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Articolo di ricerca

L'inibizione di LINC00707 attenua l'infiammazione e lo stress ossidativo nei microglia BV2 stimolati con LPS tramite l'asse miR-145-5p/TRAF6 nel danno midollare

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11 settembre 2026

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1Department of Nursing, Zhangjiakou First Hospital, 2Department of Orthopedics, Zhangjiakou First Hospital, 3Department of Pediatrics, Zhangjiakou First Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'espressione plasmatica di LINC00707 è aumentata nella lesione del midollo spinale e promuove l'infiammazione e lo stress ossidativo mediati dai microglia attraverso l'asse di segnalazione miR-145-5p/TRAF6. L'insonorizzazione di LINC00707 attenua queste risposte patologiche, evidenziandone il potenziale come bersaglio terapeutico.

Abstract

La lesione del midollo spinale (SCI) provoca disabilità permanenti, riduce profondamente il benessere e comporta un notevole onere socioeconomico. Questo studio ha indagato il ruolo di LINC00707 nella SCI attraverso la regolazione dell'asse di segnalazione miR-145-5p/TRAF6. Campioni plasmatici di 30 soggetti sani e di 75 pazienti con SCI sono stati analizzati per l'espressione di LINC00707, miR-145-5p e TRAF6 mediante RT-qPCR. Sono state valutate le associazioni tra i livelli plasmatici di LINC00707 e i fattori pro-infiammatori nei pazienti con SCI. Le cellule microgliali BV2 sono state esposte a 100 ng/mL di LPS, e sono stati misurati i fattori correlati all'infiammazione e allo stress ossidativo. Le interazioni molecolari sono state valutate mediante saggio del reporter a doppia luciferasi. L'analisi di regressione logistica è stata utilizzata per identificare i fattori associati all'espressione di LINC00707. I livelli plasmatici di LINC00707 e TRAF6 erano aumentati nei pazienti con SCI, mentre i livelli di miR-145-5p erano ridotti. I livelli plasmatici di LINC00707 erano positivamente correlati ai livelli plasmatici dei fattori infiammatori. LINC00707 agiva da spugna molecolare per miR-145-5p, e TRAF6 era un gene bersaglio di miR-145-5p. L'inibizione di LINC00707 ha ridotto i fattori infiammatori, le sostanze pro-ossidative e i livelli di mRNA di TRAF6 nelle cellule BV2. L'inibizione di miR-145-5p ha prodotto effetti opposti. Questi risultati suggeriscono che un'espressione elevata di LINC00707 è associata alla gravità della SCI e che il silenziamento di LINC00707 potrebbe attenuare l'infiammazione e lo stress ossidativo mediati dalle microglia regolando l'asse di segnalazione miR-145-5p/TRAF6.

Introduzione

La lesione del midollo spinale (SCI) è una condizione traumatica che danneggia il midollo spinale, una componente fondamentale del sistema nervoso centrale. L'SCI interrompe direttamente i percorsi di conduzione neurale tra il midollo spinale e il cervello, causando gravi deficit nelle funzioni motorie, sensoriali e autonomiche1,2. Studi epidemiologici hanno riportato un'incidenza annuale di circa 5 casi ogni 100.000 individui, con una mortalità correlata alla malattia che raggiunge fino al 16,7%3,4. Un'indagine canadese ha stimato che il costo della riabilitazione durante l'intera vita per ogni paziente con SCI possa arrivare fino a 336.000 dollari statunitensi5. L'elevata incidenza, la mortalità e i costi sostanziali associati alla diagnosi, al trattamento e alla riabilitazione rendono l'SCI una sfida clinica importante che richiede strategie terapeutiche migliorate.

La progressione patologica del danno midollare (SCI) comprende due fasi: lesione primaria e lesione secondaria. La lesione primaria deriva da una compressione meccanica traumatica o dalla rottura del tessuto midollare, mentre la lesione secondaria è mediata da processi patologici, tra cui l'infiammazione e lo stress ossidativo6,7. In condizioni fisiologiche, la neuroinfiammazione mediata dai microglia contribuisce all'omeostasi del sistema nervoso centrale8,9,10. Tuttavia, dopo una lesione midollare, i microglia si attivano in modo eccessivo e rilasciano elevate quantità di mediatori pro-infiammatori11,12. Questi mediatori inducono una produzione eccessiva di specie reattive dell'ossigeno (ROS), causando danno neuronale e morte cellulare, e aggravando la lesione midollare secondaria13,14. Pertanto, inibire l'attivazione eccessiva dei microglia e interrompere la cascata infiammatoria rappresentano strategie terapeutiche promettenti per favorire il recupero neurologico e migliorare gli esiti dopo una lesione midollare.

Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono una classe di RNA non codificanti più lunghi di 200 nucleotidi che non possiedono potenziale di codifica proteica15. Inizialmente considerati un "rumore" trascrizionale, gli lncRNA sono ora riconosciuti come importanti regolatori di diversi processi fisiologici e patologici16. Studi recenti hanno dimostrato che gli lncRNA svolgono ruoli fondamentali nel danno neuronale. L'RNA non codificante lungo intergenico 707 (LINC00707) si è affermato come un importante regolatore dei disturbi del sistema nervoso. Studi precedenti hanno riportato che LINC00707 aggrava la lesione cerebrale traumatica potenziando l'infiammazione mediata dai microglia17. Inoltre, Zhu et al. hanno dimostrato che l'abbattimento di LINC00707 attenuava significativamente l'infiammazione e l'apoptosi indotte dal lipopolisaccaride (LPS) nelle cellule PC1218. Questi risultati forniscono una base teorica preliminare per esplorare il coinvolgimento di LINC00707 nella lesione del midollo spinale (SCI). Tuttavia, non è ancora chiaro se LINC00707 regoli l'infiammazione mediata dai microglia durante la SCI.

Gli lncRNA agiscono come spugne molecolari attraverso il meccanismo dell'RNA endogeno competitivo (ceRNA), sequestrando i microRNA (miRNA) e regolando l'espressione dei geni bersaglio a valle19. Questo schema regolatorio è ampiamente coinvolto nella patogenesi di numerose malattie. In particolare, miR-145-5p risulta significativamente ridotto nei tessuti di lesione midollare (SCI)20 e durante il danno indotto da LPS21, e la sua sovraespressione attenua efficacemente le risposte infiammatorie e da stress ossidativo nei microglia22. Anche il fattore associato al recettore del fattore di necrosi tumorale 6 (TRAF6) svolge un ruolo fondamentale nella patologia della SCI23,24,25. Tuttavia, non è ancora chiaro se LINC00707, miR-145-5p e TRAF6 esercitino funzioni regolatorie coordinate nella SCI.

Nel presente studio, l'espressione di LINC00707 è risultata significativamente aumentata nelle cellule microgliali stimolate con LPS. Pertanto, abbiamo ipotizzato che LINC00707 possa agire come un regolatore pro-infiammatorio nella microglia e che il suo silenziamento possa attenuare la risposta neuroinfiammatoria, migliorando così la progressione patologica del danno al midollo spinale (SCI). Questo studio ha indagato se LINC00707 regola le risposte infiammatorie della microglia e contribuisce alla patogenesi della SCI.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhangjiakou First (numero di approvazione 2024-KY-18). A tutti i partecipanti sono stati illustrati gli obiettivi dello studio e i potenziali rischi, e hanno fornito consenso informato scritto prima dell'arruolamento. Campioni di sangue venoso sono stati raccolti da soggetti sani durante esami fisici di routine e da pazienti con lesione del midollo spinale immediatamente dopo il ricovero in ospedale. Le analisi di laboratorio sono state eseguite dal laboratorio clinico dell'ospedale. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Soggetti
Un totale di 75 pazienti con lesione del midollo spinale (SCI) sono stati reclutati presso l'Ospedale di Zhangjiakou tra gennaio 2023 e gennaio 2025. I criteri di inclusione erano una lesione del midollo spinale confermata mediante tomografia computerizzata (TC) o risonanza magnetica (RM) e un intervallo di tempo tra il trauma e il ricovero ospedaliero ≤ 12 h. I criteri di esclusione comprendevano anamnesi di trauma o intervento chirurgico al midollo spinale o al cervello nei precedenti 6 mesi; malattia cardiovascolare grave, inclusi infarto miocardico o aritmia; gravidanza o allattamento; e tumori maligni, alterata funzionalità epatica o renale, grave malattia cerebrovascolare o malattie infettive.

Secondo gli standard di classificazione neurologica dell'American Spinal Injury Association (ASIA)26, 75 pazienti con lesione midollare sono stati classificati in base alla funzione neurologica normale (n = 21), lesione midollare incompleta (n = 36) e lesione midollare completa (n = 18). La distribuzione dei siti di lesione è stata la seguente: cervicale, 36,0%; toracica, 30,7%; e lombare, 33,3%. Sono stati reclutati in modo casuale 30 individui sani, abbinati alla popolazione in studio, per costituire il gruppo di controllo. Per tutti i partecipanti è stata raccolta l'informazione clinica di base. I criteri di inclusione per gli individui sani erano assenza di anamnesi di trauma o intervento chirurgico al midollo spinale o al cervello, o di disturbi neurologici; assenza di anamnesi di malattie infiammatorie croniche, disturbi autoimmuni o neoplasie; assenza di malattie cardiovascolari, epatiche o renali gravi; assenza di infezioni acute o croniche nelle precedenti 4 settimane; assenza di gravidanza o allattamento; e abbinamento per età e sesso al gruppo con lesione midollare.

La misura dell'Indipendenza Funzionale (FIM) è stata utilizzata per valutare l'indipendenza funzionale nelle attività quotidiane. Il punteggio FIM massimo è 126. I punteggi relativi alla sensibilità tattile, all'acmestesia e al funzionamento motorio sono stati impiegati per valutare le funzioni sensoriali e motorie. I punteggi massimi per la sensibilità tattile e per l'acmestesia erano 112, mentre il punteggio motorio massimo era 100. Punteggi più bassi indicano un deficit neurologico più grave.

2. Coltura cellulare, costruzione del modello e trasfezione
Le cellule microgliali murine immortalizzate BV2 sono state ottenute dal Centro di Risorse Cellulari dell'Istituto di Biotecnologia di Shanghai. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco modificato di Eagle ad alto contenuto di glucosio (DMEM) integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10%, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 U/mL). Le cellule sono state mantenute a 37 °C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO₂.

Per la costruzione del modello, le cellule BV2 sono state stimolate con 0, 10, 20, 50, 100, 150 o 200 ng/mL di lipopolisaccaride (LPS) per 24 h. La concentrazione ottimale di LPS è stata selezionata in base ai risultati sperimentali.

Per la trasfezione, le cellule BV2 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti e trasfettate una volta raggiunta la confluenza appropriata. È stato utilizzato un reagente di trasfezione in una quantità di 1,5 µL/pozzetto seguendo le istruzioni del produttore. Dopo 6 h, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo fresco e le cellule sono state coltivate per ulteriori 24 h. Il costrutto per il silenziamento di LINC00707, il controllo negativo corrispondente, l'oligonucleotide miR-145-5p e l'oligonucleotide di controllo corrispondente sono stati utilizzati ciascuno a una concentrazione di 50 nM per pozzetto. Tutti gli esperimenti di trasfezione sono stati ripetuti indipendentemente almeno 5 volte, con 3 replicati paralleli per ciascun esperimento indipendente. I dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando i risultati di almeno 5 esperimenti indipendenti.

3. ELISA
I supernatanti di coltura delle cellule BV2 trasfettate e stimolate con LPS sono stati raccolti mediante centrifugazione a 12.000 × g per 10 minuti, e i livelli di interleuchina-1β (IL-1β), IL-6 e fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) sono stati misurati utilizzando i rispettivi kit ELISA. In breve, il saggio è stato eseguito incubando in successione con un anticorpo biotinilato, un coniugato HRP-streptavidina e un substrato TMB, seguendo le istruzioni del produttore. L'assorbanza è stata registrata a 450 nm mediante un lettore per micropiastre. I livelli di citochine sono stati determinati a partire dalle curve standard. Ogni campione è stato misurato in triplice replicato e sono stati effettuati 6 esperimenti indipendenti.

4. Misurazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS)
I livelli intracellulari di ROS in cellule BV2 stimolate con LPS sono stati misurati utilizzando un kit per saggio delle specie reattive dell'ossigeno. In breve, le cellule sono state incubate con 10 µmol/L di DCFH-DA a 37 °C per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, il soprannatante è stato eliminato e le cellule sono state lavate 3 volte con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per rimuovere il sondeo extracellulare in eccesso. L'intensità di fluorescenza è stata misurata mediante un lettore per micropiastre con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 488 nm e 525 nm. I livelli relativi di ROS sono stati calcolati in base all'intensità di fluorescenza. Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice replicato e l'intero esperimento è stato ripetuto in modo indipendente almeno 5 volte.

5. Rilevamento di malondialdeide, superossido dismutasi e glutathione
Le cellule BV2 trattate sono state raccolte e sono stati preparati gli omogenati cellulari. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 min a 4 °C per ottenere il soprannatante. Sono stati utilizzati kit commerciali per il rilevamento di malondialdeide (MDA), superossido dismutasi (SOD) e glutathione (GSH), seguendo le istruzioni del produttore, per determinare i livelli di queste sostanze nei soprannatanti cellulari. Tutti i campioni sono stati analizzati in triplice replicato e l'intero esperimento è stato ripetuto in modo indipendente almeno 5 volte.

6. Saggio del reporter dual-luciferasi
Frammenti della regione non tradotta 3' (3' UTR) di LINC00707 e TRAF6 contenenti i siti di legame predetti per miR-145-5p, insieme alle corrispondenti sequenze mutate, sono stati clonati nel vettore reporter di luciferasi pmirGLO per generare costrutti reporter di tipo selvatico (WT-LINC00707 e WT-TRAF6) e mutati (MUT-LINC00707 e MUT-TRAF6). Le cellule BV2 sono state co-trasfettate con i costrutti reporter e oligonucleotidi miR-145-5p e coltivate per 24 h. Le cellule sono state quindi raccolte e le attività della luciferasi di firefly e della Renilla sono state misurate utilizzando un lettore per micropiastre.

7. RT-qPCR
L'RNA totale è stato estratto utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. La qualità dell'RNA è stata valutata mediante il rapporto OD₂₆₀/OD₂₈₀, considerando accettabili valori compresi tra 1,8 e 2,0. Circa 1 µg di RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando un kit di retrotrascrizione. L'espressione genica è stata quantificata mediante RT-qPCR utilizzando una miscela master PCR con SYBR Green. La retrotrascrizione è stata eseguita a 42 °C per 15 min, seguita dall'inattivazione della retrotrascrittasi a 95 °C per 3 min. Il cDNA sintetizzato è stato conservato a −20 °C fino all'analisi. La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita con una pre-denaturazione a 95 °C per 1 min, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 s e di annealing ed estensione a 60 °C per 15 s. I segnali di fluorescenza sono stati raccolti al termine di ogni fase di annealing ed estensione. L'analisi della curva di denaturazione è stata effettuata a 95 °C per 15 s, seguita da 60 °C per 1 min. I livelli di espressione relativi sono stati calcolati utilizzando il metodo 2⁻ΔΔCt. GAPDH o 5S è stato utilizzato come riferimento interno per la normalizzazione dell'espressione genica. Le sequenze dei primer erano le seguenti: LINC00707, forward 5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3' e reverse 5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'; miR-145-5p, forward 5'-GCCGAGGTCCAGTTTTCCCA-3' e reverse 5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'; TRAF6, forward 5'-ATTACAACTGAGGTGCTTCT-3' e reverse 5'-GCATCTGGTTCTGTTATAGGA-3'; GAPDH, forward 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3' e reverse 5'-CGCCCCACTTGATTTTGG-3'; e 5S, forward 5'-TCGTCTGATCTCGGAAGCTAA-3' e reverse 5'-AAGCCTACAGCACCCGGTAT-3'.

8. Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software statistico. La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk, in cui un valore di P > 0,05 indicava una distribuzione normale. I dati con distribuzione normale sono stati espressi come media ± DS, mentre i dati con distribuzione non normale sono stati espressi come mediana (P25, P75). Per le variabili continue con distribuzione normale, i confronti tra due gruppi sono stati effettuati mediante il test t di Student, mentre i confronti tra più gruppi sono stati effettuati mediante ANOVA a un fattore seguita dal test post hoc di Tukey. Per i dati con distribuzione non normale, il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per i confronti tra due gruppi, e il test di Kruskal-Wallis per i confronti tra più gruppi. Il test del chi-quadro è stato impiegato per analizzare le variabili categoriche tra i gruppi. Sono state utilizzate analisi di regressione logistica univariata e multivariata per valutare i fattori clinici associati all'espressione di LINC00707. Le variabili continue sono state dicotomizzate in base alla mediana del coorte (gruppo ad alto valore = 1; gruppo a basso valore = 0). Le variabili con P < 0,05 nell’analisi di regressione logistica univariata sono state inserite nell’analisi di regressione logistica multivariata. I risultati sono stati espressi come odds ratio (OR) con intervalli di confidenza al 95% (IC), in cui un valore di OR > 1 indicava un'associazione positiva e un valore di OR < 1 indicava un'associazione negativa. Tutti gli esperimenti sul fenotipo cellulare hanno incluso almeno 4 replicati biologici indipendenti, con 3 replicati tecnici per ogni replicato biologico. Un valore di P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

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Risultati

I livelli plasmatici di LINC00707 erano elevati nei pazienti con lesione del midollo spinale (SCI)
Sono state analizzate le caratteristiche cliniche di base di 30 soggetti sani e di 75 pazienti con lesione del midollo spinale (SCI). Rispetto ai soggetti sani, i pazienti con lesione del midollo spinale presentavano punteggi significativamente più bassi per quanto riguarda la sensibilità tattile, l'acmestesia, le funzioni motorie e il punteggio Functional Independence Measure (FIM), indicando un deteri...

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Discussione

La lesione del midollo spinale (SCI) è un grave disturbo traumatico del sistema nervoso centrale che determina un'alterazione o una perdita completa della conduzione nervosa attraverso il midollo spinale, causando disfunzioni motorie, sensoriali e autonomiche permanenti, nonché conseguenze fisiologiche e psicologiche profonde29˒30. La gravità di tali alterazioni generalmente aumenta con l'estensione della lesione del midollo spinale. Nel presente studio, l'espressione plasm...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto di Ricerca in Scienze Mediche del Hebei (Concessione n. 20251479).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
tubo microcentrifugo da 1,5 mLKIRGENKG2211Tubo in polipropilene con tappo a scatto, privo di DNasi/RNasi, non pirogeno, forza centrifuga massima 20.000 × g, per la conservazione e la centrifugazione di campioni di RNA/proteine.
Piastra per coltura cellulare a 6 pozzettiCorning3516Piastra in polistirene trattata per colture cellulari, con fondo piatto, sterile e confezionata singolarmente; volume della pozzetta di 16,8 mL e superficie di crescita di 9,5 cm²
Ago per prelievo del sangueBecton, Dickinson and Company367283BD Vacutainer Ago Monouso per Prelievo di Sangue. Progettato con ago a doppia estremità, di cui una per la venipuntura e l'altra per il collegamento al portatacche e al tubo sottovuoto, consentendo il prelievo multiplo in più provette. Rivestito in silicone per ridurre al minimo il disagio del paziente durante l'inserimento.
Tubi per il prelievo del sangueBecton, Dickinson and Company367605Tubi per prelievo ematico evacuati BD Vacutainer. Tappi codificati con diversi colori indicano vari additivi, corrispondenti a specifici test di laboratorio.
Linea cellulare immortalizzata di microglia murina BV2Centro di Risorse Cellulari dell'Istituto di Biotecnologia di ShanghaiRRID: CVCL_0182Linea cellulare murina di microglia immortalizzata che esprime stabilmente marcatori specifici della microglia (Iba1, CD11b, F4/80). In seguito a stimolazione con LPS, le cellule BV2 secernono citochine pro-infiammatorie (IL-1β, IL-6, TNF-α) e accumulano ROS intracellulari, MDA per mimare l'attivazione infiammatoria microgliale in vivo dopo una lesione del midollo spinale. Le cellule vengono coltivate in DMEM ad alto contenuto di glucosio integrato con 10% di FBS e 1× penicillina-streptomicina, mantenuto a 37 °C con 5% CO2 incubatrice umidificata; passati al raggiungimento del 70%–80% di confluenza per evitare un'eccessiva attivazione.
Kit per il dosaggio del malondialdeide (MDA) cellulareNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-4-2Kit colorimetrico basato su micropiastre per la rilevazione quantitativa del malondialdeide cellulare, un marcatore della perossidazione lipidica. L'MDA reagisce con l'acido tiobarbiturico (TBA) in condizioni di riscaldamento formando addotti rossi; l'assorbanza viene rilevata a 532 nm mediante spettrofotometro per micropiastre. Ottimizzato per campioni di lisati cellulari, operazioni ad alto rendimento in piastre da 96 pozzetti, con un intervallo di quantificazione lineare che copre livelli da bassi a moderati di ossidazione lipidica nelle microglia.
CO2 incubatriceThermo Scientific3111CO₂ con giacca d'acqua umidificata2 incubatrice con volume interno di 184 L, CO₂ ad infrarossi2 sensore, sistema di filtrazione dell'aria HEPA per minimizzare la contaminazione microbica. Mantiene un ambiente di coltura stabile a 37 °C, 5% CO₂2 e umidità satura per la coltura cellulare aderente a lungo termine.
Kit per Saggio Genico del Reporter a Doppia LuciferasiBeyotime BiotechnologyRG028Questo kit a doppia luciferasi consente la rilevazione quantitativa sequenziale della luciferasi della lucciola e della luciferasi di Renilla nei lisati cellulari. Il segnale della luciferasi della lucciola viene innanzitutto misurato utilizzando il substrato luciferina; il successivo reagente di rilevazione per Renilla contiene un potente inibitore che elimina >99,9% di luminescenza residua della luciferasi di firefly, garantendo una lettura pura del segnale di Renilla con substrato coelenterazina. Il kit include un buffer specifico per la lisi cellulare, compatibile con luminometri per micropiastre a 96 pozzetti, per la lisi di cellule aderenti. Il reagente per la luciferasi di firefly è fornito in soluzione liquida pre-miscelata, pronta all'uso; i valori di luminescenza di firefly e Renilla vengono registrati in sequenza per calcolare l'attività luciferasica relativa normalizzata (rapporto Firefly/Renilla) per la validazione di bersagli ceRNA.
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11995065DMEM è un mezzo basale ampiamente utilizzato per sostenere la crescita di molti tipi diversi di cellule mammifere. Questa formulazione contiene glucosio ad alta concentrazione, L-glutammina, rosso fenolo e piruvato di sodio. Richiede un'integrazione, comunemente con il 10% di siero fetale bovino (FBS), e una concentrazione di CO₂ al 5%–10% CO2 ambiente per mantenere il pH fisiologico.
Siero fetale bovinoOGNI VERDE13011-8611FBS di grado premium, basso contenuto di endotossine, privo di micoplasmi & batteriofago negativo, aggiunto al DMEM al 10% v/v per supportare la crescita cellulare.
GraphPad Prism versione 9GraphPad Software, San Diego, CA, USANASoftware specializzato in grafica scientifica e analisi statistica per dati sperimentali di cellule in vitro. Tutti i valori grezzi di qPCR, ELISA, stress ossidativo e luminescenza dual-luciferasi con assorbanza sono stati importati in Prism 9 per verificare la normalità, effettuare confronti tra gruppi parametrici/non parametrici, generare tutte le figure quantitative e calcolare la media ± DS, valori P esatti e intervalli di confidenza al 95%, ed esportare figure ad alta risoluzione (300 dpi) conformi agli standard di pubblicazione delle riviste. I file sorgente originali del progetto .prism di tutti i grafici sono depositati nel repository pubblico dei dati, come richiesto.
IBM SPSS Statistics Versione 26.0IBM Corporation, Armonk, NY, USANAPacchetto statistico completo utilizzato per l'ordinamento dei dati basali dei campioni clinici, il test di normalità (test di Shapiro-Wilk), il test t indipendente/non appaiato, l'ANOVA a un fattore con correzione di Tukey’correzione per confronti multipli, test non parametrico U di Mann-Whitney e calcolo di valori P esatti e intervalli di confidenza al 95% per tutti i dati quantitativi umani e cellulari. Tutti i dati demografici e di laboratorio dei pazienti clinici sono stati elaborati e analizzati all'interno di questa piattaforma.
IL-1β SimpleStep ELISA KitAbcamab255730Questo kit ELISA colorimetrico sandwich con un solo lavaggio adotta la tecnologia proprietaria SimpleStep, completando l'intera procedura di rilevamento in 90 minuti. Misura quantitativamente l'interleuchina-1 di rattoβ nei campioni di supernatante di coltura cellulare, siero e plasma con EDTA/citrato/eeparina. La sensibilità di rilevamento raggiunge 26,58 pg/mL, con un intervallo di quantificazione lineare di 54,69–3500 pg/mL. È inclusa una micropiattaforma in striscia da 8 pozzetti rimovibili pre-ricoperta. I segnali di assorbanza vengono rilevati a 450 nm mediante lettore per micropiastre per calcolare l'IL-1β concentrazione
Kit ELISA SimpleStep per IL-6Abcamab234570Kit colorimetrico ELISA sandwich SimpleStep ottimizzato per la rilevazione quantitativa dell'interleuchina-6 (IL-6) di ratto in campioni di supernatante di coltura cellulare, siero e plasma con citrato/EDTA/eeparina. Adotta un protocollo con un'unica fase di incubazione e un singolo lavaggio, riducendo il tempo totale del saggio a 90 minuti, con una sensibilità di rilevamento di 43 pg/mL e un intervallo di quantificazione lineare compreso tra 125 pg/mL e 8000 pg/mL. Il kit include una micropiastra in strisce da 8 pozzetti pre-rivestiti e divisibili; i valori di assorbanza vengono letti a 450 nm mediante spettrofotometro per micropiastre per il calcolo finale della concentrazione di IL-6.
Piastra LightCycler Multiwell da 96 pozzetti, biancaRoche LifeScience, Svizzera4729692001Piastre di reazione bianche in polipropilene a 96 pozzetti con bordo parziale, appositamente ottimizzate per l'utilizzo con lo strumento di PCR in tempo reale LightCycler 96. Le pareti bianche dei pozzetti riducono l'interferenza della fluorescenza di fondo e potenziano la riflessione del segnale, migliorando la sensibilità di rilevamento per trascritti a bassa abbondanza. Il design uniforme a pareti sottili garantisce una conduttività termica costante in tutti i pozzetti, ed è compatibile con volumi di reazione compresi tra 10 e 50 μL. Privi di DNasi/RNasi e privi di pirrogeni per saggi di amplificazione di cDNA derivato da RNA.
Reagente per trasfezione LipofectamineTM 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Il reagente per la trasfezione con nanoparticelle lipidiche abbinato all'Enhancer P3000 consente una trasfezione ad alta efficienza di siRNA/plasmidi nelle microglia BV2 con bassa citotossicità.
Kit per la Sintesi del cDNA del Primo Filamento di lncRNA lnRcute lncRNATIANGENKR202-02Questo kit è stato appositamente ottimizzato per la trascrizione inversa di RNA non codificanti lunghi (lncRNA) a bassa abbondanza, con contenuto variabile di GC e strutture secondarie complesse. Contiene un buffer indipendente per l'eliminazione del DNA genomico (gDNA) al fine di rimuovere la contaminazione da DNA genomico prima della trascrizione inversa, nonché una miscela specifica di primer lnR-RT per arricchire i templati di lncRNA a lunghezza intera. La trascrittasi inversa modificata consente una sintesi efficiente di cDNA a filamento lungo a partire da RNA totale in quantità comprese tra 10 ng e 2 ng.
Kit di rilevamento lnRcute per lncRNA con qPCR (SYBR Green)TIANGENFP402Un premix dedicato per PCR quantitativa basato su SYBR Green per la quantificazione di lncRNA. La DNA polimerasi con attivazione termica mediata da anticorpo garantisce un'elevata specificità di amplificazione; i componenti H-competitor riducono l'interferenza dovuta alla struttura secondaria dei templati di lncRNA ricchi in GC. Compatibile con il cDNA generato dal kit di trascrizione inversa lnRcute per lncRNA e adatto alla quantificazione dell'espressione relativa di lncRNA a bassa abbondanza.
oligonucleotidi miR-145-5pGeneralbiol (Wuhan, Cina)NAMimetico sintetico di miR-145-5p, inibitore e oligonucleotidi di controllo negativo corrispondenti, utilizzati per modulare l'attività di miR-145-5p in cellule BV2. Utilizzati in saggi di espressione, infiammazione, stress ossidativo e saggi reporter dual-luciferasi.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA KitTIANGENKR211-02Adotta una reazione combinata in un unico tubo di poliadenilazione e trascrizione inversa per semplificare il flusso di lavoro sperimentale. La miscela enzimatica contiene poli(A) polimerasi da E. coli, trascrittasi inversa priva di attività RNasi H e inibitore delle RNasi, che riconosce specificamente il miRNA maturo a singolo filamento ed evita interferenze nell'amplificazione da parte del pre-miRNA con strutture a forcina. Adatto per miRNA estratto da lisati cellulari, plasma e campioni di tessuto.
Kit di rilevamento miRcute Plus per qPCR di miRNA (SYBR Green)TIANGENFP411Premix di SYBR Green ottimizzato per la quantificazione di miRNA maturi, perfettamente abbinato ai prodotti di trascrizione inversa miRcute. Il sistema tampone migliora l'efficienza di appaiamento dei primer per gli ampliconi brevi di miRNA, garantendo segnali fluorescenti stabili e un'elevata sensibilità nella rilevazione di miRNA espressi a livelli bassi. L'RNA snU6 è comunemente utilizzato come riferimento interno per la normalizzazione.
Soluzione di Penicillina-Streptomicina (100×)Beyotime BiotechnologyC0222Miscela filtrata sterile contenente 10.000 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina; diluizione di lavoro 1:100 nel mezzo di coltura per prevenire contaminazioni batteriche.
Kit per Saggio di Specie Reattive dell'Ossigeno con DiluenteBeyotime BiotechnologyS0034MQuesto kit utilizza la sonda fluorescente DCFH-DA per quantificare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) intracellulari. La DCFH-DA attraversa la membrana cellulare e viene idrolizzata dall'esterasi intracellulare in DCFH, che viene ossidata dai ROS per generare la DCF fluorescente. Compatibile con piastre microtitolazione a 96 pozzetti e lettore fluorimetrico per piastre, consente rilevazioni ad alto rendimento (Es = 488 nm, Em = 525 nm). Fornito con un diluente specifico per la sonda e il reagente di controllo positivo Rosup per stabilizzare i segnali di colorazione, è adatto al rilevamento dello stress ossidativo nei microglia BV2 aderenti senza lisare le cellule.
Kit per il Dosaggio del Glutatione Ridotto (GSH)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA006-1-2Kit colorimetrico in micropiastre per la rilevazione del glutatione ridotto (GSH), l'antiossidante intracellulare principale. Il GSH reagisce con l'acido ditionitrobenzoico (DTNB) per produrre un composto cromogeno giallo, la cui assorbanza viene misurata a 405 nm su un lettore di micropiastre. Il kit adatta un protocollo standard in provetta alla rilevazione ad alto rendimento in micropiastre da 96 pozzetti per l'analisi degli antiossidanti in lisati cellulari.
si-LINC00707GenePharma (Shanghai, Cina)NARNA interferente corto progettato per ridurre l'espressione di LINC00707 in cellule BV2. Utilizzato in esperimenti di perdita di funzione per valutare gli effetti del silenziamento di LINC00707 sulle risposte infiammatorie, sullo stress ossidativo, sull'espressione di miR-145-5p e sull'espressione di TRAF6.
si-LINC00707 NCGenePharma (Shanghai, Cina)NARNA interferente corto non mirato utilizzato come controllo negativo per la trasfezione di si-LINC00707. Utilizzato per controllare gli effetti non specifici della procedura di trasfezione e dell'esposizione all'RNA interferente.
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)TIANGEN4992777Premix universale per PCR quantitativa con SYBR Green per la quantificazione relativa di mRNA, contenente Taq polimerasi con attivazione termica (hot-start), dNTP, SYBR Green I e colorante di riferimento ROX per la normalizzazione della fluorescenza. Amplificazione non specifica ridotta, efficienza di amplificazione stabile, ampiamente utilizzato per la quantificazione di geni bersaglio mRNA (TRAF6, GAPDH ecc.).
Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8 centrifuga da banco piccolaThermo Scientific75200709La scelta classica per i laboratori clinici, in grado di gestire fino a 24 × Tubi per la raccolta del sangue da 5/7 mL contemporaneamente. La serie R è una versione refrigerata, in grado di proteggere meglio i campioni che richiedono una centrifugazione a bassa temperatura.
Kit per la Sintesi del cDNA di Primo Filamento TIANScript IITIANGENGKR107-02Progettato per la trascrizione inversa di mRNA in generale, per generare cDNA di lunghezza fino a 12 kb. Dotato sia di primer Oligo (dT) 15 che di esameri casuali, per strategie di innesco flessibili. La trascrittasi inversa M-MLV modificata legge efficacemente attraverso strutture secondarie complesse e regioni ricche di GC nell'mRNA, con ampia compatibilità per l'amplificazione successiva mediante qPCR dell'mRNA.
TNF-α SimpleStep ELISA KitAbcamab236712Un kit ELISA sandwich SimpleStep con un solo lavaggio rapido ottimizzato per la rilevazione quantitativa del fattore di necrosi tumorale di rattoα (TNF-α) nel supernatante di colture cellulari, siero e diverse specie di plasma. La durata totale del saggio è di 90 minuti, con un'ultra-elevata sensibilità di 1,04 pg/mL e un intervallo di rilevamento lineare compreso tra 15,63 pg/mL e 1000 pg/mL. Dotato di un modulo staccabile da 8×piatto pre-ricoperto a 12 pozzetti; i valori di DO a 450 nm vengono registrati per il TNF finaleα calcolo quantitativo
Kit per il dosaggio della superossido dismutasi totale (T-SOD)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-3-2Kit cromogenico per micropiastre WST-1 per la rilevazione dell'attività enzimatica totale della SOD. La SOD elimina i radicali anionici superossido e inibisce la reazione di riduzione del WST-1. L'assorbanza viene registrata a 450 nm mediante lettore per micropiastre per il calcolo dell'attività. Adatto per omogenati cellulari, sieri e campioni tissutali, con sviluppo del colore stabile e alta ripetibilità, per la valutazione della capacità antiossidante.
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596018Reagente monofasico di fenolo-guanidina isotiocianato per l'isolamento in un unico passaggio di RNA totale da cellule di microglia in coltura; estrae contemporaneamente DNA e proteine dagli stessi campioni.

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