Articolo metodologico

Dissociazione di tessuti di ghiandola mammaria e tumorali murini per la creazione di sospensioni di singole cellule ad alta vitalità

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DOI:

10.3791/72844

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21 agosto 2026

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Oncology, Wayne State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo stabilisce un metodo riproducibile per generare sospensioni monocellulari altamente vitali a partire da tessuti di ghiandola mammaria murina e da tumori mammari, preservando gli epitopi di superficie cellulare per analisi successive, incluse la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Abstract

La dissociazione del tessuto in sospensioni di singole cellule per l'analisi contribuisce a comprendere ciò che avviene a livello cellulare nel microambiente tumorale. Una sfida duratura in L'ottenimento e l'utilizzo di cellule primarie richiede la produzione di sospensioni cellulari di alta qualità che preservino le caratteristiche cellulari per analisi successive, tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-Seq) o l'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Generalmente, i tessuti vengono dissociati utilizzando una combinazione di frammentazione meccanica, digestione enzimatica e filtrazione, e diversi fattori in ciascun passaggio introducono variabilità nel prodotto finale. Pertanto, è necessario ottimizzare i passaggi del protocollo al fine di identificare il metodo più adatto per ciascun tipo di tessuto. Ad esempio, il tessuto del cuscinetto adiposo mammario è ricco di adipociti, il che rende più difficile ottenere una sospensione cellulare pura e preservare con successo cellule vitali. Di conseguenza, generare sospensioni cellulari comparabili a partire da tessuto del cuscinetto adiposo mammario e da tumori epiteliali rappresenta una sfida. Questo protocollo stabilisce un metodo riproducibile ed economico per ottenere sospensioni monocellulari altamente vitali da tessuti mammari e tumorali murini, preservando gli epitopi di superficie cellulare per analisi successive. Questa procedura è stata utilizzata per produrre librerie di scRNA-Seq di alta qualità e per eseguire immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso multivariata.

Introduzione

La dissociazione dei tessuti consente l'acquisizione di sospensioni di singole cellule e la caratterizzazione dei tipi cellulari presenti nei tessuti. Questo è particolarmente importante quando si analizza la risposta all'immunoterapia, poiché le cellule immunitarie infiltranti possono contribuire a chiarire il meccanismo alla base delle risposte immunologiche specifiche per tessuto. La vaccinazione con acido desossiribonucleico (DNA) codificante l'oncogene HER2/neu determina un aumento della protezione contro tumori mammari spontanei indotti da HER2/neu in modelli murini1. Inoltre, è stato dimostrato che la vaccinazione con DNA induce una risposta sistemica caratterizzata dalla produzione di anticorpi e da cellule T secernenti interferone-γ (IFN-γ)1,2,3. Per questo motivo, ci siamo concentrati sullo sviluppo di un protocollo per dissociare tumori mammari e tessuti della ghiandola mammaria ricchi di tessuto adiposo, al fine di consentire la quantificazione dell'immunità locale. La dissociazione del tessuto in singole cellule richiede metodi enzimatici, meccanici o una combinazione di entrambi. Una difficoltà associata alla dissociazione enzimatica è che questi metodi richiedono un'esposizione agli enzimi per un periodo prolungato, spesso tutta la notte4. Un'esposizione eccessiva provoca la degradazione delle singole cellule e dei marcatori di superficie, con effetti particolarmente dannosi sulle cellule immunitarie5,6. La digestione meccanica può rappresentare un'opzione valida per liberare cellule immunitarie come linfociti e macrofagi, anche se non degrada efficacemente lo stroma per ottenere un campione rappresentativo di cellule epiteliali e stromali. Recentemente, sono state esplorate applicazioni della microfluidica per la dissociazione dei tessuti, inizialmente utilizzata per frammentare aggregati cellulari in soluzione7. Un gruppo ha implementato un approccio microfluidico per degradare ulteriormente il tessuto tritato sfruttando forze di taglio nel dispositivo8. Dopo 60 minuti di dissociazione ottimizzata, questo metodo ha prodotto un aumento di 2 volte nel numero di cellule epiteliali e di 4 volte nel numero di cellule endoteliali rispetto a un protocollo tradizionale di digestione enzimatica nel tessuto mammario. Tuttavia, sono emerse difficoltà nella misurazione del rendimento degli epatociti in un campione di fegato, con un calo del rendimento nel tempo, probabilmente dovuto alle dimensioni e alla fragilità degli epatociti. Pertanto, è di fondamentale importanza trovare un compromesso che consenta di ottenere un campione rappresentativo e purificato di diversi tipi cellulari preservando l'integrità cellulare e gli epitopi di superficie.

Gli enzimi utilizzati nei mix di digestione includono tipicamente una combinazione di collaghenasi generiche9,10, tripsina (Una Guida alla Dissociazione di Tessuti Solidi)4,10,11, ialuronidasi9,10,11 o dispasi4,9,10 e richiedono tempi variabili per una digestione efficace. Il protocollo descritto in questo articolo utilizza due tipi specifici di collaghenasi, collaghenasi di tipo II e collaghenasi D, come enzimi principali per la digestione, con l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) impiegato in un ruolo secondario per indebolire ulteriormente i legami intercellulari mediante chelazione. La collaghenasi di tipo II è un enzima dissociativo primario prodotto da Clostridium histolyticum e favorisce la digestione di piccoli frammenti di collagene nella matrice extracellulare. La collaghenasi D è anch'essa prodotta da C. histolyticum ed è stata ampiamente utilizzata per dissociare una varietà di tessuti, come polmone, cardiaco, muscolare, osseo, nervoso ed endoteliale. Questa collaghenasi contribuisce a preservare la funzionalità e l'integrità delle proteine di superficie cellulare, un fattore importante per l'immunofenotipizzazione successiva mediante citometria a flusso. Oltre alla collaghenasi, i tessuti vengono digeriti in presenza di deossiribonucleasi I (DNase I), che degrada il DNA libero, eliminandolo così dalla sospensione cellulare risultante.

Un’altra sfida specifica della dissociazione delle ghiandole mammarie è la presenza di adipociti all’interno del campione. Con l’avanzare dell’età del topo, il cuscinetto adiposo mammario accumula un numero significativo di adipociti. Queste cellule sono più fragili e soggette a rottura durante le fasi successive di lavorazione, il che può causare il rilascio di RNA e detriti intracellulari nella sospensione cellulare, aumentando l’RNA ambientale e compromettendo la preparazione delle librerie per scRNA-Seq, con conseguente riduzione della qualità del campione. Il DNA extracellulare può portare alla formazione di aggregati cellulari; pertanto, tutti gli adipociti residui dopo la dissociazione enzimatica iniziale devono essere rimossi per mantenere l’integrità del campione. Fortunatamente, la natura galleggiante degli adipociti può essere sfruttata per facilitarne la separazione dalle altre cellule durante la centrifugazione. Utilizzando un protocollo di centrifugazione, gli adipociti rimangono sulla superficie del sopranatante. Ciò consente di eliminarli insieme al sopranatante, evitando che vengano inclusi nel pellet cellulare primario. Sebbene non obbligatorio, l’inclusione di una decelerazione graduale riduce le forze di Coriolis all’interno del tubo, aiutando a mantenere gli adipociti in uno strato distinto nella parte superiore, in particolare quando si lavora con tessuto mammario particolarmente ricco di adipociti o quando la rimozione degli adipociti è l’obiettivo dello studio12,13.

Tenendo presenti queste considerazioni specifiche per il tessuto, abbiamo cercato di stabilire un protocollo economico, che non richieda attrezzature specializzate e che produca un campione cellulare rappresentativo del tessuto di origine con qualità e riproducibilità costantemente elevate.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con la politica del Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti sull'uso degli animali da laboratorio e con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali della Michigan State University.

1. Generazione di una sospensione di singole cellule da tessuto tumorale murino e da tessuto della ghiandola mammaria:

Digestione del tessuto

  1. Smaltire tutti i tessuti murini in eccesso o non utilizzati nei rifiuti biologici. Collocare le plastiche contaminate da tessuti o cellule murine nei rifiuti biologici per lo smaltimento. Raccogliere le soluzioni contenenti cellule in un contenitore per rifiuti liquidi biologici e trattare con candeggina al 10% prima dello smaltimento.
  2. Assicurarsi che il cocktail fresco per la digestione dei tessuti venga preparato immediatamente prima della digestione. Ogni campione richiede 10 mL di cocktail di digestione (10 mL di Roswell Park Memorial Institute (RPMI), 60 U di DNasi I, 25 mg di Collagenasi D, 50 mg di Collagenasi di tipo II). Conservare a temperatura ambiente (RT) fino all'uso.
  3. Provocare l'eutanasia dei topi mediante dislocazione cervicale, con pneumotorace bilaterale come metodo secondario di eutanasia, con o senza essanguinazione.
  4. Posizionare il topo in posizione supina, con le zampe distese verso l'esterno e fissate.
  5. Spruzzare completamente il topo con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione del campione da peli sciolti. 
  6. Eseguire un'incisione singola lungo la linea mediana del topo, dal cuscinetto adiposo inguinale fino al collo, avendo cura di non perforare il peritoneo, seguita da un'incisione lungo ciascuna gamba per formare una figura a "Y" capovolta.
  7. Stendere la pelle, utilizzando tecniche di dissezione ottusa per separarla dal peritoneo sottostante, e fissarla piatta sulla tavola per necroscopia. 
  8. Rimuovere tumori di dimensioni medie o ghiandole mammarie/cuscinetti adiposi e posizionarli in un tubo conico da 50 mL con 5 mL di mezzo di lavaggio cellulare R10 (R10 è RPMI) contenente siero bovino fetale (FBS) al 10%.
    1. Evitare, se possibile, l'uso di tumori necrotici o pieni di sangue (che appaiono molto scuri e molli).
    2. Trasferire, all'interno di una cappa a sicurezza biologica, solo i cuscinetti adiposi mammarî e i tumori in una piastra di Petri pulita. Tritare finemente il tessuto utilizzando due lame chirurgiche fino a ottenere una consistenza simile a una pasta, quindi trasferirlo in un tubo da 50 mL pulito. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente (RT).
  9. Aggiungere 10 mL di cocktail di digestione per campione.
  10. Incubare in un incubatore agitato a 37 °C a 250 giri al minuto (rpm) per 30 minuti.
  11. Aggiungere EDTA 0,5 M fino a una concentrazione finale di 10 mM (200 µL di EDTA/10 mL di tampone di digestione).
  12. Riportare in incubatore agitato a 37 °C e 250 rpm per ulteriori 5 minuti.
  13. Aggiungere 40 mL di mezzo di lavaggio cellulare R10 per arrestare la reazione.
  14. Filtrare le cellule digerite attraverso un filtro da 70 µm in un tubo da 50 mL pulito per rimuovere i frammenti.
  15. Centrifugare a 500 x g utilizzando l'impostazione di accelerazione 9 e decelerazione 6, a 4 °C per 10 minuti (se si è interessati solo alle cellule linfocitarie, la forza di centrifugazione può essere ridotta a 300 x g per 5 minuti)14 per ottenere il pellet cellulare. Poiché questo procedimento comporta la dissociazione del tessuto della ghiandola mammaria, ricco di adipociti, un protocollo di frenata ridotta aiuta a mantenere il gradiente formato dalla natura galleggiante degli adipociti durante la centrifugazione13.
  16. Eliminare il soprannatante nei rifiuti biologici, disperdere il pellet e aggiungere 40 mL di mezzo di lavaggio cellulare, quindi centrifugare come sopra (passaggio 1.15). La frenata può essere riportata alla decelerazione massima nei passaggi successivi. L'omissione di questo passaggio non avrà effetti negativi sul campione.
  17. Lavare con 40 mL di mezzo di lavaggio cellulare R10 e centrifugare come al passaggio 1.15 per un totale di 3 lavaggi.
  18. Disperdere il pellet e risospendere le cellule in 2 mL di PBS freddo 1 ×.
  19. Aggiungere due volumi di tampone di lisi dei globuli rossi 1×. Diluire il concentrato di tampone di lisi 10× a 1× con acqua (ad esempio, 2 x = 2 mL di PBS 1× + 4 mL di tampone di lisi). Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente (RT).
  20. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, mescolando delicatamente di tanto in tanto capovolgendo il tubo.
  21. Neutralizzare il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo un volume equivalente di mezzo di lavaggio cellulare R10.
  22. Filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro da 30 µm in un tubo da 15 mL per rimuovere i detriti cellulari.
  23. Portare il volume a 15 mL con mezzo di lavaggio cellulare R10.
  24. Centrifugare a 500 x g per 10 minuti a 4 °C.
  25. Rimuovere completamente il soprannatante e risospendere nel mezzo di lavaggio cellulare fino a un volume finale di massimo 5 mL per il conteggio e la valutazione della vitalità. Risospendere alla diluizione desiderata. Procedere con la colorazione per citometria a flusso o con la preparazione per scRNA-seq. 
  26. Mantenere le cellule sul ghiaccio tra un passaggio e l'altro, salvo diversamente specificato.

2. Colorazione di una sospensione di cellule singole per la citometria a flusso

  1. Trasferire le cellule desiderate in un tubo conico in polipropilene da 5 mL e mantenere sul ghiaccio.
  2. Preparare una soluzione di marcatura cellulare utilizzando gli anticorpi monoclonali (mAb) desiderati coniugati a marcatori fluorescenti, in un volume totale di (n + 1) × 100 µL, usando PBS per citofluorimetria (490 mL PBS 1x, 10 mL FBS, 0,5 g di azide di sodio). Preparare (n+1) × 100 µL di soluzione di marcatura, dove n = numero di campioni (ad esempio, 6 × 100 µL = 600 µL per 5 campioni)
    NOTA: L'azide di sodio è un agente cancerogeno in forma di polvere. Indossare idonei dispositivi di protezione individuale e lavare accuratamente tutta l'apparecchiatura per assicurarsi che l'azide sia completamente in soluzione prima dello smaltimento nel contenitore per rifiuti chimici.
  3. Centrifugare ogni campione da marcare per 5 min a 4 °C a 500 x g. Risospendere in 100 µL di soluzione di marcatura. Risospendere i controlli non marcati in 1000 µL di PBS per citofluorimetria.
  4. Coprire i tubi per proteggerli dalla luce e incubare a 4 °C per 15 min.
    ​NOTA: Gli anticorpi marcati con fluorocromi possono degradarsi a causa di un'esposizione prolungata alla luce e devono rimanere coperti durante l'incubazione e il successivo stoccaggio dei campioni.
  5. Aggiungere 1 mL di PBS per citofluorimetria a ciascun tubo marcato e centrifugare a 500 x g, 4 °C, per 5 min per lavare.
  6. Eliminare il soprannatante, disperdere il pellet e risospendere le cellule in 1 mL di PBS per citofluorimetria. Centrifugare come in precedenza (Passaggio 2.5).
  7. Ripetere il passaggio 2.6 per un totale di tre lavaggi. Eliminare il soprannatante e disperdere i pellet.
  8. Risospendere le cellule in soluzione fissante o in PBS per citofluorimetria, a seconda dei successivi marcaggi richiesti.
  9. Utilizzare se si fissano le cellule o si esegue un marcaggio intracellulare. In caso contrario, procedere al Passaggio 2.10:
    1. Aggiungere 200 µL di soluzione di permeabilizzazione/fissazione a ciascun campione per consentire il marcaggio intranucleare.
    2. Coprire i campioni con carta d'alluminio e lasciarli incubare per almeno 20 min a 4 °C. Se si prevede di analizzare i campioni in un giorno successivo, è possibile conservarli coperti a 4 °C durante la notte a questo passaggio.
    3. Dopo la fissazione, centrifugare i campioni a 500 x g per 5 min e risospendere in 1 × tampone di permeabilizzazione (diluito in acqua).
    4. Se si prepara un marcaggio secondario o intracellulare, marcare i campioni al diluizione desiderata in tampone di permeabilizzazione 1x. Posizionare i tubi coperti nell'incubatore a 4 °C per 15–20 min.
    5. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun tubo marcato e centrifugare a 500 x g per 5 min per lavare.
    6. Eliminare il soprannatante, disperdere il pellet e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare come in precedenza (Passaggio 9.5).
    7. Ripetere il passaggio 2.9.6 per un totale di tre lavaggi. Eliminare il soprannatante e disperdere i pellet.
    8. Risospendere le cellule in 200 µL di tampone di permeabilizzazione 1x e mantenere sul ghiaccio fino al momento dell'analisi mediante citofluorimetro.
  10. Se non si fissano le cellule, risospendere in 200 µL di PBS per citofluorimetria e mantenere sul ghiaccio fino al momento dell'analisi mediante citofluorimetro.
  11. Per l'analisi mediante scRNA-Seq, seguire i protocolli per rimuovere detriti e cellule morte, valutare la qualità dell'RNA e generare librerie.

3. Valutazione della qualità della libreria di scRNA-Seq

  1. Cercare una percentuale elevata di letture mappate con sicurezza alle cellule. Idealmente, questo valore sarà superiore al 90%.
  2. Confrontare i conteggi degli identificatori molecolari unici (UMI) con le sequenze di barcoding. Un campione di alta qualità mostrerà una brusca diminuzione dei conteggi UMI a circa 10.000 barcodici (punto di “flesso” nel grafico di classificazione dei barcodici).
  3. Esaminare le proiezioni approssimate su varietà uniforme (UMAP). Un campione di alta qualità proveniente da tessuti complessi, come le ghiandole mammarie o i tumori mammari spontanei, presenterà cluster cellulari distinti e ben separati.
  4. Identificare il numero di geni mitocondriali (mt-) espressi; i cluster con un elevato numero di geni mitocondriali indicano che le cellule sono morte o in via di morte.

Risultati

HER2 è un oncogene tumorale che induce tumori mammari aggressivi nelle donne e fino al 70% delle donne trattate con terapie monoclonali mirate a HER2 non risponderà al trattamento o svilupperà resistenza alla terapia anti-HER215,16,17,18. L'obiettivo finale è attivare una risposta immunitaria contro HER2/neu per migliorare l'immunità verso HER2 e aumentare la sopravvivenza. Per studiare l'immunità verso HER2/neu, si utilizzano modelli murini immunocompetenti che sviluppano tumori mammari spontanei indotti da HER2/neu2,19. HER2 è codificato dal gene umano Erbb2 e neu da quello del ratto Erbb2. I topi BALB NeuT portano un transgene del ratto neu trasformato (NeuT) sotto il controllo del promotore MMTV19. L'espressione di Neu avviene nelle ghiandole mammarie di topi femmine puberi con background BALB, portando allo sviluppo di carcinoma duttale (Figura 1A, riquadro) in tutte le femmine transgeniche, in una o più ghiandole mammarie. L'espressione continua di neu determina la comparsa di tumori palpabili tra le 14 e le 19 settimane di vita, che crescono in modo progressivo1. La vaccinazione di topi transgenici con DNA plasmidico codificante sia neu autologo sia HER2 eterologo (denominato pNeuE2TM) può rompere la tolleranza immunitaria verso neu, generando un aumento di anticorpi policlonali sistemici diretti contro neu e di cellule T spleniche secernenti IFN-γ1. Questa risposta immunitaria ha portato al rigetto delle cellule tumorali TUBO esprimenti neu. Sebbene la risposta sistemica sia informativa, non consente di comprendere il meccanismo d'azione a livello del sito tumorale. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di dissociazione per tessuti di ghiandola mammaria e di tumore mammario che consenta di ottenere singole cellule con elevata vitalità, mantenendo intatti i marcatori di superficie cellulare. La Figura 1 illustra un'overview del flusso di lavoro. In breve, dopo il prelievo, il tessuto viene finemente tritato con bisturi (Figura 1B) e posto in un buffer di digestione tissutale a base di RPMI contenente una miscela di 2 parti di collaghenasi di tipo II e 1 parte di collaghenasi D e DNasi I, per 30 minuti in un incubatore oscillante (Figura 1C–D), seguiti da ulteriori 5 minuti con EDTA 0,5 M (Figura 1E). La digestione viene arrestata aggiungendo un buffer di lavaggio contenente FBS, e la miscela viene filtrata per rimuovere i detriti tissutali (Figura 1F). Dopo i passaggi di lavaggio e la lisi dei globuli rossi (Figura 1G–H), le cellule vengono filtrate attraverso un filtro da 30 µm e contate (Figura 1I–K e Figura 2). A questo punto, le cellule possono essere destinate a flussi di lavoro successivi come la citometria a flusso o la scRNA-Seq.

Per un confronto diretto, la dissociazione è stata eseguita in parallelo utilizzando un kit commerciale. È stato seguito il protocollo pubblicato per i tumori "resistenti" e, dopo la neutralizzazione dell'enzima, i campioni sono stati trattati nello stesso modo (ad esempio, lisi dei globuli rossi, ecc.). Utilizzando il kit commerciale, sono state recuperate 1,3 × 106 cellule/mL con una vitalità del 76%, mentre con il presente protocollo sono state recuperate 4,5 × 106 cellule/mL con una vitalità dell'89% (Figura 2A,B). I detriti prodotti dai due protocolli erano simili dopo la lisi dei globuli rossi. Per rimuovere le cellule morte, 1 × 107 cellule provenienti da ciascun protocollo sono state processate attraverso la procedura di rimozione delle cellule morte. Il kit commerciale ha recuperato 1,3 × 106 cellule/mL con una vitalità del 96%, rispetto a 1,94 × 106 cellule/mL e una vitalità del 98% ottenuti con il protocollo qui descritto (Figura 2C,D). Pertanto, il protocollo qui riportato ha fornito un rendimento maggiore di cellule vitali per analisi successive, senza necessità di attrezzature specializzate.

Per valutare in modo specifico la qualità e la riproducibilità delle sospensioni cellulari ottenute dal protocollo qui riportato, sono stati raccolti campioni di ghiandola mammaria da topi femmine naïve BALB e BALB NeuT di età compresa tra 16 e 18 settimane. I tessuti di BALB NeuT contenevano sia tessuto mammario che tessuto tumorale. È stato prelevato il tessuto dai cuscinetti adiposi inguinali (ghiandole mammarie 4 e 9), inclusi i tessuti tumorali di BALB NeuT, e dissociato in una soluzione omogenea per analisi successive. Si noti che i linfonodi sentinella sono stati rimossi prima del prelievo della ghiandola mammaria.

Dopo l'elaborazione, i campioni sono stati valutati mediante citometria a flusso per confermare il mantenimento dei marcatori di superficie cellulare e la vitalità cellulare (Figura 3) e mediante scRNA-Seq (Figura 4) per verificare la qualità della preparazione cellulare ai fini della generazione di librerie. La vitalità delle cellule singole derivate da ghiandola mammaria o da tumore ha mostrato una media ≥85% prima della rimozione delle cellule morte. Per ottenere una preparazione cellulare iniziale altamente vitale per l'analisi scRNA-Seq, possono essere utilizzati kit commerciali per la rimozione di cellule morte e detriti. Seguendo questi protocolli, la vitalità delle preparazioni di cellule singole è risultata compresa tra il 94% e il 98% (Figura 2C,F). Le cellule ottenute con questo protocollo sono state fissate e confrontate con il metodo di fissazione raccomandato per l'analisi scRNA-Seq, denominato protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale, che utilizza una termolisinasi commerciale (Figura 2E,F). Il protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale ha prodotto 1,5 × 107 cellule/mL, ma la vitalità non è stata misurata poiché il tessuto viene fissato prima della dissociazione, mentre il presente protocollo ha fornito 8,6 × 106 cellule/mL a partire da una vitalità iniziale del 94%. Pertanto, il metodo del protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale ha prodotto un numero di cellule paragonabile o leggermente superiore rispetto al protocollo descritto in questo studio.

Le cellule sono state colorate e analizzate per i marcatori di superficie cellulare mediante citometria a flusso. Le cellule epiteliali (Figura 3A) e i fibroblasti (Figura 3B) sono stati identificati rispettivamente mediante colorazione con EpCAM e Pdgfrb/CD140a mAb. Poiché la vaccinazione tripla di topi BALB NeuT con DNA HER2/neu ha determinato un significativo ritardo nell'insorgenza tumorale e una risposta immunitaria sistemica, è risultato particolarmente interessante valutare le cellule immunitarie presenti nelle ghiandole mammarie e nei tumori. Le cellule CD45+ della linea immunitaria costituivano circa il 50% della sospensione cellulare (Figura 3C). La presenza di cellule B e T è stata valutata utilizzando B220/CD45R e CD3 (Figura 3D), e le cellule T CD3+ sono state ulteriormente suddivise in CD4 e CD8 (Figura 3E). Per valutare la capacità di mantenere popolazioni cellulari rare, i campioni sono stati colorati per identificare le cellule T regolatorie. A tale scopo, il campione cellulare è stato fissato e colorato per il fattore di trascrizione Foxp3 specifico per le Treg. Le cellule T regolatorie di solito rappresentano una piccola frazione della popolazione immunitaria totale dell'organismo, ma il loro ruolo nella modulazione del sistema immunitario è di grande interesse nei settori della ricerca oncologica e delle malattie autoimmuni. Pertanto, l'acquisizione affidabile di popolazioni immunitarie piccole ma robuste, come le cellule T regolatorie, è fondamentale nella scelta di un protocollo di dissociazione tissutale. Le cellule T regolatorie Foxp3+ sono state identificate sottoponendo prima a ulteriore selezione (sub-gating) le cellule CD3+CD4+ per l'espressione di CD25 (il recettore ad alta affinità per IL-2) e Foxp3. Utilizzando questa strategia di gating, circa il 5% delle cellule CD4+ risultava positivo per entrambi i marcatori, mentre circa il 25% risultava positivo per Foxp3 ma con espressione bassa o negativa per CD25 (Figura 3F). CD64 è stato valutato su un campione tumorale separato per verificare che i macrofagi CD64+ potessero essere isolati con successo utilizzando questa tecnica di dissociazione (Figura 3G). Per identificare gruppi mieloidi più ampi, sono stati analizzati i macrofagi F4/80+ e le cellule F4/80- CD11c+, identificate come cellule dendritiche (Figura 3H). Le cellule dendritiche costituivano circa il 3% delle cellule totali, mentre i neutrofili CD11b+Ly6G+ costituivano circa il 5% (Figura 3H,I). Pertanto, è stata ottenuta una ripresa affidabile e la conservazione degli epitopi di superficie nelle cellule CD45+ dopo la dissociazione sia del tessuto mammario che tumorale utilizzando il protocollo sopra descritto.

Prima dell'invio per la generazione di librerie per scRNA-Seq, i campioni possono essere valutati per l'integrità dell'RNA. I campioni freschi preparati utilizzando il protocollo commerciale o il protocollo descritto qui hanno prodotto rapporti A260/230 rispettivamente di 1,9 e 2,2. I campioni fissati vengono valutati determinando la percentuale di letture superiori a 200 nucleotidi (nt). Il protocollo descritto qui, seguito da fissazione immediata e conservazione a –80 °C, ha determinato che l'83% del campione conteneva letture > 200 nt.

Qualità dei campioni

Dopo la preparazione e il sequenziamento della libreria scRNA-Seq, è stata valutata la qualità del campione (Figura 4). Le librerie campione di scRNA-Seq vengono innanzitutto valutate utilizzando parametri relativi alla qualità della chiamata cellulare e del mapping, al grafico del rango delle barcode, alla saturazione del sequenziamento e alle proiezioni UMAP. La dissociazione del tessuto mammario di BALB, effettuata mediante il protocollo di dissociazione qui descritto, ha prodotto 16.182 cellule, con il 97% delle letture assegnate alle cellule, indicando un campione sano, poiché poche letture sono state attribuite all'RNA extracellulare. Una percentuale significativa di letture registrate al di fuori della cellula indica livelli elevati di contaminazione da mRNA ambientale proveniente da cellule morte o morenti. La qualità del mapping corrisponde alla percentuale di sonde che si sono allineate al set di sonde; in questo caso era del 99,1%. La saturazione del sequenziamento stava raggiungendo un plateau, indicando la replicazione di geni già identificati piuttosto che di geni unici. Il grafico del rango delle barcode mostra il numero di UMI in funzione delle barcode, e un campione di alta qualità presenta un netto calo, o "punto di flesso", intorno a 10K UMIs (Figura 4A). Infine, la proiezione UMAP mostra diversi cluster distinti (Figura 4A). Tutti questi parametri indicano una libreria scRNA-Seq di alta qualità.

Per confrontare la qualità di questo protocollo con quella del protocollo commerciale raccomandato basato sulla fissazione seguita da dissociazione per la chimica Flex, è stato eseguito in parallelo il protocollo commerciale basato sulla fissazione iniziale e il protocollo qui descritto, e la qualità della libreria risultante è stata valutata. Il protocollo commerciale di fissazione seguita da dissociazione per i campioni di ghiandola mammaria di topi BALB ha recuperato 720 cellule, con il 68% di letture nelle cellule e una qualità di mappatura del 89,3%. Analogamente, la curva di saturazione stava iniziando a raggiungere un plateau, ma i conteggi di geni per cellula erano chiaramente inferiori rispetto alla dissociazione su campioni freschi (4.500 geni/cellula per campioni freschi contro 1.000 geni/cellula per il protocollo commerciale di fissazione seguita da dissociazione). Il grafico del rango delle barcode non mostra un punto di flesso (Figura 4B), e sebbene siano presenti cluster distinti, questi sono in numero minore (Figura 4B).

Anche le librerie di tessuto mammario contenente tumori BALB NeuT sono state valutate per la qualità (Figura 4C,D). Utilizzando la dissociazione in vivo qui descritta, sono state sequenziate 18.077 cellule, con il 97% delle letture all'interno delle cellule e il 99,1% mappato sul set di sonde. È stato osservato un chiaro punto di flesso (Figura 4C), così come una distinta separazione tra i cluster (Figura 4C). Il protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale ha fornito risultati migliori in presenza di tumore, con 7.119 cellule sequenziate, il 91% delle letture all'interno delle cellule e il 98,6% delle letture mappate sul set di sonde. Nel grafico del rango delle barcode si osservava un punto di flesso migliore (Figura 4D), ma nonostante la saturazione del sequenziamento, le proiezioni UMAP mostravano pochi cluster distinti (Figura 4D).

Metriche di qualità aggiuntive includono la determinazione del numero di geni mitocondriali espressi dai cluster cellulari. Una buona separazione delle cellule indica la qualità del campione, con un'elevata percentuale di "reads in cell" che dimostra lo stato di salute del campione. Le cellule con un alto numero di geni mitocondriali (indicati come 'mt-') possono essere identificate ed eliminate utilizzando strumenti di clustering open source e forniti dal produttore. Il confronto diretto tra campioni può essere effettuato aggregando i campioni con l'applicazione Cell Ranger, che consente un confronto bioinformatico diretto, oppure utilizzando lo script di "integrazione" negli strumenti di clustering open source e forniti dal produttore. I cluster cellulari vengono identificati interrogando marcatori noti di linea cellulare (ad esempio, CD45/Ptprc per le cellule immunitarie, EpCAM per le cellule epiteliali, Fap o Pdgfra per i fibroblasti). Se un cluster cellulare non può essere definito mediante marcatori di linea noti, i 10-15 geni più altamente espressi possono essere analizzati mediante strumenti di arricchimento dell'insieme genico per ottenere informazioni sul possibile tipo cellulare. In alternativa, i geni più espressi possono essere interrogati utilizzando strumenti di atlante cellulare di riferimento per verificarne l'espressione in tipi cellulari noti.


Le cellule con un elevato numero di geni mitocondriali sono state rimosse da ogni campione, lasciando 16.114 cellule (0,5% delle cellule contenenti geni mitocondriali elevati) nella ghiandola mammaria BALB e 18.024 cellule (0,3%) nel BALB NeuT. Nei campioni del protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale, la ghiandola mammaria BALB ha mantenuto 627 cellule (13% delle cellule contenenti geni mitocondriali elevati), e il BALB NeuT ha mantenuto 6.181 cellule (14%).

L'integrazione tra le ghiandole mammarie di BALB e BALB NeuT è stata eseguita per il protocollo di dissociazione di cellule vive descritto qui ed è mostrata in Figura 4E,F. Il confronto dei campioni ha mostrato popolazioni cellulari simili tra le librerie (Figura 4E, F, e Tabella 1). I cluster cellulari sono stati etichettati utilizzando marcatori noti delle linee cellulari, e sono stati effettuati confronti tra i campioni. Le popolazioni di cellule immunitarie includevano cellule T, cellule B e cluster di macrofagi, mentre le popolazioni di cellule non immunitarie includevano cellule epiteliali, fibroblasti e cellule endoteliali. Non sorprendentemente, il campione BALB NeuT presentava un'ulteriore popolazione di cellule tumorali (Figura 4F). Analizzando popolazioni cellulari specifiche, si osservava un numero maggiore di macrofagi nel campione BALB NeuT con tumore, ma un numero inferiore di cellule T e di cellule epiteliali non tumorali. L'analisi scRNA-Seq ha mostrato una popolazione comparabile di cellule epiteliali derivate dalla ghiandola mammaria BALB e una popolazione significativa di cellule epiteliali/tumorali nel corrispondente campione NeuT. Il grafico di riduzione dimensionale mostra una chiara distinzione tra la popolazione di cellule epiteliali residenti normali della ghiandola mammaria e le cellule tumorali epiteliali specifiche del campione BALB NeuT (Figura 4E,F).

Dopo aver stabilito le popolazioni epiteliali, le cellule stromali sono state valutate tra i campioni BALB e BALB NeuT. L'analisi del gene del recettore alfa per il fattore di crescita derivato dalle piastrinche (Pdgfrα) espresso dai fibroblasti ha identificato una popolazione distinta di fibroblasti in entrambi i campioni BALB e BALB NeuT. Nel campione BALB di scRNA-Seq, i fibroblasti esprimenti Pdgfrα rappresentavano il 15% delle cellule, una percentuale leggermente inferiore rispetto all'analisi mediante citometria a flusso, che ha rilevato fibroblasti nel 29% delle cellule (Figura 3B). Dopo il gating per vitalità e stato di singola cellula, i fibroblasti sono stati identificati mediante citometria a flusso utilizzando il marcatore PDGFRα (CD140a). I risultati osservati nei diversi campioni, indipendentemente dai metodi di analisi successiva, confermano la coerenza di questo protocollo di dissociazione nel tempo e attraverso più ripetizioni sperimentali.

La proteina CD45 è codificata dal gene Ptprc, e il sequenziamento dell'RNA di cellule esprimenti Ptprc ha rivelato cluster linfocitari altamente identificabili all'interno del campione (Figura 4E). Per valutare ulteriormente le popolazioni linfocitarie, le cellule sono state analizzate per identificare le popolazioni di cellule B e T utilizzando Cd3e+ o Cd79a+ (Figura 4E,F). Queste popolazioni risultavano distinte nell'analisi dei dati di sequenziamento a singola cellula, sebbene l'analisi scRNA-Seq abbia ulteriormente identificato diversi sottocluster di cellule T esprimenti Cd3. L'analisi del conteggio delle ulteriori cellule immunitarie ha mostrato un aumento dei macrofagi nel campione BALB NeuT, come indicato dall'espressione di Itgam e Adgre1 (F4/80) (Figura 4F). Per valutare l'identificazione di popolazioni cellulari rare nell'analisi scRNA-Seq, le cellule T regolatorie sono state identificate in base all'espressione di Foxp3 (Figura 4F). Le cellule T regolatorie sono presenti nelle librerie scRNA-Seq, ma non erano sufficientemente abbondanti da essere identificate come un cluster distinto. Invece, si sono aggregate insieme alle cellule T e alle cellule natural killer (NK).

Infine, la capacità di identificare i neutrofili (PMN) all'interno delle librerie di scRNA-Seq è stata fonte di perplessità e non è stata ottenuta con altri protocolli commerciali disponibili per la dissociazione della mammella20. Mediante citometria a flusso, circa il 5% delle cellule immunitarie è stato identificato come neutrofili esprimenti Ly6G e CD11b (Figura 3H). Per identificare i neutrofili all'interno delle librerie di scRNA-Seq, si raccomanda di effettuare un riclustering utilizzando i pipeline forniti dal produttore, al fine di riconoscere cellule al di sotto del punto standard di flesso della curva. Questa procedura è stata applicata sia alle librerie della ghiandola mammaria di topi BALB che di topi BALB NeuT. I dotplot dei geni tipicamente associati ai macrofagi (Ptprc, Adgre1, Mrc1) sono stati confrontati con quelli espressi dai neutrofili (S100a8, Trem1, Clec4). Né la libreria BALB né quella BALB NeuT contenevano un numero significativo di neutrofili (Figura 5A,B). Tuttavia, questo sembra dipendere dal background del modello, poiché i topi F1 NeuT su background BALB x PWK presentavano un cluster cellulare che esprimeva marcatori dei neutrofili (Figura 5C).

Pertanto, questo protocollo di dissociazione ha permesso di chiarire i tipi cellulari presenti nelle ghiandole mammarie di topi BALB e di topi BALB NeuT che sviluppano tumori mammari spontanei. Poiché queste cellule presentano un'alta vitalità, questa tecnica può essere utilizzata per valutare l'immunità anti-tumorale e la funzionalità anti-HER2/neu delle popolazioni cellulari immunitarie isolate.

Schema di flusso per l'elaborazione del tessuto per scRNA-Seq: incubazione, centrifugazione, filtraggio cellulare, rimozione delle cellule morte.
Figura 1: Protocollo per la dissociazione dei tessuti: flusso di lavoro. (ALe ghiandole mammarie o i tumori sono stati rimossi (B,C), tritati finemente (D) e digeriti a 37 °C, agitando in un cocktail di collagenasi tipo II, collagenasi D e DNasi I (E). È stato aggiunto EDTA e la digestione è proseguita per ulteriori 5 min. (FL'idrolisi è stata arrestata portando a 40 mL con RPMI contenente il 10% di FBS (mezzo di lavaggio R10), e la sospensione è stata quindi filtrata attraverso 70 µm filtri.G) Le sospensioni cellulari sono state centrifugate a 4 °C e 500 × g per 10 min, quindi lavato 3 volte con mezzo di lavaggio RPMI. (H) I globuli rossi (RBC) sono stati lisati utilizzando una soluzione 10 × di lisi dei globuli rossi a base di cloruro di ammonio.IIl tampone di lavaggio R10 è stato utilizzato per arrestare la lisi, e le sospensioni cellulari sono state filtrate attraverso 30 µm filtri.J,KDopo la lisi dei globuli rossi, le cellule vengono lavate altre tre volte prima della valutazione di concentrazione e vitalità.LSe le cellule vengono utilizzate per la generazione di librerie per scRNA-Seq, le cellule morte e i detriti cellulari vengono rimossi utilizzando kit disponibili in commercio, seguendo i rispettivi protocolli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati di vitalità cellulare; dissociazione, metodi Chop Fix; immagini al microscopio; conteggi cellulari, tassi di vitalità
Figura 2: Confronto della dissociazione. Dati di conteggio cellulare e di vitalità per confrontare il protocollo di dissociazione descritto in questo studio con il protocollo commerciale Miltenyi e un protocollo commerciale di dissociazione con fissazione preliminare raccomandato per l'analisi scRNA-Seq. I conteggi cellulari dopo la dissociazione sono stati ottenuti mediante un contatore cellulare automatico con colorazione per cellule morte mediante acridina arancione/ioduro di propidio (AO/PI). Le cellule sono state contate e la vitalità registrata dopo la rimozione delle cellule morte. (A–B) Conteggi cellulari e vitalità immediatamente prima della rimozione delle cellule morte. (C–D) Conteggi cellulari e vitalità dopo la rimozione delle cellule morte, rappresentativi del campione che entra nel flusso di lavoro per scRNA-Seq. (E–F) Confronto del conteggio cellulare e della vitalità tra il protocollo descritto in questo studio e un protocollo commerciale di dissociazione con fissazione preliminare. La valutazione della vitalità dopo la dissociazione non è stata possibile utilizzando il protocollo contenente Liberase, poiché il campione di tessuto era stato fissato prima della dissociazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici di analisi mediante citometria a flusso; risultati di colorazione per CD45, EPCAM, PDGFRa, linfociti, cellule mieloidi.
Figura 3: Analisi citometrica a flusso di tessuti dissociati. Per verificare la presenza e la vitalità delle cellule immunitarie, campioni rappresentativi di BALB e BALB NeuT sono stati analizzati. Le cellule sono state innanzitutto selezionate in base alla vitalità, quindi sono state identificate le singolette prima dell'identificazione dei sottogruppi. Per assicurare il recupero di cellule di linea epiteliale e stromale, queste sono state valutate preliminarmente. L'EpCAM è stato utilizzato per identificare le cellule di origine epiteliale (A), mentre il PDGFRa è stato impiegato per identificare i fibroblasti (B). Per valutare le popolazioni immunitarie, il 51% delle cellule totali risultava positivo per CD45 nella ghiandola mammaria (C). Le popolazioni di cellule B (B220+) e di cellule T (CD3+) sono state ottenute da tessuto mammario murino dissociato (D), mentre le popolazioni CD8+ e CD4+ sono state ulteriormente suddivise a partire dal tessuto tumorale (E). Per determinare se questo protocollo permette l'isolamento efficace di popolazioni cellulari più rare, in (F) le cellule Treg nel tessuto tumorale sono state valutate mediante espressione di Foxp3+. Tale analisi è stata condotta selezionando innanzitutto una popolazione CD3+ e CD4+, all'interno della quale sono state identificate le cellule Foxp3+ e CD25+ (circa il 6%). (G) Valutazione dei macrofagi CD64+ provenienti dal tessuto tumorale. (H) Le cellule CD11b+ sono state ulteriormente analizzate per l'espressione di F4/80 e CD11c, con le cellule F4/80− CD11c+ identificate come cellule dendritiche. (I) I neutrofili sono stati identificati come cellule che esprimono CD45+, Ly6G+ e CD11b+, ma risultano F4/80−. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafici dell'efficienza di dissociazione cellulare e diagrammi dei cluster cellulari di ghiandole mammarie e tumori nei topi.
Figura 4: Valutazione delle librerie di scRNA-Seq. Campioni fissati sono stati utilizzati per generare librerie di scRNA-Seq; mediante il protocollo di dissociazione di cellule vive descritto qui, seguito dalla fissazione come riportato nel presente manoscritto, oppure mediante il protocollo commerciale raccomandato di fissazione prima della dissociazione. (A) Controllo di qualità della libreria di scRNA-Seq della ghiandola mammaria BALB ottenuta con dissociazione di cellule vive. Sono state sequenziate 16.182 cellule, con il 97,1% delle letture mappate con certezza all'interno delle cellule e il 98,8% mappate con certezza al set di sonde filtrato. I grafici del punto di flesso (knee bend) sono mostrati in alto, e le proiezioni UMAP in basso. Un chiaro punto di flesso e cluster cellulari distinti indicano librerie di alta qualità. (B) La valutazione della qualità di una libreria di scRNA-Seq della ghiandola mammaria BALB ottenuta con un protocollo commerciale di fissazione prima della dissociazione mostra l'assenza di un punto di flesso e un numero ridotto di cellule (n = 720). (C) La libreria di scRNA-Seq della ghiandola mammaria BALB NeuT è stata generata utilizzando il protocollo descritto qui. Sono state sequenziate 18.077 cellule, con il 97% delle letture mappate alle cellule e il 98,9% mappate al set di sonde filtrato. Un chiaro punto di flesso, insieme a cluster distinti, dimostra una buona qualità, mentre una libreria BALB NeuT ottenuta con un protocollo commerciale di fissazione prima della dissociazione (D) mostra un punto di flesso debole e cluster cellulari non distinti tra le 7.119 cellule sequenziate. Dopo la generazione delle librerie, Cell Ranger è stato utilizzato per integrare le librerie della ghiandola mammaria BALB e BALB NeuT, seguito da clustering K-Means nel Loupe Cell Browser per un confronto diretto. Dieci cluster unici definiscono le cellule che compongono la ghiandola mammaria BALB/c, come mostrato nei grafici T-SNE (E,F). Nella ghiandola mammaria transgenica NeuT (F) è presente una popolazione aggiuntiva di cellule tumorali. All'interno del cluster dei linfociti, le cellule che esprimono Cd4- e CD8a sono distribuite in tutto il cluster. L'espressione di Cd4 è mostrata nell'inserzione. Le cellule T regolatorie, definite dall'espressione di Foxp3, non erano sufficientemente numerose da formare un cluster separato, ma si sono aggregate con le cellule T, come mostrato nel grafico delle caratteristiche evidenziato. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Diagrammi di analisi dell'espressione genica che illustrano l'espressione e la percentuale in campioni di ghiandola mammaria e tumori.
Figura 5: Identificazione dei neutrofili (PMN). I PMN sono notoriamente difficili da identificare nelle librerie di scRNA-Seq a causa dei bassi livelli di trascritti di RNA e della scarsa espressione di Ly6g. I PMN nelle librerie di scRNA-Seq possono essere identificati utilizzando il comando ‘count’ in Cell Ranger e includendo l'opzione ‘force cell = 8000’ nella riga di comando. Questa analisi è stata condotta sia per le librerie della ghiandola mammaria di topi BALB (A) sia per quelle BALB NeuT (B), ma poche cellule esprimevano geni specifici dei PMN. Tutti i cluster di cellule mieloidi nei modelli BALB e BALB NeuT esprimevano anche Adgre1 (F4/80) e Mrc1 (CD206). Un numero molto ridotto di cellule nelle popolazioni mieloidi esprimeva i geni specifici dei PMN S100a8, Trem1 e Clec4e. Tuttavia, questo risultato è attribuibile al background BALB del modello, poiché librerie di scRNA-Seq preparate utilizzando la tecnica di dissociazione da topi femmine (BALBxPWK)F1 NeuT, come descritto qui (C), senza l'uso del comando force cell, hanno mostrato la presenza di un cluster di cellule che esprimevano geni specifici dei PMN ma non Adgre1. Ciò dimostra che questo protocollo di dissociazione è in grado di catturare effettivamente anche i PMN, oltre ad altre popolazioni mieloidi. I riquadri rettangolari rossi evidenziano i cluster che esprimono Adgre1. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tumore BALB NeuTCitometria a flussoscRNA-Seq
CD3 / Linfociti6% delle cellule totali
(12% delle cellule CD45+)		7% delle cellule totali
CD4 / Cd43,9% delle cellule totali
(65% delle cellule CD45+CD3+)		4% delle cellule totali
CD8 / Cd8a 1% delle cellule totali
(17% delle cellule CD45+CD3+)		0,9% delle cellule totali
Foxp3 / Foxp30,8% delle cellule totali
(33% delle cellule CD3+CD4+)		0,7% delle cellule totali
F4/80 / Adgre120% delle cellule totali 16% delle cellule totali
CD64 / Fcgr1NT14% delle cellule totali
PMN/neutrofili2% delle cellule totali (5% delle cellule CD45+)0,05% delle cellule totali
PDGFRa (CD140a)
/ Stroma		29% delle cellule totali10% delle cellule totali
EpCAM / Epiteliali32% delle cellule totali54% delle cellule totali
NT, non testato

Tabella 1: Confronto delle percentuali cellulari ottenute con questo protocollo di dissociazione mediante tecniche successive, tra cui il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e la citometria a flusso.

Discussione

Questo protocollo di dissociazione produce in modo costante sospensioni di singole cellule composte da popolazioni rappresentative del tessuto di origine. Per isolare tipi cellulari rappresentativi — inclusi fibroblasti più grandi e cellule staminali adipocitiche — dal tessuto mammario, è stata utilizzata una forza centrifuga di 500 x g14,21,22. La vitalità cellulare e gli epitopi di superficie sono mantenuti in modo affidabile in diversi tipi cellulari, inclusi popolazioni immunitarie, epiteliali e stromali. Uno dei vantaggi logistici di questo protocollo di dissociazione è il tempo relativamente breve necessario per passare dalla raccolta iniziale del tessuto a una sospensione cellulare pura pronta per ulteriori lavorazioni, senza la necessità di apparecchiature specializzate. Nel complesso, questo flusso di lavoro richiede circa tre ore per essere completato dalla A alla Z, un vantaggio rispetto ad altri protocolli di dissociazione enzimatica che potrebbero richiedere un'esposizione notturna del campione all'enzima. Questo protocollo è stato sviluppato ed è stato utilizzato in questo e in altri laboratori nel formato fornito a partire dal 2023. Negli ultimi 6 mesi soltanto, il laboratorio ha eseguito il protocollo 37 volte ottenendo risultati simili, e tutti i livelli di personale in formazione lo hanno portato a termine con successo. Oltre alla citometria a flusso e alla generazione di librerie per scRNA-Seq, il protocollo è stato impiegato per isolare linfociti infiltranti il tumore (TIL) e macrofagi associati al tumore (TAM) per analisi funzionali ex vivo. Sebbene i risultati dimostrino che il protocollo di dissociazione è in grado di identificare le principali popolazioni cellulari, è importante sottolineare che citometria a flusso e scRNA-Seq sono fondamentalmente differenti. La citometria a flusso è progettata per studiare l'espressione di più marcatori a livello di singola cellula e utilizza strategie di gating e sottogating per raggiungere questo obiettivo. Lo scRNA-Seq, al contrario, è progettato per identificare le variazioni nell'espressione genica all'interno di un gruppo di cellule senza ricorrere a gating e sottogating.

La risoluzione dei problemi del protocollo ha incluso: 1) Digestione incompleta: La digestione dei campioni di tessuto è fortemente influenzata dalla dissociazione fisica. Triturare il tessuto fino a quando non assomiglia a una pasta, spargendolo per osservare le dimensioni dei frammenti di tessuto. Questo passaggio richiede più tempo di quanto spesso ci si aspetti. Una dissociazione incompleta porta a un numero ridotto di cellule stromali ed epiteliali rispetto alle cellule immunitarie. 2) Bassa vitalità: La vitalità cellulare è influenzata dal tempo di digestione e dal mantenimento del rapporto 2:1 tra collagenasi di tipo II e collagenasi D. La mancanza di collagenasi di tipo II comporta una riduzione significativa della vitalità cellulare. Inoltre, se la vitalità del campione è compresa tra il 70% e l'85%, sistemi commerciali per la rimozione delle cellule morte sono efficaci nel migliorare la vitalità e sono raccomandati prima di sottoporre i campioni alla generazione di librerie per scRNA-Seq. 3) Elevata quantità di detriti cellulari: I detriti cellulari sono spesso un effetto collaterale della dissociazione fisica e della digestione. I detriti vengono rimossi in modo più efficace utilizzando un mezzo a gradiente di densità o una soluzione commerciale per la rimozione dei detriti con densità significativamente ridotta. 4) Recupero scarso del pellet: Un recupero scadente del campione è influenzato principalmente dalla quantità di tessuto iniziale. Questo protocollo è stato ottimizzato per 2 ghiandole mammarie o tumori di medie dimensioni compresi tra 10 e 20 mg. Se la dimensione del campione iniziale è inferiore a una singola ghiandola mammaria o a un tumore più piccolo di circa 200 mm3, il rendimento cellulare sarà basso. Se le dimensioni del tessuto sono ridotte, i volumi possono essere diminuiti del 50%. Analogamente, in caso di tumori di grandi dimensioni o di più ghiandole mammarie (più di 4 ghiandole mammarie o tumori superiori a circa 25 mg), i volumi possono essere aumentati fino a 1,5 ×. I campioni di dimensioni superiori a circa 25 mg devono essere divisi per l'elaborazione. 5) Scarsa qualità del scRNA-Seq: La qualità delle librerie di scRNA-Seq dipende quasi interamente dalla qualità del campione originario. Quando si lavora con tessuti tumorali, i tempi iniziali di formazione delle goccioline con perle in gel (GEM) e di sintesi del cDNA sono essenziali. Per questo motivo, l'utilizzo di un protocollo che si integri naturalmente con una fissazione immediata dell'RNA, come un sistema chimico a cellula singola basato su sonde con RNA fissato, elimina il tempo come variabile che influisce sulla qualità del campione. Detto ciò, la valutazione della qualità dell'RNA prima di entrare nella procedura di scRNA-Seq garantisce che le librerie risultanti siano informative. 6) Cluster cellulari inferiori al previsto: Quando i risultati del scRNA-Seq mostrano bassi livelli di espressione genica in pochi cluster unici, le librerie possono essere sequenziate nuovamente per aumentare il numero di letture (profondità di sequenziamento). Inoltre, se lo studio si concentra esclusivamente sulle cellule immunitarie, la purificazione della popolazione CD45+ prima della generazione della libreria aumenterà la sensibilità del sequenziamento.

Il protocollo commerciale di fissazione e dissociazione citato in precedenza ha incontrato difficoltà durante l'elaborazione del tessuto adiposo. Principalmente, il tessuto adiposo fissato risultava galleggiante e difficile da dissociare ulteriormente e filtrare in modo efficace. Per questo motivo, il tessuto adiposo non è raccomandato per il protocollo commerciale di fissazione e dissociazione utilizzato in questo caso. La fissazione del tessuto prima della dissociazione in una sospensione di singole cellule eliminava passaggi di controllo qualità, come le misurazioni della vitalità post-fissazione e della dissociazione. Ciò rendeva difficile stimare la qualità del campione prima della consegna per analisi scRNA-seq successive, un passaggio necessario nel processo di dissociazione del tessuto. La fissazione del tessuto per scRNA-seq successivi può degradare l'RNA. La qualità dell'RNA può essere valutata esaminando la lunghezza delle letture dei nucleotidi (nt) nei campioni di cellule fissate. Maggiore è la percentuale del campione con letture >200 nt, migliore è la qualità. I campioni con un punteggio di integrità dell'RNA presenteranno >30% del campione con letture >200 nt e possono quindi essere utilizzati per generare librerie scRNA-Seq con elevata affidabilità. I campioni fissati provenienti dalla ghiandola mammaria BALB e dai tessuti tumorali BALB NeuT riportati qui mostravano rispettivamente l'83% e l'82% di letture >200 nt.

I tessuti con elevato contenuto adiposo, come le ghiandole mammarie, rappresentano un problema perché gli adipociti possono interferire con la preparazione di cellule di alta qualità. La maggior parte degli adipociti rimane nella parte superiore del tubo conico ed è possibile rimuoverli mediante aspirazione o eliminando il soprannatante. Abbiamo osservato che ghiandole mammarie estremamente grasse, come quelle di femmine con background New Zealand Obese (NZO), richiedono un passaggio aggiuntivo: passare la superficie superiore del tubo con un panno da laboratorio pulito e privo di lanugine per facilitare la rimozione degli adipociti, seguito da ulteriori passaggi di lavaggio per eliminare completamente l'adipe. I tessuti mammari tendono inoltre a fornire rese più basse. Per mitigare questo problema, i campioni vengono raggruppati ogni volta che possibile al fine di aumentare il numero di cellule ottenute. Per tumori particolarmente compatti, una corretta trinciatura è essenziale, poiché riduce la superficie disponibile per la digestione da parte delle collagenasi nel tempo necessario a ottenere cellule singole altamente vitali.

Questo protocollo, tuttavia, presenta alcune limitazioni. È difficile digerire completamente le cellule epiteliali in una sospensione singola quando si ottiene una miscela eterogenea di cellule. I tumori mammari BALB NeuT sono generalmente compatti, con una capsula tumorale e un componente stromale robusto. Al contrario, la raccolta delle cellule immunitarie infiltranti richiede un'esposizione minima all'enzima, e un'eccessiva esposizione può alterarne lo stato fenotipico. Pertanto, per raccogliere cellule tumorali e stromali, è necessario trovare un compromesso che mantenga l'integrità di questa varietà di tipi cellulari, inclusi i neutrofili infiltranti. Di conseguenza, le proporzioni di cellule epiteliali e stromali ottenute con questo protocollo potrebbero essere inferiori rispetto a quelle effettivamente presenti nel tessuto originario. Il protocollo è stato ottimizzato attraverso numerosi tentativi volti a valutare i rapporti tra enzimi collagenasi e i tempi di dissociazione, al fine di stabilire le migliori pratiche per ottenere un campione eterogeneo di cellule di alta qualità e altamente vitali. Utilizzando questo protocollo, le prospettive future includono l'analisi funzionale ex vivo delle cellule immunitarie infiltranti durante l'insorgenza e la progressione dei tumori mammari, al fine di identificare finestre di opportunità per il trattamento. 

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

I dati presentati in questo lavoro sono stati acquisiti, in parte, utilizzando strumentazione del Genomics Core (RRID: SCR_012406), sostenuto dall'Ufficio della Ricerca della Michigan State University & Innovazione. 

Questo lavoro è stato finanziato da CA278818.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RPMIGibco11875-093
DNAasiInvitrogen18047019
Collagenasi DSigma11088866001
Collagenasi IIWorthington BiochemicalLS004177
Siero fetale bovinoVWR97068-085
PBS 10xGibco70011-044
Azoturo di sodioVWR0639-250G
MACS Smart Strainer, 70 µmMiltenyi Biotec130-110-916
MACS Smart Strainer, 30 µmMiltenyi Biotec130-110-915
EDTAMillipore324506-100ML
Tampone di lisi dei globuli rossi 10xeBioscience/Invitrogen00-4300-54
Kit Foxp3/Fissazione/Permeabilizzazione dei fattori di trascrizioneeBioscience/Invitrogen00-5523-00
Brilliant Stain BufferInvitrogen00-4409-42
Kit per la rimozione delle cellule morte MojosortBiolegend580157
Tampone Mojosort (5x)Biolegend480017
Quick-RNA Miniprep Plus KitZymo ResearchR1057
Kit di dissociazione tumorale, topoMiltenyi Biotec130-096-730
PDGFRα PerCP-eFluor710Invitrogen46-1401-80
Epcam eF450Invitrogen48-5791-82
CD11c APCBiolegend117310
CD11b AF700Invitrogen56-0112-82
Colorante vitalità fissabile eF780Invitrogen65-0865-14
B220/CD45R AF488Biolegend103225
CD3 PE-Cy7Invitrogen25-0031-82
CD49b PerCP-eFluor710Invitrogen46-5971-82
CD8a BV480Invitrogen414-0081-80
CD4 SB600Invitrogen63-0041-82
CD45 BV711Invitrogen407-0451-80
FOXP3 APCInvitrogen17-5773-82
Ly6G APCInvitrogen17-5931-82
Ly6C PECy7Invitrogen25-5932-82
CD64 PerCP-eFluor71046-0641-80
TruStainBiolegend101320
10x Genomics GEM-X Flex Gene Expression Reagent Kit10x Genomics(https://www.10xgenomics.com/blog/answering-your-questions-about-single-cell-analysis-in607 clinical-ffpe-samples);1000781
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher ScientificUtilizzato per l'acquisizione dei dati di citometria a flusso con canali laser rosso, blu e violetto.
FCS ExpressDe Novo SoftwareUtilizzato per l'analisi dei dati di citometria a flusso.
Kit di dissociazione tumorale di Miltenyiun kit commerciale per la dissociazione tumorale
Kit Miltenyi / protocollo Miltenyiil kit commerciale" o "il kit di riferimento
Enzima Liberaseuna miscela commerciale di termolisina/collagenasi
Chop Fixun protocollo commerciale di dissociazione con fissazione iniziale 
Chimica Flex / sistema chimica Flexuna chimica a singola cellula basata su sonde per RNA fissato
Seurat(https://satijalab.org/seurat/strumenti di clustering open-source e del produttore
Cell Rangerstrumenti di clustering open-source e del produttore
 Loupe Cell Browser strumenti di clustering open-source e del produttore
EnrichRhttps://maayanlab.cloud/Enrichr/) strumenti per l'arricchimento di set genici e per l'atlante cellulare di riferimento
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Strumento Cellometer K2" e "acridina arancione / ioduro di propidio (AOPI)" un contatore cellulare automatico con colorazione di vitalità acridina arancione/ioduro di propidio (AO/PI)
Kimwipeun panno da laboratorio senza lanugine
STEMCELL Technologiesun mezzo a gradiente di densità (ad esempio, un mezzo di tipo Ficoll o Percoll)
Ficoll/Percolllame per bisturi #10
due lame per bisturi #10
Cellometer K2 + reagente AOPIun contatore cellulare automatico con colorazione di vitalità acridina arancione/ioduro di propidio (AO/PI)
STEMCELL TechnologiesSTEMCELL
Technologies, www.stemcell.com, 2018
Ficoll/Percollun mezzo a gradiente di densità 
#10 scalpelslama chirurgica per bisturi
Kit Foxp3/Fissazione/Permeabilizzazione dei fattori di trascrizionesoluzione commercialmente disponibile che consente la colorazione intranucleare

Riferimenti

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