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Articolo di ricerca

Analisi correlazionale del Granulo Qiming con la rete centrata su CMKLR1 e l'infiammazione sistemica tramite l'asse intestino-retina nella retinopatia diabetica

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DOI:

10.3791/72700

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15 settembre 2026

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1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio dimostra che il Granulo Qiming (QMG) migliora la retinopatia diabetica (DR) modulando l'asse intestino-retina. Il QMG ha rimodellato la microbiota intestinale, soppresso l'infiammazione sistemica e ripristinato la rete regolatoria centrata su CMKLR1, invertendo così i danni istopatologici retinici. Questi risultati collocano il QMG come una promettente strategia terapeutica a livello dell'asse intestino-retina per la DR.

Abstract

La retinopatia diabetica (DR) è una complicanza neurovascolare determinata da iperglicemia cronica e infiammazione sistemica, con prove emergenti che evidenziano l'asse intestino-retina come un bersaglio terapeutico fondamentale ma ancora poco sfruttato. Questo studio indaga se il Qiming Granule (QMG) eserciti un'efficacia protettiva contro la DR modulando l'asse intestino-retina. Topi C57BL/6 sono stati assegnati casualmente a diversi gruppi sperimentali e sottoposti a interventi distinti. Le alterazioni istopatologiche retiniche sono state valutate mediante colorazione con ematossilina-eosina (HE). I livelli sierici di citochine infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) sono state misurate mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). L'espressione delle principali proteine regolatrici (CMKLR1, Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53) in entrambi i tessuti retinici e colici è stato rilevato mediante immunoblotting Western (WB). La composizione e la diversità della microbiota intestinale sono state caratterizzate mediante sequenziamento completo del gene 16S rDNA. Sono state effettuate analisi di correlazione per valutare le relazioni tra la microbiota intestinale e i fattori infiammatori o le proteine chiave. Il trattamento con QMG ha migliorato le alterazioni istopatologiche retiniche, come dimostrato dal ripristino dell'architettura laminare retinica e dal recupero parziale del numero di cellule gangliari retiniche (P < 0,001) e inversione dell'assottigliamento retinico (P < 0,01). Ha inoltre notevolmente ridotto i livelli sierici di IL-1β, IL-6 e TNFα livelli (P < 0,0001). Lungo l'asse intestino-retina, il QMG ha invertito l'espressione anomala di proteine regolatrici chiave, in particolare la rete centrata su CMKLR1 (Wnt5a, PPAR-γ, AP-1, TP53). Inoltre, il QMG ha ripristinato la composizione, la diversità e la funzione del microbiota intestinale, e analisi di correlazione hanno rivelato che il QMG collega l'infiammazione sistemica a queste proteine regolatorie per modulare l'asse intestino-retina. Questo studio fornisce evidenze farmacologiche preliminari che il QMG migliora la DR attraverso l'attivazione della rete regolatoria centrata su CMKLR1 (inclusi Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 e TP53) e l'infiammazione sistemica attraverso l'asse intestino-retina, posizionando il QMG come una promettente strategia terapeutica intestino-retina per la retinopatia diabetica.

Introduzione

La retinopatia diabetica (DR), una delle complicanze microvascolari più comuni del diabete mellito (DM), è una delle principali cause di cecità negli adulti in età lavorativa a livello mondiale1. A livello globale, la DR colpisce circa il 20-30% della popolazione affetta da DM2. L'iper-glicemia cronica guida la patogenesi della DR innescando una cascata di eventi patologici, tra cui il deterioramento dell'accoppiamento neurovascolare, risposte infiammatorie accentuate e lo stress ossidativo3. Recentemente, alterazioni nella diversità e composizione della microbiota intestinale sono state osservate in pazienti diabetici con retinopatia rispetto a quelli senza4,5. Di conseguenza, l'asse intestino-retina—una rete di comunicazione bidirezionale che collega l'omeostasi intestinale alla salute retinica—si è affermata come un nuovo fattore coinvolto nella progressione della DR. Tuttavia, i mediatori molecolari specifici che traducono i segnali dell'asse intestino-retina in patologia retinica rimangono in gran parte non caratterizzati, limitando l'identificazione di biomarcatori affidabili e di bersagli terapeutici.

L'asse intestino-retina definisce una complessa rete di comunicazione bidirezionale tra la microflora intestinale e i suoi metaboliti con i tessuti retinici attraverso vie immunologiche, metaboliche, neuroendocrine e vascolari, modulandone così l'equilibrio omeostatico6. Dal punto di vista molecolare, l'asse intestino-retina è caratterizzato dalla disregolazione di proteine chiave coinvolte nella risposta allo stress e nella determinazione del destino cellulare, in particolare AP-1 e TP537,8,9. Inoltre, CMKLR1, un recettore chemochinico fondamentale, si pone come un importante mediatore della disfunzione endoteliale e della deregolazione metabolica, stabilendo un collegamento cruciale tra alterazioni della microflora intestinale e la patogenesi della retinopatia diabetica10. In particolare, la via di segnalazione Wnt regola in modo duale il mantenimento dell'omeostasi vascolare retinica e della funzione della barriera epiteliale intestinale11, mentre la segnalazione PPAR agisce come regolatore principale delle risposte infiammatorie e dei processi metabolici in entrambi i tessuti oculare e intestinale12,13. Questi fattori molecolari costituiscono collettivamente una rete di segnalazione interconnessa all'interno dell'asse intestino-retina, offrendo nuove prospettive meccanicistiche e opportunità terapeutiche per le complicanze correlate al diabete. Pertanto, intervenire sulle alterazioni strutturali e funzionali lungo questo asse rappresenta una strategia promettente per la gestione della retinopatia diabetica (DR).

La medicina tradizionale cinese (MTC) ha storicamente svolto un ruolo significativo nel trattamento del diabete e della relativa retinopatia, con decisioni terapeutiche basate sulla differenziazione dei sindromi14. Il Granulato Qiming (QMG), composto da Astragalus membranaceus, Pueraria lobata, Rehmannia glutinosa, Lycium barbarum, Senna obtusifolia, Leonurus japonicus, Typha angustifolia e Whitmania pigra, è ampiamente utilizzato nel trattamento della RD. Approvato dall'Amministrazione Nazionale Cinese per i Prodotti Farmaceutici (numero di approvazione Z20090036), il QMG ha completato con successo studi clinici ed ha ottenuto l'autorizzazione all'immissione in commercio. Il QMG esercita effetti protettivi prevenendo l'ispessimento della membrana basale nei capillari retinici, riducendo il danno ai periciti e alla microvascolatura retinica e mantenendo la morfologia patologica locale dell'occhio15, risultando così una terapia promettente per il trattamento della RD. Agendo su proteine chiave e fattori infiammatori, i componenti attivi del QMG esercitano effetti antinfiammatori, antiossidanti e antiapoptotici, fornendo una base meccanicistica alla sua modulazione dell'asse intestino-retina16. Queste proprietà forniscono una base meccanicistica al potenziale effetto modulante del QMG sull'asse intestino-retina, tuttavia pochi studi hanno esplorato questo legame. Pertanto, lo scopo di questo studio è confermare l'efficacia del QMG nella modulazione dell'asse intestino-retina, fornendo evidenze sperimentali del suo potenziale terapeutico nella RD.

Questo studio collega le previsioni teoriche con dati sperimentali in vivo per validare l'efficacia del QMG nella modulazione dell'asse intestino-retina. Questi risultati dimostrano che il QMG migliora la retinopatia diabetica accoppiando la rete regolatoria centrata su CMKLR1 (inclusi Wnt5a, PPAR-γ, AP-1 e TP53) all'infiammazione sistemica attraverso l'asse intestino-retina, posizionando il QMG come una promettente strategia terapeutica mirata all'asse intestino-retina per la retinopatia diabetica. L'abstract grafico è mostrato in Figura 1.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida ARRIVE. Lo studio è stato approvato dal Comitato di Revisione Etica di Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd. (IACUC ISSUE SYST-2024-011).  Una cronologia dettagliata dell'esperimento che riassume il disegno dello studio è fornita nella Figura Supplementare 1.

Preparazione e trattamento degli animali

I topi sono stati anestetizzati profondamente mediante inalazione di isoflurano al 2%. In profonda anestesia, il sangue è stato prelevato tramite enucleazione retro-orbitale. Immediatamente dopo il prelievo del sangue, i bulbi oculari sono stati enucleati per l'isolamento del tessuto retinico. Successivamente, è stata eseguita la dislocazione cervicale in profonda anestesia per garantire l'eutanasia. I tessuti del colon sono stati quindi dissecati immediatamente. Gli animali che presentavano eventi avversi sono stati immediatamente rimossi dallo studio e hanno ricevuto le opportune cure veterinarie.

Randomizzazione e cecità

Topi maschi C57BL/6, di 5 settimane di età e del peso compreso tra 20 e 30 grammi, sono stati ospitati in condizioni strettamente controllate, comprese temperatura e umidità. Dopo una settimana di ambientamento, i topi C57BL/6 sono stati assegnati casualmente a tre gruppi (gruppo controllo, gruppo modello e gruppo di intervento) mediante una sequenza di numeri casuali generata al computer. La sequenza di randomizzazione è stata generata da un ricercatore non coinvolto nella manipolazione degli animali né nella valutazione degli esiti.

Per garantire la cecità, tutte le operazioni di cura degli animali, somministrazione dei farmaci e raccolta dei dati sono state eseguite da ricercatori ignari dell'assegnazione ai gruppi. Le assegnazioni codificate ai gruppi sono state rivelate solo al termine di tutti gli esperimenti e delle analisi statistiche. La cecità è stata applicata a: il tecnico che ha effettuato la gavaggio orale; il patologo che ha valutato l'istologia retinica; e l'analista che ha quantificato le bande del Western blot (WB).

Calcolo della dimensione del campione

La dimensione del campione è stata determinata sulla base di un esperimento preliminare volto a valutare il numero di cellule gangliari retiniche (RGC) nelle stesse condizioni sperimentali. Assumendo un livello di significatività bilaterale (α) pari a 0,05 e una potenza statistica (1-β) del 0,80, erano necessari almeno 5 topi per gruppo per rilevare una differenza clinicamente rilevante nel numero di RGC tra il gruppo modello e il gruppo sottoposto all'intervento. Considerando un tasso di abbandono potenziale di circa il 20%, ogni gruppo è stato fissato a 6 topi.

Creazione di animali diabetici

Al gruppo controllo è stata somministrata una dieta standard, mentre ai gruppi di intervento e modello è stata somministrata una dieta ricca di grassi e zuccheri (HFHSD) per un periodo di quattro settimane. Al termine di questo periodo alimentare, i gruppi di intervento e modello hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale con una soluzione al 1% di Streptozotocina (STZ) a un dosaggio di 35 mg/kg17,18,19,20. Dopo settantadue ore dall'iniezione, i topi che presentavano livelli di glucosio nel sangue a digiuno non forzato superiori a 16,7 mmol/L erano considerati modelli di DM indotti con successo e venivano selezionati per ulteriori esperimenti. Gli animali con DM hanno proseguito con la dieta ricca di grassi e zuccheri per ulteriori quattro mesi, mentre il gruppo controllo ha mantenuto la propria dieta standard.

Convalida tassonomica e valutazione della qualità

Gli otto ingredienti presenti nel QMG sono stati validati tassonomicamente utilizzando il Modernized Plant Names Search (MPNS, http://mpns.kew.org/mpns-portal/). La qualità della segnalazione della composizione del QMG è stata valutata mediante lo strumento ConPhYMP.

Metodi di somministrazione

Nel gruppo di intervento, gli animali sono stati trattati per via orale con QMG. QMG è stato acquistato dalla Zhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd. (Numero cinese di autorizzazione farmaceutica nazionale Z20090036). La sospensione di QMG è stata preparata mescolando uniformemente QMG con acqua distillata. I topi del gruppo di intervento hanno ricevuto la sospensione mediante sondino gastrico, in un volume equivalente a quello dei gruppi modello e di controllo. Il dosaggio è stato calcolato in base alla dose terapeutica clinica singola di 4,5 g per un adulto di 60 kg (dose unitaria standard della formulazione commerciale), utilizzando il metodo di normalizzazione per area della superficie corporea (BSA) raccomandato dalla FDA e da Reagan-Shaw21. Il fattore di conversione tra esseri umani adulti (Km = 37) e topi (Km = 3) è pari a 12,33, ottenendo così una dose per il topo di 0,9 g/kg di peso corporeo. Il gruppo modello e il gruppo di controllo hanno ricevuto un volume equivalente di soluzione salina fisiologica mediante sondino gastrico. Il trattamento è stato effettuato quotidianamente tra le 9:00 e le 11:00 per un periodo consecutivo di 3 mesi.

Osservazione e indicatori di prova

Monitoraggio generale dei segni vitali

I segni vitali generali e gli indicatori fisiologici, inclusi il peso corporeo, i livelli di glucosio nel sangue, il consumo di acqua e cibo, la diuresi, i livelli di attività e il comportamento, la temperatura corporea, nonché lo stato del pelo e della pelle, sono stati osservati e registrati sistematicamente al fine di valutare in modo completo gli interventi terapeutici e rilevare eventuali complicanze.

Osservazione dei cambiamenti morfologici nella retina mediante analisi con colorazione HE

Tutti i campioni sono stati processati mediante un disidratatore automatico utilizzando una serie di soluzioni di etanolo e xilene dopo la fissazione, seguita dall'inclusione in paraffina. Successivamente, sono state effettuate sezioni di 4 µm in paraffina, colorate con ematossilina-eosina e quindi montate con gomma neutra. Le immagini retiniche sono state acquisite mediante uno scanner 3DHISTECH Pannoramic SCAN. L'analisi delle immagini e la misurazione dei dati sono state eseguite con Image-Pro Plus.

Rilevamento di IL-6, TNF-α e IL-1β sieriche mediante analisi ELISA

I campioni di sangue sono stati prelevati mediante enucleazione retro‑orbitale. Il siero è stato separato mediante centrifugazione a 1.000 × g per 15 minuti a 4 °C e conservato a -80 °C fino all'analisi. I livelli sierici di IL‑1β, IL‑6 e TNF‑α sono stati misurati seguendo le procedure standard, compresa l'equilibratura dei reagenti, l'aggiunta del campione, l'incubazione, il lavaggio, l'aggiunta di coniugato e substrato, l'interruzione della reazione, la misurazione della densità ottica e il calcolo della concentrazione in base a una curva standard. La densità ottica è stata letta a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche, e le concentrazioni delle citochine sono state calcolate in base alle curve standard.

Rilevamento delle principali proteine regolatrici nella retina e nel colon mediante analisi WB

Sono stati effettuati tre replicati biologici indipendenti su una singola membrana e successivamente sono state ricercate le proteine bersaglio. Tutti i replicati sono stati ottenuti da un singolo gruppo di animali sacrificati contemporaneamente. Quando il peso molecolare di una proteina bersaglio era troppo simile a quello della GAPDH (differenza <5 kDa), le analisi sono state eseguite su membrane distinte per evitare sovrapposizioni di segnale. Ogni membrana è stata sottoposta a sonda esclusivamente per la proteina bersaglio o per la GAPDH al fine di garantire una quantificazione accurata. Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi primari: anticorpo policlonale anti-GAPDH policlonale anticorpo (1:5000), anticorpo policlonale anti-CMKLR1 (1:1000), anticorpo policlonale anti-Wnt5a (1:1000), anticorpo policlonale anti-TP53 (1:1000), anticorpo monoclonale anti-AP-1 (1:5000) e anticorpo policlonale anti-PPAR gamma (PPAR-γ) (1:1000). Le proteine totali sono state ottenute mediante lisi cellulare seguita da centrifugazione. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando il saggio BCA. Le proteine estratte sono state separate mediante elettroforesi su gel di SDS-PAGE al 12% e successivamente trasferite su membrane. Le membrane sono state bloccate in TBST contenente il 5% di latte scremato e incubate con gli opportuni anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP anti-coniglio o anti-topo in un rapporto di diluizione di 1:10.000. Infine, le bande proteiche sono state visualizzate e analizzate mediante imaging chemiluminescente. Durante la visualizzazione e l'elaborazione dei dati, le membrane sono state ritagliate orizzontalmente per rimuovere le regioni di peso molecolare non rilevanti, mantenendo tutte le corsie campione senza eliminare le aree intercorrenti tra le corsie. Durante il ritaglio per rimuovere le regioni di gel non rilevanti, potrebbe verificarsi una leggera distorsione ai bordi.

Rilevamento della microbiota intestinale mediante analisi del sequenziamento del 16S rDNA

Campioni fecali freschi sono stati raccolti da ciascun topo prima delle procedure terminali. I topi sono stati posizionati singolarmente in gabbie sterili per 10–15 minuti per consentire la defecazione spontanea. I pellet fecali sono stati immediatamente raccolti con pinze sterili, trasferiti in provette sterili da 1,5 mL, congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 °C fino all'estrazione del DNA. Tutte le procedure sono state eseguite in condizioni sterili per minimizzare la contaminazione incrociata. L'intervallo tra defecazione e congelamento è stato mantenuto entro i 10 minuti per garantire l'integrità microbica. I campioni di DNA genomico fecale (gDNA) sono stati purificati utilizzando il kit di estrazione del gDNA fecale, seguiti dall'amplificazione completa del gene 16S rDNA mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) con primer universali 8F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’) e 1492R (5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’). I prodotti della PCR sono stati successivamente analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio, purificati e quantificati per applicazioni successive. Il sequenziamento ad alto rendimento è stato effettuato sul sequenziatore Nanopore GridION. Il processo di analisi dei dati ha incluso la chiamata delle basi, il controllo di qualità dei dati, l'annotazione delle specie, la costruzione dell'albero filogenetico, l'analisi della comunità, l'analisi della diversità alfa e beta e l'analisi delle specie differenzialmente abbondanti e la previsione della funzione della comunità. Diversi strumenti e database, come NanoFilt, Usearch, il linguaggio di programmazione R, Python e il database SILVA, sono stati utilizzati durante l'analisi.

Analisi della correlazione tra l'asse intestino-retina, l'infiammazione sistemica e la microbiota intestinale a più livelli

Per esplorare le potenziali associazioni tra la microbiota intestinale a più livelli e le citochine infiammatorie sieriche e le proteine regolatrici chiave, è stata effettuata un'analisi di correlazione utilizzando la piattaforma Luoning Bio-Cloud. Inizialmente, i dati sull'abbondanza delle specie ai livelli di Regno, Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere e Specie sono stati estratti dai risultati del sequenziamento. I fattori fisicochimici, inclusi le citochine infiammatorie sieriche e i livelli di espressione proteica, sono stati raccolti in un file di fattori ambientali. Per garantire l'affidabilità e la visualizzazione delle correlazioni, i dati sono stati normalizzati al fine di eliminare le differenze di scala tra l'abbondanza microbica e le unità di misura cliniche. Sono stati calcolati i coefficienti di correlazione (valori R) e i corrispondenti livelli di significatività (P-valori). I risultati sono stati visualizzati mediante una mappa termica di correlazione, in cui i gradienti di colore indicano l'intensità e la direzione della correlazione (rosso indica correlazione positiva, blu indica correlazione negativa) e gli asterischi (**) indicano la significatività statistica (P < 0,01).

Metodi statistici

Tutte le analisi statistiche e la visualizzazione dei dati sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism. Per confrontare le medie, è stato utilizzato il test t per dati che seguivano una distribuzione normale. Nei casi in cui i dati si discostavano dalla normalità, è stato impiegato il test di Kruskal-Wallis. Per valutare le relazioni tra variabili, sono state effettuate analisi di correlazione di Spearman o di Pearson. Tutti i test statistici sono stati condotti come test a due code, con significatività statistica stabilita al valore di 0,05.

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Risultati

General situation of experimental animals

Blood glucose levels were significantly elevated in the model group (27.21 ± 6.03 mmol/L) compared with the blank group (P < 0.001), indicating the successful induction of the DM model. During the study period, the experimental animals showed stable body weight, continuous water and food intake, normal urine output, body temperature, healthy fur and skin condition, and normal behavior during the experiment.

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Discussione

La retinopatia diabetica (DR) è una complicanza neurovascolare complessa causata da iperglicemia cronica, infiammazione e alterazioni del metabolismo22. L'Accademia Americana di Oftalmologia classifica la DR in forma non proliferativa e forma proliferativa, caratterizzata dall'insorgenza di neovascolarizzazione23. Date le limitazioni delle attuali strategie terapeutiche, l'esplorazione di nuovi meccanismi si è rivelata una direzione promettente per affrontare la DR. In part...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro descritto in questo articolo.

Ringraziamenti

L'autore desidera riconoscere tutti i membri del proprio team che hanno fornito un notevole sostegno e assistenza per portare a termine questa ricerca.

Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Natural Science Foundation of China (numero di concessione: 82474580) e dal progetto di esplorazione libera del fondo ospedaliero dell'Ospedale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (n. 23ZYTS1601).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo monoclonale AP-1Proteintech66313-1-IG1:5000
Anticorpo policlonale CMKLR1AffinityAF52911:1000
Anticorpo policlonale GAPDHAffinityAF70211:5000
GoatAnti-Mouse IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAM00721:10000
GoatAnti-Rabbit IgG(H+L) HRPMULTI SCIENCESGAR00721:10000
GraphPad Prism/versione 9.5
Image-Pro PlusMedia Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USAversione 6.0
Piattaforma Luoning Bio-Cloud http://www.biomediv.cn/login.html
Kit ELISA per IL-1β murina (Interleuchina 1 Beta)ElabscienceE-EL-M0037Rilevamento citochine sieriche
Kit ELISA per IL-6 murina (Interleuchina-6)ElabscienceE-EL-M0044Rilevamento citochine sieriche
Kit ELISA per TNF-α murino (Fattore di Necrosi Tumorale Alfa)ElabscienceE-EL-M3063Rilevamento citochine sieriche
NanoFilt/versione 2.7.1
Sequenziatore Nanopore GridIONOxford Nanopore Technologieshttps://store.nanoporetech.com/gridion.html
Pannoramic SCAN IIScanner 3DHISTECH Pannoramic SCAN https://www.3dhistech.com/scanners/pannoramic-scan-ii-digital-scanner/
Anticorpo policlonale PPAR gamma (PPAR-γ) ImmunoWaybs-0530R1:1000
Python/versione 3.7.4
Granuli QimingZhejiang Sansheng Mandi Pharmaceutical Co., Ltd.Numero di Approvazione Nazionale Cinese per Farmaci Z200900360,9 g/kg, per gavaggio orale
Linguaggio di programmazione R/versione 4.0.3
Database SILVA/versione 138
Streptozotocina (STZ)Sigma-AldrichS013035 mg/kg, i.p.
Anticorpo policlonale TP53Abcamab1314421:1000
Usearch/versione 10.0.240
Anticorpo policlonale Wnt5aProteintech55184-1-AP1:1000
Kit Zymo Research BIOMICS DNA MicroprepZymo ResearchD4301Estrazione di gDNA fecale

Riferimenti

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