Questo protocollo descrive un metodo Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) modificato, con una pulizia mediante estrazione in fase solida dispersiva basata su un adsorbente di silicato di magnesio, per la determinazione multiresiduale di pesticidi organofosforici nei suoli agricoli mediante cromatografia gassosa abbinata a spettrometria di massa in tandem, migliorando l'eliminazione dei co-estratti, minimizzando le interferenze analitiche legate alla matrice e consentendo una quantificazione affidabile a livelli traccia.
Articolo metodologico
Metodo QuEChERS modificato per l'analisi di pesticidi organofosforici nei suoli agricoli mediante gascromatografia-spettrometria di massa tandem
In questo articolo
Sommario
Abstract
La determinazione accurata di residui di pesticidi organofosforici (OPP) nei suoli agricoli mediante cromatografia gassosa in tandem con spettrometria di massa (GC-MS/MS) è spesso ostacolata da effetti di segnale indotti dalla matrice, causati da materia organica co-estratta, sostanze umiche e interferenti associati ai minerali. Le strategie convenzionali di purificazione Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) potrebbero non rimuovere in modo sufficiente i componenti della matrice da estratti complessi di suolo, compromettendo le prestazioni analitiche. Questo studio presenta un protocollo QuEChERS modificato che incorpora un adsorbente nella purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva con sorbenti misti (dSPE) per la determinazione simultanea di 12 OPP in suoli agricoli mediante GC-MS/MS. Sono state valutate sette combinazioni di sorbenti dSPE in sei suoli agricoli con proprietà diverse. La rimozione delle co-estrazioni è stata quantificata gravimetricamente, e la combinazione di ammina primaria-secondaria, ottadecilsilano e un adsorbente a base di silicato di magnesio (50 mg ciascuno, con 150 mg di solfato di magnesio anidro) ha ottenuto la più alta rimozione media di co-estrazioni (88%). Negli estratti finali sono stati aggiunti protettori dell'analita costituiti da etilglicerolo, L-gulonico acido γ-lattone, D-sorbitolo e acido sciamico per minimizzare gli effetti di matrice, mentre la taratura con matrice abbinata ha compensato le variazioni specifiche del segnale in funzione del suolo. Clorpirifos-metile-d10 e fosfato di trifenile sono stati utilizzati rispettivamente come standard interno di procedura e di iniezione. Le curve di taratura con matrice abbinata (5–600 µg/kg) hanno mostrato un'eccellente linearità, con coefficienti di determinazione ≥0,9933 per la maggior parte delle combinazioni analita-suolo. Il limite di rilevabilità (5 µg/kg) è stato utilizzato per la valutazione della linearità, mentre il limite di quantificazione del metodo è stato stabilito a 50 µg/kg come livello più basso validato. Accuratezza e precisione, valutate a tre livelli di recupero (50, 200 e 400 µg/kg, n = 5 per livello), hanno mostrato recuperi compresi tra il 70% e il 120% con deviazioni standard relative ≤20% per la maggior parte delle combinazioni analita-suolo, soddisfacendo i criteri di prestazione di SANTE/2020/12830 (Rev.2). Recuperi inferiori sono stati osservati soltanto per fenamifos, pirimifos-etile ed etione in alcune matrici di suolo selezionate. I risultati dimostrano che l'adsorbente a base di silicato di magnesio migliora la purificazione dSPE riducendo le co-estrazioni e che la sua combinazione con protettori dell'analita e taratura con matrice abbinata consente una determinazione affidabile di residui multipli di OPP in matrici di suolo complesse mediante GC-MS/MS.
Introduzione
Gli insetticidi organofosforati (OPP) rimangono tra le classi di agrochimici più ampiamente utilizzate a livello mondiale grazie all'elevata efficacia e versatilità di questa categoria di pesticidi nella protezione delle colture1. Sebbene molti OPP si degradino nell'ambiente più rapidamente rispetto ai pesticidi organoclorurati, l'applicazione diffusa e ripetuta di questi composti determina una loro persistenza nei suoli agricoli2. Il suolo rappresenta il principale compartimento ambientale che riceve gli apporti di pesticidi e può fungere da serbatoio temporaneo da cui i residui possono essere trasferiti alle colture, alle acque superficiali, alle acque sotterranee e agli ecosistemi circostanti3. La presenza di residui di OPP è preoccupante poiché questi composti sono associati a effetti neurotossici nell'uomo attraverso l'inibizione dell'attività della acetilcolinesterasi, nonché a impatti negativi sugli organismi non bersaglio, sulle comunità microbiche del suolo e sul funzionamento degli ecosistemi2. La presenza di residui di OPP nei suoli agricoli può quindi contribuire alla perdita di biodiversità, allo squilibrio ecologico e all'esposizione ambientale attraverso vie alimentari e idriche3. La determinazione affidabile dei residui di OPP è pertanto essenziale per generare dati di occorrenza di alta qualità, sostenere le valutazioni dell'esposizione ambientale e migliorare la comprensione del destino ambientale degli OPP in diverse condizioni agricole. Inoltre, metodi analitici sviluppati e ottimizzati utilizzando un singolo tipo di suolo potrebbero non fornire prestazioni equivalenti quando applicati a suoli con caratteristiche fisico-chimiche contrastanti4,5, evidenziando l'importanza di valutare l'applicabilità del metodo in diversi ambienti agricoli. Tuttavia, la quantificazione a livelli traccia rimane una sfida poiché i suoli agricoli presentano una notevole variabilità fisico-chimica, che influenza l'efficienza di estrazione, gli effetti di matrice (ME) e le prestazioni analitiche complessive6.
La cromatografia gassosa-spettrometria di massa in tandem (GC-MS/MS) è ampiamente riconosciuta come tecnica analitica di riferimento per la determinazione multiresiduo di OPP a livelli traccia in matrici complesse7,8. Tuttavia, una quantificazione accurata dipende non solo dalle prestazioni strumentali, ma anche dall'efficacia della preparazione del campione. Gli estratti di suolo contengono comunemente componenti di matrice co-estratti che raggiungono il sistema cromatografico insieme agli analiti target e possono alterare la risposta degli analiti attraverso soppressione o potenziamento del segnale4,5,6. L'entità di questi effetti varia notevolmente tra i diversi tipi di suolo ed è influenzata da fattori come il contenuto di materia organica, la frazione argillosa, la composizione minerale e il pH. Di conseguenza, gli effetti di matrice (ME) rimangono una delle principali fonti di incertezza analitica nella determinazione di pesticidi basata su GC-MS/MS, evidenziando la necessità di strategie di purificazione in grado di ridurre il carico di co-estratti preservando al contempo il recupero degli analiti5,9,10. Inoltre, la generazione di dati residui affidabili richiede il rispetto di criteri analitici prestazionali accettati a livello internazionale, al fine di garantire l'accuratezza del metodo, la comparabilità tra studi e l'idoneità per applicazioni di monitoraggio ambientale11.
Il metodo Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe (QuEChERS) è diventato l'approccio più utilizzato per la preparazione dei campioni nell'analisi multiresiduale di pesticidi grazie alla sua semplicità, al basso consumo di solvente e alla vasta applicabilità su matrici agricole4,12,13. La sua progettazione modulare e flessibile ha permesso un'ampia adattabilità a diversi tipi di campioni e applicazioni analitiche, contribuendo alla sua diffusa adozione nell'analisi multiresiduale contemporanea e alla sua frequente associazione con la chimica analitica sostenibile, grazie al ridotto consumo di solventi e alla semplificazione della preparazione del campione. Questa adattabilità consente inoltre di personalizzare il metodo selezionando condizioni di estrazione e purificazione in base alle specifiche caratteristiche della matrice. Nell'analisi del suolo, l'efficacia del passaggio di purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva (dSPE) è fondamentale, poiché una rimozione insufficiente dei componenti della matrice co-estratti può compromettere le prestazioni analitiche della successiva determinazione mediante GC-MS/MS4,14. Le combinazioni convenzionali di sorbenti basate su ammina primaria-secondaria (PSA) e silano ottadecilico (C18) spesso garantiscono una rimozione limitata dei costituenti umici polari, tra i principali responsabili degli effetti di segnale indotti dalla matrice negli estratti di suolo agricolo14. Il Florisil, un adsorbente a base di silicato di magnesio con affinità per composti che coprono un ampio intervallo di polarità, ha dimostrato prestazioni promettenti nella purificazione di matrici alimentari e vegetali15,16. Tuttavia, il suo contributo alle strategie di purificazione dSPE con sorbenti misti per suoli agricoli rimane insufficientemente caratterizzato, in particolare nei suoli con diverse proprietà fisico-chimiche17,18,19,20,21.
Questo studio presenta un protocollo QuEChERS modificato in cui sette combinazioni di sorbenti dSPE sono state valutate su sei suoli agricoli con diverso pH, contenuto di materia organica e tessitura. Lo studio si basava sull'ipotesi che l'inclusione dell'adsorbente silicato di magnesio nella pulizia dSPE con sorbenti misti avrebbe potenziato la rimozione dei componenti di matrice co-estratti dagli estratti di suolo agricolo. La selezione del sorbente è stata effettuata in base alla valutazione gravimetrica della rimozione dei co-estratti, e la combinazione che ha fornito la maggiore efficienza media di pulizia è stata successivamente sottoposta a una completa validazione analitica. La procedura ottimizzata è stata validata per la determinazione simultanea di 12 OPP mediante standardizzazione con standard interno, taratura con matrice abbinata e GC-MS/MS. Inoltre, sono stati inclusi nel protocollo finale degli additivi protettivi per gli analiti (etilglicerolo, γ-lattone dell'acido L-gulonico, D-sorbitolo e acido scichimico) come strategia complementare per ridurre al minimo gli effetti residui del segnale indotti dalla matrice. Integrando un'ottimizzazione sistematica della pulizia con una validazione analitica completa su suoli con proprietà fisico-chimiche contrastanti, questo protocollo fornisce un flusso di lavoro robusto e riproducibile che potrebbe facilitare la determinazione dei residui di pesticidi in suoli agricoli eterogenei.
Protocollo
I dati di origine alla base dell'ottimizzazione sperimentale della procedura di purificazione mediante dSPE, del set di dati relativi all'effetto di matrice e della caratterizzazione fisico-chimica dei sei suoli agricoli sono stati depositati su Zenodo e sono disponibili pubblicamente al DOI: 10.5281/zenodo.21644870. I dettagli sui reagenti e sull'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Campionamento e preparazione del suolo
NOTA: Per garantire la sicurezza personale, si raccomanda di indossare una camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in nitrile durante tutto il protocollo.
- Prelevare un campione composito di suolo in massa dallo strato superficiale (0–10 cm) in ciascuna località agricola selezionata, combinando 8 sottocampioni individuali raccolti tramite un disegno di campionamento sistematico a griglia quadrata22.
NOTA: Il disegno a griglia quadrata con 8 punti è conforme alle raccomandazioni della New South Wales Environment Protection Authority (NSW EPA) per siti di circa 1000 m2 (0,1 ha)22. - Combinare e mescolare accuratamente questi sottocampioni in campo per ottenere un singolo campione composito rappresentativo (≥500 g) per località, stabilendo una matrice omogenea di riferimento per la valutazione delle prestazioni del metodo.
NOTA: Il campionamento composito viene utilizzato qui esclusivamente per standardizzare gli effetti di fondo della matrice ai fini dell'ottimizzazione e della validazione del metodo. Nel contesto di quadri normativi per la valutazione di terreni contaminati sconosciuti o reali, il campionamento composito è rigorosamente limitato dalla NSW EPA a causa del rischio di diluizione chimica22. Per la caratterizzazione effettiva del sito o il rilevamento di aree con alta concentrazione di contaminanti, i campioni provenienti dai nodi della griglia devono essere mantenuti separati ed analizzati singolarmente per evitare falsi negativi e preservare i dati sulla varianza spaziale. - Trasportare i campioni di suolo in laboratorio in contenitori di vetro ambrato ermetici e al riparo dalla luce.
NOTA: I contenitori di vetro sono preferiti rispetto ai sacchetti di polietilene per minimizzare le perdite per adsorbimento degli OPP idrofobi o semi-volatili sulle superfici plastiche e ridurre il rischio di lisciviazione dei contaminanti o interazioni tra polimeri e analiti. Le condizioni al buio minimizzano la fotodegradazione dei composti sensibili alla luce durante il trasporto. - Essiccare i campioni all'aria a temperatura ambiente, in assenza di luce diretta, fino al raggiungimento di un peso costante.
NOTA: L'essiccazione all'aria viene applicata per standardizzare il contenuto di umidità del suolo e garantire che i risultati siano espressi sulla base del peso secco, migliorando la comparabilità tra campioni con diverso contenuto naturale di acqua. Si evita l'essiccazione forzata in stufa per prevenire potenziali perdite di OPP termolabili o semi-volatili e alterazioni della struttura della materia organica del suolo e delle sue proprietà di sorption. - Sfaldare manualmente gli aggregati del suolo e setacciare attraverso un setaccio in acciaio inossidabile da 2 mm. Conservare i suoli omogeneizzati in contenitori di vetro ambrato ermetici, al buio e in condizioni refrigerate a 4 °C fino all'estrazione.
NOTA: Le caratteristiche fisico-chimiche dei sei suoli utilizzati in questo studio erano disponibili da precedenti analisi di routine del suolo. Questi dati sono stati utilizzati esclusivamente per selezionare suoli agricoli che coprissero un ampio intervallo di pH (suolo:H2O, 1:2)23, contenuto di materia organica (metodo di Walkey Black)24 e tessitura (metodo di Bouyoucos)25 ai fini della valutazione del metodo.
2. Preparazione dei reagenti, degli standard e delle soluzioni standard interne
NOTA: A meno che non sia specificato diversamente, le soluzioni stock singole di pesticidi, le soluzioni standard di lavoro miste, le soluzioni di standard interno procedurale (P-IS) e di standard interno di iniezione (I-IS), le soluzioni di recupero e le soluzioni standard di calibrazione vengono preparate in fiale volumetriche da 10 mL, trasferite in vial di vetro ambrato e conservate a −20 °C fino all'uso. La calibrazione con matrice abbinata, i protettori dell'analita, il P-IS e l'I-IS sono stati inclusi poiché ciascuno di essi affronta una diversa fonte di variabilità analitica, migliorando così la robustezza dell'analisi quantitativa in matrici di suolo complesse.
- Preparare singole soluzioni stock di ciascuno dei 12 standard commerciali di OPP (vedere Tabella dei Materiali) a 1000 mg/L in toluene.
- Combinare volumi appropriati delle singole soluzioni stock per preparare una soluzione standard di lavoro mista in acetonitrile (ACN) a 400 mg/L.
NOTA: Questa soluzione standard di lavoro mista viene successivamente utilizzata per la preparazione delle soluzioni di recupero e di taratura. - Preparare il clorpirifos-metile-d10 come P-IS in ACN a 750 mg/L. Aggiungere durante l'estrazione (passo 3.2) per monitorare e correggere le variazioni procedurali.
NOTA: Il clorpirifos-metile-d10 è stato scelto come P-IS perché, essendo un OPP marcati isotopicamente, mostra un comportamento fisico-chimico simile a quello degli analiti target pur rimanendo facilmente distinguibile mediante MS/MS. - Preparare il fosfato di tri fenile come I-IS in ACN a 1050 mg/L. Aggiungere immediatamente prima dell'analisi strumentale (passo 4.2.4) per correggere le variazioni di iniezione.
- Preparare le soluzioni di recupero stock in ACN acidificato con acido formico al 0,05% (v/v) per ottenere concentrazioni finali equivalenti nel suolo di 50 µg/kg, 200 µg/kg e 400 µg/kg per gli OPP quando 300 µL vengono aggiunti a 5 g di suolo nero prima dell'estrazione. Preparare una soluzione P-IS separata corrispondente a un campione equivalente di 200 µg/kg.
NOTA: L'acidificazione con acido formico migliora la stabilità degli OPP durante lo stoccaggio. - Preparare soluzioni di taratura contenenti i 12 OPP e il clorpirifos-metile-d10 in ACN con acido formico al 0,05% (v/v), corrispondenti a concentrazioni finali equivalenti nel suolo di 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 µg/kg per gli analiti e di 200 µg/kg per il P-IS.
NOTA: Queste soluzioni vengono successivamente utilizzate per la preparazione di curve di taratura con matrice abbinata per ciascuna matrice di suolo, che sono state interpolate mediante regressione lineare non pesata. Il limite di rilevazione (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati definiti secondo il documento guida SANTE/2020/12830 (Rev.2). Il LOD è stato considerato il livello di taratura più basso nella matrice, mentre il LOQ corrispondeva al livello di concentrazione più basso validato, dimostrando recupero e precisione accettabili. - Preparare una miscela di protettori per analiti costituita da etilglicerolo (100 g/L), L-gulonico γ-lattone (10 g/L), D-sorbitolo (10 g/L) e acido shikimico (5 g/L) in ACN:acqua (1:1, v/v) acidificato con acido formico allo 0,1%. Conservare a −20 °C. Aggiungere immediatamente prima dell'analisi strumentale (passo 4.2.4) per ridurre gli effetti della matrice (ME).
Estrazione QuEChERS
- Pesare 5,00 g ± 0,01 g di suolo essiccato all'aria e setacciato in un tubo da centrifuga in polipropilene da 50 mL.
- Per gli esperimenti di recupero, aggiungere la soluzione P-IS (preparata al punto 2.3) e la relativa soluzione di recupero (preparata al punto 2.5) per ottenere concentrazioni finali di 200 µg/kg per clorpirifos-metile-d10 e di 50, 200 o 400 µg/kg per gli OPP bersaglio (n = 5 per livello di recupero per ciascun suolo).
NOTA: Per gli esperimenti di recupero, sia la soluzione P-IS che la soluzione di recupero del pesticida vengono aggiunte prima dell'estrazione, come descritto al punto 3.2. Per l'analisi di routine dei campioni di suolo, solo il P-IS viene aggiunto prima dell'estrazione, al fine di compensare le variazioni procedurali durante la preparazione e l'analisi dei campioni. Per la preparazione degli estratti di calibrazione con matrice corrispondente, né il P-IS né gli standard del pesticida vengono aggiunti durante l'estrazione; si preparano estratti di suolo bianco, e gli standard di calibrazione contenenti sia gli analiti che il P-IS (preparati al punto 2.6) vengono aggiunti dopo il ripulimento (vedere punto 4.2.4). - Vortexare per 30 s e lasciare equilibrare i campioni fortificati per 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Il periodo di equilibrio favorisce l'interazione tra gli analiti fortificati e la matrice del suolo prima dell'estrazione, migliorando la rappresentatività degli esperimenti di recupero. - Aggiungere 10 mL di acqua deionizzata e agitare manualmente per 30 s per assicurare un completo bagnamento della matrice del suolo.
NOTA: La reidratazione migliora la desorbimento degli analiti dalle particelle del suolo e facilita un'efficiente ripartizione durante l'estrazione. - Aggiungere 10 mL di ACN contenente 1% (v/v) di acido acetico. Chiudere immediatamente il tubo e agitare vigorosamente per 2 min.
- Aggiungere 6,0 g di solfato di magnesio anidro (MgSO4) e 1,5 g di acetato di sodio, quindi agitare immediatamente il tubo vigorosamente per 1 min.
NOTA: Un'agitazione rapida dopo l'aggiunta del sale è essenziale per garantire una ripartizione di fase efficiente e prevenire la formazione di aggregati di sale. - Centrifugare a 1800 × g per 5 min.
- Trasferire la fase superiore di ACN in un tubo pulito per il successivo ripulimento con dSPE.
4. Purificazione mediante estrazione in fase solida dispersiva
NOTA: Questa sezione comprende due approcci. In primo luogo, sono state valutate sette combinazioni di sorbenti dSPE per identificare la composizione di purificazione in grado di garantire la rimozione media più elevata degli estratti concomitanti in sei suoli agricoli. Successivamente, la combinazione di sorbenti selezionata è stata applicata come procedura ottimizzata di purificazione per la validazione del metodo, secondo il documento guida della Direzione Generale della Salute e della Sicurezza Alimentare della Commissione Europea (DG SANTE) SANTE/2020/12830 (Rev.2)11.
- Ottimizzazione delle combinazioni di sorbenti per la dSPE
NOTA: La rimozione gravimetrica dei co-estratti è stata scelta come criterio di ottimizzazione perché fornisce una misura indipendente dall'analita dell'efficienza della pulizia. Le quantità di sorbente valutate corrispondono alle proporzioni convenzionali ampiamente utilizzate nelle procedure dSPE basate su QuEChERS, facilitando così l'adozione del protocollo proposto nei laboratori analitici di routine.- Preparare provette microcentrifughe da 2 mL contenenti le seguenti combinazioni di sorbenti: (i) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA; (ii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di C18; (iii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (iv) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di C18; (v) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (vi) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di C18 + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio; (vii) 150 mg di MgSO4 anidro + 50 mg di PSA + 50 mg di C18 + 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio.
- Trasferire aliquote da 1,0 mL dell'estratto ottenuto al passaggio 3.8 in ciascuna provetta dSPE.
NOTA: Eseguire tutte le valutazioni dei sorbenti in triplice replicazione per ogni tipo di suolo. Le aliquote utilizzate per il confronto devono provenire dallo stesso estratto per garantire che le differenze nella rimozione dei co-estratti siano attribuibili esclusivamente alla composizione del trattamento di pulizia. - Agitare con vortex per 1 minuto e centrifugare a 1800 × g per 5 minuti.
- Trasferire 1,0 mL di ciascun estratto purificato in un tubo di vetro precedentemente asciugato e pesato. Evaporare il solvente a secco sotto un flusso leggero di azoto a 40 °C.
- Lasciare raffreddare il tubo in un essiccatore fino a temperatura ambiente e determinare la massa del residuo rimanente. Calcolare la massa dei co-estratti sottraendo il peso iniziale del tubo vuoto dal peso finale dopo l'evaporazione del solvente.
- Determinare la quantità di co-estratti presenti negli estratti non sottoposti a pulizia dSPE evaporando aliquote equivalenti di estratto non trattato in condizioni identiche.
- Calcolare la percentuale di rimozione dei co-estratti secondo la Equazione 126:
- Calcolare la rimozione media dei co-estratti ottenuta da tre determinazioni per ciascuna combinazione di sorbenti e tipo di suolo. Successivamente, calcolare la rimozione media complessiva sui sei tipi di suolo agricolo per ogni combinazione di sorbenti.
- Valutare le differenze tra le combinazioni di sorbenti mediante analisi della varianza (ANOVA) in un disegno a blocchi completi randomizzati (RCBD), considerando la combinazione di sorbenti come fattore trattamentale e la matrice del suolo come fattore di blocco. Prima dell'ANOVA, verificare la normalità dei residui e l'omogeneità delle varianze utilizzando rispettivamente i test di Shapiro-Wilk e di Levene. Eseguire confronti a coppie mediante il test HSD di Tukey a un livello di significatività di α = 0,05.
- Scegliere la composizione di pulizia in base alla valutazione combinata dell'analisi statistica e della rimozione media complessiva dei co-estratti.
NOTA: Ridurre il carico di co-estratti minimizza l'introduzione di componenti della matrice nel sistema cromatografico, migliorando così le prestazioni cromatografiche, riducendo la contaminazione del sistema GC-MS/MS e abbassando i requisiti di manutenzione dello strumento.
NOTA: La combinazione contenente PSA, C18 e l'adsorbente al silicato di magnesio (50 mg ciascuno, con 150 mg di MgSO4 anidro) ha mostrato la rimozione media più elevata ed è stata pertanto selezionata come procedura ottimizzata di pulizia per tutte le analisi successive.
- Applicazione della procedura ottimizzata di pulizia dSPE
- Trasferire 1,0 mL dell'estratto ottenuto al passaggio 3.8 in una provetta microcentrifughe da 2 mL contenente 150 mg di MgSO4 anidro, 50 mg di PSA, 50 mg di C18 e 50 mg di adsorbente al silicato di magnesio.
- Agitare con vortex per 1 minuto per garantire un'interazione completa tra l'estratto e i sorbenti.
- Centrifugare a 1800 × g per 5 minuti.
- Trasferire 200 µL del surnatante purificato in un vial per autosampler e aggiungere 20 µL della miscela protettiva per analiti preparata al passaggio 2.7 e 50 µL della soluzione di triifenil fosfato preparata al passaggio 2.4. Mescolare accuratamente prima dell'analisi strumentale.
NOTA: Per la taratura con matrice corrispondente, preparare estratti bianchi per ciascun tipo di suolo seguendo le procedure di estrazione e pulizia descritte ai passaggi 3 e 4.2, senza aggiunta di pesticidi o del P-IS. Dopo la pulizia, trasferire 200 µL dell'estratto bianco purificato in sette vial separati e aggiungere le soluzioni di taratura preparate al passaggio 2.6 per ottenere concentrazioni finali di 5, 10, 25, 75, 200, 400 e 600 µg/kg per gli analiti e 200 µg/kg per il P-IS. Aggiungere a ogni vial 20 µL della miscela protettiva per analiti e 50 µL di triifenil fosfato come descritto al passaggio 4.2.4, ottenendo un volume finale del vial di 270 µL. Costruire curve di taratura indipendenti corrispondenti alla matrice per ciascun tipo di suolo. Le concentrazioni equivalenti al suolo si basano sull'aliquota da 200 µL di estratto purificato, che rappresenta l'estratto ottenuto dal campione originale di 5 g di suolo. L'aggiunta successiva di protettivi per analiti e del P-IS aumenta il volume finale del vial ma non modifica la quantità di suolo rappresentata dall'aliquota di estratto. Per la taratura basata su solvente, sostituire l'aliquota da 200 µL di estratto purificato con 200 µL di ACN e preparare i vial di taratura utilizzando le stesse concentrazioni di analiti, concentrazione del P-IS, concentrazione del P-IS e miscela protettiva per analiti impiegate per la taratura con matrice corrispondente. Queste curve di taratura basate su solvente verranno successivamente utilizzate per la valutazione dell'effetto di matrice (ME). - Eseguire l'analisi strumentale utilizzando un sistema GC-MS/MS.
5. Analisi GC-MS/MS e acquisizione dei dati
NOTA: descrizioni dettagliate della configurazione del GC-MS/MS e delle procedure di acquisizione dati sono disponibili in Varela-Martínez et al.27. I principali parametri cromatografici e spettrometrici di massa sono riassunti di seguito.
- Utilizzare un sistema GC-MS/MS dotato di uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo, una sorgente di ionizzazione elettronica (EI) funzionante a −70 eV e un campionatore automatico.
- Installare una colonna capillare in silice fusa a bassa polarità (30 m × 0,25 mm di diametro interno × 0,25 µm di spessore del film) e utilizzare elio come gas trasportatore a un flusso costante di 1,2 mL/min.
- Prima dell'analisi, verificare la prontezza dello strumento, inclusi l'alimentazione del gas trasportatore, le prestazioni del sistema a vuoto, lo stato della siringa e i livelli di solvente per il lavaggio del campionatore automatico. Eseguire la taratura dello strumento secondo le raccomandazioni del produttore.
NOTA: Verificare che la pressione operativa a vuoto soddisfi le specifiche raccomandate dal produttore dello strumento prima di avviare qualsiasi sequenza analitica. - Impostare il programma di temperatura del forno GC come segue: temperatura iniziale di 50 °C per 1 min; aumento fino a 180 °C a 25 °C/min; quindi fino a 230 °C a 5 °C/min; e infine fino a 290 °C a 25 °C/min. Mantenere la temperatura finale per 6 min. Il tempo totale di analisi è di 24,6 min.
- Impostare la temperatura del portainiettore a 250 °C ed effettuare iniezioni di 1 µL in modalità senza divisione del flusso (splitless). Aprire la valvola di sfogo del flusso di divisione 1 min dopo l'iniezione.
NOTA: Per ridurre al minimo il carryover, risciacquare la siringa del campionatore automatico in sequenza con metanolo, acetato di etile e ACN tra un'iniezione e l'altra. - Impostare la temperatura della linea di trasferimento MS a 250 °C e la temperatura della sorgente ionica a 300 °C.
- Acquisire i dati in modalità monitoraggio di reazioni multiple (MRM) utilizzando le transizioni ione precursore-prodotto elencate nella Tabella 1.
- Quantificare gli analiti utilizzando curve di calibrazione adattate alla matrice, preparate per ciascuna matrice di suolo. Calcolare le concentrazioni degli analiti a partire dal rapporto tra l'area del picco dell'analita e l'area del picco di clorpirifos-metile-d10.
- Utilizzare il fosfato di tri fenile come I-IS per verificare la coerenza delle iniezioni durante l'intera sequenza analitica.
- Calcolare gli effetti di matrice (ME) secondo la Equazione 228:
![Formula per l'effetto di matrice, ME(%)=[Pendenza_matrice/Pendenza_solvente-1]x100, formula di chimica analitica.](/files/ftp_upload/72745/72745eq2.jpg "figure-protocol-2")
dove valori negativi indicano soppressione del segnale e valori positivi indicano amplificazione del segnale.
NOTA: Una panoramica schematica dell'intero flusso di lavoro analitico è presentata nella Figura 1.
Risultati
I sei suoli agricoli selezionati per la valutazione del metodo rappresentavano un'ampia gamma di proprietà edafiche (vedere Tabella 2), inclusi valori di pH (suolo:H2O, 1:2) compresi tra 4,67 e 7,31, contenuti di materia organica tra lo 0,18% e il 6,46% e frazioni di argilla tra il 22,9% e il 48,5%. Cinque suoli provenivano da regioni agricole della Colombia e uno dalla Spagna. Questa diversità è stata intenzionalmente inclusa per valutare la robustezza della procedura di purificazione proposta in matrici di suolo contrastanti, poiché si sa che proprietà del suolo come pH, contenuto di materia organica e tessitura influenzano l'estrazione concomitante, gli effetti di matrice (MEs) e il recupero dell'analita durante l'analisi dei residui di pesticidi.
Sette combinazioni di sorbenti dSPE sono state valutate mediante determinazione gravimetrica della rimozione dei co-estratti (vedere Figura 2). Tra i singoli sorbenti, il Florisil ha ottenuto la rimozione media più elevata di co-estratti (71%), seguito dal PSA (58%) e dal C18 (41%). L'adsorbente a base di silicato di magnesio ha raggiunto una rimozione completa dei co-estratti in S2 (100%) e ha mostrato valori superiori al 90% in S3 (91%) e S4 (91%). Al contrario, il PSA ha mostrato una maggiore variabilità tra i diversi suoli, con efficienze di rimozione comprese tra il 21% in S4 e la rimozione completa in S6. Il C18 ha mostrato prestazioni inferiori e più variabili, con valori compresi tra lo 0% in S1 e S2 e il 93% in S4. Tra le combinazioni di sorbenti misti, la miscela PSA+Adsorbente ha ottenuto una rimozione media di co-estratti pari all'80%. Le combinazioni PSA+Adsorbente e C18+Adsorbente hanno determinato rispettivamente rimozioni medie più basse, pari al 73% e al 74%. L'aggiunta dell'adsorbente a base di silicato di magnesio alla miscela PSA+C18 ha ulteriormente aumentato la rimozione media all'88%, rappresentando il valore più alto ottenuto tra tutte le configurazioni di purificazione valutate. La combinazione PSA+C18+Adsorbente ha raggiunto valori di rimozione superiori all'80% in cinque dei sei suoli ed ha ottenuto una rimozione completa dei co-estratti in S2 e S6. Un'analisi statistica mediante ANOVA in un disegno a blocchi randomizzati (RCBD) ha rivelato un effetto significativo della combinazione di sorbenti sulla rimozione dei co-estratti (p = 0,0432). I raggruppamenti statistici ottenuti mediante il test HSD di Tukey sono riportati in Figura 2.
La selettività del metodo è stata dimostrata dall'assenza di picchi cromatografici interferenti ai tempi di ritenzione attesi degli analiti target. Sono state costruite curve di calibrazione con matrice abbinata per ciascun analita e matrice di suolo nell'intervallo di concentrazione da 5 a 600 µg/kg, con un LOD di 5 µg/kg (vedere Tabella 3). Non sono stati osservati picchi interferenti ai tempi di ritenzione corrispondenti agli analiti target. È stata ottenuta un'eccellente linearità per la stragrande maggioranza delle combinazioni analita-suolo. Solo tre curve di calibrazione hanno mostrato coefficienti di determinazione (R2) inferiori a 0,9933, tutti relativi al fenamifos, nel suolo S1 (R2 = 0,9888), nel suolo S3 (R2 = 0,9606) e nella calibrazione basata su solvente (R2 = 0,9871). Per quanto riguarda gli effetti di matrice (ME), in base ai valori medi calcolati sui sei suoli (vedere Figura 3), è stata osservata una soppressione del segnale (ME < 0) per 10 dei 12 OPP target, mentre un potenziamento del segnale (ME > 0) è stato osservato soltanto per il malathion (+3%) e il fenamifos (+25%). La maggior parte degli analiti ha mostrato effetti di matrice moderati, con valori medi di ME compresi tra −25% per il methidathion e −23% per il parathion-metile fino a −5% per l'etion. Il fenamifos ha mostrato il maggiore potenziamento medio (+25%), mentre il malathion ha mostrato un lieve potenziamento (+3%). A livello individuale per ciascun suolo, la soppressione più forte del segnale è stata osservata per il pirimiphos-etile nel suolo S5 (−60%) e per il parathion-metile nel suolo S1 (−44%). Al contrario, il fenamifos ha mostrato potenziamento del segnale in cinque dei sei suoli, raggiungendo un valore massimo di ME pari a +58% nel suolo S2, mentre il malathion ha mostrato potenziamento in quattro suoli, con un valore massimo del +16% nel suolo S4.
I risultati di recupero e precisione ottenuti ai tre livelli di fortificazione sono riassunti nella Tabella 4. Il livello di fortificazione più basso corrispondeva al limite di quantificazione (LOQ) del metodo prefissato di 50 µg/kg. La maggior parte delle combinazioni analito-terreno ha soddisfatto i criteri di prestazione indicati nel documento SANTE/2020/12830 (Rev.2)11, con recuperi medi compresi tra il 70% e il 120% e deviazioni standard relative (RSD) ≤ 20%. Il fenamifos ha mostrato recuperi inferiori al 70% nei campioni S1, S2 e S4. Il pirimifos-etile ha mostrato recuperi inferiori al 70% nei campioni S1 e S6, mentre l'etione ha mostrato recuperi inferiori al 70% nel campione S1. Per i restanti analiti, i recuperi sono generalmente rientrati nell'intervallo accettabile in tutti i tipi di suolo e a tutti i livelli di fortificazione. I valori di RSD sono rimasti al di sotto del criterio di accettazione del 20% nella maggior parte dei casi, dimostrando una precisione del metodo soddisfacente nell'intervallo di concentrazioni valutato.
Figura 1: Schema del flusso di lavoro per la determinazione di OPP nel suolo agricolo mediante estrazione QuEChERS, purificazione dSPE ottimizzata e analisi con GC-MS/MS. Campioni compositi di suolo sono stati preparati (omogeneizzati, essiccati all'aria e setacciati) prima dell'estrazione QuEChERS, effettuata con ACN acidificato e partizionamento mediante salting-out. Sette combinazioni di sorbenti per dSPE sono state valutate gravimetricamente per ottimizzare la fase di purificazione, e la miscela selezionata (150 mg MgSO4 + 50 mg PSA + 50 mg C18 + 50 mg adsorbente al silicato di magnesio) è stata utilizzata per la validazione del metodo. Gli estratti finali sono stati analizzati mediante GC-MS/MS usando protettori dell'analita e I-IS. Le prestazioni del metodo per 12 OPP sono state valutate in termini di calibrazione con matrice abbinata, effetti di matrice (MEs), recuperi e precisione, utilizzando P-IS. Abbreviazioni: QuEChERS = Quick-Easy-Cheap-Effective-Rugged-Safe; ACN = acetonitrile; PSA = ammina primaria-secondaria; C18 = ottadecilsilano; dSPE = estrazione in fase solida dispersiva; I-IS = standard interno di iniezione; GC-MS/MS = cromatografia gassosa-spettrometria di massa in tandem; MRM = monitoraggio di reazione multipla; OPP = pesticidi organofosforici; P-IS = standard interno procedurale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rimozione di co-estrazioni ottenuta da sette combinazioni di sorbenti dSPE in sei suoli agricoli (S1–S6). La rimozione di co-estrazioni è stata determinata gravimetricamente dopo estrazione QuEChERS e purificazione dSPE. Sono state valutate sette combinazioni di sorbenti: PSA, C18, adsorbente al silicato di magnesio, PSA+C18, PSA+Adsorbente, C18+Adsorbente e PSA+C18+Adsorbente (50 mg ciascuno, con 150 mg di MgSO4 anidro). Le percentuali di rimozione sono state calcolate rispetto agli estratti non trattati secondo l'Equazione 1. I valori rappresentano la media di tre determinazioni per ogni matrice di suolo, e le barre di errore indicano la deviazione standard. S1: Villavicencio (Meta, Colombia); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, Colombia); S3: Floresta (Boyacá, Colombia); S4: Guasca (Cundinamarca, Colombia); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Colombia); S6: La Laguna (Canarie, Spagna). Diverse lettere minuscole sopra ciascuna combinazione di sorbente indicano differenze statisticamente significative tra le medie dei trattamenti secondo ANOVA in un disegno randomizzato a blocchi completi (RCBD) seguito dal test HSD di Tukey (p < 0,05). I confronti statistici sono stati effettuati utilizzando le medie dei trattamenti su tutte e sei le matrici di suolo. Abbreviazioni: PSA = ammina primaria-secondaria; C18 = ottadecilsilano. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Mappa termica degli effetti di matrice (ME%) per 12 OPP in sei matrici di suolo (S1–S6). L'effetto di matrice (ME) è stato calcolato come differenza relativa tra le pendenze di taratura in matrice e in solvente, secondo l'Equazione 2. I valori positivi indicano un potenziamento del segnale (rosso), mentre i valori negativi indicano una soppressione del segnale (blu). Abbreviazioni: OPP = pesticidi organofosforici; IS = standard interno; OM = materia organica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Analita | tR (min) | Quantificatore (m/z) | CE (V) | Qualificatore 1 (m/z) | CE (V) | Qualificatore 2 (m/z) | CE (V) | ||
| Clorpirifos-metile | 11.720 | 288 286 | 5 | 28693 | 25 | 286125 | 25 | ||
| Paration-metile | 11.868 | 263109 | 15 | 10979 | 10 | 263125 | 10 | ||
| Tolclofos-metile | 11.915 | 265250 | 15 | 267265 | 5 | 265125 | 5 | ||
| Pirimifos-metile | 12.431 | 290233 | 10 | 305290 | 10 | 290276 | 10 | ||
| Fenitrotione | 12.526 | 277260 | 5 | 277109 | 20 | 125109 | 15 | ||
| Malathion | 12.727 | 12799 | 5 | 173127 | 5 | 12593 | 5 | ||
| Clorpirifos | 12.976 | 314258 | 15 | 199171 | 15 | 19797 | 15 | ||
| Fentione | 13.083 | 278109 | 20 | 278169 | 20 | 278245 | 10 | ||
| Pirimifos-etile | 13.571 | 333168 | 25 | 333318 | 10 | 318180 | 10 | ||
| Methidathion | 14.856 | 14585 | 10 | 14558 | 15 | 14593 | 10 | ||
| Fenamifos | 15.519 | 303288 | 10 | 303154 | 20 | 303217 | 10 | ||
| Ethion | 16.148 | 153125 | 10 | 153125 | 5 | 231153 | 5 | ||
| Clorpirifos-metile-d10 (P-IS) | 12.862 | 324260 | 25 | 324195 | 25 | 324292 | 10 | ||
| Fosfato di triifenile (I-IS) | 18.187 | 326325 | 5 | 326169 | 25 | 326215 | 25 | ||
Tabella 1: Tempi di ritenzione, transizioni quantificatrici, transizioni qualificatrici ed energie di collisione nelle analisi GC-MS/MS per i 12 OPP target, clorpirifos-metile-d10 (P-IS) e fosfato di trifenile (I-IS). Abbreviazioni: GC-MS/MS = spettrometria di massa accoppiata a cromatografia gassosa; OPPs = pesticidi organofosforici; P-IS = standard interno di procedura; I-IS = standard interno di iniezione; tR = tempo di ritenzione; CE (V) = energia di collisione (volt); m/z = rapporto massa/carica. Cliccare qui per scaricare questa tabella.
| Terreno | Origine | pH terreno:H2O (1:2) | Materia organica (%) | Argilla (%) | Classe tessiturale |
| S1 | Villavicencio (Meta, Colombia) | 5.51 | 0.18 | 48.5 | Argilla |
| S2 | Sabana di Bogotá (Cundinamarca, Colombia) | 4.67 | 1.04 | 37.4 | Frangia argillosa |
| S3 | Floresta (Boyacá, Colombia) | 5.53 | 1.71 | 28.2 | Frangia argillosa |
| S4 | Guasca (Cundinamarca, Colombia) | 4.89 | 6.46 | 22.9 | Frangia argillosa sabbiosa |
| S5 | Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Colombia) | 4.76 | 2.74 | 27.5 | Frangia argillosa sabbiosa |
| S6 | La Laguna (Canarie, Spagna) | 7.31 | 1.27 | 39.6 | Frangia argillosa |
Tabella 2: Origine e proprietà fisico-chimiche dei sei suoli agricoli (S1–S6) utilizzati per la valutazione del metodo. I dati includono il pH (suolo:H2O, 1:2), il contenuto di materia organica (metodo di Walkley–Black), la frazione argillosa (metodo di Bouyoucos) e la classe tessiturale. I suoli diversificati sono stati selezionati per garantire un'ampia gamma di condizioni fisico-chimiche per la valutazione del metodo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
| Analita | Campione | Intervalloµg/kg) | b ± sb·t(0,05;7) | a ± sa·t(0,05;7) | sy/x | R² | ME (%) | ||
| Chlorpyrifos-metile | Suolo 1 | 5–600 | 1,50·10⁻² ± 1,75·10⁻⁴ | 2,39·10⁻² ± 5,02·10⁻² | 3,61·10⁻² | 0.9999 | -22 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 1,68·10⁻² ± 3,21·10⁻⁴ | 8,31·10⁻³ ± 9,20·10⁻² | 6,62·10⁻² | 0.9997 | -13 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 1,83·10⁻² ± 5,62·10⁻⁴ | −6,60·10⁻² ± 1,61·10⁻¹ | 1,26·10⁻¹ | 0.9991 | -5 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 1,72·10⁻² ± 1,59·10⁻⁴ | −2,40·10⁻² ± 4,56·10⁻² | 3,54·10⁻² | 0.9999 | -11 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,66·10⁻² ± 9,51·10⁻⁴ | −6,65·10⁻² ± 2,71·10⁻¹ | 2,09·10⁻¹ | 0.9975 | -14 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 1,62·10⁻² ± 2,28·10⁻⁴ | 1,15·10⁻² ± 6,52·10⁻² | 4,99·10⁻² | 0.9998 | -16 | |||
| Solvente | 5–600 | 1,93·10⁻² ± 1,19·10⁻³ | −1,23·10⁻¹ ± 3,41·10⁻¹ | 2,46·10⁻¹ | 0.9971 | — | |||
| Paration-metile | Suolo 1 | 5–600 | 3,80·10⁻³ ± 1,42·10⁻⁴ | −3,10·10⁻² ± 4,05·10⁻² | 2,92·10⁻² | 0.9989 | -44 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 5,16·10⁻³ ± 1,70·10⁻⁴ | −3,24·10⁻² ± 4,86·10⁻² | 3,50·10⁻² | 0.9992 | -24 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 5,27·10⁻³ ± 1,76·10⁻⁴ | −1,93·10⁻² ± 5,02·10⁻² | 3,93·10⁻² | 0.9990 | -22 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 5,77·10⁻³ ± 1,00·10⁻⁴ | −3,06·10⁻² ± 2,87·10⁻² | 2,23·10⁻² | 0.9997 | -15 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 5,80·10⁻³ ± 3,16·10⁻⁴ | −5,68·10⁻² ± 9,00·10⁻² | 6,96·10⁻² | 0.9978 | -15 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 5,45·10⁻³ ± 1,46·10⁻⁴ | −2,40·10⁻² ± 4,18·10⁻² | 3,20·10⁻² | 0.9994 | -20 | |||
| Solvente | 5–600 | 6,80·10⁻³ ± 4,74·10⁻⁴ | −7,73·10⁻² ± 1,36·10⁻¹ | 9,76·10⁻² | 0.9963 | — | |||
| Tolclofos-metile | Suolo 1 | 5–600 | 1,78·10⁻² ± 2,78·10⁻⁴ | −4,35·10⁻⁴ ± 7,94·10⁻² | 5,72·10⁻² | 0.9998 | -17 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 1,90·10⁻² ± 2,25·10⁻⁴ | 1,40·10⁻² ± 6,44·10⁻² | 4,64·10⁻² | 0.9999 | -12 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 2,10·10⁻² ± 2,15·10⁻⁴ | −4,10·10⁻³ ± 6,15·10⁻² | 4,81·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 1,97·10⁻² ± 3,08·10⁻⁴ | 3,68·10⁻² ± 8,82·10⁻² | 6,85·10⁻² | 0.9998 | -9 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,97·10⁻² ± 1,01·10⁻³ | −1,08·10⁻¹ ± 2,88·10⁻¹ | 2,23·10⁻¹ | 0.9980 | -9 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 1,95·10⁻² ± 1,68·10⁻⁴ | 7,35·10⁻³ ± 4,80·10⁻² | 3,67·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| Solvente | 5–600 | 2,16·10⁻² ± 9,90·10⁻⁴ | −9,16·10⁻² ± 2,83·10⁻¹ | 2,04·10⁻¹ | 0.9984 | — | |||
| Pirimifos-metile | Suolo 1 | 5–600 | 6,48·10⁻³ ± 1,09·10⁻⁴ | −3,28·10⁻² ± 3,11·10⁻² | 2,24·10⁻² | 0.9998 | -19 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 7,41·10⁻³ ± 6,28·10⁻⁵ | −2,13·10⁻² ± 1,80·10⁻² | 1,30·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 8,00·10⁻³ ± 1,29·10⁻⁴ | −1,76·10⁻² ± 3,68·10⁻² | 2,88·10⁻² | 0.9998 | 1 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 7,80·10⁻³ ± 1,52·10⁻⁴ | −5,27·10⁻³ ± 4,36·10⁻² | 3,38·10⁻² | 0.9997 | -2 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 7,33·10⁻³ ± 3,71·10⁻⁴ | −6,17·10⁻² ± 1,06·10⁻¹ | 8,16·10⁻² | 0.9981 | -8 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 7,42·10⁻³ ± 8,58·10⁻⁵ | −2,18·10⁻² ± 2,46·10⁻² | 1,88·10⁻² | 0.9999 | -7 | |||
| Solvente | 5–600 | 7,96·10⁻³ ± 4,79·10⁻⁴ | −6,77·10⁻² ± 1,37·10⁻¹ | 9,88·10⁻² | 0.9972 | — | |||
| Fenitrotion | Suolo 1 | 5–600 | 4,65·10⁻³ ± 2,84·10⁻⁴ | −4,91·10⁻² ± 8,12·10⁻² | 5,85·10⁻² | 0.9971 | -40 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 6,34·10⁻³ ± 2,12·10⁻⁴ | −5,64·10⁻² ± 6,06·10⁻² | 4,36·10⁻² | 0.9991 | -18 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 6,43·10⁻³ ± 2,20·10⁻⁴ | −2,81·10⁻² ± 6,31·10⁻² | 4,94·10⁻² | 0.9989 | -17 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 7,41·10⁻³ ± 1,83·10⁻⁴ | −5,38·10⁻² ± 5,23·10⁻² | 4,07·10⁻² | 0.9995 | -4 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 6,84·10⁻³ ± 4,22·10⁻⁴ | −8,07·10⁻² ± 1,20·10⁻¹ | 9,28·10⁻² | 0.9971 | -11 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 6,50·10⁻³ ± 1,48·10⁻⁴ | −5,02·10⁻² ± 4,24·10⁻² | 3,25·10⁻² | 0.9995 | -16 | |||
| Solvente | 5–600 | 7,71·10⁻³ ± 7,02·10⁻⁴ | −1,06·10⁻¹ ± 2,01·10⁻¹ | 1,45·10⁻¹ | 0.9937 | — | |||
| Malathion | Suolo 1 | 5–600 | 1,20·10⁻² ± 4,06·10⁻⁴ | −4,45·10⁻² ± 1,16·10⁻¹ | 8,37·10⁻² | 0.9991 | -24 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 1,78·10⁻² ± 2,03·10⁻⁴ | −4,55·10⁻² ± 5,81·10⁻² | 4,19·10⁻² | 0.9999 | 12 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 1,67·10⁻² ± 1,44·10⁻³ | 1,00·10⁻¹ ± 4,11·10⁻¹ | 3,21·10⁻¹ | 0.9933 | 5 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 1,83·10⁻² ± 1,44·10⁻⁴ | −2,48·10⁻² ± 4,12·10⁻² | 3,20·10⁻² | 0.9999 | 16 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,58·10⁻² ± 8,21·10⁻⁴ | −9,07·10⁻² ± 2,33·10⁻¹ | 1,81·10⁻¹ | 0.9980 | 0 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 1,69·10⁻² ± 2,54·10⁻⁴ | −2,97·10⁻² ± 7,28·10⁻² | 5,57·10⁻² | 0.9998 | 7 | |||
| Solvente | 5–600 | 1,58·10⁻² ± 7,45·10⁻⁴ | −8,76·10⁻² ± 2,13·10⁻¹ | 1,53·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| Chlorpyrifos | Suolo 1 | 5–600 | 1,03·10⁻² ± 1,59·10⁻⁴ | −1,62·10⁻² ± 4,54·10⁻² | 3,27·10⁻² | 0.9998 | -21 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 1,15·10⁻² ± 1,96·10⁻⁴ | 4,71·10⁻¹ ± 5,62·10⁻² | 4,04·10⁻² | 0.9998 | -12 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 1,26·10⁻² ± 9,94·10⁻⁵ | −1,12·10⁻² ± 2,84·10⁻² | 2,23·10⁻² | 0.9999 | -3 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 1,24·10⁻² ± 1,76·10⁻⁴ | −1,44·10⁻⁴ ± 5,04·10⁻² | 3,92·10⁻² | 0.9998 | -5 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,16·10⁻² ± 6,33·10⁻⁴ | −8,42·10⁻² ± 1,80·10⁻¹ | 1,39·10⁻¹ | 0.9977 | -11 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 1,14·10⁻² ± 2,29·10⁻⁴ | 7,10·10⁻⁴ ± 6,57·10⁻² | 5,02·10⁻² | 0.9996 | -12 | |||
| Solvente | 5–600 | 1,30·10⁻² ± 5,48·10⁻⁴ | −7,41·10⁻² ± 1,57·10⁻¹ | 1,13·10⁻¹ | 0.9986 | — | |||
| Fenthion | Suolo 1 | 5–600 | 1,71·10⁻² ± 3,38·10⁻⁴ | −3,26·10⁻² ± 9,68·10⁻² | 6,97·10⁻² | 0.9997 | -16 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 1,88·10⁻² ± 1,89·10⁻⁴ | −2,84·10⁻² ± 5,40·10⁻² | 3,89·10⁻² | 0.9999 | -8 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 2,01·10⁻² ± 4,45·10⁻⁴ | −1,38·10⁻² ± 1,27·10⁻¹ | 9,95·10⁻² | 0.9996 | -2 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 1,96·10⁻² ± 2,89·10⁻⁴ | −8,63·10⁻⁴ ± 8,27·10⁻² | 6,42·10⁻² | 0.9998 | -4 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,89·10⁻² ± 9,10·10⁻⁴ | −1,33·10⁻¹ ± 2,59·10⁻¹ | 2,00·10⁻¹ | 0.9983 | -7 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 1,84·10⁻² ± 1,16·10⁻⁴ | −4,97·10⁻² ± 3,31·10⁻² | 2,54·10⁻² | 0.9999 | -10 | |||
| Solvente | 5–600 | 2,05·10⁻² ± 9,70·10⁻⁴ | −1,27·10⁻¹ ± 2,78·10⁻¹ | 2,00·10⁻¹ | 0.9983 | — | |||
| Pirimifos-etile | Suolo 1 | 5–600 | 3,30·10⁻³ ± 6,51·10⁻⁵ | −2,54·10⁻² ± 1,86·10⁻² | 1,34·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 3,30·10⁻³ ± 3,66·10⁻⁵ | −5,05·10⁻³ ± 1,05·10⁻² | 7,55·10⁻³ | 0.9999 | -3 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 2,80·10⁻³ ± 1,78·10⁻⁴ | 1,98·10⁻³ ± 5,10·10⁻² | 3,99·10⁻² | 0.9963 | -17 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 2,64·10⁻³ ± 5,18·10⁻⁵ | 2,01·10⁻³ ± 1,48·10⁻² | 1,15·10⁻² | 0.9997 | -22 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 1,36·10⁻³ ± 6,77·10⁻⁵ | 4,60·10⁻⁴ ± 1,93·10⁻² | 1,49·10⁻² | 0.9981 | -60 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 2,92·10⁻³ ± 1,23·10⁻⁴ | −9,09·10⁻³ ± 3,51·10⁻² | 2,69·10⁻² | 0.9985 | -14 | |||
| Solvente | 5–600 | 3,39·10⁻³ ± 1,46·10⁻⁴ | −2,62·10⁻² ± 4,18·10⁻² | 3,01·10⁻² | 0.9986 | — | |||
| Methidathion | Suolo 1 | 5–600 | 2,12·10⁻² ± 7,46·10⁻⁴ | −9,50·10⁻² ± 2,13·10⁻¹ | 1,54·10⁻¹ | 0.9990 | -34 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 2,59·10⁻² ± 5,46·10⁻⁴ | −1,20·10⁻¹ ± 1,56·10⁻¹ | 1,12·10⁻¹ | 0.9997 | -19 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 2,33·10⁻² ± 1,54·10⁻³ | 6,34·10⁻² ± 4,41·10⁻¹ | 3,45·10⁻¹ | 0.9961 | -27 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 2,51·10⁻² ± 3,38·10⁻⁴ | −5,47·10⁻² ± 9,66·10⁻² | 7,51·10⁻² | 0.9998 | -22 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 2,59·10⁻² ± 1,32·10⁻³ | −2,06·10⁻¹ ± 3,75·10⁻¹ | 2,90·10⁻¹ | 0.9980 | -19 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 2,27·10⁻² ± 3,71·10⁻⁴ | −6,62·10⁻² ± 1,06·10⁻¹ | 8,13·10⁻² | 0.9998 | -29 | |||
| Solvente | 5–600 | 3,21·10⁻² ± 1,75·10⁻³ | −2,83·10⁻¹ ± 5,00·10⁻¹ | 3,60·10⁻¹ | 0.9977 | — | |||
| Fenamifos | Suolo 1 | 5–600 | 2,36·10⁻³ ± 2,87·10⁻⁴ | −4,42·10⁻² ± 8,20·10⁻² | 5,91·10⁻² | 0.9888 | 8 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 3,47·10⁻³ ± 1,21·10⁻⁴ | −2,82·10⁻² ± 3,46·10⁻² | 2,49·10⁻² | 0.9991 | 58 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 1,89·10⁻³ ± 4,02·10⁻⁴ | 9,58·10⁻³ ± 1,15·10⁻¹ | 8,99·10⁻² | 0.9606 | -14 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 2,63·10⁻³ ± 7,66·10⁻⁵ | −2,51·10⁻² ± 2,19·10⁻² | 1,70·10⁻² | 0.9992 | 20 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 2,95·10⁻³ ± 1,91·10⁻⁴ | −3,58·10⁻² ± 5,43·10⁻² | 4,20·10⁻² | 0.9969 | 35 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 3,09·10⁻³ ± 5,98·10⁻⁵ | −2,12·10⁻² ± 1,71·10⁻² | 1,31·10⁻² | 0.9997 | 41 | |||
| Solvente | 5–600 | 2,19·10⁻³ ± 2,87·10⁻⁴ | −4,33·10⁻² ± 8,20·10⁻² | 5,91·10⁻² | 0.9871 | — | |||
| Ethion | Suolo 1 | 5–600 | 5,02·10⁻³ ± 1,00·10⁻⁴ | −1,16·10⁻² ± 2,87·10⁻² | 2,07·10⁻² | 0.9997 | -3 | ||
| Suolo 2 | 5–600 | 5,07·10⁻³ ± 2,15·10⁻⁴ | −1,06·10⁻² ± 6,16·10⁻² | 4,43·10⁻² | 0.9986 | -2 | |||
| Suolo 3 | 5–600 | 4,58·10⁻³ ± 2,21·10⁻⁴ | 9,11·10⁻⁴ ± 6,32·10⁻² | 4,95·10⁻² | 0.9979 | -12 | |||
| Suolo 4 | 5–600 | 5,07·10⁻³ ± 7,18·10⁻⁵ | −1,21·10⁻² ± 2,05·10⁻² | 1,60·10⁻² | 0.9998 | -2 | |||
| Suolo 5 | 5–600 | 5,00·10⁻³ ± 2,32·10⁻⁴ | −2,72·10⁻² ± 6,61·10⁻² | 5,11·10⁻² | 0.9984 | -3 | |||
| Suolo 6 | 5–600 | 4,73·10⁻³ ± 8,29·10⁻⁵ | −6,89·10⁻³ ± 2,37·10⁻² | 1,81·10⁻² | 0.9997 | -9 | |||
| Solvente | 5–600 | 5,18·10⁻³ ± 2,24·10⁻⁴ | −2,80·10⁻² ± 6,40·10⁻² | 4,61·10⁻² | 0.9986 | — | |||
Tabella 3: Parametri di taratura con matrice abbinata ed effetti di matrice per i 12 OPP bersaglio in sei suoli agricoli. Abbreviazioni: OPP = pesticidi organofosforici; b = pendenza; sb = deviazione standard della pendenza; a = intercetta; sa = deviazione standard dell'intercetta; R2 = coefficiente di determinazione; sy/x = deviazione standard della stima; ME = effetto di matrice. Cliccare qui per scaricare questa tabella.
| Analita | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |||||||||||||
| 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | 50 µg/kg | 200 µg/kg | 400 µg/kg | ||
| Clorpirifos-metile | 106 (4) | 102 (2) | 103 (1) | 110 (17) | 99 (2) | 101 (2) | 105 (5) | 104 (2) | 110 (10) | 105 (4) | 98 (3) | 100 (4) | 107 (4) | 107 (3) | 100 (4) | 114 (4) | 102 (3) | 114 (4) | |
| Paration-metile | 96 (3) | 96 (0) | 99 (1) | 97 (17) | 92 (3) | 97 (2) | 116 (4) | 104 (6) | 121 (5) | 103 (6) | 87 (4) | 95 (6) | 117 (6) | 110 (4) | 107 (6) | 107 (6) | 100 (4) | 108 (6) | |
| Tolclofos-metile | 113 (3) | 107 (2) | 104 (1) | 110 (15) | 100 (2) | 105 (3) | 101 (6) | 97 (2) | 104 (10) | 100 (7) | 98 (3) | 102 (2) | 106 (7) | 104 (3) | 101 (2) | 110 (7) | 103 (3) | 108 (2) | |
| Pirimifos-metile | 78 (12) | 79 (3) | 89 (2) | 106 (22) | 95 (1) | 99 (3) | 102 (7) | 97 (3) | 104 (9) | 101 (5) | 97 (2) | 100 (3) | 104 (5) | 101 (2) | 98 (3) | 113 (5) | 102 (2) | 104 (3) | |
| Fenitrotione | 91 (4) | 90 (2) | 98 (2) | 104 (25) | 90 (3) | 95 (2) | 116 (5) | 105 (4) | 118 (5) | 101 (6) | 90 (3) | 96 (7) | 111 (6) | 107 (3) | 103 (7) | 118 (6) | 101 (3) | 103 (7) | |
| Malathion | 89 (3) | 81 (1) | 87 (4) | 108 (18) | 90 (2) | 92 (2) | 118 (7) | 110 (4) | 119 (5) | 106 (5) | 96 (4) | 97 (5) | 122 (5) | 110 (4) | 102 (5) | 122 (5) | 102 (4) | 103 (5) | |
| Clorpirifos | 97 (4) | 96 (2) | 97 (1) | 160 (13) | 117 (5) | 112 (4) | 97 (6) | 95 (3) | 103 (10) | 102 (6) | 95 (2) | 98 (4) | 105 (6) | 98 (2) | 96 (4) | 108 (6) | 97 (2) | 103 (4) | |
| Fentione | 101 (2) | 99 (1) | 98 (2) | 99 (3) | 98 (2) | 103 (2) | 100 (7) | 101 (3) | 106 (8) | 102 (6) | 94 (2) | 97 (4) | 104 (6) | 100 (2) | 100 (4) | 110 (6) | 100 (2) | 104 (4) | |
| Pirimifos-etile | 63 (14) | 66 (5) | 85 (2) | 100 (21) | 93 (3) | 101 (3) | 70 (12) | 78 (3) | 93 (8) | 105 (9) | 104 (8) | 108 (7) | 113 (9) | 103 (8) | 103 (7) | 55 (9) | 33 (8) | 34 (7) | |
| Metidation | 92 (3) | 80 (16) | 91 (3) | 103 (16) | 87 (2) | 90 (2) | 125 (8) | 113 (5) | 125 (5) | 90 (12) | 85 (5) | 92 (8) | 97 (12) | 97 (5) | 97 (8) | 113 (12) | 100 (5) | 104 (8) | |
| Fenamifos | 5 (38) | 1 (38) | 3 (52) | 58 (18) | 58 (8) | 56 (6) | 140 (16) | 117 (3) | 126 (2) | 65 (15) | 50 (19) | 40 (20) | 82 (15) | 62 (19) | 69 (20) | 88 (15) | 70 (19) | 70 (20) | |
| Etione | 59 (15) | 42 (11) | 59 (15) | 83 (12) | 82 (3) | 87 (3) | 93 (11) | 97 (4) | 103 (7) | 80 (10) | 78 (6) | 81 (4) | 83 (10) | 77 (6) | 87 (4) | 96 (10) | 87 (6) | 89 (4) | |
Tabella 4: Recupero medio (%) e RSD (%) tra parentesi per i 12 OPP bersaglio in sei suoli agricoli (S1–S6) a tre livelli di aggiunta. Gli esperimenti di recupero sono stati condotti a 50, 200 e 400 µg/kg (n = 5 per livello) utilizzando clorpirifos-metile-d10 come standard interno di procedimento (P-IS). Sia le soluzioni di aggiunta dei pesticidi che quella dello standard interno di procedimento sono state aggiunte prima dell'estrazione. Secondo i criteri di prestazione stabiliti da SANTE/2020/12830 (Rev.2), i valori accettabili di recupero variano dal 70 al 120% con RSD ≤20%. S1: Villavicencio (Meta, Colombia); S2: Sabana Bogotá (Cundinamarca, Colombia); S3: Floresta (Boyacá, Colombia); S4: Guasca (Cundinamarca, Colombia); S5: Santa Rosa de Viterbo (Boyacá, Colombia); S6: La Laguna (Canarie, Spagna). Abbreviazioni: RSD = deviazione standard relativa; OPP = pesticidi organofosforici; P-IS = standard interno di procedimento. Cliccare qui per scaricare questa tabella.
Discussione
La determinazione dei residui di pesticidi nei suoli rimane analiticamente complessa a causa dell'elevata variabilità delle proprietà fisico-chimiche del suolo e delle conseguenti differenze nella composizione dei co-estratti4,5,6,14,17,18,19,20,21. Sebbene i metodi basati su QuEChERS siano stati ampiamente applicati a matrici alimentari e vegetali, sono stati condotti pochi studi che ottimizzano sistematicamente la fase di purificazione mediante dSPE per suoli agricoli con proprietà diverse4. Nel presente studio, sette combinazioni di sorbenti per dSPE sono state valutate utilizzando sei suoli agricoli selezionati per rappresentare un ampio intervallo di condizioni edafiche. I risultati hanno dimostrato che la composizione del passaggio di purificazione influisce notevolmente sulla rimozione dei componenti di matrice co-estratti. Sebbene la rimozione dei co-estratti sia stata utilizzata come criterio indipendente dall'analita per selezionare la configurazione dSPE più efficiente, le prestazioni analitiche della procedura di purificazione ottimizzata sono state successivamente valutate mediante la valutazione dell'effetto di matrice (ME) e la validazione del metodo. Identificando una configurazione dSPE ottimizzata e integrandola con protettori dell'analita, un IS marcati con deuterio, una curva di taratura in matrice e la validazione secondo le indicazioni del documento SANTE/2020/12830 (Rev.2), questo protocollo fornisce un flusso di lavoro analitico completo, pratico e simultaneo per la determinazione degli OPP in suoli agricoli con proprietà contrastanti. Piuttosto che rappresentare un'ottimizzazione per una singola matrice di suolo, il protocollo è stato progettato per fornire una metodologia robusta e facilmente trasferibile, adatta ai laboratori ambientali di routine.
Le prestazioni superiori della combinazione PSA+C18+Adsorbente possono essere attribuite ai meccanismi di ritenzione complementari forniti dai tre sorbenti. Il PSA contribuisce principalmente alla rimozione di co-estratti polari acidi attraverso interazioni di scambio anionico debole, mentre il C18 trattiene i composti apolari mediante partizionamento idrofobico12,13. Il Florisil, un sorbente a base di silicato di magnesio, fornisce una ritenzione aggiuntiva di costituenti della matrice polari e moderatamente polari attraverso interazioni di legame a idrogeno, dipolo-dipolo e acido-base di Lewis15,16. I risultati supportano questo comportamento complementare. L'adsorbente da solo ha prodotto una rimozione media di co-estratti superiore rispetto al PSA o al C18 utilizzati singolarmente. Inoltre, l'aggiunta dell'adsorbente al solo PSA o al solo C18 ha determinato solo lievi variazioni nell'efficienza media di purificazione, mentre la sua inclusione nella combinazione PSA+C18 ha portato alla rimozione complessiva più elevata di co-estratti tra tutte e sette le configurazioni di dSPE valutate. Questo andamento è più coerente con l'ipotesi che l'adsorbente contribuisca con una ritenzione complementare di costituenti della matrice non rimossi in modo efficiente dal PSA o dal C18, piuttosto che agire semplicemente come massa aggiuntiva di sorbente. Tale complementarità risulta particolarmente rilevante per i suoli agricoli, in cui le variazioni nel contenuto di materia organica, nella composizione minerale e nella tessitura determinano profili di co-estratti altamente eterogenei.
Poiché lo scopo di questo studio era stabilire un singolo protocollo di purificazione applicabile a suoli agricoli con diverse caratteristiche fisico-chimiche, la selezione finale del sorbente ha tenuto conto sia del confronto statistico tra le configurazioni di purificazione valutate sia della giustificazione analitica fornita dai meccanismi complementari di ritenzione dei tre sorbenti. La combinazione MgSO4+PSA+C18+Adsorbente ha garantito la rimozione media più elevata di co-estratti, offrendo al contempo la copertura fisico-chimica più ampia dei co-estratti di matrice tra le configurazioni dSPE valutate. Pertanto, questa combinazione è stata selezionata per la successiva validazione del metodo.
Gli effetti di matrice (ME) rimangono una delle principali fonti di incertezza nella determinazione mediante GC-MS/MS di residui di pesticidi, in particolare in matrici eterogenee come i suoli4,5. Sebbene in questo studio il fenomeno predominante osservato sia stata la soppressione del segnale, la maggior parte degli analiti ha mostrato valori medi di effetti di matrice entro l'intervallo generalmente considerato da lieve a moderato (rispettivamente −20% a +20% e −20% a −50%)14,28. Questo risultato è coerente con una riduzione efficace del carico di co-estratti che raggiunge il sistema cromatografico. Tuttavia, è stata comunque osservata una variabilità dipendente dall'analita. Ad esempio, il methidathion, il parathion-metile e il pirimiphos-etile hanno mostrato la soppressione media del segnale più marcata, mentre il fenamiphos ha mostrato un potenziamento del segnale. Gli effetti di matrice nella GC-MS/MS sono intrinsecamente dipendenti dal composto e derivano dalle interazioni tra analiti, costituenti residui della matrice e siti attivi all'interno del sistema di iniezione e del percorso cromatografico. Di conseguenza, i componenti residui della matrice possono ridurre o aumentare la risposta del rivelatore a seconda delle proprietà fisico-chimiche di ciascun analita e della sua suscettibilità alle interazioni superficiali. Le risposte contrastanti osservate tra i OPP valutati riflettono quindi principalmente un comportamento dipendente dall'analita sovrapposto alle differenze nella composizione della matrice del suolo. Oltre alla pulizia mediante dSPE, il flusso analitico ha incluso una miscela di protettori per analiti precedentemente descritta come in grado di ridurre le interazioni degli analiti con i siti attivi nei sistemi GC e di migliorare le prestazioni cromatografiche nell'analisi dei residui di pesticidi28,29. La persistenza di effetti di matrice specifici per ciascun analita nonostante queste misure evidenzia la complessità delle matrici di suolo e sostiene l'uso di una taratura con matrice abbinata (matrix-matched calibration) per una quantificazione affidabile dei OPP in suoli con composizione matriciale diversa.
Gli esperimenti di recupero hanno dimostrato che il metodo ottimizzato fornisce una quantificazione accurata e precisa per la maggior parte degli OPP bersaglio in una vasta gamma di condizioni di suoli agricoli. La maggior parte delle combinazioni analita-suolo ha soddisfatto i criteri di accettabilità stabiliti da SANTE/2020/12830 (Rev.2)11, con recuperi compresi tra il 70% e il 120% e RSD inferiori al 20%. Tuttavia, alcune deviazioni rispetto all'intervallo di recupero raccomandato sono state osservate per un numero limitato di combinazioni analita-suolo. Le deviazioni più rilevanti sono state associate a fenamifos, pirimifos-etile ed etione, che hanno mostrato bassi recuperi in specifiche matrici di suolo. Sono state osservate ulteriori deviazioni isolate, principalmente recuperi leggermente superiori al limite massimo di accettabilità a singoli livelli di fortificazione, per clorpirifos, parathion-metile, malathion e methidathion. Poiché queste deviazioni non sono state osservate in modo costante tra le diverse matrici di suolo, il comportamento osservato è probabilmente legato a caratteristiche dipendenti dal composto combinate con effetti di matrice (MEs). Un numero maggiore di deviazioni è stato osservato in S1, che presentava il contenuto più elevato di argilla (48,5%) tra le matrici valutate, suggerendo che le caratteristiche fisico-chimiche del suolo possano aver contribuito a una ridotta efficienza di estrazione per alcuni analiti. I minerali argillosi offrono numerosi siti di adsorbimento che possono trattenere le molecole dei pesticidi attraverso interazioni superficiali, riducendone così la desorbimento durante l'estrazione. L'entità di queste interazioni dipende anche dalle proprietà fisico-chimiche dell'analita, inclusa l'affinità per le superfici minerali. Tuttavia, l'assenza di un modello simile in tutti i suoli ricchi di argilla indica che nessun singolo parametro del suolo spiega completamente le deviazioni osservate. Inoltre, poiché la stessa procedura di pulizia basata su adsorbente ha fornito prestazioni soddisfacenti per la maggior parte delle combinazioni analita-suolo, non è stata osservata alcuna evidenza di perdite sistematiche associate alla fase di pulizia. Sebbene il contributo individuale dell'adsorbente al trattenimento dell'analita non sia stato valutato separatamente durante l'ottimizzazione del sorbente, le prestazioni soddisfacenti in termini di recupero ottenute con la procedura ottimizzata suggeriscono che l'inclusione di questo sorbente non abbia compromesso la determinazione degli analiti. Nel complesso, questi risultati dimostrano l'idoneità del metodo proposto, evidenziando al contempo l'influenza delle interazioni analita-matrice sulle prestazioni di composti specifici.
Sebbene il metodo abbia mostrato prestazioni soddisfacenti su sei suoli agricoli valutati, la sua applicabilità a suoli con proprietà estreme, come suoli salini, torbosi, con contenuti molto elevati di materia organica, suoli fortemente alcalini o matrici arricchite di materiali carboniosi, deve ancora essere stabilita. Inoltre, la presente validazione è stata eseguita utilizzando suoli agricoli fortificati; pertanto, l'applicabilità del metodo a campioni di campo naturalmente contaminati deve ancora essere confermata. Inoltre, poiché il metodo è stato sviluppato e validato esclusivamente per gli OPP, non se ne può dare per scontata l'idoneità per altre classi di pesticidi. Nonostante queste limitazioni, il protocollo fornisce un approccio standardizzato per la determinazione dei residui di OPP nei suoli agricoli e può essere impiegato in programmi di monitoraggio ambientale, studi sul destino e il trasporto dei pesticidi, indagini di valutazione del rischio e attività di sorveglianza regolatoria. Ricerche future dovrebbero valutare la trasferibilità della strategia di purificazione ottimizzata ad ulteriori tipi di suolo e classi di pesticidi, nonché esplorare ulteriori affinamenti volti a migliorare i rendimenti di recupero per i composti che mostrano bassa efficienza di estrazione in matrici ricche di argilla.
Nel complesso, il flusso di lavoro proposto combina una pulizia dSPE ottimizzata, una taratura con matrice abbinata, una standardizzazione con standard interno e l'uso di protettori dell'analita in un singolo protocollo validato per la determinazione simultanea di OPP nei suoli agricoli. La valutazione sistematica di combinazioni di sorbenti su suoli con proprietà fisico-chimiche contrastanti fornisce indicazioni pratiche per la selezione di condizioni di pulizia in grado di minimizzare gli effetti di matrice mantenendo al contempo prestazioni analitiche soddisfacenti. Il protocollo, pertanto, offre un approccio riproducibile che può supportare il monitoraggio ambientale, gli studi sul destino dei pesticidi e la determinazione di residui di routine in suoli agricoli con caratteristiche diverse.
Dichiarazioni
Durante la preparazione di questo lavoro, gli autori hanno utilizzato la versione gratuita di Claude (Anthropic) per assistere nella progettazione della disposizione grafica della Figura 3 e la versione gratuita di ChatGPT (GPT-5.5, OpenAI) per supporto nella grammatica e nell'ortografia. Dopo aver utilizzato questi strumenti, gli autori hanno attentamente rivisto e modificato tutti i contenuti secondo necessità. Tutti i contenuti scientifici, i dati, le analisi e le conclusioni sono stati prodotti, verificati e approvati dagli autori, che si assumono piena responsabilità per l'accuratezza e l'integrità dell'articolo pubblicato.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano con gratitudine l'Università EAN e il suo Ufficio Gestione della Ricerca e del Trasferimento per il sostegno a questa ricerca. Gli autori ringraziano inoltre i laboratori dell'Università EAN per aver messo a disposizione le strutture analitiche e le risorse tecniche necessarie per svolgere questo lavoro, inclusi l'accesso e l'utilizzo dello strumento GC-MS/MS impiegato durante lo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio Gestione della Ricerca e del Trasferimento, Universidad EAN, Bogotá D.C., Colombia.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3-Etoxi-1,2-propanediolo (etilglicerolo) | Sigma Aldrich | 260428-1G | |
| Acido acetico | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Acetonitrile | Merck | 1006652500 | |
| Autocampionatore AOAC 20i/s | Shimadzu | 221-723115-58 | |
| Bilancia | OHAUS | PA224 | |
| C18 | Sigma Aldrich | 52600-U | |
| Tubi da centrifuga, 2 mL | Eppendorf | 4610-1815 | |
| Tubi da centrifuga, 50 mL | Nest | 602002 | |
| Centrifuga Z206A | MERMLE | 6019500118 | |
| Colonna SH-Rxi-5sil MS, 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm | Shimadzu | 221-75954-30 | |
| Contenitore, con tappo, in vetro ambrato, 1000 mL | Sigma Aldrich | Z674176 | |
| Essiccatore | Simax | 415262302 | |
| Dispensette 5-50 mL | BRAND | 4600361 | |
| D-Sorbitolo | Sigma Aldrich | 240850-5G | |
| Acetato di etile | Merk | 1313181212 | |
| Florisil <200 mesh, polvere fine | Sigma Aldrich | 288705-50G | |
| Acido formico | Merck | 1002641000 | |
| GCMS-TQ8040 | Shimadzu | 211552 | |
| Siringa per iniezione | Shimadzu | LC2213461800 | |
| L-Gulonico acido γ-lattone | Sigma Aldrich | 310301-5G | |
| Linner senza split | Shimadzu | 221-4887-02 | |
| Solfato di magnesio (anidro) | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Metanolo | Panreac | 131091.12.12 | |
| Acqua ultrapura Milli-Q (tipo 1) | Millipore | F4H4783518 | |
| Punte per pipetta 10 - 100 µL | Biologix | 200010 | |
| Punte per pipetta 100 - 1000 µL | Brand | 541287 | |
| Punte per pipetta 20 - 200 µL | Brand | 732028 | |
| Pipette Pasteur | NORMAX | 5426023 | |
| Pipetta Transferpette S variabile 10 - 100 µL | BRAND | 704774 | |
| Pipetta Transferpette S variabile 100 - 1000 µL | BRAND | 704780 | |
| Pipetta Transferpette S variabile 20 - 200 µL | SCILOGEX | 712111099999 | |
| Amina primaria-secondaria (PSA) | Sigma Aldrich | 52738-U | |
| Frigorifero/congelatore | Haceb | NEV ALC 404 | |
| Acido shikimico | Sigma Aldrich | S5375-1G | |
| Acetato di sodio | Sigma Aldrich | 241245-1KG | |
| Software GCMSsolution | Shimadzu | 223-18472-92 | |
| Rete in acciaio inossidabile da 2 mm | Pinzuar | PS33N10 | |
| Provetta, in vetro, 10 mL | Sigma Aldrich | BR114508 | |
| Toluene | Merck | 1083252500 | |
| Triphenyl phosphate (I-IS) | Sigma Aldrich | 241288-50G | |
| Vial con inserto fuso, 0,3 mL | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| Vial, con tappo a vite, in vetro ambrato, 15 mL | Sigma Aldrich | 27088-U | |
| Matraccio tarato, 10 mL | Sigma Aldrich | DKW28017-10 | |
| Vortex | Scilogex | 82120004 | |
| Pesticidi | |||
| Clorpirifos | Sigma Aldrich | 45395-100MG | 2921-88-2 |
| Clorpirifos-metile | Sigma Aldrich | 45396-250MG | 5598-13-0 |
| Clorpirifos-metile-d10 (P-IS) | Sigma Aldrich | 90047-5MG | 285138-81-0 |
| Ethion | Sigma Aldrich | 45477-250MG | 563-12-2 |
| Fenamifos | Sigma Aldrich | 45483-250MG | 22224-92-6 |
| Fenitrotione | Sigma Aldrich | 45487-250MG | 122-14-5 |
| Fentione | Sigma Aldrich | 36552-250MG | 55-38-9 |
| Malathion | Sigma Aldrich | 36143-100MG | 121-75-5 |
| Methidathion | Sigma Aldrich | 36158-100MG | 950-37-8 |
| Parathion-metile | Sigma Aldrich | 36187-100MG | 298-00-0 |
| Pirimiphos-etile | Sigma Aldrich | 45628-250MG | 23505-41-1 |
| Pirimiphos-metile | Sigma Aldrich | 32058-250MG | 29232-93-7 |
| Tolclofos-metile | Sigma Aldrich | 31209-250MG | 5701804-9 |
Riferimenti
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