richiesta per ogni gruppo. Non è stata effettuata alcuna formale calcolazione statistica a priori della potenza. La dimensione campionaria è stata scelta sulla base di precedenti studi ex vivo comparabili, del numero di combinazioni di parametri di irradiazione valutate e della disponibilità di denti estratti idonei.
Preparazione e sterilizzazione del canale radicolare
La corona di ogni dente è stata rimossa a livello della giunzione amelo-cementizia utilizzando una sega diamantata a bassa velocità con raffreddamento continuo ad acqua, al fine di ottenere un segmento radicolare standardizzato di 10 mm. La lunghezza lavorativa è stata determinata posizionando un file K di dimensione 10 a 1 mm dal forame apicale. I canali radicolari sono stati preparati utilizzando il sistema rotante in nichel-titanio ProTaper Universal seguendo le istruzioni del produttore, con la sequenza S1, S2, F1, F2 e F3, fino al raggiungimento della dimensione apicale F3. Durante l'atto strumentale, i canali sono stati irrorati con circa 2 mL di ipoclorito di sodio al 5,25% dopo l'utilizzo di ogni file rotante, per un volume totale di irrigazione di circa 10 mL per canale. Un'irrigazione finale è stata eseguita con 5 mL di EDTA al 17% per 1 minuto, seguita da 5 mL di soluzione salina sterile. Il forame apicale è stato sigillato con un composito fluido in resina per creare un sistema canalare chiuso. Le radici preparate sono state sterilizzate mediante autoclave a 121°C per 20 minuti, conservate in soluzione salina tamponata al fosfato sterile (PBS) a 4°C ed inoculate con batteri entro 24 ore dalla sterilizzazione.
Stirpe batterica e condizioni di coltura
E. faecalis ATCC 29212 è stato utilizzato per stabilire il modello di canale radicolare infetto. La stirpe è stata coltivata su agar brain heart infusion (BHI) a 37°C per 24 h in condizioni aerobiche. Una singola colonia è stata trasferita nel brodo BHI e incubata a 37°C per 18–24 h. La sospensione batterica è stata aggiustata a circa 1,5 × 108 UFC/mL, equivalente a uno standard McFarland 0,5, utilizzando un valore di densità ottica a 600 nm (OD600) compreso tra 0,08 e 0,10.
Stabilimento di E. faecalis Modello di canale radicolare infetto
Per creare un modello di biofilm in canale radicolare infetto, la superficie esterna di ogni radice sterilizzata è stata ricoperta con due strati di smalto trasparente per unghie al fine di prevenire la penetrazione batterica attraverso il cemento. La regione apicale è stata ricoperta dopo aver sigillato il forame apicale con un composito resinoso fluido, mentre l'orifizio del canale è stato lasciato scoperto per consentire l'inoculazione batterica. Utilizzando una micropipetta sterile, 10 µL del E. faecalis la sospensione è stata trasferita in ciascun canale radicolare singolarmente per riempire l'intera lunghezza del canale senza fuoriuscire. I campioni inoculati sono stati quindi posizionati singolarmente in piastre da coltura sterili a 24 pozzetti, aggiungendo 1,5 mL di brodo BHI in ogni pozzetto. I campioni sono stati coltivati a 37°C in condizioni aerobiche per 21 giorni. Il terreno di coltura è stato rimosso e sostituito con brodo BHI sterile fresco ogni 2 giorni per fornire nutrienti necessari alla crescita batterica continuata e per rimuovere i detriti cellulari accumulati. Nessuna ulteriore inoculazione con E. faecalis è stata effettuata durante il cambio del terreno. Al termine del periodo di incubazione, tutti i campioni vitali sono stati lavati una volta con PBS per rimuovere i batteri planctonici debolmente aderenti prima dei test sperimentali. Due campioni selezionati casualmente sono stati utilizzati per visualizzare la formazione di biofilm maturo e la penetrazione batterica nei tubuli dentinali mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). I campioni sono stati fissati in glutaraldeide al 2,5% a 4°C per 24 h, lavati tre volte con PBS, disidratati mediante una serie crescente di etanolo (30%, 50%, 70%, 80%, 90% e 100%), con ogni passaggio della durata di 10 minuti, quindi divisi longitudinalmente, essiccati all'aria, montati su supporti di alluminio, rivestiti con oro mediante sputtering e analizzati al microscopio elettronico a scansione (SEM).
Gruppi sperimentali e protocolli di irradiazione laser
I 135 campioni di radice infetti sono stati suddivisi in tre gruppi sperimentali principali in base al sistema laser utilizzato: il Gruppo Laser a Diodo a 808 nm, il Gruppo Laser al Tulio a 1940 nm e il Gruppo Laser all'Erbio a 2940 nm. Ogni gruppo laser comprendeva 45 campioni, ulteriormente suddivisi in base ai parametri di irradiazione. Il laser a diodo è stato utilizzato con potenze medie di 1,0, 1,5 o 2,0 W, e ciascun livello di potenza è stato applicato per 10, 20 o 30 s, ottenendo nove sottogruppi con tre campioni per ciascun sottogruppo. Il laser al tulio è stato utilizzato con potenze medie di 1,5, 2,5 o 3,5 W, e ciascun livello di potenza è stato applicato per 10, 20 o 30 s, ottenendo anch'esso nove sottogruppi con tre campioni per ciascun sottogruppo. Il laser all'erbio è stato utilizzato in modalità impulso superbreve a una frequenza fissa di 15 Hz. Sono state applicate energie d'impulso di 10, 20 o 30 mJ per 10, 20 o 30 s, generando nove sottogruppi con tre campioni per ciascun sottogruppo. Sia il laser a diodo a 808 nm sia il laser al tulio a 1940 nm sono stati utilizzati in modalità continua.
In totale, sono stati inclusi sei campioni aggiuntivi, con tre campioni assegnati ciascuno ai gruppi di controllo negativo e positivo. Il gruppo di controllo negativo è stato trattato con soluzione salina sterile, mentre il gruppo di controllo positivo è stato trattato con ipoclorito di sodio al 5,25% (NaOCl) per 30 s.
Per i gruppi trattati con laser, è stato seguito un protocollo di irradiazione standardizzato. La fibra ottica è stata inserita nel canale radicolare fino alla lunghezza di lavoro ed è stata spostata con un movimento lento e continuo a spirale dalla direzione apicale a quella coronale per tutta la durata dell'irradiazione. Sono state utilizzate fibre o punte specifiche per ciascun laser, anziché una singola fibra intercambiabile. Il laser a diodo a 808 nm è stato applicato tramite una fibra terminale da 200 µm, il laser al tulio a 1940 nm tramite una fibra terminale da 200 µm e il laser all'erbio a 2940 nm tramite una punta radiale da 400 µm. La fibra o la punta di consegna è stata ritirata a una velocità approssimativa di 1 mm/s. Dopo aver raggiunto l'orifizio del canale, è stata riportata alla lunghezza di lavoro e il movimento a spirale da apicale a coronale è stato ripetuto fino al completamento della durata di irradiazione assegnata.
Per i laser al tulio e all'iterbio, i canali sono stati mantenuti riempiti con soluzione salina sterile durante l'irradiazione, al fine di simulare un'attivazione laser assistita dall'acqua. Circa 10 µL di soluzione salina sterile sono stati introdotti in ciascun canale per riempirlo fino al livello dell'orifizio canicolare prima dell'irradiazione. La soluzione salina è stata reintegrata prima di ogni ciclo di irradiazione, se necessario, per mantenere il canale pieno di liquido per tutta la durata del trattamento. Per il gruppo trattato con il laser a diodo, i canali sono stati asciugati con puntine di carta sterile prima dell'irradiazione, poiché il laser a diodo a 808 nm ha un'assorbimento relativamente basso nell'acqua ed è stato utilizzato per produrre un effetto fototermico antibatterico diretto all'interno del canale. Al contrario, i laser al tulio a 1940 nm e all'iterbio a 2940 nm presentano un assorbimento nell'acqua notevolmente maggiore e sono stati pertanto applicati in canali riempiti di soluzione salina per facilitare effetti fototermici e fotomeccanici mediati dall'acqua. Il trattamento laser è stato ripetuto una volta al giorno per tre giorni consecutivi.
Misurazione della Temperatura della Superficie Radicolare Esterna
Le variazioni di temperatura in tempo reale sulla superficie radicolare esterna sono state misurate durante il primo giorno di irradiazione laser. Ogni campione radicolare è stato fissato verticalmente su un treppiede a temperatura ambiente (22°C ± 1°C). Una termocoppia di tipo K collegata a un termometro digitale è stata posizionata a stretto contatto con il terzo medio della superficie radicolare esterna, perpendicolarmente all’asse longitudinale della radice. La sonda della termocoppia è stata posizionata mediante una pinza regolabile ed è stata fissata alla superficie radicolare con nastro adesivo resistente al calore per mantenere un contatto costante e stabile durante tutta la misurazione. La sonda della termocoppia è stata tarata prima di ogni sessione di misurazione utilizzando acqua bollente (100°C) e una miscela di ghiaccio e acqua (0°C). Le letture della temperatura sono state registrate a intervalli di 50 ms per tutta la durata dell’irradiazione (10, 20 o 30 s). Per ogni campione sono state misurate sia la temperatura di base sia la temperatura massima registrata durante o immediatamente dopo l’irradiazione laser. L’aumento di temperatura dalla temperatura di base alla temperatura di picco è stato calcolato come ΔT. Un valore di ΔT superiore a 10°C è stato considerato la soglia per possibili danni ai tessuti parodontali.
Valutazione microbiologica: conteggio delle colonie e tasso di inibizione
Per determinare l'effetto antibatterico dei trattamenti laser, sono stati prelevati campioni dopo ciascun trattamento laser. Il canale è stato asciugato con puntine di carta sterili. Per ogni campione è stato utilizzato un nuovo file sterile Hedström di dimensione 40 per ottenere scaglie di dentina dalle pareti del canale, prevenendo così la contaminazione incrociata tra i campioni. Ogni scaglia di dentina è stata trasferita in una provetta microcentrifuga separata contenente 1 mL di PBS sterile. Le provette sono state sottoposte a vortex energeticamente per 30 s per liberare i batteri dalle scaglie di dentina. Sono state preparate diluizioni seriali decrescenti da 10−1 a 10−6 trasferendo 100 µL della sospensione batterica in 900 µL di PBS sterile a ogni passaggio di diluizione. Aliquote (30 µL) di ciascuna diluizione sono state distribuite su piastre separate di agar brain heart infusion, che sono state incubate a 37°C per 24 h. Le colonie sono state contate e registrate come unità formanti colonie (CFU). Ogni diluizione è stata seminata in triplice replicazione e il valore medio del conteggio delle colonie ottenuto dalle tre piastre è stato utilizzato per l'analisi. Le piastre sono state codificate prima del conteggio e l'investigatore che ha effettuato il conteggio delle colonie era in cieco rispetto all'assegnazione dei trattamenti.

In questo caso, C è il conteggio medio di UFC del gruppo di controllo negativo (soluzione fisiologica) e T è il conteggio medio di UFC del gruppo sperimentale.
Analisi della curva di crescita batterica
L'effetto di vari trattamenti laser sulla cinetica della crescita batterica è stato studiato tracciando curve di crescita. Al terzo giorno dopo l'ultimo trattamento laser, i canali sono stati lavati con 5 mL di soluzione salina sterile. Il contenuto dei canali è stato raccolto mediante puntine di carta sterili, che sono state successivamente trasferite in una provetta da centrifuga contenente 5 mL di brodo BHI. La provetta è stata vortexata per sospendere i batteri nel brodo. La sospensione batterica è stata aggiustata a 1 × 106 CFU/mL. La concentrazione batterica è stata aggiustata in base all'OD600 misurazioni utilizzando una curva di calibrazione precedentemente stabilita per E. faecalis ATCC 29212 e successivamente verificata mediante conteggio delle colonie vitali. Un'aliquote di 200 µL di sospensione è stato aggiunto a ogni pozzetto di una micropiattaforma sterile da 96 pozzetti. Inoltre, 20 µL è stato aggiunto olio minerale sterile in ogni pozzetto per ridurre al minimo l'evaporazione. La micropiattaforma è stata posta in un spettrofotometro/incubatrice mantenuto a 37°Ce OD600 è stata misurata ogni ora per 24 h. Prima di ogni lettura dell'OD600, la piastra micropiastre è stata sottoposta a agitazione orbitale a circa 300 giri/min per 10 s per garantire una sospensione batterica omogenea. Ogni campione è stato analizzato in cinque pozzetti replicati.
Analisi statistica
Tutti i dati numerici sono riportati come media ± deviazione standard (SD). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS Versione 26.0. La distribuzione dei dati è stata valutata mediante il test di Shapiro–Wilk. L'analisi della varianza (ANOVA) è stata utilizzata per confrontare più di due gruppi, seguita dal test di Tukey per la differenza significativa onesta (HSD) per i confronti a coppie. I confronti tra due gruppi sono stati effettuati utilizzando un test t per campioni indipendenti. L'omogeneità della varianza è stata verificata mediante il test di Levene prima dell'applicazione dei test parametrici. Quando l'assunzione di omogeneità della varianza non era rispettata, è stata applicata la correzione di Welch, ove appropriato. L'importanza statistica è stata definita come P < 0,05. I grafici sono stati realizzati utilizzando GraphPad Prism Versione 9.0.