Questo studio esplorativo su sei pazienti con malattia di Parkinson sottoposti a trapianto di microbiota fecale ha osservato modificazioni temporali nella diversità microbica intestinale, nella composizione tassonomica e nei profili funzionali predetti, insieme a miglioramenti dei sintomi motori e non motori. Questi risultati forniscono evidenze preliminari a sostegno di ulteriori indagini su interventi basati sul microbiota.
Articolo di ricerca
Effetti del trapianto di microbiota fecale sulle caratteristiche microbiche intestinali e sui fenotipi clinici in pazienti con malattia di Parkinson
In questo articolo
Sommario
Abstract
Alterazioni del microbiota intestinale sono state associate alla malattia di Parkinson (PD), ma le modifiche microbiche longitudinali successive al trapianto di microbiota fecale (FMT) e le loro associazioni cliniche rimangono poco comprese. Questo studio osservazionale retrospettivo monocentrico ha incluso 6 pazienti con PD, suddivisi in sottogruppi di gravità elevata e ridotta in base alla durata della malattia (>6 anni rispetto a ≤6 anni). Sono stati raccolti 36 campioni fecali prima dell’FMT e mensilmente per cinque mesi successivi. Diversità microbica, struttura della comunità, composizione tassonomica e profili funzionali predetti sono stati valutati mediante sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S. Le analisi hanno incluso la diversità alfa e beta, l'abbondanza tassonomica, l'analisi dell'effetto dimensionale con discriminante lineare, la previsione funzionale basata su Tax4Fun2 e le correlazioni di Spearman tra caratteristiche microbiche e indicatori clinici. Le analisi descrittive hanno evidenziato differenze nella ricchezza microbica, nella diversità, nella struttura della comunità e nelle funzioni predette tra i sottogruppi di gravità e nei diversi punti temporali successivi all’FMT. A basale, il sottogruppo a bassa gravità presentava una ricchezza e diversità microbica maggiore rispetto al sottogruppo ad alta gravità, con abbondanze relativamente più elevate di taxa come Bifidobacterium e Lactobacillus. Un mese dopo l’FMT, ricchezza e diversità sono aumentate rispetto al basale nel sottogruppo ad alta gravità, accompagnate da cambiamenti nella composizione tassonomica. Entrambi i sottogruppi hanno mostrato variazioni legate al tempo nella diversità microbica e nell'arricchimento predetto dei percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes dopo l’FMT. Le funzioni predette includevano metabolismo di carboidrati e aminoacidi, biosintesi di metaboliti secondari, trasporto di membrana e trasduzione del segnale. Diverse unità tassonomiche operative si sono correlate con indicatori di compromissione motoria, stitichezza, qualità del sonno, stato funzionale e sintomi neuropsichiatrici. L’FMT si è quindi associato a modifiche longitudinali nella diversità, composizione e funzioni predette del microbiota intestinale, e specifiche caratteristiche microbiche si sono associate a indicatori motori e non motori. Considerata la piccola coorte retrospettiva, questi risultati sono preliminari e richiedono conferma in studi controllati più ampi. Studi futuri dovranno determinare se queste alterazioni microbiche siano riproducibili, persistano oltre i cinque mesi, riflettano l'attecchimento del donatore e corrispondano a un miglioramento clinico misurabile dopo il trapianto nei pazienti con PD.
Introduzione
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo progressivo comune, caratterizzato da bradicinesia, rigidità, tremore da riposo e instabilità posturale1. Sebbene la sua patogenesi non sia ancora completamente chiarita, diversi fattori, tra cui l'infiammazione neurologica, l'esposizione a fattori ambientali e la predisposizione genetica, sono stati implicati nell'insorgenza e nella progressione della malattia2. Evidenze epidemiologiche indicano che il PD è tra i disturbi neurologici più diffusi negli adulti anziani ed è associato a un notevole carico di disabilità, con una prevalenza che aumenta con l'età3. I trattamenti attuali, in particolare la terapia di sostituzione della dopamina, possono alleviare in una certa misura i sintomi motori, ma i loro effetti sulla progressione della malattia e su molti sintomi non motori rimangono limitati, e la risposta al trattamento varia da individuo a individuo4. Pertanto, ulteriori indagini sui cambiamenti biologici associati al PD e sui potenziali bersagli terapeutici rimangono clinicamente importanti.
La comunità microbica intestinale svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità della barriera intestinale, nella regolazione delle risposte immunitarie e nel supporto dell'omeostasi metabolica5. Il trapianto di microbiota fecale (FMT) prevede il trasferimento del microbiota fecale da un donatore sano a un ricevente al fine di ripristinare l'equilibrio microbico intestinale6,7. Diversi studi sugli animali hanno suggerito che il trapianto del microbiota intestinale può influenzare i fenotipi neurocomportamentali8,9. Dal momento che il microbiota di pazienti affetti da depressione o ansia può indurre nei topi modifiche comportamentali corrispondenti, il microbiota di donatori sani potrebbe migliorare gli esiti comportamentali10. Inoltre, osservazioni cliniche preliminari hanno riportato un miglioramento dei sintomi dopo FMT in alcuni pazienti con malattia di Parkinson (PD) e autismo, suggerendo che interventi basati sul microbiota potrebbero avere una rilevanza potenziale nei disturbi neurologici e neuropsichiatrici11,12. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi effetti rimangono poco chiari, e sono necessari studi clinici per stabilire la sicurezza e l'efficacia dell'FMT nella PD.
Sebbene studi precedenti abbiano suggerito una relazione tra il microbiota intestinale e il morbo di Parkinson (PD), i cambiamenti longitudinali nella composizione microbica intestinale dopo il trapianto di feci (FMT) e le loro associazioni con le caratteristiche cliniche non sono ancora ben compresi. Resta incerto se pazienti con diverse gravità cliniche presentino risposte microbiche distinte dopo l'FMT.
In questo studio osservazionale retrospettivo monocentrico, abbiamo esaminato i pazienti con malattia di Parkinson (PD) sottoposti a trapianto di microbiota fecale (FMT) nella pratica clinica routinaria. Sono stati analizzati i punteggi clinici prima e dopo l'FMT, e i campioni fecali disponibili sono stati ulteriormente analizzati mediante sequenziamento del gene 16S rRNA per esplorare la diversità microbica intestinale, la composizione tassonomica, i profili funzionali predetti e le correlazioni con gli indicatori clinici. Lo scopo di questo studio era caratterizzare gli esiti clinici e i profili del microbiota intestinale dopo l'FMT nella PD e fornire evidenze preliminari per futuri studi prospettici controllati.
Protocollo
Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki, e il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Nanjing (numero di approvazione: 2021-KY-100-01). A tutti i partecipanti è stato ottenuto il consenso informato scritto.
Questo studio osservazionale retrospettivo monocentrico è stato condotto presso il Dipartimento di Neurologia del Secondo Ospedale Affiliato dell'Università Medica di Nanjing. Da gennaio 2022 a dicembre 2023, sono stati inclusi complessivamente 32 pazienti con malattia di Parkinson primaria che soddisfacevano i Criteri Diagnostici per la Malattia di Parkinson (edizione 2020). Alla fine, sei pazienti che soddisfacevano rigorosi criteri di selezione e avevano completato tutte le procedure dello studio sono stati inclusi nell'analisi successiva. I dettagli relativi alla selezione, all'esclusione e al follow-up sono mostrati nella Figura Supplementare 1.
Raccolta dei campioni fecali e analisi della comunità microbica
Il microbiota fecale è stato ottenuto da volontari sani. Il processo di selezione dei donatori è stato rigorosamente condotto in conformità con il Consenso degli Esperti Cinesi sull'Applicazione Clinica del Trapianto di Microbiota Fecale. Criteri di inclusione dei donatori: età compresa tra 18 e 40 anni, senza storia di malattie croniche; assenza di patologie gastrointestinali, disturbi metabolici, malattie autoimmuni o disturbi psichiatrici; assenza di utilizzo di antibiotici, probiotici, immunosoppressori o inibitori della pompa protonica negli ultimi 3 mesi; assenza di viaggi in aree epidemiche, trasfusioni di sangue o interventi chirurgici negli ultimi 6 mesi. Lo screening ematico e fecale per l'esclusione di malattie infettive e patogeni include: virus dell'immunodeficienza umana (HIV), virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV), Treponema pallidum, Clostridium difficile, Salmonella, Shigella, Campylobacter, patogeno Escherichia coli, virus enterici e parassiti. Il volume di un singolo campione di feci valido deve essere di almeno 50 g. Utilizzando un sistema automatizzato di purificazione della microbiota fecale (vedere Tabella dei materiali), sono stati aggiunti 500 mL di soluzione salina sterile ogni 100 g di campione fecale fresco, seguiti da tre cicli di centrifugazione e lavaggio standardizzati (700 × g, 3 min) e immediatamente inoculato dopo aver preparato una sospensione con soluzione salina sterile in rapporto volumetrico 1:2. I soggetti hanno ricevuto una singola iniezione di 150 mL di sospensione contenente circa 5 × 10^13 batteri vitali13.
Tutti i riceventi hanno ricevuto il trapianto di microbiota fecale (FMT) mediante colonscopia, con l'introduzione dello strumento fino al cieco e al colon ascendente; la sospensione è stata infusa lentamente e in modo uniforme attraverso il canale per biopsia per favorire la colonizzazione preferenziale del colon destro. Dopo l'infusione, i pazienti sono rimasti in posizione laterale destra per almeno 2 ore. Nei giorni precedenti la procedura, è stata seguita una dieta iporesiduale per 3 giorni, seguita da una dieta liquida completa per 24 ore prima dell'intervento, con digiuno da cibi solidi per 6 ore e da liquidi per 2 ore prima dell'infusione. La sera precedente il trapianto, è stata effettuata una pulizia standard dell'intero intestino con soluzione elettrolitica di polietilenglicole fino a ottenere un effluente limpido e privo di feci. Tra le restrizioni terapeutiche rientrava la sospensione di antibiotici sistemici almeno 72 ore prima dell'FMT e la loro evitazione per 1 settimana successivamente. Gli inibitori della pompa protonica (PPI) vengono interrotti da 24 a 48 ore prima della procedura, mentre lassativi e probiotici vengono sospesi nel giorno del trapianto.
Durante la procedura, frequenza cardiaca, pressione arteriosa e saturazione di ossigeno sono state monitorate continuamente, e sono stati osservati eventuali sintomi, come distensione addominale, dolore o nausea; l'infusione è stata interrotta immediatamente in caso di dolore addominale grave o ipotensione. Nei primi 7 giorni successivi al trapianto, è stato effettuato un follow-up giornaliero per registrare la frequenza delle evacuazioni intestinali, la consistenza delle feci e tutti gli eventi avversi, inclusi dolore addominale, diarrea, febbre ed ematochezia. Il follow-up a lungo termine si è protratto fino a 5 mesi, con campionamenti programmati di feci per l'analisi della microbiota intestinale e valutazioni cliniche mediante la Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS) e il Wexner Constipation Score, insieme alla documentazione dei cambiamenti dei sintomi e dell'uso di farmaci concomitanti, al fine di valutare in modo completo sia l'efficacia che la sicurezza.
I campioni fecali sono stati raccolti in sei momenti temporali: prima del FMT e a 1, 2, 3, 4 e 5 mesi dopo il FMT. Tutti i partecipanti hanno ricevuto istruzioni standardizzate per la raccolta del campione di feci. Approssimativamente da 10 a 20 g di feci della porzione centrale sono stati raccolti utilizzando pinze sterili e posti in contenitori sterili per la raccolta. I campioni sono stati trasportati in laboratorio entro 2-3 ore dalla raccolta e suddivisi in aliquote in provette sterili microcentrifuga da 1,5 mL (vedere Tabella dei Materiali) da ricercatori addestrati in condizioni asettiche. Tutte le aliquote sono state immediatamente conservate a −80 °C fino all'analisi successiva.
Dopo il prelievo dei campioni fecali, tutti i campioni sono stati trasportati su ghiaccio secco presso un fornitore commerciale di sequenziamento (vedere Tabella dei Materiali) per il sequenziamento del gene dell'rRNA 16S. La preparazione delle librerie, il sequenziamento e il controllo iniziale della qualità sono stati eseguiti seguendo il protocollo standard del fornitore. Il DNA genomico è stato estratto da ciascun campione fecale e le regioni ipervariabili V3–V4 del gene batterico dell'rRNA 16S sono state amplificate mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando i primer 341F e 805R. Il sequenziamento è stato effettuato su una piattaforma di sequenziamento di tipo benchtop con chimica a lettura accoppiata 2 × 300 bp (vedere Tabella dei Materiali) per caratterizzare i profili microbici intestinali dei pazienti prima del trapianto di microbiota fecale (FMT) e in diversi momenti di follow-up successivi al FMT. Dopo il sequenziamento, le letture grezze sono state elaborate per ottenere sequenze di alta qualità destinate all'analisi microbica successiva. La classificazione tassonomica è stata effettuata utilizzando un pacchetto commerciale per l'assegnazione tassonomica 16S e il relativo database di identificazione microbica (vedere Tabella dei Materiali). I profili tassonomici ottenuti sono stati utilizzati per analisi successive sulla diversità microbica, sulla composizione della comunità, sull'abbondanza differenziale e sulla funzione microbica predetta.
Valutazioni cliniche ed etichette analitiche
I pazienti con MP sono stati suddivisi in due gruppi di gravità in base alla durata della malattia: un gruppo ad alta gravità (>6 anni, indicato come “_H”) e un gruppo a bassa gravità (≤6 anni, indicato come “_L”). I campioni fecali raccolti prima del trapianto di microbiota fecale sono stati definiti campioni basali ed etichettati come FB_H o FB_L in base al corrispondente gruppo di gravità. I campioni raccolti a 1, 2, 3, 4 e 5 mesi dopo il trapianto di microbiota fecale sono stati etichettati come FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H per il gruppo ad alta gravità, e come FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L e FP5M_L per il gruppo a bassa gravità. I parametri clinici valutati includevano il punteggio di costipazione di Wexner, la scala dei sintomi non motori (NMSS), il questionario sui sintomi non motori (NMSQ), l'inventario neuropsichiatrico (NPI), lo stadio di Hoehn–Yahr, la scala delle attività della vita quotidiana (ADL), l'indice di qualità del sonno di Pittsburgh (PSQI), la scala unificata dei disturbi della malattia di Parkinson (UPDRS I–VI) e il punteggio totale UPDRS. È stata utilizzata una combinazione di metodi statistici descrittivi e inferenziali per analizzare le variazioni degli indicatori clinici nei pazienti con MP nel gruppo ad alta gravità (gruppo _H) e nel gruppo a bassa gravità (gruppo _L) in sei punti temporali. Per esplorare preliminarmente le differenze tra i gruppi in tutti i punti temporali, le distribuzioni degli indicatori tra i gruppi _H e _L sono state confrontate in ciascun punto temporale mediante il test della somma dei ranghi di Wilcoxon, e successivamente è stato applicato un modello lineare misto (LMM) più rigoroso con intercette casuali specifiche per paziente. A causa della dimensione campionaria limitata, i risultati del modello a effetti misti sono forniti unicamente come riferimenti esplorativi. L'endpoint primario di questo studio esplorativo è stato il cambiamento nella diversità e composizione del microbiota intestinale dal basale ai diversi punti temporali successivi al trapianto di microbiota fecale, mentre le variazioni cliniche sono state valutate come endpoint secondari.
Raggruppamento delle OTU, analisi della diversità e abbondanza tassonomica
Le unità tassonomiche operative (OTU) sono state utilizzate per riassumere la composizione della comunità microbica, e le sequenze con una similarità ≥97% sono state raggruppate nella stessa OTU. La profondità del sequenziamento è stata valutata mediante curve di rarefazione basate sull'indice di Shannon, il cui plateau indica generalmente una copertura sufficiente per analisi della diversità successive.
La diversità alfa è stata valutata utilizzando gli indici Chao1 e abundance-based coverage estimator (ACE) per la ricchezza microbica, e gli indici di Shannon e Simpson per la diversità complessiva e l'equità. La diversità beta è stata analizzata mediante distanze UniFrac pesate e non pesate, seguite da un'analisi delle coordinate principali (PCoA) per visualizzare le differenze nella composizione delle comunità microbiche tra i gruppi. Le differenze tra gruppi nella diversità alfa e beta sono state valutate rispettivamente mediante test non parametrici e Analisi della Varianza Multivariata Permutazionale (PERMANOVA), come descritto nella sezione relativa all'analisi statistica.
La composizione tassonomica è stata riassunta a livello di phylum, classe, ordine, famiglia e genere in base ai dati di sequenziamento del gene 16S rRNA. Utilizzando un pacchetto per l'analisi di ecologia delle comunità per R (vedere la Tabella dei Materiali), identificare e visualizzare i 10 taxa più abbondanti a ciascun livello tassonomico. I profili tassonomici sono stati rappresentati mediante istogrammi, e alcuni taxa selezionati sono stati ulteriormente confrontati tra i gruppi utilizzando diagrammi a scatola con baffi.
Analisi dell'abbondanza differenziale di taxa microbici
I taxa con abbondanza differenziale tra gruppi predefiniti sono stati identificati mediante l'analisi della dimensione dell'effetto basata sulla discriminante lineare (LEfSe). LEfSe integra il test di Kruskal-Wallis, il test di Wilcoxon e l'analisi discriminante lineare (LDA) per identificare i taxa dotati sia di significatività statistica sia di valore discriminatorio. Sono stati considerati con abbondanza differenziale i taxa con P < 0,05 e un punteggio LDA (log10) > 3. Le abbondanze relative dei taxa discriminatori sono state visualizzate mediante istogrammi tassonomici.
Predizione funzionale e analisi della correlazione clinica
I profili funzionali predetti della microbiota intestinale sono stati dedotti dai dati di sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S mediante Tax4Fun2 e annotati secondo la banca dati Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). I percorsi predetti con arricchimento differenziale sono stati identificati utilizzando LEfSe, con P < 0,05 e un punteggio LDA (log10) > 3 come soglie. Poiché questi profili funzionali sono stati dedotti piuttosto che misurati direttamente mediante approcci metagenomici o metabolomici, sono stati interpretati come differenze funzionali predette. È stata eseguita un'analisi della correlazione dei ranghi di Spearman per esplorare le associazioni tra le caratteristiche microbiche e gli indicatori clinici.
Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software R (vedere la Tabella dei materiali). Le variabili cliniche sono state riassunte come mediane e intervalli (minimo–massimo). Gli indici di alfa diversità sono stati confrontati tra i gruppi mediante il test della somma dei ranghi di Wilcoxon, mentre la beta diversità è stata valutata tramite PERMANOVA con 999 permutazioni. I taxa e le vie funzionali predette con abbondanza differenziale sono stati identificati utilizzando LEfSe, con P < 0,05 e punteggio LDA (log10) > 3 come soglie di significatività. Per l'analisi longitudinale dell'abbondanza differenziale, è stato applicato un modello a effetti misti con intercette casuali specifiche per paziente, seguito da confronti a coppie post-hoc con correzione del tasso di falsa scoperta di Benjamini-Hochberg. È stata utilizzata l'analisi della correlazione dei ranghi di Spearman per valutare le associazioni tra le caratteristiche microbiche intestinali e gli indicatori clinici, applicando la correzione del tasso di falsa scoperta di Benjamini–Hochberg ai valori P della correlazione. Un valore P bilaterale < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. È stata applicata la correzione per confronti multipli alle analisi di correlazione e di abbondanza tassonomica. Data la piccola dimensione del campione e il disegno sperimentale longitudinale ripetuto, le analisi statistiche sono state considerate esplorative e i risultati sono stati interpretati con cautela.
Risultati
Selezione dei pazienti e caratteristiche alla baseline
Sei pazienti con malattia di Parkinson sono stati inclusi nell'analisi finale, di cui tre maschi e tre femmine. L'età mediana era di 69,0 anni (intervallo, 61–75) e l'indice di massa corporea mediano era di 22,6 kg/m2. Il gruppo comprendeva due fenotipi clinici dominanti per rigidità, due dominanti per tremore e due misti. Le caratteristiche cliniche basali sono riportate nella Tabella 1.
Le caratteristiche cliniche differivano tra i sottogruppi di PD ad alta e bassa gravità (Tabella 1). In questa coorte esplorativa, il punteggio totale UPDRS era più elevato nel gruppo FB_H rispetto al gruppo FB_L, coerentemente con la classificazione predefinita della gravità, a indicare un deficit motorio complessivo più grave. Sono state inoltre osservate differenze in diversi parametri clinici motori e non motori, inclusi i sottoscale UPDRS, PSQI, punteggio di costipazione Wexner, scala ADL e NMSS. Questi risultati suggeriscono che i sottogruppi di gravità predefiniti differivano non solo per lo stadio della malattia motoria, ma anche per diverse caratteristiche non motorie e funzionali.
Le traiettorie individuali dei pazienti sono state visualizzate mediante grafici a linee per indicatori clinici chiave (Figura 1). Come illustrato, in tutti e sei i pazienti si è osservata una tendenza discendente costante nei punteggi di NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS Totale e Wexner dopo il trapianto di microbiota fecale (FMT), indipendentemente dalla gravità iniziale della malattia. In particolare, i pazienti del gruppo _H hanno mostrato un miglioramento clinico più rapido rispetto a quelli del gruppo _L, nonostante punteggi basali più elevati. I confronti clinici hanno evidenziato differenze costanti tra i gruppi ad alta e bassa gravità. La maggior parte dei confronti specifici per punto temporale è risultata significativa, tutti gli indicatori clinici aggregati differivano tra i gruppi e modelli a effetti misti hanno confermato un carico sintomatologico inferiore e una migliore funzionalità quotidiana nel gruppo a bassa gravità.
Eventi avversi nei pazienti con MP dopo FMT
Gli eventi avversi registrati dopo il FMT sono stati riassunti nella Tabella 2. Gli eventi segnalati con maggiore frequenza sono stati flatulenza, diarrea, costipazione aggravata e nausea/vomito, ciascuno verificatosi in due pazienti. Un paziente ha riferito dolore addominale. Non è stata registrata febbre e nessun paziente ha interrotto il FMT a causa di eventi avversi. Questi risultati indicano che i sintomi gastrointestinali sono stati gli eventi avversi più comunemente documentati in questo piccolo gruppo di pazienti; tuttavia, i risultati relativi alla sicurezza devono essere interpretati con cautela a causa della limitata dimensione del campione.
Copertura della diversità sufficiente e identificazione di OTU specifici del gruppo
L'analisi delle curve di rarefazione ha mostrato che l'indice di Shannon si avvicinava gradualmente a un plateau all'aumentare della profondità di sequenziamento, suggerendo che la profondità di sequenziamento era generalmente sufficiente per valutare la diversità microbica tra i campioni (Figura 2A). Un totale di 80 OTU è stato identificato in tutti i campioni. Questo numero relativamente basso di OTU è coerente con la profondità di sequenziamento e la dimensione limitata del campione in questo studio esplorativo. L'analisi del diagramma di Venn ha identificato OTU condivisi e unici tra i 12 gruppi (Figura 2B). È stato rilevato un totale di 80 OTU, inclusi 53 OTU condivisi da tutti i gruppi. Il numero di OTU unici in ciascun gruppo è stato il seguente: 2 in FB_H, 12 in FB_L, 4 in FP1M_H, 0 in FP1M_L, 1 in FP2M_H, 0 in FP2M_L, 4 in FP3M_H, 0 in FP3M_L, 0 in FP4M_H, 1 in FP4M_L, 1 in FP5M_H e 2 in FP5M_L. Tra questi gruppi, FB_L presentava il numero più elevato di OTU unici, mentre FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L e FP4M_H non mostravano OTU unici in questa analisi. Questi risultati suggeriscono che i sottogruppi di PD condividevano un insieme comune di OTU, mentre alcuni gruppi mostravano schemi di OTU specifici per gruppo limitati.
La diversità microbica e i profili funzionali predetti differiscono tra i sottogruppi di gravità della malattia di Parkinson
L'alpha diversità era più elevata nel gruppo FB_L rispetto al gruppo FB_H, come indicato dagli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson aumentati (Figura 3A). L'analisi PCoA basata su UniFrac ha mostrato una chiara separazione tra i due sottogruppi di gravità, suggerendo differenze nella struttura della comunità microbica intestinale (Figura 3B). A livello di phylum, FB_L presentava abbondanze relativamente più elevate di Firmicutes e Actinobacteria, mentre FB_H era caratterizzato da abbondanze più elevate di Bacteroidetes e Proteobacteria (Figura 3C). A livello di genere, Bacteroides, Megasphaera ed Escherichia erano più abbondanti in FB_H, mentre Bifidobacterium e Lactobacillus erano più abbondanti in FB_L (Figura 3D).
L'analisi LEfSe ha identificato taxa associati alla gravità che presentavano abbondanza differenziale. I taxa associati a Bacteroidetes/Bacteroides e i taxa associati a Proteobacteria erano arricchiti in FB_H, mentre i taxa associati a Bifidobacterium, Actinobacteria, Firmicutes, Clostridia e Parabacteroides erano arricchiti in FB_L (Figura 3E). L'analisi predetta dei percorsi KEGG ha inoltre mostrato profili funzionali distinti tra i gruppi. FB_H era principalmente arricchito nei percorsi predetti legati al metabolismo globale, al metabolismo di carboidrati ed energia, alla trasduzione del segnale, ai sistemi a due componenti e alla biosintesi del lipopolisaccaride. Al contrario, FB_L era arricchito nei percorsi predetti legati alla biosintesi di metaboliti secondari, al metabolismo degli aminoacidi, al metabolismo dei nucleotidi, alla replicazione e riparazione, al quorum sensing, al trasporto di membrana e ai trasportatori ABC (Figura 3F). Questi risultati indicano che i sottogruppi di gravità del PD differivano per diversità microbica, composizione tassonomica e potenziale funzionale predetto.
Un mese dopo il FMT, il sottogruppo FP1M_H ha mostrato una maggiore diversità microbica e profili funzionali predetti distinti
Rispetto a FB_H, FP1M_H ha mostrato una maggiore diversità alfa, indicata dall'aumento degli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson (Figura 4A). L'analisi PCoA basata su UniFrac ha mostrato una chiara separazione tra FB_H e FP1M_H, suggerendo un cambiamento nella struttura della comunità microbica intestinale un mese dopo il trapianto di microbiota fecale (FMT) (Figura 4B). A livello di phylum, FP1M_H presentava abbondanze relativamente maggiori di Firmicutes, Actinobacteria e Verrucomicrobia, mentre FB_H mostrava abbondanze maggiori di Bacteroidetes e Proteobacteria (Figura 4C). A livello di genere, Bifidobacterium, Akkermansia, Enterococcus e Lactobacillus erano più abbondanti in FP1M_H, mentre Bacteroides, Megasphaera e Escherichia erano più abbondanti in FB_H (Figura 4D).
L'analisi LEfSe ha identificato taxa diversamente abbondanti associati ai gruppi. I taxa associati a Bacteroidetes/Bacteroides erano arricchiti in FB_H, mentre i taxa associati a Firmicutes, Actinobacteria, Clostridia, Bifidobacterium e Acidaminococcus erano arricchiti in FP1M_H (Figura 4E). L'analisi predetta dei percorsi KEGG ha mostrato che FB_H era arricchito in percorsi legati alla trasduzione del segnale, sistemi a due componenti, metabolismo dei carboidrati, metabolismo dei lipidi, metabolismo energetico e metabolismo di cofattori/vitamine. Al contrario, FP1M_H era arricchito nei percorsi predetti legati al metabolismo degli amminoacidi, metabolismo dei nucleotidi, metabolismo dell'amido e del saccarosio, replicazione e riparazione, traduzione, biosintesi di metaboliti secondari, quorum sensing, trasportatori ABC e trasporto di membrana (Figura 4F). Questi risultati suggeriscono che, nel sottogruppo ad alta gravità, il FMT fosse associato a un aumento della diversità microbica e a modifiche nella composizione tassonomica e nel potenziale funzionale predetto.
La ricchezza microbica, la composizione tassonomica e i profili funzionali predetti differivano tra i gruppi FB_L e FP1M_L
Rispetto a FB_L, FP1M_L ha mostrato una maggiore ricchezza microbica, indicata dagli indici Chao1 e ACE aumentati, mentre gli indici di Shannon e Simpson non differivano significativamente tra i gruppi (Figura 5A). L'analisi PCoA basata sull'UniFrac ha mostrato una chiara separazione tra FB_L e FP1M_L, suggerendo differenze nella composizione della comunità microbica dopo il trapianto di microbiota fecale (FMT) (Figura 5B). A livello di phylum, FP1M_L ha mostrato abbondanze relativamente più elevate di Actinobacteria, Verrucomicrobia, Synergistetes ed Euryarchaeota, mentre Firmicutes e Bacteroidetes erano più abbondanti in FB_L (Figura 5C). A livello di genere, Bifidobacterium, Akkermansia e Parabacteroides erano più abbondanti in FP1M_L, mentre Bacteroides e Lactobacillus erano più abbondanti in FB_L (Figura 5D).
L'analisi LEfSe ha mostrato un arricchimento di taxa associati a Firmicutes, Clostridia e Ruminococcaceae in FB_L, mentre in FP1M_L si è osservato un arricchimento di taxa associati a Bacteroidetes, Bacteroidales, Parabacteroides, Porphyromonadaceae, Synergistetes, Alistipes e Rikenellaceae (Figura 5E). L'analisi predetta dei percorsi KEGG ha indicato che FB_L era arricchito in percorsi legati alla trasduzione del segnale, ai sistemi a due componenti, al metabolismo dei carboidrati, al metabolismo dei lipidi, al metabolismo degli zuccheri amino e degli zuccheri nucleotidici, al metabolismo dell'amido e del saccarosio e al sistema fosfotrasferasico. FP1M_L era arricchito nei percorsi predetti legati ai percorsi metabolici globali, al metabolismo degli aminoacidi, alla traduzione, alla biosintesi degli aminoacidi, alla biosintesi di metaboliti secondari e all'elaborazione dell'informazione genetica (Figura 5F). Questi risultati indicano che, nel sottogruppo a bassa gravità, il FMT era associato principalmente a un aumento della ricchezza microbica e a modifiche nella composizione tassonomica e nel potenziale funzionale predetto.
La diversità microbica intestinale, la composizione tassonomica e i profili funzionali predetti variavano tra i sottogruppi con malattia di Parkinson ad alta gravità in diversi momenti successivi al trapianto di microbiota fecale
L'analisi della diversità alfa tra i cinque sottogruppi di malattia di Parkinson ad alta gravità (FP1M_H a FP5M_H) ha mostrato una variazione nella ricchezza e nella diversità microbica nei diversi punti temporali (Figura 6A). Tra questi sottogruppi, FP2M_H ha mostrato i valori più bassi degli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson, mentre FP1M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H hanno mostrato valori relativamente più elevati. L'analisi della diversità beta, basata sulle distanze UniFrac pesate e non pesate, ha rivelato una separazione tra i cinque sottogruppi nei grafici PCoA, indicando differenze nella composizione della comunità microbica intestinale nei punti temporali successivi al trapianto fecale (Figura 6B). A livello di phylum, i 10 taxa più abbondanti sono mostrati nella Figura 6C. I Bacteroidetes risultavano più abbondanti in FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H, mentre Firmicutes e Actinobacteria erano più abbondanti in FP1M_H. I Verrucomicrobia apparivano relativamente arricchiti in FP2M_H. A livello di genere, Bacteroides era relativamente più abbondante in FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H, mentre Akkermansia ed Escherichia erano più abbondanti in FP2M_H. Bifidobacterium era relativamente arricchito in FP1M_H (Figura 6D). L'analisi LEfSe ha identificato taxa distinti e differenzialmente abbondanti tra diversi sottogruppi ad alta gravità (Figura 6E), inclusi taxa associati a Firmicutes, Actinobacteria, Bifidobacterium e Clostridia in FP1M_H; taxa associati a Proteobacteria ed Enterobacteriaceae in FP2M_H; taxa associati a Bacteroidetes e Bacteroides in FP3M_H; e taxa associati a Synergistetes in FP4M_H. Il profilo funzionale predetto, basato sull'annotazione dei percorsi KEGG, ha mostrato schemi di arricchimento specifici per sottogruppo (Figura 6F). FP1M_H ha mostrato un arricchimento predetto nel metabolismo dell'amido e del saccarosio e nella biosintesi di altri metaboliti secondari, FP2M_H ha mostrato un arricchimento predetto nel metabolismo di cofattori e vitamine e nel metabolismo energetico, e FP5M_H ha mostrato un arricchimento predetto nella trasduzione del segnale e nei sistemi a due componenti. Questi risultati suggeriscono che i sottogruppi di malattia di Parkinson ad alta gravità hanno mostrato variazioni temporali nella diversità microbica, nella composizione tassonomica e nei profili funzionali predetti dopo il trapianto fecale.
La diversità microbica intestinale, la composizione tassonomica e i profili funzionali predetti hanno mostrato variazioni tra i sottogruppi con malattia di Parkinson a bassa gravità in diversi momenti successivi al trapianto di microbiota fecale (FMT)
L'analisi della diversità alfa tra i cinque sottogruppi di PD a bassa gravità (FP1M_L a FP5M_L) ha mostrato una variazione nella ricchezza e nella diversità microbica nei diversi punti temporali (Figura 7A). FP2M_L ha mostrato indici Chao1 e ACE relativamente più bassi, mentre FP4M_L e FP5M_L hanno mostrato indici di Shannon e Simpson relativamente più alti, indicando una variazione nella ricchezza e nell'equità tra i sottogruppi a bassa gravità. L'analisi della diversità beta, basata sulle distanze UniFrac pesate e non pesate, ha rivelato una separazione tra i cinque sottogruppi nei grafici PCoA, indicando differenze nella composizione della comunità microbica intestinale nei diversi punti temporali successivi al FMT (Figura 7B). A livello di phylum, i 10 taxa più abbondanti sono mostrati nella Figura 7C. Bacteroidetes e Firmicutes sono risultati i phyla dominanti in tutti i gruppi, mentre Actinobacteria e Verrucomicrobia sono risultati relativamente arricchiti in FP1M_L e Firmicutes si è mostrato relativamente più abbondante in FP3M_L. A livello di genere, Bifidobacterium e Akkermansia erano relativamente più abbondanti in FP1M_L, mentre Bacteroides era relativamente più abbondante in FP2M_L (Figura 7D). L'analisi LEfSe ha identificato taxa differenzialmente abbondanti associati ai sottogruppi in diversi sottogruppi a bassa gravità (Figura 7E), inclusi taxa associati a Ruminococcaceae in FP1M_L, taxa associati a Firmicutes e Clostridiales in FP2M_L, taxa associati a Synergistetes in FP3M_L e taxa associati a Bacteroidetes, Parabacteroides, Actinobacteria e Bifidobacterium in FP4M_L. Il profilo funzionale predetto basato sull'annotazione dei percorsi KEGG ha mostrato schemi di arricchimento specifici per sottogruppo (Figura 7F). FP1M_L ha mostrato un arricchimento predetto nella biosintesi di metaboliti secondari, FP2M_L ha mostrato un arricchimento predetto in percorsi legati alla trasduzione del segnale, sistemi a due componenti, elaborazione delle informazioni ambientali, comunità cellulari-procarionti e metabolismo dei carboidrati, FP3M_L ha mostrato un arricchimento predetto nel trasporto di membrana, quorum sensing, replicazione e riparazione e sistema fosfotrasferasico, FP4M_L ha mostrato un arricchimento predetto nell'elaborazione dell'informazione genetica e FP5M_L ha mostrato un arricchimento predetto nel metabolismo e nei percorsi metabolici. Questi risultati suggeriscono che i sottogruppi di PD a bassa gravità hanno mostrato una variazione temporale nella diversità microbica, nella composizione tassonomica e nei profili funzionali predetti dopo il FMT.
Associazioni tra specifici OTU e indicatori clinici nel PD
Per esplorare le associazioni tra le alterazioni del microbiota intestinale e le caratteristiche cliniche nel morbo di Parkinson (PD), le prime 50 correlazioni tra OTU e parametri clinici sono state visualizzate dopo la correzione per confronti multipli, corrispondenti a 23 OTU unici (Figura 8). Diversi OTU hanno mostrato schemi di correlazione simili in relazione a diversi indicatori clinici. Ad esempio, OTU165, OTU67, OTU230, OTU154, OTU72 e diversi altri OTU hanno mostrato correlazioni positive con il punteggio di Wexner, lo stadio di Hoehn–Yahr, il PSQI e diverse misure correlate all'UPDRS, mentre hanno mostrato correlazioni negative con la scala ADL e il NPI. Al contrario, OTU10 (Parabacteroides) e OTU45 (Fusobacterium) hanno mostrato uno schema di correlazione opposto per diverse variabili cliniche. OTU165, che è stato annotato a livello di phylum come Firmicutes, ha mostrato correlazioni positive con la gravità della stitichezza, lo stadio della malattia, il disturbo del sonno e diversi componenti dell'UPDRS, mentre ha mostrato correlazioni negative con la scala ADL e il NPI. Analogamente, OTU67 (Porphyromonadaceae) è stato correlato a diversi indicatori clinici motori e non motori. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che specifici OTU sono associati a diverse misure cliniche nel PD, anche se tali correlazioni devono essere interpretate con cautela e considerate generatrici di ipotesi piuttosto che prova di causalità.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
I materiali supplementari per questo studio sono disponibili all'indirizzo DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.21620775.
Figura 1: Cambiamenti longitudinali nei punteggi clinici dopo il trapianto di microbiota fecale in pazienti con malattia di Parkinson. I grafici a linee mostrano le variazioni dei punteggi NMSQ, NMSS, NPI, PSQI, UPDRS totale e Wexner per la costipazione dal basale prima del trapianto (FB) a 1, 2, 3, 4 e 5 mesi dopo il trapianto (FP1M–FP5M) nei gruppi ad alta gravità (H) e a bassa gravità (L). I punti dati rappresentano valori riassuntivi a livello di gruppo, e le barre di errore indicano la corrispondente variabilità/gamma. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Curve di rarefazione e confronto di OTU tra i gruppi. (A) Curve di rarefazione di Shannon che mostrano la relazione tra profondità di sequenziamento e diversità microbica. L'asse x rappresenta la profondità di sequenziamento, e l'asse y rappresenta l'indice di diversità di Shannon. L'andamento渐近o delle curve suggerisce che la profondità di sequenziamento era generalmente sufficiente per la valutazione della diversità. (B) Diagramma di Venn che mostra gli OTU condivisi e unici tra i 12 gruppi. Il numero al centro rappresenta gli OTU condivisi da tutti i gruppi, mentre i numeri nelle regioni esterne rappresentano gli OTU unici di ciascun gruppo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Diversità microbica, composizione tassonomica e differenze funzionali predette tra i gruppi FB_H e FB_L. (A) Analisi della diversità alfa basata sugli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Analisi delle coordinate principali (PCoA) basata sulle distanze UniFrac pesate e non pesate. (C,D) Abbondanza relativa dei 10 principali taxa microbici intestinali a livello di phylum (C) e di genere (D), mostrata mediante grafici a barre sovrapposte e grafici a scatola. (E) Analisi LEfSe che evidenzia i taxa differenzialmente abbondanti tra i gruppi FB_H e FB_L. (F) Analisi LEfSe dei percorsi funzionali predetti KEGG. Punteggi LDA positivi e negativi indicano percorsi arricchiti in gruppi diversi. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Diversità microbica, composizione tassonomica e differenze funzionali predette tra i gruppi FP1M_H e FB_H. (A) Analisi della diversità alfa basata sugli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Analisi delle coordinate principali (PCoA) basata sulle distanze UniFrac pesate e non pesate. (C,D) Abbondanza relativa dei 10 principali taxa microbici intestinali a livello di phylum (C) e di genere (D), mostrata mediante grafici a barre sovrapposte e grafici a scatola. (E) Analisi LEfSe che evidenzia i taxa differenzialmente abbondanti tra i gruppi FP1M_H e FB_H. (F) Analisi LEfSe dei percorsi funzionali predetti KEGG. Punteggi LDA positivi e negativi indicano percorsi arricchiti in gruppi diversi. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Differenze microbiche e funzionali tra i gruppi FB_L e FP1M_L. (A) Analisi della diversità alfa nei gruppi FB_L e FP1M_L. (B) Analisi della diversità beta nei gruppi FB_L e FP1M_L. (C,D) Abbondanza relativa dei taxa microbici intestinali nei gruppi FB_L e FP1M_L a livello di phylum (C) e di genere (D). (E) Analisi comparativa delle differenze tra specie nei gruppi FB_L e FP1M_L. (F) Funzioni microbiche predette nei gruppi FB_L e FP1M_L. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6Diversità microbica, composizione tassonomica e differenze funzionali previste tra i gruppi FP1M_H, FP2M_H, FP3M_H, FP4M_H e FP5M_H. (A) Analisi della diversità alfa basata sugli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Analisi delle coordinate principali (PCoA) basata su distanze UniFrac pesate e non pesate. (C,D) Abbondanza relativa dei 10 principali taxa microbici intestinali a livello di phylum (C) e a livello di genere (D), mostrati tramite grafici a barre sovrapposte e grafici a scatola (box plot). (EAnalisi LEfSe che mostra i taxa differenzialmente abbondanti tra i cinque sottogruppi con elevata gravità post-FMT.FAnalisi LEfSe dei percorsi funzionali KEGG predetti. Punteggi LDA positivi indicano percorsi arricchiti nei rispettivi gruppi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Diversità microbica, composizione tassonomica e differenze funzionali predette tra i gruppi FP1M_L, FP2M_L, FP3M_L, FP4M_L e FP5M_L. (A) Analisi della diversità alfa basata sugli indici Chao1, ACE, Shannon e Simpson. (B) Analisi delle coordinate principali (PCoA) basata sulle distanze UniFrac pesate e non pesate. (C,D) Abbondanza relativa dei 10 principali taxa microbici intestinali a livello di phylum (C) e genere (D), mostrata mediante grafici a barre sovrapposte e boxplot. (E) Analisi LEfSe che evidenzia i taxa differenzialmente abbondanti tra i cinque sottogruppi post-FMT a bassa gravità. (F) Analisi LEfSe dei percorsi funzionali predetti nel database KEGG. Punteggi LDA positivi indicano percorsi arricchiti nei rispettivi gruppi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Analisi della correlazione di Spearman tra OTU e indicatori clinici. Le righe rappresentano OTU e le colonne rappresentano caratteristiche cliniche. Ogni cella mostra il coefficiente di correlazione di Spearman tra un OTU specifico e un indicatore clinico. Il rosso indica una correlazione positiva, il blu una correlazione negativa, con l'intensità del colore che riflette l'intensità dell'associazione. I valori numerici nelle celle rappresentano i coefficienti di correlazione. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; ns, non significativo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Paziente | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Sesso (F/M) | M | F | M | F | M | F |
| Età (anni) | 65 | 72 | 68 | 75 | 61 | 70 |
| IMC | 23,5 | 21,8 | 24,2 | 20,5 | 22,1 | 23 |
| Sottotipo del PD | Rigidità | Tremore | Ibrido | Rigidità | Tremore | Ibrido |
| Andamento della malattia | 5 | 8 | 6 | 10 | 3 | 7 |
| Punteggio Wexner | 12 | 15 | 10 | 18 | 8 | 13 |
| Totale UPDRS | 45 | 61 | 49 | 72 | 36 | 55 |
| Totale NMSS | 45 | 62 | 50 | 70 | 38 | 55 |
| NMSQ | 10 | 14 | 11 | 16 | 8 | 12 |
| PSQI | 8 | 11 | 9 | 13 | 6 | 10 |
| ADL | 90 | 75 | 85 | 70 | 95 | 65 |
| NPI | 5 | 9 | 6 | 12 | 3 | 7 |
| Durata della stitichezza | 4 | 7 | 5 | 9 | 2 | 6 |
| LEDD (mg/g) | 600 | 800 | 700 | 900 | 400 | 750 |
| Uso di lassativi | No | Uso intermittente | No | Uso a lungo termine | No | Uso intermittente |
| Uso di probiotici | No | Sì | No | Sì | No | No |
| Uso di antibiotici | No | No | Sì | No | No | No |
| Stadio di Hoehn–Yahr | 2 | 3 | 2,5 | 3,5 | 1,5 | 3 |
| Gruppo di gravità | basso | alto | basso | alto | basso | alto |
Tabella 1: Caratteristiche demografiche e cliniche di base dei pazienti con malattia di Parkinson, stratificate per durata della malattia. I pazienti sono stati classificati nel gruppo ad alta durata (>6 anni; FB_H) o nel gruppo a bassa durata (≤6 anni; FB_L). I dati devono essere presentati come mediana (intervallo) per le variabili continue e come numero (%) per le variabili categoriali, quando applicabile. Abbreviazioni: ADL, Attività della Vita Quotidiana; BMI, indice di massa corporea; NMSS, Scala dei Sintomi Non Motori; NMSQ, Questionario sui Sintomi Non Motori; NPI, Inventario Neuropsichiatrico; PD, malattia di Parkinson; PSQI, Indice di Qualità del Sonno di Pittsburgh; UPDRS, Scala Unificata di Valutazione della Malattia di Parkinson.
| Eventi avversi | Pazienti (n, %) |
| Flatulenza | 2 (33,3%) |
| Dolore addominale | 1 (16,7%) |
| Diarrea | 2 (33,3%) |
| Stipsi aggravata | 2 (33,3%) |
| Febbre | 0 |
| Nausea/vomito | 2 (33,3%) |
| Interruzione del FMT a causa di eventi avversi | 0 |
Tabella 2: Eventi avversi dopo il trapianto di microbiota fecale in pazienti con malattia di Parkinson. La tabella riporta il numero e la percentuale di pazienti che hanno sperimentato ciascun evento avverso durante il follow-up successivo al trapianto di microbiota fecale. Non sono stati segnalati casi di febbre né interruzioni del trattamento a causa di eventi avversi. Abbreviazioni: FMT, trapianto di microbiota fecale; PD, malattia di Parkinson.
Figura supplementare 1: Selezione dei partecipanti e flusso dei pazienti. Diagramma di flusso del processo di screening del campione per i pazienti con malattia di Parkinson sottoposti a FMT e partecipanti al sequenziamento dell'rRNA 16S. n rappresenta il numero di partecipanti.Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Il trapianto di microbiota fecale (FMT) è un intervento basato sul microbiota che trasferisce il microbiota fecale da un donatore sano all'intestino del ricevente per ripristinare l'equilibrio microbico intestinale14. Sempre più evidenze indicano che il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi del sistema nervoso15. Le evidenze provenienti dall'asse bidirezionale intestino-cervello indicano che il microbiota intestinale può influenzare l'infiammazione del sistema nervoso centrale, il metabolismo dei neurotrasmettitori e le risposte comportamentali nel morbo di Parkinson (PD)16,17. Il trapianto di microbiota ha quindi attirato l'attenzione come possibile intervento, sebbene la sua applicazione clinica nelle malattie neuropsichiatriche e neurodegenerative rimanga ancora esplorativa18. Questo studio osservazionale retrospettivo monocentrico ha valutato gli esiti clinici, la sicurezza e i profili esplorativi del microbiota intestinale in pazienti con PD sottoposti a trapianto di microbiota fecale (FMT) nella pratica clinica di routine. Sono state osservate differenze nella ricchezza microbica intestinale, nella diversità, nella struttura della comunità e nei profili funzionali predetti tra sottogruppi di gravità del PD e diversi tempi successivi all'FMT. Questi risultati suggeriscono che i profili microbici intestinali possano variare in base alla gravità della malattia e possano modificarsi dinamicamente dopo l'intervento di FMT. Pertanto, tali risultati devono essere considerati esclusivamente come generazione di ipotesi e richiedono conferma in studi più ampi e adeguatamente potenziati.
La stitichezza è uno dei sintomi non motori più comuni e invalidanti nel PD19. La stitichezza può ridurre la qualità della vita, aumentare la necessità di lassativi e interferire con l'assorbimento dei farmaci dopaminergici. Nella coorte attuale, i punteggi di stitichezza Wexner sono diminuiti dopo il FMT in entrambi i sottogruppi analitici, sebbene l'entità e la persistenza del miglioramento abbiano mostrato differenze nei diversi momenti del follow-up. Questo andamento suggerisce un'associazione temporale tra FMT e miglioramento dei sintomi intestinali.
Abbiamo inoltre osservato modifiche in diverse misurazioni cliniche motorie e non motorie, inclusi i punteggi NMSS, PSQI, UPDRS III e l'UPDRS totale. Questi risultati sono degni di nota poiché il morbo di Parkinson è una patologia multisistemica in cui disfunzione gastrointestinale, disturbi del sonno, sintomi autonomi, sintomi neuropsichiatrici e compromissione motoria spesso coesistono. Una possibile spiegazione è che la modulazione della microbiota intestinale possa influenzare la motilità gastrointestinale, l'infiammazione sistemica, l'integrità della barriera intestinale, i metaboliti microbici e la segnalazione lungo l'asse microbiota-intestino-cervello. Tuttavia, i punteggi motori e non motori nel morbo di Parkinson sono influenzati da numerosi fattori, tra cui lo stadio della malattia, la terapia dopaminergica, la qualità del sonno, l'umore, la disfunzione autonomici, lo stato di riabilitazione e l'attività quotidiana. Pertanto, le variazioni nei punteggi UPDRS, NMSS, PSQI e nelle misurazioni relative alle ADL devono essere interpretate come osservazioni cliniche esplorative.
I nostri risultati sono ampiamente coerenti con studi precedenti che hanno collegato la microbiota intestinale all'eterogeneità clinica associata al morbo di Parkinson. Uno studio recente ha riportato che il trapianto di microbiota fecale da donatori sani potrebbe migliorare i sintomi motori e non motori nei pazienti affetti da morbo di Parkinson, accompagnato da cambiamenti nella composizione della microbiota intestinale e nei percorsi funzionali13,20. Sebbene in uno studio precedente i disturbi del controllo degli impulsi non abbiano influenzato in modo significativo la diversità α e β nei pazienti con morbo di Parkinson, alcuni taxa microbici risultavano arricchiti nei pazienti con disturbi del controllo degli impulsi e mostravano potenziali differenze funzionali in percorsi come la degradazione degli xenobiotici e il metabolismo della niacina21. Un altro studio ha riportato che i pazienti con morbo di Parkinson e ansia presentavano alterazioni nella composizione della microbiota intestinale e nella diversità β, ulteriormente supportando la possibile associazione tra flora intestinale e sintomi non motori correlati al morbo di Parkinson22. In questo studio, la diversità microbica e la composizione differivano tra i sottogruppi ad alta e bassa gravità, e diversi sottogruppi post-trapianto mostravano profili microbici distinti. Questi risultati supportano la possibilità che la microbiota intestinale possa essere coinvolta nelle manifestazioni cliniche multidimensionali del morbo di Parkinson, sebbene le relazioni causali rimangano da confermare.
Diversi taxa identificati in questo studio potrebbero essere biologicamente rilevanti per i cambiamenti legati al morbo di Parkinson (PD) nel microbioma intestinale. Alcuni batteri potrebbero influenzare la fisiopatologia del PD attraverso vie immunitarie e metaboliche23. Firmicutes è uno dei principali phyla batterici Gram-positivi presenti nell'intestino umano e comprende membri coinvolti nella produzione di acidi grassi a catena corta e nel mantenimento della barriera intestinale24. In questo studio, OTU165, annotato a livello di phylum come Firmicutes, è stato uno degli OTU più frequentemente associati a variabili cliniche. Tuttavia, gruppi tassonomici ampi come Firmicutes contengono membri funzionalmente diversi, e la loro interpretazione biologica deve essere affrontata con cautela. Un'analisi metagenomica fecale ha mostrato che Lactobacillus e i suoi epitopi microbici associati al phylum Firmicutes sono arricchiti nei pazienti con PD e sono associati a marcatori infiammatori e vie metaboliche come la fermentazione del propionato25. Bifidobacterium è un genere batterico con possibili proprietà anti-infiammatorie e potrebbe contribuire alla regolazione del microbiota intestinale, mentre Bacteroides è un genere commensale importante il cui stato di disbiosi è stato associato a un'alterata funzione della barriera intestinale e a risposte infiammatorie aumentate26,27. Nello studio attuale, Bacteroides era relativamente più abbondante in FP2M_L, mentre Bifidobacterium era relativamente più abbondante in FP1M_L. In un modello murino di PD, l'intintegrazione con Bifidobacterium breve Bif11 ha migliorato il deficit motorio e cognitivo, ridotto i fattori infiammatori e lo stress ossidativo nel mesencefalo e ripristinato il contenuto di acidi grassi a catena corta e la funzione della barriera intestinale28. Studi precedenti hanno inoltre riportato un'abbondanza alterata di Bacteroides nei pazienti con PD, accompagnata da cambiamenti nel metabolismo dei precursori degli acidi grassi a catena corta e da associazioni con la gravità della malattia29. Questi risultati indicano che i taxa osservati in questo studio potrebbero avere un significato biologico potenziale, ma sono necessarie analisi tassonomiche ad alta risoluzione e una validazione funzionale.
L'analisi di previsione funzionale ha suggerito che diversi sottogruppi di MP presentavano schemi distinti di arricchimento predetto nei percorsi KEGG. Il gruppo FB_H mostrava un arricchimento predetto in percorsi come il metabolismo dei carboidrati, la fosforilazione ossidativa, il metabolismo microbico in diversi ambienti e i processi legati ai lipopolisaccaridi, il che potrebbe riflettere un potenziale metabolico microbico alterato nel gruppo ad alta gravità. La fosforilazione ossidativa è un processo principale attraverso cui i mitocondri generano energia e mantengono la normale funzione neuronale30. Il disturbo della fosforilazione ossidativa può portare a carenza energetica, stress ossidativo e neuroinfiammazione, fattori coinvolti nella depressione e nel MP31. Studi hanno suggerito che il microbioma intestinale potrebbe influenzare la disfunzione mitocondriale regolando la sintesi dei neurotrasmettitori, la mitofagia e l'omeostasi dello stress ossidativo32. I geni associati al MP potrebbero inoltre compromettere la funzione del complesso I mitocondriale, ridurre la produzione di ATP ed aggravare la progressione della malattia interrompendo il percorso Akt33. Inoltre, il lipopolisaccaride (LPS), un componente importante dei batteri Gram-negativi, potrebbe innescare risposte neuroinfiammatorie, e studi sugli animali hanno dimostrato che l'esposizione a LPS può attivare la microglia, promuovere il rilascio di fattori infiammatori, danneggiare le strutture neurali e indurre cambiamenti comportamentali simili al parkinsonismo34. In questo studio, alcuni sottogruppi a bassa gravità e post-FMT mostravano anche un arricchimento predetto in percorsi legati al metabolismo degli aminoacidi, alla biosintesi di metaboliti secondari, al trasporto di membrana, alla replicazione e riparazione, e al metabolismo relativo agli acidi grassi a catena corta. Tuttavia, poiché questi risultati sui percorsi sono stati dedotti dal sequenziamento dell'rRNA 16S piuttosto che misurati direttamente mediante approcci metagenomici o metabolomici, dovrebbero essere considerati esplorativi.
Questo studio ha inoltre valutato le associazioni tra caratteristiche microbiche intestinali e indicatori clinici che riflettono sintomi motori e non motori nel morbo di Parkinson (PD). Il punteggio di Wexner riflette la funzione evacuativa; lo stadio di Hoehn–Yahr e l'UPDRS valutano la gravità del deficit motorio; PSQI e ADL misurano rispettivamente la qualità del sonno e l'abilità funzionale quotidiana; e l'NPI valuta sintomi neuropsichiatrici come ansia e depressione35,36,37. Diversi OTU erano associati a scale cliniche relative a costipazione, disturbi del sonno, deficit motorio, stato funzionale e sintomi neuropsichiatrici. Studi randomizzati controllati precedenti hanno riportato che il trapianto di microbiota fecale (FMT) potrebbe migliorare la funzione autonoma e i sintomi gastrointestinali nei pazienti con PD e aumentare la complessità del microbioma intestinale, suggerendo che l'FMT potrebbe rappresentare un intervento adiuvante fattibile38. Un altro studio ha inoltre riscontrato che la diversità microbica intestinale era alterata nei pazienti con PD, con Firmicutes e Actinobacteria correlati positivamente ai punteggi dell'UPDRS III, NMSS, Wexner e del questionario per il morbo di Parkinson a 39 voci (PDQ-39), mentre Bacteroidetes mostrava correlazioni negative con questi indicatori39. Tuttavia, le correlazioni osservate nel presente studio non dimostrano causalità, e la direzionalità di tali associazioni va interpretata con cautela.
La sicurezza è un aspetto essenziale nella valutazione del trapianto di microbiota fecale (FMT) per le malattie neurodegenerative. In questo gruppo di pazienti, gli eventi avversi riportati erano principalmente gastrointestinali, inclusi flatulenza, diarrea, stitichezza aggravata, nausea/vomito e dolore addominale. Non è stata registrata febbre e nessun paziente ha interrotto il FMT a causa di eventi avversi. Questi risultati indicano che il FMT è stato generalmente ben tollerato in questo piccolo gruppo. Tuttavia, la valutazione della sicurezza si è basata su cartelle cliniche retrospettive e su un numero limitato di pazienti. Non possono essere escluse complicanze rare ma clinicamente rilevanti, come infezioni, aspirazione, trasmissione di patogeni derivati dal donatore, complicanze metaboliche ed eventi avversi ritardati. Studi prospettici futuri dovrebbero includere definizioni standardizzate di eventi avversi, sorveglianza attiva della sicurezza, documentazione dello screening dei donatori e un follow-up a lungo termine.
Vanno riconosciute diverse limitazioni, tra cui la piccola dimensione del campione (n = 6), l'assenza di un gruppo di controllo, un disegno sperimentale con misure ripetute che comporta potenziale pseudoreplicazione e regressione verso la media, e una documentazione incompleta di possibili fattori confondenti come dieta, trattamenti per la stitichezza, aggiustamenti farmacologici e uso di antibiotici o probiotici, anche se ai partecipanti era stato consigliato di evitare questi ultimi; tuttavia, esposizioni non documentate non possono essere escluse e potrebbero aver influenzato il microbiota intestinale. Inoltre, la storia familiare di malattia di Parkinson o di altri disturbi neurologici non è stata registrata in modo sistematico, impedendo la valutazione di contributi genetici o familiari. Le previsioni funzionali si basavano su dati di 16S rRNA piuttosto che su misurazioni dirette metagenomiche o metabolomiche, e diversi OTU sono stati annotati solo a livelli tassonomici ampi, limitando l'interpretazione biologica. Tali limitazioni richiedono un'interpretazione cauta di questi risultati.
Nonostante ciò, questo studio esplorativo suggerisce che il trapianto di microbiota fecale (FMT) è stato associato a modifiche dei sintomi correlati alla costipazione, a determinati punteggi clinici motori e non motori, a eventi avversi gastrointestinali e a profili esplorativi del microbiota intestinale in pazienti con malattia di Parkinson (PD). I risultati forniscono evidenze preliminari derivanti dalla pratica clinica e sostengono ulteriori indagini su interventi mirati al microbiota nei pazienti con PD e costipazione. Tuttavia, considerata la ridotta numerosità del campione, il disegno retrospettivo, la struttura con misure ripetute e l'assenza di un gruppo di controllo, i risultati devono essere interpretati con cautela. Sono necessari studi prospettici controllati, con protocolli standardizzati di FMT, endpoint clinici predeterminati, un rigoroso monitoraggio della sicurezza e analisi integrate di tipo multi-omico, per chiarire il valore clinico, la sicurezza e i meccanismi biologici dell'FMT nella PD.
Dichiarazioni
Dichiarazione di interessi contrastanti: gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare tutti i colleghi che hanno contribuito e sostenuto questa ricerca. La loro collaborazione e il loro incoraggiamento sono stati di inestimabile valore per il nostro lavoro.
Finanziamento: Questa ricerca è stata finanziata dal programma chiave provinciale del Jiangsu per la salute degli anziani (LKZ2022004).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema MiSeq | Illumina, Inc. | SY-410-1003 | Piattaforma di sequenziamento di nuova generazione a lettura corta da banco utilizzata per il sequenziamento di ampliconi della regione V3–V4 dell'RNA 16S con chimica a estremità accoppiate 2 × 300 bp. |
| Metagenome@KIN | World Fusion Co., Ltd. | v2.2.1; https://www.w-fusion.com/metagenome | Software commerciale utilizzato per l'assegnazione tassonomica dell'RNA 16S e l'analisi delle comunità microbiche. |
| Database per l'identificazione microbica (batterico) | TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd. | DB-BA, database v10.0; https://www.tecsrg.co.jp/services/enki/ | Database di riferimento del DNA ribosomiale 16S batterico utilizzato per l'identificazione microbica. |
| Primer 341F | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleotide su misura; nessun numero di catalogo | Sequenza del primer diretto: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′. |
| Primer 805R | BGI Genomics Co., Ltd. | Oligonucleotide su misura; nessun numero di catalogo | Sequenza del primer inverso: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′. |
| Servizio di sequenziamento del gene dell'RNA 16S | BGI Genomics Co., Ltd. (Wuhan, Cina) | https://www.bgi.com/us/sequencing-services/rna-sequencing-solutions/16s18s-its-sequencing/ | Fornitore commerciale di servizi di sequenziamento; ha eseguito la preparazione delle librerie, il sequenziamento e il controllo qualità iniziale. |
| Tubi microcentrifuga Eppendorf Safe-Lock, Biopur, 1,5 mL | Eppendorf SE | '0030121589 | Tubi sterili in polipropilene utilizzati per l'aliquotatura dei campioni fecali da conservare a −80 °C. |
| LEfSe | Segata Lab/bioBakery | v1.1.2; https://github.com/SegataLab/lefse | Software basato sull'analisi lineare della dimensione dell'effetto (LDA) utilizzato per identificare taxa e percorsi predetti con abbondanza differenziale. |
| Tax4Fun2 | Team di sviluppo di Tax4Fun2 | v1.1.5; https://github.com/fjossandon/Tax4Fun2 | Pacchetto R utilizzato per inferire i profili funzionali del Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a partire da dati di sequenziamento dell'RNA 16S. |
| Pacchetto R microeco | Chi Liu e collaboratori | v1.15.0; https://cran.r-project.org/package=microeco | Pacchetto per l'analisi e la visualizzazione dell'ecologia delle comunità microbiche, utilizzato per analizzare abbondanza e diversità microbica. |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versione non specificata; https://www.r-project.org/ | Ambiente di calcolo statistico utilizzato per le analisi cliniche e del microbioma; la versione esatta deve essere confermata dagli autori. |
| Sistema automatizzato GenFMTer per la purificazione della microbiota fecale | Nanjing FMT Medical Co., Ltd. | Modello: GenFMTer; https://en.fmtmed.com/ | Sistema automatizzato utilizzato per la centrifugazione, il lavaggio e la preparazione standardizzata della sospensione di microbiota fecale. |
Riferimenti
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