Articolo metodologico

Dissezione di Aedes albopictus ed estrazione di RNA totale dai tessuti post-dissezione

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DOI:

10.3791/72811

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30 ottobre 2026

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

In questo studio viene presentato un protocollo per la dissezione del midgut, delle ovaie e delle ghiandole salivari di Aedes albopictus, seguito dall'estrazione di RNA totale per la caratterizzazione molecolare dei tessuti vettoriali in studi sulla trasmissione di virus trasmessi da zanzare.

Abstract

Nel luglio 2025 a Foshan, nella provincia del Guangdong, in Cina, si è verificato un focolaio di febbre dengue e chikungunya. Ae. albopictus è un vettore principale di questi virus. Questo protocollo descrive un metodo semplice e standardizzato per dissezionare l'intestino medio, le ghiandole salivari e le ovaie di Ae. albopictus ed estrarre l'RNA totale dai tessuti isolati. Zanzare femmine non alimentate con sangue, di tre giorni di vita, sono state anestetizzate mediante congelamento a −20 °C per 2 minuti, dopo di che i tessuti di interesse sono stati dissezionati. L'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit per l'estrazione di RNA da tessuti, quantificato mediante uno spettrofotometro a microvolume ed impiegato per l'analisi di reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). I risultati mostrano che il metodo di dissezione separa rapidamente e completamente i tessuti e che l'RNA ottenuto dai tessuti separati può raggiungere una purezza relativamente elevata. L'RT-qPCR ha evidenziato i profili di espressione e la stabilità relativa di tre geni di riferimento (GAPDH, β-actin e RPS6). Il metodo è semplice, validato e fornisce un supporto tecnico standardizzato per ricerche correlate ad Ae. albopictus.

Introduzione

Aedes albopictus (Ae. albopictus) è un vettore di diversi patogeni, tra cui il virus della dengue (DENV) e il virus della chikungunya (CHIKV)1,2,3. È ampiamente diffuso e ha causato focolai di malattie trasmesse da zanzare in numerose regioni4,5. La capacità di Ae. albopictus di trasmettere patogeni, nota come competenza vettoriale, varia tra le popolazioni ed è associata all'espressione genica specifica in midgut, ovaie e ghiandole salivari6. Comprendere la struttura di questi tessuti ed estrarre RNA di alta qualità sono passaggi fondamentali per studiare la replicazione, la disseminazione e la trasmissione dei virus trasmessi dai vettori7.

Il rilevamento dell'espressione genica relativa mediante PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) dipende dalla precisa dissezione dei tessuti di Ae. albopictus e dall'estrazione di RNA di alta qualità8,9. Ad oggi, i protocolli video pubblicati per la dissezione del midgut, delle ovaie e delle ghiandole salivari si sono concentrati principalmente su Aedes aegypti10. Pertanto, questo protocollo illustra la dissezione del midgut, delle ovaie e delle ghiandole salivari di Ae. albopictus, in cui i tessuti dissezionati vengono posti direttamente in provette contenenti soluzione di conservazione dell'RNA, evitando passaggi di trasferimento e minimizzando le perdite. L'RNA totale viene estratto dai tessuti dissezionati mediante un metodo basato su colonne, che richiede meno operazioni e meno tempo rispetto al metodo tradizionale con TRIzol11. Questa estrazione fornisce tipicamente da 0,1 a 0,3 µg di RNA totale dalle ghiandole salivari di cinque esemplari di Ae. albopictus, con rapporti A260/A280 compresi tra 1,8 e 2,0, soddisfacendo i requisiti di purezza necessari per successivi RT-qPCR. Viene eseguita una RT-qPCR per misurare l'espressione di tre geni di riferimento nei tessuti di Ae. albopictus, valutando così la qualità dell'RNA estratto da ciascun tessuto.

Va notato che questo protocollo è stato convalidato soltanto per il midgut, le ovaie e le ghiandole salivari di femmine di Ae. albopictus non pasciute di sangue e di 3 giorni di età, e non è adatto all'estrazione di RNA dal corpo adiposo. Ottenere tessuti intatti e individuali rappresenta la base per le analisi successive. Attraverso la dissezione sistematica dei tessuti di Ae. albopictus ed un'estrazione di RNA di alta qualità, questo protocollo fornisce supporto tecnico per la successiva rilevazione dell'espressione genica, la valutazione della competenza vettoriale a livello di popolazione e il controllo della trasmissione degli arbovirus.

Protocollo

In questo studio sono stati utilizzati esclusivamente zanzare  Ae. albopictus  allevate in laboratorio. Di conseguenza, non è stato richiesto l'approvazione etica istituzionale per questo studio. La ceppa di  Ae. albopictus  utilizzata nell'esperimento è stata fornita dal Laboratorio Chiave per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie Parassitarie della Commissione Nazionale per la Salute della Cina (Jiangsu). Questa colonia è stata originariamente raccolta nella città di Wuxi negli anni '80 ed è stata mantenuta presso l'Allevamento Insetti dell' Istituto di Jiangsu per le Malattie Parassitarie  in condizioni standard. La colonia di zanzare è stata ospitata in una camera climatica artificiale a 25 °C ± 1 °C, umidità relativa del 75% ± 5%, con un fotoperiodo di 10 ore di luce e 14 ore di buio. I larvi sono stati allevati in acqua ultrapura e nutriti con una miscela di polvere di fegato di maiale ed estratto di lievito (Shanghai Brewery) in rapporto 2:1. Gli adulti sono stati mantenuti con una soluzione di glucosio al 5%. I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparazione delle soluzioni
    1. Preparazione del tampone PBS 1x: pesare 8,0 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4. Sciogliere in 800 mL di acqua ultrapura sotto agitazione. Regolare il pH a 7,4. Portare il volume finale a 1 L. Autoclavare a 121 °C per 20 min.
    2. Preparazione della soluzione di DEPC: aggiungere 1 mL di soluzione madre di DEPC a 1 L di acqua ultrapura. Mescolare energeticamente con un agitatore magnetico per 12–16 h. Autoclavare a 121 °C per 20 min.
      ATTENZIONE: L'DEPC è altamente tossico e cancerogeno. Indossare guanti e occhiali di protezione ed eseguire le operazioni in una cappa aspirante.
      NOTA: Coprire il becher con della carta stagnola durante l'agitazione vigorosa. Aliquotare la soluzione di DEPC e conservarla a -20 °C per un periodo fino a 6 mesi.
  2. Preparazione dei materiali monouso
    1. Sterilizzare gli strumenti di dissezione: posizionare gli aghi da dissezione da 1 mm e le pinzette a punta fine in un contenitore di alluminio e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 20 min.
    2. Preparare provette da 2 mL per macinazione contenenti microsfere di silice di 0,5–1,0 mm. Posizionarle in un contenitore di alluminio e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 20 min.
    3. Aggiungere 200 µL della soluzione di conservazione dell'RNA fornita con il kit in ogni tubo di macinazione.
      NOTA: La qualità dell'RNA nei tessuti diminuisce significativamente entro 1 minuto dal prelievo dall'organismo. Preparare in anticipo i tubi per la macinazione con soluzione di conservazione.

2. Raccolta di Ae. albopictus

NOTA: Indossare camici da laboratorio bianchi e guanti. Non indossare abiti scuri, poiché i colori scuri attirano le zanzare.

  1. Chiudere tutte le porte, finestre e sistemi di ventilazione nella stanza contenente la gabbia per zanzare per evitare la fuga di Ae. albopictus.
  2. Accendere l'aspiratore elettrico e inserirlo nella gabbia per zanzare. Orientare l'aspiratore verso le Ae. albopictus appoggiate sulle pareti interne della gabbia e raccogliere le zanzare.
  3. Mantenere l'aspiratore acceso mentre lo si estrae lentamente dalla gabbia. Sigillare immediatamente la gabbia e chiudere il coperchio dell'aspiratore.
  4. Rimuovere la camera di raccolta e posizionarla a -20 °C per 2 min per l'immobilizzazione a freddo delle Ae. albopictus.
  5. Posizionare una capsula di Petri di vetro da 10 cm sul ghiaccio per il pre-raffreddamento. Trasferire le Ae. albopictus immobilizzate dalla camera di raccolta alla capsula di vetro.
    NOTA: Controllare rigorosamente il tempo di immobilizzazione a freddo per prevenire danni ai tessuti.

3. Identificazione di femmine di Ae. albopictus prima della dissezione

  1. Selezionare esemplari morfologicamente integri di Ae. albopictus, anestetizzati a freddo, dalla capsula di vetro e trasferirli su un vetrino. Esaminare al microscopio stereoscopico con un ingrandimento di 80x.
  2. Individuare la striatura longitudinale bianca sul mesonoto.
  3. Confermare la presenza di fasce bianche alla base dei segmenti tarsali e alla base dei tergiti addominali II-VI12.
  4. Esaminare le antenne con un ingrandimento di 80x. Distinguere le antenne filiformi (femmina) dalle antenne piumose (maschio) per identificare le femmine.

4. Dissezione addominale di Ae. albopictus

  1. Posizionare tre gocce di PBS sterile 1x da sinistra a destra su un vetrino sterilizzato, con ciascuna goccia approssimativamente 20 µL in volume e distanziati circa 5 mm l'uno dall'altro.
    NOTA: Le gocce di PBS devono essere abbastanza grandi da immergere completamente l'intero Ae. albopictus.
  2. Usare pinze fini per afferrare le ali di Ae. albopictus e posizionare la zanzara nella goccia di PBS più a sinistra.
  3. Orientare Ae. albopictus con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Utilizzare la mano sinistra per tenere un ago da dissezione e premere sul secondo segmento addominale per immobilizzare l'animale Ae. albopictus.
  4. Utilizzare la mano destra per inserire un ago da dissezione di 1 mm nel punto medio del sesto segmento addominale. Eseguire un'incisione trasversale, semicircolare per aprire la cavità addominale.
  5. Spostare l'ago da dissezione tenuto nella mano destra di circa 2 mm in direzione posteriore e premere sulla regione mediana dei segmenti addominali VI–VIII per fissare l'addome.
    NOTA: Le ovaie sono localizzate dorsalmente nei segmenti addominali II-VI. Non muovere l'ago in modo casuale durante la pressione sui segmenti VI-VIII per evitare di danneggiare la morfologia integra delle ovaie.
  6. Utilizzare la mano sinistra per afferrare il secondo segmento addominale con l'ago da dissezione e tirare delicatamente verso l'esterno per separare l'addome al sesto segmento. Durante la separazione, stomodeo, mesentero e tubuli di Malpighi saranno completamente esposti.
    NOTA: I tubuli di Malpighi sono bianchi e sottili. L'intestino medio è semitrasparente e fusiforme.
  7. Separare l'intestino medio dal proctodeo e dal metenterone. Sciacquare l'intestino medio nella goccia centrale di PBS due volte.
  8. Trasferirlo in un tubo da macinazione contenente 200 µL della soluzione di conservazione dell'RNA fornita nel kit commerciale di estrazione dell'RNA.
  9. Premere con l'ago da dissezione sulla metà dell'ottavo segmento addominale per esporre le ovaie a coppie su entrambi i lati. Rimuovere le ovaie, lavarle due volte nella goccia centrale di PBS e trasferirle in un tubo da frantumazione contenente 200 µL Soluzione per la conservazione dell'RNA.
    NOTA: Le ovaie appaiate sono simmetriche, di forma simile a un chicco di riso e di colore bianco-latteo. Manipolarle con cura per garantire l'integrità strutturale delle ovaie durante il prelievo.

5. Dissezione delle ghiandole salivari di Ae. albopictus

  1. Aumentare l'ingrandimento del microscopio a 400x. Trasferire l'Ae. albopictus con l'addome dissezionato nella goccia di PBS più a destra.
  2. Esercitare una leggera pressione sul mesotorace con l'ago da dissezione della mano sinistra finché la testa non si solleva leggermente.
  3. Utilizzare la mano destra per sollevare la testa a livello del collo con l'ago da dissezione e tirare lentamente verso l'esterno. Osservare le ghiandole salivari (struttura trilobata) mentre si staccano dal torace insieme alla testa.
    NOTA: Le ghiandole salivari si trovano nel torace anteriore e sono collegate alla testa tramite il dotto salivare. Applicando una pressione costante sul torace si evita la rottura del dotto salivare e si permette alle ghiandole salivari di staccarsi dal torace insieme alla testa in modo integro. Il controllo della forza in questo passaggio richiede pratica ripetuta.
  4. Separare le ghiandole salivari dalla testa. Lavare due volte nella goccia centrale di PBS e trasferirle in un tubo da omogeneizzazione preparato.
    NOTA: Le ghiandole salivari hanno dimensioni di circa 1 mm. Trasferirle in un tubo da omogeneizzazione contenente 200 µL di soluzione per la conservazione dell'RNA ed esaminare alla luce bianca per confermare la presenza di piccoli puntini bianchi in sospensione nella soluzione.

6. Estrazione dell'RNA da Ae. albopictus e dalle sue ghiandole salivari, ovaie e midgut

NOTA: tutti i passaggi di estrazione dell'RNA sono stati eseguiti seguendo le istruzioni del produttore del kit commerciale per l'estrazione dell'RNA da tessuto, senza modifiche.

  1. Raffreddare preventivamente il macinatore di tessuti a 4 °C. Impostare i parametri su 30 Hz, 30 s di tempo di macinazione, 10 cicli e 8 s di pausa.
  2. Posizionare i tubi di macinazione contenenti i campioni di tessuto nel macinatore ed eseguire il programma.
    NOTA: dopo la macinazione, verificare se il tessuto è completamente disperso nella soluzione di conservazione dell'RNA. Se la macinazione non è completa, eseguire altri 5 cicli.
  3. Trasferire l'omogenato in un tubo da centrifuga sterile da 1,5 mL. Centrifugare a 12.000 x g a 4 °C per 5 minuti.
  4. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo da centrifuga sterile da 1,5 mL. Aggiungere 30 µL di cloroformio.
    ATTENZIONE: il cloroformio è tossico e cancerogeno. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e manipolarlo sotto cappa aspirante.
  5. Vortexare energeticamente per 20 s. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi centrifugare a 12.000 x g a 4 °C per 15 minuti.
    NOTA: aspirare con attenzione la fase acquosa superiore, evitando lo strato bianco intermedio per prevenire contaminazioni proteiche.
  6. Trasferire la fase acquosa superiore in un nuovo tubo da centrifuga sterile da 1,5 mL. Aggiungere 75 µL di isopropanolo.
  7. Mescolare per inversione e trasferire l'intera miscela su una colonna in silice per centrifuga. Centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto.
  8. Aggiungere 600 µL di soluzione di lavaggio sulla colonna. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso passante.
  9. Aggiungere 600 µL di etanolo al 70% sulla colonna. Centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso passante. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta, per un totale di due lavaggi.
  10. Aggiungere 30 µL di acqua DEPC al centro della membrana della colonna. Incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
  11. Posizionare la colonna in un tubo da centrifuga sterile da 1,5 mL. Centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA.
  12. Prelevare 1 µL dell'RNA eluito e misurare la concentrazione e la purezza utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.

7. Trascrizione inversa dell'RNA

  1. Preparazione del sistema di reazione
    1. Scongelare su ghiaccio il master mix per la trascrizione inversa 4x, l'acqua priva di nucleasi e il template di RNA.
    2. In una provetta PCR da 200 µL, preparare un sistema di reazione da 20 µL aggiungendo 5 µL di master mix per la trascrizione inversa 4x, 10 µL di template di RNA totale e 5 µL di acqua priva di nucleasi.
    3. Centrifugare brevemente a 1.000 x g per 1 min per raccogliere la miscela di reazione sul fondo della provetta.
    4. Posizionare la provetta PCR in un termociclatore ed eseguire il programma di trascrizione inversa: 50 °C per 5 min; 85 °C per 5 s.
      NOTA: diluire il prodotto della trascrizione inversa 20 volte prima dell'uso per ridurre l'effetto di eventuali inibitori sulla RT-qPCR.

8. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

  1. Preparazione del sistema di reazione per RT-qPCR
    1. Scongelare sulla ghiacciaia la miscela master 2x SYBR Green qPCR, il template di cDNA e i primer forward e reverse a 10 µM, proteggendo il tutto dalla luce per tutta la durata dell'operazione.
    2. In una piastra PCR a 96 pozzetti, preparare un sistema di reazione da 20 µL per pozzetto aggiungendo 10 µL di miscela master 2x SYBR Green qPCR, 0,8 µL ciascuno di primer forward e reverse a 10 µM (concentrazione finale 400 nM), 2 µL di template di cDNA diluito 20 volte e 6,4 µL di acqua priva di nucleasi.
    3. Sigillare la piastra a 96 pozzetti con un film adesivo ottico, assicurandosi che tutti i pozzetti siano completamente sigillati.
    4. Centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto per raccogliere la miscela di reazione sul fondo dei pozzetti.
    5. Posizionare la piastra PCR in un sistema di rilevamento PCR in tempo reale ed eseguire il programma di termociclaggio.
      NOTA: Programma di termociclaggio: pre-denaturazione a 95 °C per 30 s (1 ciclo); amplificazione: 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s (40 cicli); analisi della curva di fusione: 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min, rampa fino a 95 °C a 0,15 °C/s. Ogni campione di RNA tessutale viene sottoposto a qPCR in quadruplicate tecnica. Ogni campione tessutale è costituito da tessuti pooled provenienti da 5 Ae. albopictus. Le sequenze di primer utilizzate per la RT-qPCR sono elencate in Tabella 1.
  2. Analisi dei dati
    1. Esaminare la curva di fusione per ogni coppia di primer per confermare la presenza di un singolo picco di dissociazione ben definito.
    2. Esportare i valori di Ct dal software dello strumento. La rappresentazione grafica e l'analisi dei dati vengono effettuate utilizzando software statistici e grafici.
Nome dei primerSequenze dei primer (5'-3')
Ae. albopictus βPrimer diretto per -actin GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus βPrimer inverso di -actinTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus Primer inverso di GAPDHCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus Primer inverso di GAPDHTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus Primer RPS6 ForwardACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6, primer inversoCTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

Tabella 1: Sequenze dei primer di Ae. albopictus utilizzate nella RT-qPCR.

Risultati

Questo studio comprende due parti: la dissezione di Ae. albopictus e l'estrazione dell'RNA dai tessuti ottenuti dopo la dissezione. Il flusso di lavoro complessivo è mostrato in Figura 1, dove Figura 1A illustra la dissezione di Ae. albopictus e Figura 1B illustra l'estrazione dell'RNA e la successiva rilevazione dei livelli di espressione dei geni di riferimento.

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Figura 1: Schema della dissezione di Ae. albopictus ed estrazione totale di RNA dai tessuti dopo la dissezione. (A) Raccolta, anestesia e dissezione di Ae. albopictus. (B) Estrazione di RNA dai tessuti post-dissezione, identificazione della purezza e rilevamento dei livelli di espressione dei geni di riferimento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Cinque esemplari di Ae. albopictus allevati in laboratorio sono stati dissezionati per isolare l'intestino medio, le ghiandole salivari e le ovaie. Con un ingrandimento di 80×, il proventricolo trasparente, l'intestino medio e il retto dell'Ae. albopictus erano chiaramente visibili, con le ovaie di aspetto granulare posizionate su entrambi i lati e ricoperte dai tubuli di Malpighi di colore bianco (Figura 2A). Quando l'ingrandimento è stato regolato a 400×, le ghiandole salivari traslucide dell'Ae. albopictus sono diventate chiaramente osservabili (Figura 2B). Figure 2C,D illustrano  i tessuti isolati di intestino medio e ovaie. I risultati hanno indicato che i tessuti isolati mediante questo metodo di dissezione hanno mantenuto la loro integrità strutturale, aspetto essenziale per l'estrazione successiva di RNA totale dai campioni post-dissecazione.

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Figura 2: Analisi post-dissezione dei tessuti di Ae. albopictus. (A) Tessuti isolati dall'addome di Ae. albopictus. (B) Ghiandole salivari traslucide e trilobate di Ae. albopictus. (C) Foregut e midgut di Ae. albopictus. (D) Ovaie a forma di chicco di riso di Ae. albopictus. I: foregut; II: midgut; III: hindgut; IV: tubuli di Malpighi; V: ovaie. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'RNA totale è stato estratto da tessuti dissecati di Ae. albopictus. I campioni di tessuto (ghiandole salivari, midgut e ovaie) sono stati completamente macinati prima dell'estrazione. Le concentrazioni di RNA variavano a seconda del tipo di tessuto: le ghiandole salivari presentavano un valore di 7,8 ng/µL, mentre midgut, ovaie e omogenati di intero corpo di femmine di Ae. albopictus mostravano valori rispettivamente di 55,3, 45,7 e 42,7 ng/µL. Tutti i campioni hanno mostrato un'elevata purezza, con rapporti A260/A280 compresi tra 1,87 e 2,10 e rapporti A260/A230 compresi tra 1,73 e 2,13 (Tabella 2). I livelli di espressione di tre geni di riferimento candidati (GAPDH, β-actin e RPS6) sono stati valutati mediante RT-qPCR in tutti i tessuti. Sebbene la loro espressione variasse leggermente in funzione della concentrazione di RNA, tutti e tre i geni sono risultati relativamente stabili in diversi tipi di tessuto (Figura 3). GAPDH, β-actin e RPS6 sono adatti come geni di riferimento stabili per la normalizzazione dell'espressione genica in diversi tessuti di Ae. albopictus.

TessutoNumero di campioniConc. di RNA (ng/μL)A260/A280A260/A230
Ghiandola salivare57,81,871,73
Midgut555,31,941,98
Ovaio545,72,102,13
Femmina142,72,041,92

Tabella 2: Concentrazione e purezza dell'RNA estratto da tessuti di Ae. albopictus.

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Figura 3: Valori di Ct dei geni di riferimento (GAPDH, β-actin e RPS6) rilevati mediante RT-qPCR. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Ae. albopictus è ampiamente diffuso nelle regioni temperate, subtropicali e tropicali di tutti i continenti, ad eccezione dell'Antartide13,14. In quanto importante vettore di arbovirus come il virus del dengue (DENV), il virus Zika (ZIKV) e il virus chikungunya (CHIKV), ha ripetutamente causato focolai di malattie trasmesse da zanzare nella provincia di Guangdong, in Cina15.

Per facilitare la ricerca sui virus associati ad Ae. albopictus e sulla loro trasmissione, abbiamo sviluppato un metodo semplice per la dissezione dei tessuti di Ae. albopictus. Nei protocolli convenzionali di dissezione, quando la testa viene separata dal torace durante l'isolamento delle ghiandole salivari, queste ultime possono rimanere attaccate al torace o alla testa a seconda della forza applicata; poiché le ghiandole salivari hanno dimensioni di circa 1 mm, risulta difficile localizzarle all'interno del torace16. Questo metodo si basa sui protocolli standard di isolamento degli organi delle zanzare e ottimizza la separazione delle ghiandole salivari situate al di sotto degli stinchi prostatici e mesosterniti, che devono essere osservate a un ingrandimento di 400×17. Per effettuare la dissezione, premere delicatamente sul mesotorace con un ago mentre con un secondo ago si esercita una pressione che separa la testa, consentendo alle ghiandole salivari di staccarsi intatte. Questo approccio evita la necessità di cercare le ghiandole salivari all'interno del torace, previene contaminazioni e danni alle ghiandole e riduce il tempo complessivo di dissezione. Le ovaie si trovano nelle vicinanze dei segmenti addominali VI–VIII e vengono preservate iniziando la dissezione dal sesto segmento addominale ed estraendo con attenzione l'intestino medio, i tubuli di Malpighi e le ovaie dall'addome18. Questo metodo consente di ottenere ghiandole salivari integre, ovaie con forma tipica e prive di aderenze, e un intestino medio intatto (Figura 2). Questa tecnica di dissezione fornisce indicazioni preziose per gli studi su Ae. albopictus e sulla replicazione, diffusione e trasmissione dei virus trasmessi da vettori.

L'estrazione di RNA dai tessuti di Ae. albopictus è fondamentale per la rilevazione di virus trasmessi dalle zanzare. Il metodo tradizionale con TRIzol è lungo e tecnico, ma in genere fornisce rese elevate di RNA e può produrre RNA di alta qualità se eseguito correttamente. Al contrario, il metodo basato su colonne offre una migliore riproducibilità ed è più semplice da eseguire, ma può determinare un recupero inferiore di RNA e presenta un'efficienza ridotta quando applicato al corpo grasso19,20. In questo studio, i tessuti dissezionati sono stati immediatamente conservati in un stabilizzatore per acidi nucleici, macinati accuratamente ed elaborati mediante il metodo della colonna a centrifugazione per estrarre l'RNA necessario alla sintesi di cDNA21. Per garantire una corretta normalizzazione dei dati di RT-qPCR nonostante le variazioni nella qualità del cDNA, sono necessari geni di riferimento stabili22. Sebbene siano già stati stabiliti geni di riferimento per diverse fasi di sviluppo di Ae. albopictus, i geni di riferimento specifici per tessuto richiedono ulteriori conferme23,24. L'analisi RT-qPCR dell'RNA retrotrascritto proveniente da tutti i tessuti dissezionati ha mostrato un'amplificazione costante di GAPDH, β-actin e RPS6, confermando che la qualità dell'RNA ottenuta con questo protocollo di dissezione è sufficiente a supportare studi successivi sull'espressione genica specifica per tessuto in Ae. albopictus.

Durante la dissezione dei tessuti di Ae. albopictus con questo protocollo, può occasionalmente verificarsi il mancato distacco delle ghiandole salivari insieme alla testa. Ciò è solitamente causato da una pressione insufficiente applicata al torace combinata a una separazione eccessivamente rapida della testa. Per risolvere il problema, applicare una pressione costante sul mesotorace e tirare lentamente la testa verso l’esterno, consentendo alle ghiandole salivari di staccarsi integre insieme alla testa. Quando si trasferiscono le ghiandole salivari in un tubo da triturazione contenente soluzione di conservazione dell’RNA, esaminare attentamente la soluzione contro una fonte luminosa alla ricerca di piccole particelle bianche galleggianti. Se le ghiandole salivari non vengono individuate nel tubo, verificare immediatamente se sono ancora attaccate all’ago da dissezione. Durante l’estrazione dell’RNA, seguire rigorosamente il protocollo fornito dal produttore del kit. Se la concentrazione di RNA ottenuta è bassa, è possibile effettuare una seconda eluizione con il buffer di eluizione. Nella RT-qPCR, possono apparire picchi multipli nella curva di fusione; in tal caso, verificare innanzitutto la specificità dei primer. Se i valori di Ct sono elevati, regolare la temperatura di annealing del programma in base alla temperatura di fusione dei primer. In generale, la temperatura di annealing nel programma deve essere impostata 1–2 °C al di sotto della temperatura di fusione dei primer25.

Questo studio presenta alcuni limiti. L'ambito del campione è relativamente ristretto, in quanto si concentra esclusivamente sul midgut, sulle ghiandole salivari e sui tessuti ovarici, senza indagare altri tessuti come i tubuli di Malpighi e il corpo adiposo26. Inoltre, l'analisi si è limitata a zanzare femmine allevate in laboratorio di 3 giorni di età, escludendo individui alimentati con sangue o infetti da virus27. Futuri miglioramenti dovrebbero prevedere l'ampliamento dell'ambito campionario includendo tessuti come i tubuli di Malpighi e considerando individui di Ae. albopictus in diversi stati fisiologici.

In sintesi, la dissezione dell'intestino medio, delle ovaie e delle ghiandole salivari di Ae. albopictus, seguita dall'estrazione totale di RNA, fornisce una base tecnica per successive valutazioni della competenza del vettore e studi sulla trasmissione degli arbovirus.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pipetta Pasteur extra lunga da 3 mLWHBWHB-S43 mL
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711-02500 rxns
Kit HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix per qPCRVazymeR433-01100 rxns
Kit per estrazione di RNA totale microMedTechMDT-CFR07100T/box
Pipette micrometriche 0,5-10μLEppendorf4043444
Vetrini per microscopioCITOTEST80302-210475 mm×25 mm
MicrosspettrofotometroKAIAOK5600C
Tampone per estrazione di acidi nucleiciMedTechMDT-TP01100 mL
PBS (soluzione salina tamponata al fosfato, sterile)ServicebioG4202500 ML
Ciclatore termico per PCREppendorfMastercycler X50s
Sistema QuantStudioTM 7 Pro per PCR in tempo realeApplied biosystemsEN61326-1
Set microscopio Stemi 305 LABZEISS435063-9010-000

Riferimenti

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