Questo studio ottimizza il saggio di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) utilizzando carbonio attivo e bentonite per rilevare specie patogene di Vibrio nei prodotti ittici. Questo trattamento preliminare rimuove efficacemente gli inibitori della reazione, consentendo diagnosi significativamente più rapide, sensibili ed economiche rispetto ai metodi convenzionali.
Articolo di ricerca
Aumento della Sensibilità dell'Amplificazione in Loop mediante l'Uso di Carbone Attivo e Bentonite per il Rilevamento di Vibrio spp. nei Prodotti della Pesca
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il genere Vibrio comprende oltre 100 specie, delle quali 12 sono considerate patogene per l'uomo; le specie più frequentemente isolate negli alimenti sono V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus. Il principale problema nell'identificarle mediante metodi microbiologici convenzionali è rappresentato dai costi elevati e dai tempi lunghi diagnostici. È stata utilizzata l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) per l'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus. È stato impiegato carbone attivo con bentonite (ACB) per rimuovere gli inibitori, migliorando la sensibilità del test; sono stati testati i valori di pH 6, 7 e 9, così come diversi tempi di contatto tra il campione e l'ACB. Il metodo LAMP ha mostrato un miglioramento della sensibilità quando il carbone attivo e la bentonite sono stati utilizzati per rimuovere gli inibitori di reazione in campioni di gamberi, pesce e ostriche. La sensibilità del metodo LAMP, il valore predittivo negativo, il valore predittivo positivo e la specificità del test LAMP sono risultati pari o superiori al 90% per tutti i campioni analizzati. Il metodo LAMP potrebbe rappresentare un'alternativa per l'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus nei prodotti ittici, grazie a un'applicazione più rapida, una maggiore sensibilità e costi inferiori rispetto al metodo standard.
Introduzione
Specie del Vibrio il genere è ampiamente diffuso negli ambienti marini e può essere associato a pesci, molluschi o crostacei in modo che può risultare patogeno o commensale. È stato riportato che 12 specie possono essere patogene per l'uomo, con Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificuse V. alginolyticus rivelando una maggiore frequenza di isolamento nei prodotti della pesca. Negli Stati Uniti, le autorità sanitarie stimano che Vibrio spp. causano più di 80.000 infezioni all'anno1,2,3,4,5L'isolamento di Vibrio spp. viene effettuato mediante metodi convenzionali che prevedono un prearricchimento, la coltura in terreni selettivi e la conferma tramite test biochimici e sierologici.6,7. Questi metodi convenzionali sono limitati dal tempo prolungato necessario per isolare l'agente patogeno (fino a 5 giorni) e dalla loro scarsa potenza risolutiva, che spesso non consente di differenziare con precisione specie strettamente correlate all'interno del Vibrio genere a causa di profili fenotipici e biochimici simili6,7,8.
In alternativa, l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è stata descritta come una tecnica molecolare rapida, accurata ed economica per l'identificazione di patogeni9,10. Questo metodo è altamente conveniente in termini di costi e più veloce della PCR convenzionale, poiché non richiede attrezzature sofisticate come i termociclatori9. Il metodo LAMP consente, in un unico passaggio, il rilevamento del gene bersaglio osservando la torbidità nel tubo di reazione causata dalla precipitazione del pirofosfato di magnesio, che è un prodotto di reazione stabile a 65 °C, la temperatura utilizzata nella tecnica LAMP, in modo che l'aumento della torbidità sia correlato alla quantità di DNA sintetizzato, eliminando la necessità di utilizzare gel di agarosio e transilluminatori11,12,13,14,15.
La sensibilità del rilevamento di questi patogeni può essere migliorata eliminando gli inibitori della reazione, come proteasi, ioni calcio, glicogeno e lipidi, che possono inibire la polimerasi Bst o legarsi alla sequenza di DNA bersaglio, impedendo l'amplificazione13,16,17,18,19,20. È stato riportato che la combinazione di carbonio attivo con bentonite (ACB) presenta un'elevata efficienza nell'eliminare gli inibitori dell'amplificazione, aumentando quindi la sensibilità del rilevamento di Escherichia coli in campioni di ostriche e riducendo i costi, poiché l'ACB è più economico rispetto all'uso di kit commerciali21.
In questo studio, proponiamo di ottimizzare il metodo LAMP utilizzando carbone attivo e bentonite per aumentare la sensibilità nell'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus direttamente da prodotti ittici. Questo metodo ottimizzato fornisce indicazioni pratiche per il monitoraggio di routine e il controllo qualità nell'industria alimentare, risultando altamente applicabile per la diagnosi rapida di patogeni, evitando le lunghe fasi di pre-arricchimento. Per quanto riguarda le prestazioni attese, il metodo dimostra un'elevata sensibilità (superiore al 98%) e specificità (100%) in matrici come pesce e gamberi. Tuttavia, una limitazione importante da considerare è che in campioni altamente contaminati all'origine, come le ostriche, il sistema ACB non riesce ad eliminare completamente tutta la materia organica interferente, il che può ridurre leggermente la sensibilità del saggio (94%–98%).
Protocollo
Questo studio non ha coinvolto soggetti umani né animali vertebrati; pertanto, non è stata richiesta l'approvazione etica istituzionale. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Ceppi batterici utilizzati ed estrazione del DNA
I ceppi di Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 e V. alginolyticus ATCC 17749 sono stati coltivati in brodo brain heart infusion (BHI) con il 2% di NaCl a 37 °C per 24 ore. I ceppi di Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sono stati coltivati in brodo BHI senza cloruro di sodio a 37 °C per 24 ore, da utilizzare come controlli negativi nei test. Per l'estrazione del DNA, una coltura notturna è stata centrifugata a 16.000 x g per 6 minuti a 25 °C in una centrifuga. Il soprannatante è stato accuratamente decantato per evitare di disturbare il pellet cellulare, e il pellet è stato completamente risospeso mediante pipettaggio in 500 μL di soluzione tampone TAE (Tris-acido acetico-EDTA, pH 8). La sospensione è stata fatta bollire per 6 minuti per lisare le cellule, quindi immediatamente raffreddata sul ghiaccio per 5 minuti. È stata eseguita una centrifugazione finale per ottenere il pellet dei detriti cellulari, ottenendo un soprannatante limpido contenente il DNA estratto, che è stato successivamente utilizzato come stampo per l'amplificazione mediante LAMP22,23.
2. Procedura LAMP
I primer utilizzati nel LAMP (Tabella 1) sono stati testati per confermare la specificità nell'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. L'identificazione di ciascuno Vibrio specie mediante LAMP è stato eseguito in provette da reazione preparando un volume finale di 25 μL della miscela contenente: 1.6 μM di ciascuno dei primer, 1,4 mM di una miscela di dNTP, 6 mM di MgSO4, 800 mM di betaina, 8 U di Bst DNA polimerasi, e 5 μL di DNA stampo. La miscela di reazione è stata delicatamente mescolata e incubata in un bagno termico a 65 °C per 60 min. Al termine del periodo di incubazione, i prodotti di amplificazione sono stati separati su un gel di agarosio all'1,5%. I prodotti di amplificazione sono stati quindi colorati utilizzando 1 μL di un colorante fluorescente per DNA diluito 1:100 e rivelato mediante un transilluminatore a luce blu. Un'altra tecnica per determinare se il test era positivo nell'identificazione dell'agente patogeno prevedeva l'aggiunta di 4 μL di idrossinaphtolo blu (HNB, 125 μM) ai tubi della reazione e osservando il cambiamento di colore a occhio nudo. Un test positivo era indicato dalla formazione di un colore blu, mentre uno negativo da un colore violetto24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sono stati utilizzati come controlli negativi per il metodo LAMP. Le amplificazioni ottenute con la reazione LAMP sono state separate in un gel di agarosio ed osservate mediante un transilluminatore. Le immagini risultanti sono state acquisite e digitalizzate utilizzando il software MS 1D Analysis.
3. Trattamento di campioni di ostriche, gamberi e pesce per l'eliminazione di Vibrio spp. naturalmente presenti nei campioni
Sono stati ottenuti dieci campioni di ostriche, dieci campioni di gamberi e dieci campioni di pesce, ciascuno con un peso approssimativo di 200 g. Per rimuovere le cellule di Vibrio naturalmente presenti, è stata seguita la metodologia precedentemente pubblicata21. Cinquanta grammi (50 g) di ciascun campione sono stati pesati e omogeneizzati meccanicamente in un miscelatore a palette a 260 giri/min per 1 minuto, producendo una sospensione tissutale uniforme, che è stata quindi conservata a -70 °C per 72 ore. Successivamente, i campioni sono stati completamente scongelati utilizzando un bagno termico a 40 °C e lavati con 300 mL di soluzione tampone salina fosfato (0,85% NaCl, pH 9). Per assicurare che la procedura precedente avesse eliminato con successo Vibrio dai campioni, è stata eseguita la metodologia di pre-arricchimento indicata nel capitolo 9 del Bacteriological Analytical Manual della Food and Drug Administration7. La soluzione salina contenente il campione è stata sostituita con 450 mL di acqua peptonata alcalina (APW, pH 9). Successivamente, sono state preparate con attenzione diluizioni seriali in APW fino a una diluizione 10⁻3 e incubate per 24 ore. Infine, un’aliquota da ciascun tubo è stata stesa su un terreno selettivo di agar tiosolfato-citrato-bile-saccarosio (TCBS) e incubata per 24 ore a 37 °C per confermare visivamente l’assenza di colonie tipiche di Vibrio. Tutti i test sono stati eseguiti in triplice replicazione.
4. Preparazione del carbone attivo con bentonite (ACB) e valutazione del recupero cellulare
Per determinare le condizioni in cui l'ACB è più efficiente nell'assorbire gli inibitori presenti nei campioni di prodotti della pesca mantenendo al contempo un assorbimento minimo delle cellule bersaglio, si è seguita la metodologia pubblicata21 per stabilire il pH ottimale e il tempo di contatto tra l'ACB e i campioni alimentari. Il carbonio attivo è stato accuratamente lavato con acqua distillata ed essiccato a 55 °C. Successivamente, 32,6 g di carbonio attivo sono stati mescolati con 3,04 g di bentonite, agitati continuamente a 150 giri/min per 24 ore per garantire una distribuzione uniforme, essiccati a 55 °C e sterilizzati, ottenendo una polvere fine e omogenea di ACB. Per valutare il recupero cellulare dopo il mescolamento delle cellule di Vibrio con la miscela di carbonio attivo e bentonite (ACB), i ceppi sono stati coltivati separatamente in brodo BHI con il 2% di NaCl fino al raggiungimento di una densità cellulare di 1,5 x 104 UFC/mL. Successivamente, 1 mL di ciascun ceppo di Vibrio è stato inoculato separatamente in 100 mL di tampone fosfato (PBS, 0,85% NaCl, aggiustato a pH 4, 6 e 9). La sospensione batterica è stata quindi combinata con 4,6 g di ACB pre-preparato ed agitata a 150 giri/min per 15, 30 e 60 minuti per favorire il contatto. Dopo ciascun tempo di contatto stabilito, un'aliquote di 0,1 mL è stata accuratamente prelevata, spalmata su agar TCBS e incubata a 37 °C per 24 ore prima di effettuare il conteggio delle colonie.
5. Valutazione del limite di rilevamento di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus in campioni di ostriche, gamberi e pesce trattati con carbone attivo e bentonite
Ogni specie di Vibrio utilizzata in questo studio è stata coltivata in brodo BHI e le densità cellulari sono state accuratamente regolate a 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 e 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), misurate mediante spettrofotometro. Successivamente, 1 mL di ciascuna coltura di Vibrio è stato utilizzato per inoculare 50 g di ciascun campione (ostriche, pesce, gamberi) precedentemente trattato per eliminare qualsiasi presenza di Vibrio. I campioni inoculati sono stati omogeneizzati in un agitatore meccanico a pale a 360 giri/min per 30 secondi e diluiti con 450 mL di APW (pH 6). La miscela è stata quindi centrifugata a 260 x g per 5 minuti a 4 °C per separare i detriti più grandi. Il sopranatante ottenuto è stato travasato in beute contenenti 23 g di ACB, agitato a 150 giri/min per 15 minuti per assorbire gli inibitori e filtrato mediante carta da filtro, ottenendo un eluato limpido privo di particelle di grandi dimensioni. Questo eluato è stato quindi centrifugato a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C, ottenendo un pellet cellulare visibile sul fondo del tubo, successivamente utilizzato per l'estrazione del DNA. Ogni specie di Vibrio è stata identificata mediante il metodo LAMP. I controlli negativi consistevano in campioni inoculati con ceppi di Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. La miscela di reazione è stata incubata in un bagno termostatato a 65 °C per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, i prodotti di amplificazione sono stati separati su un gel di agarosio al 1,5% e colorati con un colorante fluorescente per il DNA. I gel sono stati visualizzati su un transilluminatore a luce blu. Infine, 4 μL di idrossinaftolo blu (125 μM) sono stati aggiunti a ciascun tubo per la rilevazione ad occhio nudo24.
6. Determinazione del valore predittivo positivo, del valore predittivo negativo, della specificità e della sensibilità del metodo LAMP
La sensibilità, la specificità e i valori predittivi del metodo LAMP sono stati determinati utilizzando 30 campioni (10 di gamberi, 10 di ostriche e 10 di pesce). Ciascun campione è stato inoculato con la concentrazione minima rilevabile stabilita per ciascuna specie di Vibrio. Per determinare la percentuale di sensibilità e specificità, nonché il valore predittivo negativo (VPN) e il valore predittivo positivo25, è stata utilizzata una tabella di contingenza per riassumere i veri positivi (VP), i veri negativi (VN), i falsi positivi (FP) e i falsi negativi (FN) ottenuti durante gli esperimenti. (Tabella 2). A partire da questi dati, sono state applicate le seguenti formule:
Risultati
Stirpi batteriche utilizzate ed estrazione del DNA
Il DNA è stato estratto con successo da tutte le stirpi patogene e dai controlli negativi da utilizzare come template per i saggi LAMP successivi.
Procedura LAMP
Gli inneschi utilizzati in questo studio erano specifici per l'amplificazione della sequenza molecolare bersaglio in ciascuna specie di Vibrio. I prodotti di amplificazione ottenuti mediante LAMP quando sono stati utilizzati ceppi di Vibrio hanno dimostrato che ciascun innesco era specifico per l'amplificazione del gene bersaglio in ciascuna specie di Vibrio (Figura 1).
Trattamento di campioni di ostriche, gamberi e pesce per l'eliminazione di Vibrio spp. naturalmente presenti nei campioni
Il trattamento per l'eliminazione di Vibrio spp. naturalmente presenti sui campioni si è rivelato adeguato, consentendo la riduzione del 100% di Vibrio spp. Non si è verificata alcuna crescita di Vibrio spp. quando è stato seguito il metodo BAM7.
Preparazione del carbone attivo con bentonite (ACB) e valutazione del recupero cellulare
L'eliminazione degli inibitori della reazione mediante il carbone attivo-bentonite ha permesso un aumento della sensibilità nella rilevazione del patogeno con il metodo LAMP. Ciò è dovuto alla capacità del carbone attivo-bentonite di assorbire sostanze inibitorie che possono interferire con la polimerasi durante la procedura di amplificazione, oltre al limitato trattenimento delle cellule batteriche (Figura 2). La percentuale di recupero di Vibrio utilizzando diversi valori di pH e tempi di contatto ha mostrato un recupero cellulare maggiore (93,4% ± 2,9%) quando il pH era pari a 6 con un tempo di contatto di 15 minuti. Quando è stato utilizzato un pH pari a 4, non si è osservata alcuna crescita di Vibrio, mentre ai valori di pH 7 e 9 i recupero sono stati rispettivamente del 33,4% ± 7,6% e del 67,2% ± 5,8%. Questo studio suggerisce l'utilizzo di un pH pari a 6 per migliorare la sensibilità analitica del metodo.
Valutazione del limite di rilevamento di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus in campioni di ostriche, gamberi e pesce trattati con carbonio attivo e bentonite
Nei campioni di ostrica, il limite di rilevamento per V. cholerae era di 150 CFU/g, mentre per V. alginolyticus, V. vulnificus e V. parahaemolyticus era di 3 x 102 CFU/g; nei campioni di gambero e pesce, V. cholerae è stato rilevato a una concentrazione minima di 150 CFU/g, mentre per V. alginolyticus, V. vulnificus e V. parahaemolyticus il limite era di 76 CFU/g. I risultati ottenuti con il metodo LAMP hanno mostrato che l'uso dell'idrossinaphtolo blu ha aumentato la sensibilità del test LAMP eliminando gli inibitori della reazione nei campioni non trattati con ACB (Figura 3). È stato osservato che la sensibilità del test LAMP era maggiore quando i campioni erano stati trattati con ACB.
Determinazione del valore predittivo positivo, del valore predittivo negativo, della specificità e della sensibilità del metodo LAMP
Le prestazioni diagnostiche del metodo ottimizzato di amplificazione isotermica mediata da sequenze ripetute in loop (LAMP), con e senza pretrattamento mediante carbonio attivo-bentonite (ACB), sono state valutate sistematicamente in 150 prove al fine di analizzarne la robustezza (Tabella 3). L'eliminazione degli inibitori naturali presenti negli alimenti mediante il sistema ACB ha migliorato significativamente tutti i parametri diagnostici (sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV)), portandoli a valori pari o superiori al 90% in tutte le matrici, rispetto ai campioni non trattati.
Nei campioni di pesce e gamberi trattati con ACB, il saggio ha dimostrato una performance diagnostica massima, raggiungendo una sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV) del 100% (Figura 4). Al contrario, nei campioni di pesce e gamberi non trattati, la presenza di inibitori derivati dalla matrice ha gravemente compromesso il saggio, riducendo la sensibilità di rilevamento rispettivamente al 62,5% e al 52,5%. Per la matrice altamente complessa dell’ostrica, il trattamento con ACB ha efficacemente attenuato le interferenze principali, ottenendo una sensibilità complessiva elevata del 95,0% e un NPV del 71,4% (Figura 5). In confronto, i campioni di ostrica non trattati hanno mostrato un calo critico della sensibilità di rilevamento al 32,5% e un NPV del 15,6%, a causa dell’elevata presenza di composti organici come glicogeno e lipidi che inibiscono la polimerasi.
La specificità diagnostica del metodo LAMP è rimasta al 100% in tutte e 150 le prove, indipendentemente dal tipo di matrice o dal pretrattamento, senza alcun risultato falso positivo registrato. Questa specificità assoluta è attribuita alla progettazione altamente selettiva dei set di primer mirati a geni specifici per specie (gyrB per V. alginolyticus, ompW per V. cholerae, tlh per V. parahaemolyticus e vvhA per V. vulnificus). Questi risultati statistici dimostrano che il metodo ACB-LAMP ottimizzato è uno strumento altamente affidabile e robusto per la rilevazione rapida, indipendente dalla coltura, di specie patogene di Vibrio in diversi prodotti ittici.
Infine, riteniamo che l'uso del metodo LAMP in combinazione con un pretrattamento per eliminare gli inibitori della reazione possa aumentare la sensibilità nella rilevazione di patogeni negli alimenti mediante il metodo LAMP. Pertanto, questa tecnica applicata alla ricerca di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, e V. vulnificus dovrebbe risultare utile nel monitoraggio finalizzato alla prevenzione delle infezioni causate da questi microrganismi.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Tutti i dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio, inclusi i conteggi numerici delle colonie batteriche recuperate (CFU/g) in corrispondenza di diversi valori di pH e tempi di contatto, nonché i risultati completi delle prestazioni diagnostiche per tutte e 150 le prove di validazione, sono disponibili pubblicamente nel repository Zenodo all'indirizzo https://doi.org/10.5281/zenodo.21799272. Il dataset associato contiene il file completo del foglio di calcolo (File Supplementare 1).
Figura 1: Analisi della specificità dei prodotti amplificati con LAMP su gel di agarosio al 1,5%. Corsia M, marcatore molecolare di dimensione 100 bp; Corsia 1, controllo negativo (Escherichia coli ATCC 25922); Corsia 2, controllo negativo (Listeria monocytogenes ATCC 49594); Corsia 3, V. alginolyticus ATCC 17749; Corsia 4, V. cholerae no O1 CECT 557; Corsia 5, V. parahaemolyticus ATCC 7802; Corsia 6, V. vulnificus ATCC 29037. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Percentuale di recupero di ceppi di Vibrio utilizzando diverse condizioni di pH e tempi di contatto con la miscela di carbone attivo-bentonite (ACB). Il recupero cellulare (%) è stato determinato dopo aver inoculato ceppi di Vibrio a 1,5 × 104 UFC/mL in PBS aggiustato a pH 4,0, 6,0, 7,0 e 9,0, e aver trattato con 4,6 g di ACB per 15 min, 30 min e 60 min. Il punto dati a pH 6,0 e 15 min di contatto dimostra un recupero cellulare ottimale (93,4% ± 2,9%), indicando che un breve tempo di contatto è sufficiente per recuperare le cellule bersaglio mantenendo un'elevata efficienza di rimozione degli inibitori. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Limite di rilevamento dei prodotti amplificati con LAMP in campioni artificiali di frutti di mare contaminati. Risultati dell'amplificazione in campioni di (A) ostrica, (B) gambero e (C) pesce contaminati con diluizioni seriali di specie di Vibrio e pretrattati con ACB. Provette: (1) Controllo negativo; (2) V. alginolyticus; (3) V. parahaemolyticus; (4) V. vulnificus; (5) V. cholerae no O1; e (6) V. mimicus (utilizzato come controllo positivo). Pannello superiore: rilevamento colorimetrico visivo mediante l'uso di 4 μL di Idrossinaftolo Blu (HNB, 125 μM) osservato a occhio nudo, in cui le reazioni positive appaiono blu e quelle negative rimangono viola. Pannello inferiore: rilevamento basato sulla fluorescenza mediante colorazione con Midori Green Advanced (MGA) osservata con un transilluminatore a luce blu. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Parametri comparativi di prestazione diagnostica del metodo LAMP con e senza rimozione degli inibitori. Confronto della sensibilità complessiva, specificità, valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV) in campioni di pesce, gamberi e ostriche contaminati ai limiti minimi rilevabili (n = 10 prove per combinazione specie/matrice, per un totale di 150 prove). Le barre confrontano campioni pretrattati con la miscela ottimizzata di carbonio attivo e bentonite (ACB) rispetto ai controlli non trattati (nessuna rimozione di inibitori). I livelli di contaminazione sono stati stabiliti a 150 CFU/g per V. cholerae in tutte le matrici; 300 CFU/g per V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus nell'ostrica; e 76 CFU/g nel pesce e nei gamberi. Il pretrattamento con ACB ha ripristinato con successo tutti i parametri diagnostici al valore ≥90% in tutte le matrici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Sensibilità e specificità specifiche per l'obiettivo del metodo ACB-LAMP ottimizzato in diverse matrici ittiche. Prestazioni diagnostiche individuali per V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus in campioni di pesce, gambero e ostrica (n = 10 test per combinazione bersaglio/alimento) pretrattati con ACB. L'analisi ha raggiunto il 100% di specificità per tutti i bersagli grazie alla progettazione di primer specifici per specie, mirati ai geni gyrB, ompW, tlh e vvhA. La sensibilità ha raggiunto il 100% nelle matrici di pesce e gambero, con una leggera diminuzione al 90% osservata nelle ostriche a causa dell'elevata complessità di fondo della matrice organica, che interferisce con la reazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Primer utilizzati nei saggi di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP). Descrizione dei primer interni diretti e inversi (FIP, BIP), dei primer esterni (F3, B3) e dei primer di loop (LF, LB) progettati per il targeting specifico per specie di V. alginolyticus (gyrB), V. parahaemolyticus (tlh), V. vulnificus (vvhA) e V. cholerae (ompW). Cliccare qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Tabella di contingenza per la valutazione dei parametri di prestazione diagnostica del metodo LAMP. Configurazione matriciale standard 2x2 utilizzata per classificare e riassumere i Veri Positivi (VP), i Veri Negativi (VN), i Falsi Positivi (FP) e i Falsi Negativi (FN) al fine di calcolare sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (VPP) e valore predittivo negativo (VPN) in campioni di frutti di mare arricchiti e non arricchiti. Cliccare qui per scaricare questa tabella.
File Supplementare 1: Set di dati grezzi a supporto dei risultati di questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Questo studio stabilisce condizioni ottimizzate per aumentare la sensibilità dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) nella rilevazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus in campioni di prodotti ittici contaminati. Evitando la tradizionale fase di pre-arricchimento, il tempo diagnostico viene notevolmente ridotto, offrendo un approccio altamente efficiente e rapido per l'identificazione diretta di patogeni nei prodotti della pesca.
Un importante miglioramento metodologico di questo studio è l'ottimizzazione del passaggio di rimozione dell'inibitore. Le metodologie precedenti utilizzavano un pH di 4 prima dell'amplificazione21; tuttavia, ciò ha portato a un recupero nullo di ceppi di Vibrio, principalmente perché Vibrio le specie sono altamente sensibili agli ambienti acidi26. Per affrontare questo problema, le condizioni sono state modificate sistematicamente al fine di migliorare contemporaneamente il recupero cellulare ed eliminare gli inibitori della reazione naturalmente presenti. La sospensione del carbone attivo con bentonite (ACB) in una soluzione tampone a pH 6, seguita da un'agitazione di 15 minuti con il campione, si è rivelata la condizione ottimale. Questa modifica massimizza la repulsione elettrostatica tra i batteri e l'ACB avvicinandosi al punto isoelettrico della membrana batterica.21,27,28, riducendo così la perdita di cellule bersaglio. Di conseguenza, questo miglioramento metodologico ha prodotto una sensibilità di rilevamento da 2 a 50 volte maggiore rispetto a quella dei campioni processati senza trattamento con ACB.
A differenza di questi miglioramenti metodologici, l'implementazione corretta di questo protocollo potrebbe richiedere un'analisi approfondita dei problemi qualora si verifichino inconvenienti comuni. Un problema frequente riscontrato durante l'implementazione è la rimozione incompleta della materia organica, che può interferire con la polimerasi e ridurre la sensibilità del LAMP, in particolare in matrici altamente contaminate. Se l'amplificazione fallisce o la sensibilità diminuisce, la prima azione di risoluzione dei problemi dovrebbe consistere nel verificare il pH della miscela campione-ACB; deviazioni dal pH 6 possono provocare la morte cellulare (se troppo acido) o un'assorbimento insufficiente degli inibitori. Inoltre, se si verificano falsi negativi nonostante un trattamento corretto con ACB, i ricercatori devono accertarsi che il tempo di contatto non superi i 15 minuti, poiché un'esposizione prolungata può portare a un ritenzione involontaria delle cellule bersaglio da parte della matrice. Per il rilevamento a occhio nudo, cambiamenti di colore ambigui possono essere risolti assicurandosi della completa rimozione degli ioni calcio dalla matrice, che altrimenti potrebbero interferire con la precipitazione del pirofosfato di magnesio nel saggio LAMP.
Questo lavoro riporta, per la prima volta, l'identificazione di Vibrio spp. in campioni di pesce utilizzando il metodo LAMP in combinazione con un pretrattamento ACB. Questa ricerca rappresenta un progresso nel campo scientifico, stabilendo un metodo rapido, affidabile ed economico per l'identificazione dei prodotti della pesca13,19,23,29. Sebbene la PCR convenzionale rappresenti un approccio alternativo per verificare questa ipotesi, l'elevata specificità e i valori predittivi ottenuti dimostrano che il saggio ACB-LAMP è un'opzione superiore. Un vantaggio metodologico fondamentale di questa tecnica è l'indipendenza da apparecchiature sofisticate e costose, come termociclatori, camere per elettroforesi e transilluminatori9,30. Inoltre, il rilevamento visivo dei risultati tramite blu di idrossinaftolo semplifica notevolmente l'interpretazione dei dati.
Nonostante l'elevata sensibilità e specificità raggiunte, una limitazione notevole dello studio è osservata in matrici con elevata contaminazione di base, come i campioni di ostrica. In questi casi, il sistema ACB non riesce ad eliminare completamente tutte le sostanze organiche interferenti, il che riduce leggermente la sensibilità del saggio rispetto ai campioni di pesce o gamberi. Infine, le possibili applicazioni di questo metodo ne evidenziano l'utilità per il monitoraggio routinario ad alto rendimento nell'industria alimentare, al fine di prevenire infezioni correlate a Vibrio. Le future linee di ricerca dovrebbero dare priorità all'automazione dei passaggi di estrazione del DNA e di rimozione degli inibitori ACB. L'automazione di questi elementi metodologici chiave rappresenta un vantaggio cruciale che ridurrà in modo significativo il tempo di manipolazione manuale, minimizzerà gli errori umani e standardizzerà le variabili di risoluzione dei problemi, facilitando così l'applicazione su larga scala di questa tecnica nei laboratori industriali di controllo qualità.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carbonio attivo | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonite | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transilluminatore Bio-Image systems | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerasi del DNA Bst | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifuga (modello J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Miscela di dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Blu di idrossinaftolo | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software di analisi MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrofotometro (modello 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (modello 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Carta Whatman | Whatman | 1001-055 |
Riferimenti
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