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Articolo metodologico

Metodo QuEChERS modificato per l'analisi di pesticidi organofosforici nei suoli agricoli mediante gascromatografia-spettrometria di massa tandem

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DOI:

10.3791/72745

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18 settembre 2026

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1Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ingeniería, Universidad EAN

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) modificato, con una pulizia mediante estrazione in fase solida dispersiva basata su un adsorbente di silicato di magnesio, per la determinazione multiresiduale di pesticidi organofosforici nei suoli agricoli mediante cromatografia gassosa abbinata a spettrometria di massa in tandem, migliorando l'eliminazione dei co-estratti, minimizzando le interferenze analitiche legate alla matrice e consentendo una quantificazione affidabile a livelli traccia.

Abstract

La determinazione accurata di residui di pesticidi organofosforici (OPP) nei suoli agricoli mediante cromatografia gassosa in tandem con spettrometria di massa (GC-MS/MS) è spesso ostacolata da effetti di segnale indotti dalla matrice, causati da materia organica co-estratta, sostanze umiche e interferenti associati ai minerali. Le strategie convenzionali di purificazione Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) potrebbero non rimuovere in modo sufficiente i componenti della matrice da estratti complessi di suolo, compromettendo le prestazioni analitiche. Questo studio presenta un protocollo QuEChERS modificato che incorpora un adsorbente nella purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva con sorbenti misti (dSPE) per la determinazione simultanea di 12 OPP in suoli agricoli mediante GC-MS/MS. Sono state valutate sette combinazioni di sorbenti dSPE in sei suoli agricoli con proprietà diverse. La rimozione delle co-estrazioni è stata quantificata gravimetricamente, e la combinazione di ammina primaria-secondaria, ottadecilsilano e un adsorbente a base di silicato di magnesio (50 mg ciascuno, con 150 mg di solfato di magnesio anidro) ha ottenuto la più alta rimozione media di co-estrazioni (88%). Negli estratti finali sono stati aggiunti protettori dell'analita costituiti da etilglicerolo, L-gulonico acido γ-lattone, D-sorbitolo e acido sciamico per minimizzare gli effetti di matrice, mentre la taratura con matrice abbinata ha compensato le variazioni specifiche del segnale in funzione del suolo. Clorpirifos-metile-d10 e fosfato di trifenile sono stati utilizzati rispettivamente come standard interno di procedura e di iniezione. Le curve di taratura con matrice abbinata (5–600 µg/kg) hanno mostrato un'eccellente linearità, con coefficienti di determinazione ≥0,9933 per la maggior parte delle combinazioni analita-suolo. Il limite di rilevabilità (5 µg/kg) è stato utilizzato per la valutazione della linearità, mentre il limite di quantificazione del metodo è stato stabilito a 50 µg/kg come livello più basso validato. Accuratezza e precisione, valutate a tre livelli di recupero (50, 200 e 400 µg/kg, n = 5 per livello), hanno mostrato recuperi compresi tra il 70% e il 120% con deviazioni standard relative ≤20% per la maggior parte delle combinazioni analita-suolo, soddisfacendo i criteri di prestazione di SANTE/2020/12830 (Rev.2). Recuperi inferiori sono stati osservati soltanto per fenamifos, pirimifos-etile ed etione in alcune matrici di suolo selezionate. I risultati dimostrano che l'adsorbente a base di silicato di magnesio migliora la purificazione dSPE riducendo le co-estrazioni e che la sua combinazione con protettori dell'analita e taratura con matrice abbinata consente una determinazione affidabile di residui multipli di OPP in matrici di suolo complesse mediante GC-MS/MS.

Introduzione

Gli insetticidi organofosforati (OPP) rimangono tra le classi di agrochimici più ampiamente utilizzate a livello mondiale grazie all'elevata efficacia e versatilità di questa categoria di pesticidi nella protezione delle colture1. Sebbene molti OPP si degradino nell'ambiente più rapidamente rispetto ai pesticidi organoclorurati, l'applicazione diffusa e ripetuta di questi composti determina una loro persistenza nei suoli agricoli2. Il suolo rappresenta il principale compartimento ambientale che riceve gli apporti di pesticidi e può fungere da serbatoio temporaneo da cui i residui possono essere trasferiti alle colture, alle acque superficiali, alle acque sotterranee e agli ecosistemi circostanti3. La presenza di residui di OPP è preoccupante poiché questi composti sono associati a effetti neurotossici nell'uomo attraverso l'inibizione dell'attività della acetilcolinesterasi, nonché a impatti negativi sugli organismi non bersaglio, sulle comunità microbiche del suolo e sul funzionamento degli ecosistemi2. La presenza di residui di OPP nei suoli agricoli può quindi contribuire alla perdita di biodiversità, allo squilibrio ecologico e all'esposizione ambientale attraverso vie alimentari e idriche3. La determinazione affidabile dei residui di OPP è pertanto essenziale per generare dati di occorrenza di alta qualità, sostenere le valutazioni dell'esposizione ambientale e migliorare la comprensione del destino ambientale degli OPP in diverse condizioni agricole. Inoltre, metodi analitici sviluppati e ottimizzati utilizzando un singolo tipo di suolo potrebbero non fornire prestazioni equivalenti quando applicati a suoli con caratteristiche fisico-chimiche contrastanti4,5, evidenziando l'importanza di valutare l'applicabilità del metodo in diversi ambienti agricoli. Tuttavia, la quantificazione a livelli traccia rimane una sfida poiché i suoli agricoli presentano una notevole variabilità fisico-chimica, che influenza l'efficienza di estrazione, gli effetti di matrice (ME) e le prestazioni analitiche complessive6.

La cromatografia gassosa-spettrometria di massa in tandem (GC-MS/MS) è ampiamente riconosciuta come tecnica analitica di riferimento per la determinazione multiresiduo di OPP a livelli traccia in matrici complesse7,8. Tuttavia, una quantificazione accurata dipende non solo dalle prestazioni strumentali, ma anche dall'efficacia della preparazione del campione. Gli estratti di suolo contengono comunemente componenti di matrice co-estratti che raggiungono il sistema cromatografico insieme agli analiti target e possono alterare la risposta degli analiti attraverso soppressione o potenziamento del segnale4,5,6. L'entità di questi effetti varia notevolmente tra i diversi tipi di suolo ed è influenzata da fattori come il contenuto di materia organica, la frazione argillosa, la composizione minerale e il pH. Di conseguenza, gli effetti di matrice (ME) rimangono una delle principali fonti di incertezza analitica nella determinazione di pesticidi basata su GC-MS/MS, evidenziando la necessità di strategie di purificazione in grado di ridurre il carico di co-estratti preservando al contempo il recupero degli analiti5,9,10. Inoltre, la generazione di dati residui affidabili richiede il rispetto di criteri analitici prestazionali accettati a livello internazionale, al fine di garantire l'accuratezza del metodo, la comparabilità tra studi e l'idoneità per applicazioni di monitoraggio ambientale11.

Il metodo Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) è diventato l'approccio più utilizzato per la preparazione dei campioni nell'analisi multiresiduale di pesticidi grazie alla sua semplicità, al basso consumo di solvente e alla vasta applicabilità su matrici agricole4,12,13. La sua progettazione modulare e flessibile ha permesso un'ampia adattabilità a diversi tipi di campioni e applicazioni analitiche, contribuendo alla sua diffusa adozione nell'analisi multiresiduale contemporanea e alla sua frequente associazione con la chimica analitica sostenibile, grazie al ridotto consumo di solventi e alla semplificazione della preparazione del campione. Questa adattabilità consente inoltre di personalizzare il metodo selezionando condizioni di estrazione e purificazione in base alle specifiche caratteristiche della matrice. Nell'analisi del suolo, l'efficacia del passaggio di purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva (dSPE) è fondamentale, poiché una rimozione insufficiente dei componenti della matrice co-estratti può compromettere le prestazioni analitiche della successiva determinazione mediante GC-MS/MS4,14. Le combinazioni convenzionali di sorbenti basate su ammina primaria-secondaria (PSA) e silano ottadecilico (C18) spesso garantiscono una rimozione limitata dei costituenti umici polari, tra i principali responsabili degli effetti di segnale indotti dalla matrice negli estratti di suolo agricolo14. Il Florisil, un adsorbente a base di silicato di magnesio con affinità per composti che coprono un ampio intervallo di polarità, ha dimostrato prestazioni promettenti nella purificazione di matrici alimentari e vegetali15,16. Tuttavia, il suo contributo alle strategie di purificazione dSPE con sorbenti misti per suoli agricoli rimane insufficientemente caratterizzato, in particolare nei suoli con diverse proprietà fisico-chimiche17,18,19,20,21.

Questo studio presenta un protocollo QuEChERS modificato in cui sette combinazioni di sorbenti dSPE sono state valutate su sei suoli agricoli con diverso pH, contenuto di materia organica e tessitura. Lo studio si basava sull'ipotesi che l'inclusione dell'adsorbente silicato di magnesio nella pulizia dSPE con sorbenti misti avrebbe potenziato la rimozione dei componenti di matrice co-estratti dagli estratti di suolo agricolo. La selezione del sorbente è stata effettuata in base alla valutazione gravimetrica della rimozione dei co-estratti, e la combinazione che ha fornito la maggiore efficienza media di pulizia è stata successivamente sottoposta a una completa validazione analitica. La procedura ottimizzata è stata validata per la determinazione simultanea di 12 OPP mediante standardizzazione con standard interno, taratura con matrice abbinata e GC-MS/MS. Inoltre, sono stati inclusi nel protocollo finale degli additivi protettivi per gli analiti (etilglicerolo, γ-lattone dell'acido L-gulonico, D-sorbitolo e acido scichimico) come strategia complementare per ridurre al minimo gli effetti residui del segnale indotti dalla matrice. Integrando un'ottimizzazione sistematica della pulizia con una validazione analitica completa su suoli con proprietà fisico-chimiche contrastanti, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro robusto e riproducibile che potrebbe facilitare la determinazione dei residui di pesticidi in suoli agricoli eterogenei.

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Protocollo

I dati di origine alla base dell'ottimizzazione sperimentale della procedura di purificazione mediante dSPE, del set di dati relativi all'effetto di matrice e della caratterizzazione fisico-chimica dei sei suoli agricoli sono stati depositati su Zenodo e sono disponibili pubblicamente al DOI: 10.5281/zenodo.21644870. I dettagli sui reagenti e sull'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Campionamento e preparazione del suolo

NOTA: Per garantire la sicurezza personale, si raccomanda di indossare una camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile durante tutto il protocollo.

  1. Prelevare un campione composito di suolo in massa dallo strato superficiale (0–10 cm) in ciascuna località agricola selezionata, combinando 8 sottocampioni individuali raccolti tramite un disegno di campionamento sistematico a griglia quadrata22.
    NOTA: Il disegno a griglia quadrata con 8 punti è conforme alle raccomandazioni della New South Wales Environment Protection Authority (NSW EPA) per siti di circa 1000 m2 (0,1 ha)22.
  2. Combinare e mescolare accuratamente questi sottocampioni in campo per ottenere un singolo campione composito rappresentativo (≥500 g) per località, stabilendo una matrice omogenea di riferimento per la valutazione delle prestazioni del metodo.
    NOTA: Il campionamento composito viene utilizzato qui esclusivamente per standardizzare gli effetti di fondo della matrice ai fini dell'ottimizzazione e della validazione del metodo. Nel contesto di quadri normativi per la valutazione di terreni contaminati sconosciuti o reali, il campionamento composito è rigorosamente limitato dalla NSW EPA a causa del rischio di diluizione chimica22. Per la caratterizzazione effettiva del sito o il rilevamento di aree con alta concentrazione di contaminanti, i campioni provenienti dai nodi della griglia devono essere mantenuti separati ed analizzati singolarmente per evitare falsi negativi e preservare i dati sulla varianza spaziale.
  3. Trasportare i campioni di suolo in laboratorio in contenitori di vetro ambrato ermetici e al riparo dalla luce.
    NOTA: I contenitori di vetro sono preferiti rispetto ai sacchetti di polietilene per minimizzare le perdite per adsorbimento degli OPP idrofobi o semi-volatili sulle superfici plastiche e ridurre il rischio di lisciviazione dei contaminanti o interazioni tra polimeri e analiti. Le condizioni al buio minimizzano la fotodegradazione dei composti sensibili alla luce durante il trasporto.
  4. Essiccare i campioni all'aria a temperatura ambiente, in assenza di luce diretta, fino al raggiungimento di un peso costante.
    NOTA: L'essiccazione all'aria viene applicata per standardizzare il contenuto di umidità del suolo e garantire che i risultati siano espressi sulla base del peso secco, migliorando la comparabilità tra campioni con diverso contenuto naturale di acqua. Si evita l'essiccazione forzata in stufa per prevenire potenziali perdite di OPP termolabili o semi-volatili e alterazioni della struttura della materia organica del suolo e delle sue proprietà di sorption.
  5. Sfaldare manualmente gli aggregati del suolo e setacciare attraverso un setaccio in acciaio inossidabile da 2 mm. Conservare i suoli omogeneizzati in contenitori di vetro ambrato ermetici, al buio e in condizioni refrigerate a 4 °C fino all'estrazione.
    NOTA: Le caratteristiche fisico-chimiche dei sei suoli utilizzati in questo studio erano disponibili da precedenti analisi di routine del suolo. Questi dati sono stati utilizzati esclusivamente per selezionare suoli agricoli che coprissero un ampio intervallo di pH (suolo:H2O, 1:2)23, contenuto di materia organica (metodo di Walkey Black)24 e tessitura (metodo di Bouyoucos)25 ai fini della valutazione del metodo.

2. Preparazione dei reagenti, degli standard e delle soluzioni standard interne

NOTA: A meno che non sia specificato diversamente, le soluzioni stock singole di pesticidi, le soluzioni standard di lavoro miste, le soluzioni di standard interno procedurale (P-IS) e di standard interno di iniezione (I-IS), le soluzioni di recupero e le soluzioni standard di calibrazione vengono preparate in fiale volumetriche da 10 mL, trasferite in vial di vetro ambrato e conservate a −20 °C fino all'uso. La calibrazione con matrice abbinata, i protettori dell'analita, il P-IS e l'I-IS sono stati inclusi poiché ciascuno di essi affronta una diversa fonte di variabilità analitica, migliorando così la robustezza dell'analisi quantitativa in matrici di suolo complesse.

  1. Preparare singole soluzioni stock di ciascuno dei 12 standard commerciali di OPP (vedere Tabella dei Materiali) a 1000 mg/L in toluene.
  2. Combinare volumi appropriati delle singole soluzioni stock per preparare una soluzione standard di lavoro mista in acetonitrile (ACN) a 400 mg/L.
    NOTA: Questa soluzione standard di lavoro mista viene successivamente utilizzata per la preparazione delle soluzioni di recupero e di taratura.
  3. Preparare il clorpirifos-metile-d10 come P-IS in ACN a 750 mg/L. Aggiungere durante l'estrazione (passo 3.2) per monitorare e correggere le variazioni procedurali.
    NOTA: Il clorpirifos-metile-d10 è stato scelto come P-IS perché, essendo un OPP marcati isotopicamente, mostra un comportamento fisico-chimico simile a quello degli analiti target pur rimanendo facilmente distinguibile mediante MS/MS.
  4. Preparare il fosfato di tri fenile come I-IS in ACN a 1050 mg/L. Aggiungere immediatamente prima dell'analisi strumentale (passo 4.2.4) per correggere le variazioni di iniezione.
  5. Preparare le soluzioni di recupero stock in ACN acidificato con acido formico al 0,05% (v/v) per ottenere concentrazioni finali equivalenti nel suolo di 50 µg/kg, 200 µg/kg e 400 µg/kg per gli OPP quando 300 µL vengono aggiunti a 5 g di suolo nero prima dell'estrazione. Preparare una soluzione P-IS separata corrispondente a un campione equivalente di 200 µg/kg.
    NOTA: L'acidificazione con acido formico migliora la stabilità degli OPP durante lo stoccaggio.
  6. Preparare soluzioni di taratura contenenti i 12 OPP e il clorpirifos-metile-d10 in ACN con acido formico al 0,05% (v/v), corrispondenti a concentrazioni finali equivalenti nel suolo di 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 µg/kg per gli analiti e di 200 µg/kg per il P-IS.
    NOTA: Queste soluzioni vengono successivamente utilizzate per la preparazione di curve di taratura con matrice abbinata per ciascuna matrice di suolo, che sono state interpolate mediante regressione lineare non pesata. Il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati definiti secondo il documento guida SANTE/2020/12830 (Rev.2). Il LOD è stato considerato il livello di taratura più basso nella matrice, mentre il LOQ corrispondeva al livello di concentrazione più basso validato, dimostrando recupero e precisione accettabili.
  7. Preparare una miscela di protettori per analiti costituita da etilglicerolo (100 g/L), L-gulonico γ-lattone (10 g/L), D-sorbitolo (10 g/L) e acido shikimico (5 g/L) in ACN:acqua (1:1, v/v) acidificato con acido formico allo 0,1%. Conservare a −20 °C. Aggiungere immediatamente prima dell'analisi strumentale (passo 4.2.4) per ridurre gli effetti della matrice (ME).

Estrazione QuEChERS

  1. Pesare 5,00 g ± 0,01 g di suolo essiccato all'aria e setacciato in un tubo da centrifuga in polipropilene da 50 mL.
  2. Per gli esperimenti di recupero, aggiungere la soluzione P-IS (preparata al punto 2.3) e la relativa soluzione di recupero (preparata al punto 2.5) per ottenere concentrazioni finali di 200 µg/kg per clorpirifos-metile-d10 e di 50, 200 o 400 µg/kg per gli OPP bersaglio (n = 5 per livello di recupero per ciascun suolo).
    NOTA: Per gli esperimenti di recupero, sia la soluzione P-IS che la soluzione di recupero del pesticida vengono aggiunte prima dell'estrazione, come descritto al punto 3.2. Per l'analisi di routine dei campioni di suolo, solo il P-IS viene aggiunto prima dell'estrazione, al fine di compensare le variazioni procedurali durante la preparazione e l'analisi dei campioni. Per la preparazione degli estratti di calibrazione con matrice corrispondente, né il P-IS né gli standard del pesticida vengono aggiunti durante l'estrazione; si preparano estratti di suolo bianco, e gli standard di calibrazione contenenti sia gli analiti che il P-IS (preparati al punto 2.6) vengono aggiunti dopo il ripulimento (vedere punto 4.2.4).
  3. Vortexare per 30 s e lasciare equilibrare i campioni fortificati per 10 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Il periodo di equilibrio favorisce l'interazione tra gli analiti fortificati e la matrice del suolo prima dell'estrazione, migliorando la rappresentatività degli esperimenti di recupero.
  4. Aggiungere 10 mL di acqua deionizzata e agitare manualmente per 30 s per assicurare un completo bagnamento della matrice del suolo.
    NOTA: La reidratazione migliora la desorbimento degli analiti dalle particelle del suolo e facilita un'efficiente ripartizione durante l'estrazione.
  5. Aggiungere 10 mL di ACN contenente 1% (v/v) di acido acetico. Chiudere immediatamente il tubo e agitare vigorosamente per 2 min.
  6. Aggiungere 6,0 g di solfato di magnesio anidro (MgSO4) e 1,5 g di acetato di sodio, quindi agitare immediatamente il tubo vigorosamente per 1 min.
    NOTA: Un'agitazione rapida dopo l'aggiunta del sale è essenziale per garantire una ripartizione di fase efficiente e prevenire la formazione di aggregati di sale.
  7. Centrifugare a 1800 × g per 5 min.
  8. Trasferire la fase superiore di ACN in un tubo pulito per il successivo ripulimento con dSPE.

4. Purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva

NOTA: Questa sezione comprende due approcci. In primo luogo, sono state valutate sette combinazioni di sorbenti dSPE per identificare la composizione di purificazione in grado di garantire la rimozione media più elevata degli estratti concomitanti in sei suoli agricoli. Successivamente, la combinazione di sorbenti selezionata è stata applicata come procedura ottimizzata di purificazione per la validazione del metodo, secondo il documento guida della Direzione Generale della Salute e della Sicurezza Alimentare della Commissione Europea (DG SANTE) SANTE/2020/12830 (Rev.2)11.

  1. Ottimizzazione delle combinazioni di sorbenti per la dSPE
    ​NOTA: La rimozione gravimetrica dei co-estratti è stata scelta come criterio di ottimizzazione perché fornisce una misura indipendente dall'analita dell'efficienza della pulizia. Le quantità di sorbente valutate corrispondono alle proporzioni convenzionali ampiamente utilizzate nelle procedure dSPE basate su QuEChERS, facilitando così l'adozione del protocollo proposto nei laboratori analitici di routine.
    1. Preparare provette microcentrifughe da 2 mL contenenti le seguenti combinazioni di sorbenti: (i) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA; (ii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di C18; (iii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (iv) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di C18; (v) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (vi) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di C18 + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (vii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di C18 + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio.
    2. Trasferire aliquote da 1,0 mL dell'estratto ottenuto al passaggio 3.8 in ciascuna provetta dSPE.
      NOTA: Eseguire tutte le valutazioni dei sorbenti in triplice replicazione per ogni tipo di suolo. Le aliquote utilizzate per il confronto devono provenire dallo stesso estratto per garantire che le differenze nella rimozione dei co-estratti siano attribuibili esclusivamente alla composizione del trattamento di pulizia.
    3. Agitare con vortex per 1 minuto e centrifugare a 1800 × g per 5 minuti.
    4. Trasferire 1,0 mL di ciascun estratto purificato in un tubo di vetro precedentemente asciugato e pesato. Evaporare il solvente a secco sotto un flusso leggero di azoto a 40 °C.
    5. Lasciare raffreddare il tubo in un essiccatore fino a temperatura ambiente e determinare la massa del residuo rimanente. Calcolare la massa dei co-estratti sottraendo il peso iniziale del tubo vuoto dal peso finale dopo l'evaporazione del solvente.
    6. Determinare la quantità di co-estratti presenti negli estratti non sottoposti a pulizia dSPE evaporando aliquote equivalenti di estratto non trattato in condizioni identiche.
    7. Calcolare la percentuale di rimozione dei co-estratti secondo la Equazione 126:
      Formula di equilibrio statico per la percentuale di rimozione dei co-estratti; diagramma dell'equazione chimica.
    8. Calcolare la rimozione media dei co-estratti ottenuta da tre determinazioni per ciascuna combinazione di sorbenti e tipo di suolo. Successivamente, calcolare la rimozione media complessiva sui sei tipi di suolo agricolo per ogni combinazione di sorbenti.
    9. Valutare le differenze tra le combinazioni di sorbenti mediante analisi della varianza (ANOVA) in un disegno a blocchi completi randomizzati (RCBD), considerando la combinazione di sorbenti come fattore trattamentale e la matrice del suolo come fattore di blocco. Prima dell'ANOVA, verificare la normalità dei residui e l'omogeneità delle varianze utilizzando rispettivamente i test di Shapiro-Wilk e di Levene. Eseguire confronti a coppie mediante il test HSD di Tukey a un livello di significatività di α = 0,05.
    10. Scegliere la composizione di pulizia in base alla valutazione combinata dell'analisi statistica e della rimozione media complessiva dei co-estratti.
      NOTA: Ridurre il carico di co-estratti minimizza l'introduzione di componenti della matrice nel sistema cromatografico, migliorando così le prestazioni cromatografiche, riducendo la contaminazione del sistema GC-MS/MS e abbassando i requisiti di manutenzione dello strumento.
      NOTA: La combinazione contenente PSA, C18 e l'adsorbente al silicato di magnesio (50 mg ciascuno, con 150 mg di MgSO4 anidro) ha mostrato la rimozione media più elevata ed è stata pertanto selezionata come procedura ottimizzata di pulizia per tutte le analisi successive.
  2. Applicazione della procedura ottimizzata di pulizia dSPE
    1. Trasferire 1,0 mL dell'estratto ottenuto al passaggio 3.8 in una provetta microcentrifughe da 2 mL contenente 150 mg di MgSO4 anidro, 50 mg di PSA, 50 mg di C18 e 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio.
    2. Agitare con vortex per 1 minuto per garantire un'interazione completa tra l'estratto e i sorbenti.
    3. Centrifugare a 1800 × g per 5 minuti.
    4. Trasferire 200 µL del surnatante purificato in un vial per autosampler e aggiungere 20 µL della miscela protettiva per analiti preparata al passaggio 2.7 e 50 µL della soluzione di triifenil fosfato preparata al passaggio 2.4. Mescolare accuratamente prima dell'analisi strumentale.
      NOTA: Per la taratura con matrice corrispondente, preparare estratti bianchi per ciascun tipo di suolo seguendo le procedure di estrazione e pulizia descritte ai passaggi 3 e 4.2, senza aggiunta di pesticidi o del P-IS. Dopo la pulizia, trasferire 200 µL dell'estratto bianco purificato in sette vial separati e aggiungere le soluzioni di taratura preparate al passaggio 2.6 per ottenere concentrazioni finali di 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 µg/kg per gli analiti e 200 µg/kg per il P-IS. Aggiungere a ogni vial 20 µL della miscela protettiva per analiti e 50 µL di triifenil fosfato come descritto al passaggio 4.2.4, ottenendo un volume finale del vial di 270 µL. Costruire curve di taratura indipendenti corrispondenti alla matrice per ciascun tipo di suolo. Le concentrazioni equivalenti al suolo si basano sull'aliquota da 200 µL di estratto purificato, che rappresenta l'estratto ottenuto dal campione originale di 5 g di suolo. L'aggiunta successiva di protettivi per analiti e del P-IS aumenta il volume finale del vial ma non modifica la quantità di suolo rappresentata dall'aliquota di estratto. Per la taratura basata su solvente, sostituire l'aliquota da 200 µL di estratto purificato con 200 µL di ACN e preparare i vial di taratura utilizzando le stesse concentrazioni di analiti, concentrazione del P-IS, concentrazione del P-IS e miscela protettiva per analiti impiegate per la taratura con matrice corrispondente. Queste curve di taratura basate su solvente verranno successivamente utilizzate per la valutazione dell'effetto di matrice (ME).
    5. Eseguire l'analisi strumentale utilizzando un sistema GC-MS/MS.

5. Analisi GC-MS/MS e acquisizione dei dati

NOTA: descrizioni dettagliate della configurazione del GC-MS/MS e delle procedure di acquisizione dati sono disponibili in Varela-Martínez et al.27. I principali parametri cromatografici e spettrometrici di massa sono riassunti di seguito.

  1. Utilizzare un sistema GC-MS/MS dotato di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo, una sorgente di ionizzazione elettronica (EI) funzionante a −70 eV e un campionatore automatico.
  2. Installare una colonna capillare in silice fusa a bassa polarità (30 m × 0,25 mm di diametro interno × 0,25 µm di spessore del film) e utilizzare elio come gas trasportatore a un flusso costante di 1,2 mL/min.
  3. Prima dell'analisi, verificare la prontezza dello strumento, inclusi l'alimentazione del gas trasportatore, le prestazioni del sistema a vuoto, lo stato della siringa e i livelli di solvente per il lavaggio del campionatore automatico. Eseguire la taratura dello strumento secondo le raccomandazioni del produttore.
    NOTA: Verificare che la pressione operativa a vuoto soddisfi le specifiche raccomandate dal produttore dello strumento prima di avviare qualsiasi sequenza analitica.
  4. Impostare il programma di temperatura del forno GC come segue: temperatura iniziale di 50 °C per 1 min; aumento fino a 180 °C a 25 °C/min; quindi fino a 230 °C a 5 °C/min; e infine fino a 290 °C a 25 °C/min. Mantenere la temperatura finale per 6 min. Il tempo totale di analisi è di 24,6 min.
  5. Impostare la temperatura del portainiettore a 250 °C ed effettuare iniezioni di 1 µL in modalità senza divisione del flusso (splitless). Aprire la valvola di sfogo del flusso di divisione 1 min dopo l'iniezione.
    NOTA: Per ridurre al minimo il carryover, risciacquare la siringa del campionatore automatico in sequenza con metanolo, acetato di etile e ACN tra un'iniezione e l'altra.
  6. Impostare la temperatura della linea di trasferimento MS a 250 °C e la temperatura della sorgente ionica a 300 °C.
  7. Acquisire i dati in modalità monitoraggio di reazioni multiple (MRM) utilizzando le transizioni ione precursore-prodotto elencate nella Tabella 1.
  8. Quantificare gli analiti utilizzando curve di calibrazione adattate alla matrice, preparate per ciascuna matrice di suolo. Calcolare le concentrazioni degli analiti a partire dal rapporto tra l'area del picco dell'analita e l'area del picco di clorpirifos-metile-d10.
  9. Utilizzare il fosfato di tri fenile come I-IS per verificare la coerenza delle iniezioni durante l'intera sequenza analitica.
  10. Calcolare gli effetti di matrice (ME) secondo la Equazione 228:
    Formula per l'effetto di matrice, ME(%)=[Pendenza_matrice/Pendenza_solvente-1]x100, formula di chimica analitica.
    dove valori negativi indicano soppressione del segnale e valori positivi indicano amplificazione del segnale.
    NOTA: Una panoramica schematica dell'intero flusso di lavoro analitico è presentata nella Figura 1.

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Risultati

I sei suoli agricoli selezionati per la valutazione del metodo rappresentavano un'ampia gamma di proprietà edafiche (vedere Tabella 2), inclusi valori di pH (suolo:H2O, 1:2) compresi tra 4,67 e 7,31, contenuti di materia organica tra lo 0,18% e il 6,46% e frazioni di argilla tra il 22,9% e il 48,5%. Cinque suoli provenivano da regioni agricole della Colombia e uno dalla Spagna. Questa diversità è stata intenzionalmente inclusa per valutare la robustezza della procedura di purificazione propost...

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Discussione

La determinazione dei residui di pesticidi nei suoli rimane analiticamente complessa a causa dell'elevata variabilità delle proprietà fisico-chimiche del suolo e delle conseguenti differenze nella composizione dei co-estratti4,5,6,14,17,18,19,20,...

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Dichiarazioni

Durante la preparazione di questo lavoro, gli autori hanno utilizzato la versione gratuita di Claude (Anthropic) per assistere nella progettazione della disposizione grafica della Figura 3 e la versione gratuita di ChatGPT (GPT-5.5, OpenAI) per supporto nella grammatica e nell'ortografia. Dopo aver utilizzato questi strumenti, gli autori hanno attentamente rivisto e modificato tutti i contenuti secondo necessità. Tutti i contenuti scientifici, i dati, le analisi e le conclusioni sono stati prodotti, verificati e approvati dagli autori, che si assumono piena responsabilità per l'accuratezza e l'integrità dell'articolo pubblicato.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano con gratitudine l'Università EAN e il suo Ufficio Gestione della Ricerca e del Trasferimento per il sostegno a questa ricerca. Gli autori ringraziano inoltre i laboratori dell'Università EAN per aver messo a disposizione le strutture analitiche e le risorse tecniche necessarie per svolgere questo lavoro, inclusi l'accesso e l'utilizzo dello strumento GC-MS/MS impiegato durante lo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio Gestione della Ricerca e del Trasferimento, Universidad EAN, Bogotá D.C., Colombia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-Etoxi-1,2-propanediolo (etilglicerolo)Sigma Aldrich260428-1G
Acido aceticoSigma Aldrich695092
AcetonitrileMerck1006652500
Autocampionatore AOAC 20i/sShimadzu221-723115-58
BilanciaOHAUSPA224
C18Sigma Aldrich52600-U
Tubi da centrifuga, 2 mLEppendorf4610-1815
Tubi da centrifuga, 50 mLNest602002
Centrifuga Z206AMERMLE6019500118
Colonna SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0,25 mm, 0,25 µmShimadzu221-75954-30
Contenitore, con tappo, in vetro ambrato, 1000 mLSigma AldrichZ674176
EssiccatoreSimax415262302
Dispensette 5-50 mLBRAND4600361
D-SorbitoloSigma Aldrich240850-5G
Acetato di etileMerk1313181212
Florisil <200 mesh, polvere fineSigma Aldrich288705-50G
Acido formicoMerck1002641000
GCMS-TQ8040Shimadzu211552
Siringa per iniezioneShimadzuLC2213461800
L-Gulonico acido γ-lattoneSigma Aldrich310301-5G
Linner senza splitShimadzu221-4887-02
Solfato di magnesio (anidro)Sigma AldrichM7506-2KG
MetanoloPanreac131091.12.12
Acqua ultrapura Milli-Q (tipo 1)MilliporeF4H4783518
Punte per pipetta 10 - 100 µLBiologix200010
Punte per pipetta 100 - 1000 µLBrand541287
Punte per pipetta 20 - 200 µLBrand732028
Pipette PasteurNORMAX5426023
Pipetta Transferpette S variabile 10 - 100 µLBRAND704774
Pipetta Transferpette S variabile 100 - 1000 µLBRAND704780
Pipetta Transferpette S variabile 20 - 200 µLSCILOGEX712111099999
Amina primaria-secondaria (PSA)Sigma Aldrich52738-U
Frigorifero/congelatoreHacebNEV ALC 404
Acido shikimicoSigma AldrichS5375-1G
Acetato di sodioSigma Aldrich241245-1KG
Software GCMSsolutionShimadzu223-18472-92
Rete in acciaio inossidabile da 2 mmPinzuarPS33N10
Provetta, in vetro, 10 mLSigma AldrichBR114508
TolueneMerck1083252500
Triphenyl phosphate (I-IS)Sigma Aldrich241288-50G
Vial con inserto fuso, 0,3 mLSigma Aldrich29398-U
Vial, con tappo a vite, in vetro ambrato, 15 mLSigma Aldrich27088-U
Matraccio tarato, 10 mLSigma AldrichDKW28017-10
VortexScilogex82120004
Pesticidi
ClorpirifosSigma Aldrich45395-100MG2921-88-2
Clorpirifos-metileSigma Aldrich45396-250MG5598-13-0
Clorpirifos-metile-d10 (P-IS)Sigma Aldrich90047-5MG285138-81-0
EthionSigma Aldrich45477-250MG563-12-2
FenamifosSigma Aldrich45483-250MG22224-92-6
FenitrotioneSigma Aldrich45487-250MG122-14-5
FentioneSigma Aldrich36552-250MG55-38-9
MalathionSigma Aldrich36143-100MG121-75-5
MethidathionSigma Aldrich36158-100MG950-37-8
Parathion-metileSigma Aldrich36187-100MG298-00-0
Pirimiphos-etileSigma Aldrich45628-250MG23505-41-1
Pirimiphos-metileSigma Aldrich32058-250MG29232-93-7
Tolclofos-metileSigma Aldrich31209-250MG5701804-9

Riferimenti

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