Questo studio ottimizza il saggio di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) utilizzando carbonio attivo e bentonite per rilevare specie patogene di Vibrio nei prodotti ittici. Questo trattamento preliminare rimuove efficacemente gli inibitori della reazione, consentendo diagnosi significativamente più rapide, sensibili ed economiche rispetto ai metodi convenzionali.
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Articolo di ricerca
Aumento della Sensibilità dell'Amplificazione in Loop mediante l'Uso di Carbone Attivo e Bentonite per il Rilevamento di Vibrio spp. nei Prodotti della Pesca
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Sommario
Abstract
Il genere Vibrio comprende oltre 100 specie, delle quali 12 sono considerate patogene per l'uomo; le specie più frequentemente isolate negli alimenti sono V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus. Il principale problema nell'identificarle mediante metodi microbiologici convenzionali è rappresentato dai costi elevati e dai tempi lunghi diagnostici. È stata utilizzata l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) per l'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus. È stato impiegato carbone attivo con bentonite (ACB) per rimuovere gli inibitori, migliorando la sensibilità del test; sono stati testati i valori di pH 6, 7 e 9, così come diversi tempi di contatto tra il campione e l'ACB. Il metodo LAMP ha mostrato un miglioramento della sensibilità quando il carbone attivo e la bentonite sono stati utilizzati per rimuovere gli inibitori di reazione in campioni di gamberi, pesce e ostriche. La sensibilità del metodo LAMP, il valore predittivo negativo, il valore predittivo positivo e la specificità del test LAMP sono risultati pari o superiori al 90% per tutti i campioni analizzati. Il metodo LAMP potrebbe rappresentare un'alternativa per l'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus nei prodotti ittici, grazie a un'applicazione più rapida, una maggiore sensibilità e costi inferiori rispetto al metodo standard.
Introduzione
Specie del Vibrio il genere è ampiamente diffuso negli ambienti marini e può essere associato a pesci, molluschi o crostacei in modo che può risultare patogeno o commensale. È stato riportato che 12 specie possono essere patogene per l'uomo, con Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificuse V. alginolyticus rivelando una maggiore frequenza di isolamento nei prodotti della pesca. Negli Stati Uniti, le autorità sanitarie stimano che Vibrio spp. causano più di 80.000 infezioni all'anno1,2,3,4,5L'isolamento di Vibrio spp. viene effettuato mediante metodi convenzionali che prevedono un prearricchimento, la coltura in terreni selettivi e la conferma tramite test biochimici e sierologici.6,7. Questi metodi convenzionali sono limitati dal tempo prolungato necessario per isolare l'agente patogeno (fino a 5 giorni) e dalla loro scarsa potenza risolutiva, che spesso non consente di differenziare con precisione specie strettamente correlate all'interno del Vibrio genere a causa di profili fenotipici e biochimici simili6,7,8.
In alternativa, l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è stata descritta come una tecnica molecolare rapida, accurata ed economica per l'identificazione di patogeni9,10. Questo metodo è altamente conveniente in termini di costi e più veloce della PCR convenzionale, poiché non richiede attrezzature sofisticate come i termociclatori9. Il metodo LAMP consente, in un unico passaggio, il rilevamento del gene bersaglio osservando la torbidità nel tubo di reazione causata dalla precipitazione del pirofosfato di magnesio, che è un prodotto di reazione stabile a 65 °C, la temperatura utilizzata nella tecnica LAMP, in modo che l'aumento della torbidità sia correlato alla quantità di DNA sintetizzato, eliminando la necessità di utilizzare gel di agarosio e transilluminatori11,12,13,14,15.
La sensibilità del rilevamento di questi patogeni può essere migliorata eliminando gli inibitori della reazione, come proteasi, ioni calcio, glicogeno e lipidi, che possono inibire la polimerasi Bst o legarsi alla sequenza di DNA bersaglio, impedendo l'amplificazione13,16,17,18,19,20. È stato riportato che la combinazione di carbonio attivo con bentonite (ACB) presenta un'elevata efficienza nell'eliminare gli inibitori dell'amplificazione, aumentando quindi la sensibilità del rilevamento di Escherichia coli in campioni di ostriche e riducendo i costi, poiché l'ACB è più economico rispetto all'uso di kit commerciali21.
In questo studio, proponiamo di ottimizzare il metodo LAMP utilizzando carbone attivo e bentonite per aumentare la sensibilità nell'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus direttamente da prodotti ittici. Questo metodo ottimizzato fornisce indicazioni pratiche per il monitoraggio di routine e il controllo qualità nell'industria alimentare, risultando altamente applicabile per la diagnosi rapida di patogeni, evitando le lunghe fasi di pre-arricchimento. Per quanto riguarda le prestazioni attese, il metodo dimostra un'elevata sensibilità (superiore al 98%) e specificità (100%) in matrici come pesce e gamberi. Tuttavia, una limitazione importante da considerare è che in campioni altamente contaminati all'origine, come le ostriche, il sistema ACB non riesce ad eliminare completamente tutta la materia organica interferente, il che può ridurre leggermente la sensibilità del saggio (94%–98%).
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Protocollo
Questo studio non ha coinvolto soggetti umani né animali vertebrati; pertanto, non è stata richiesta l'approvazione etica istituzionale. I reagenti e l'equipaggiamento utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Ceppi batterici utilizzati ed estrazione del DNA
I ceppi di Vibrio cholerae no O1 CECT 55, V. parahaemolyticus ATCC 17802, V. vulnificus ATCC 29037 e V. alginolyticus ATCC 17749 sono stati coltivati in brodo brain heart infusion (BHI) con il 2% di NaCl a 37 °C per 24 ore. I ceppi di Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sono stati coltivati in brodo BHI senza cloruro di sodio a 37 °C per 24 ore, da utilizzare come controlli negativi nei test. Per l'estrazione del DNA, una coltura notturna è stata centrifugata a 16.000 x g per 6 minuti a 25 °C in una centrifuga. Il soprannatante è stato accuratamente decantato per evitare di disturbare il pellet cellulare, e il pellet è stato completamente risospeso mediante pipettaggio in 500 μL di soluzione tampone TAE (Tris-acido acetico-EDTA, pH 8). La sospensione è stata fatta bollire per 6 minuti per lisare le cellule, quindi immediatamente raffreddata sul ghiaccio per 5 minuti. È stata eseguita una centrifugazione finale per ottenere il pellet dei detriti cellulari, ottenendo un soprannatante limpido contenente il DNA estratto, che è stato successivamente utilizzato come stampo per l'amplificazione mediante LAMP22,23.
2. Procedura LAMP
I primer utilizzati nel LAMP (Tabella 1) sono stati testati per confermare la specificità nell'identificazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, e V. alginolyticus. L'identificazione di ciascuno Vibrio specie mediante LAMP è stato eseguito in provette da reazione preparando un volume finale di 25 μL della miscela contenente: 1.6 μM di ciascuno dei primer, 1,4 mM di una miscela di dNTP, 6 mM di MgSO4, 800 mM di betaina, 8 U di Bst DNA polimerasi, e 5 μL di DNA stampo. La miscela di reazione è stata delicatamente mescolata e incubata in un bagno termico a 65 °C per 60 min. Al termine del periodo di incubazione, i prodotti di amplificazione sono stati separati su un gel di agarosio all'1,5%. I prodotti di amplificazione sono stati quindi colorati utilizzando 1 μL di un colorante fluorescente per DNA diluito 1:100 e rivelato mediante un transilluminatore a luce blu. Un'altra tecnica per determinare se il test era positivo nell'identificazione dell'agente patogeno prevedeva l'aggiunta di 4 μL di idrossinaphtolo blu (HNB, 125 μM) ai tubi della reazione e osservando il cambiamento di colore a occhio nudo. Un test positivo era indicato dalla formazione di un colore blu, mentre uno negativo da un colore violetto24. Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594, e Salmonella Typhimurium ATCC 14028 sono stati utilizzati come controlli negativi per il metodo LAMP. Le amplificazioni ottenute con la reazione LAMP sono state separate in un gel di agarosio ed osservate mediante un transilluminatore. Le immagini risultanti sono state acquisite e digitalizzate utilizzando il software MS 1D Analysis.
3. Trattamento di campioni di ostriche, gamberi e pesce per l'eliminazione di Vibrio spp. naturalmente presenti nei campioni
Sono stati ottenuti dieci campioni di ostriche, dieci campioni di gamberi e dieci campioni di pesce, ciascuno con un peso approssimativo di 200 g. Per rimuovere le cellule di Vibrio naturalmente presenti, è stata seguita la metodologia precedentemente pubblicata21. Cinquanta grammi (50 g) di ciascun campione sono stati pesati e omogeneizzati meccanicamente in un miscelatore a palette a 260 giri/min per 1 minuto, producendo una sospensione tissutale uniforme, che è stata quindi conservata a -70 °C per 72 ore. Successivamente, i campioni sono stati completamente scongelati utilizzando un bagno termico a 40 °C e lavati con 300 mL di soluzione tampone salina fosfato (0,85% NaCl, pH 9). Per assicurare che la procedura precedente avesse eliminato con successo Vibrio dai campioni, è stata eseguita la metodologia di pre-arricchimento indicata nel capitolo 9 del Bacteriological Analytical Manual della Food and Drug Administration7. La soluzione salina contenente il campione è stata sostituita con 450 mL di acqua peptonata alcalina (APW, pH 9). Successivamente, sono state preparate con attenzione diluizioni seriali in APW fino a una diluizione 10⁻3 e incubate per 24 ore. Infine, un’aliquota da ciascun tubo è stata stesa su un terreno selettivo di agar tiosolfato-citrato-bile-saccarosio (TCBS) e incubata per 24 ore a 37 °C per confermare visivamente l’assenza di colonie tipiche di Vibrio. Tutti i test sono stati eseguiti in triplice replicazione.
4. Preparazione del carbone attivo con bentonite (ACB) e valutazione del recupero cellulare
Per determinare le condizioni in cui l'ACB è più efficiente nell'assorbire gli inibitori presenti nei campioni di prodotti della pesca mantenendo al contempo un assorbimento minimo delle cellule bersaglio, si è seguita la metodologia pubblicata21 per stabilire il pH ottimale e il tempo di contatto tra l'ACB e i campioni alimentari. Il carbonio attivo è stato accuratamente lavato con acqua distillata ed essiccato a 55 °C. Successivamente, 32,6 g di carbonio attivo sono stati mescolati con 3,04 g di bentonite, agitati continuamente a 150 giri/min per 24 ore per garantire una distribuzione uniforme, essiccati a 55 °C e sterilizzati, ottenendo una polvere fine e omogenea di ACB. Per valutare il recupero cellulare dopo il mescolamento delle cellule di Vibrio con la miscela di carbonio attivo e bentonite (ACB), i ceppi sono stati coltivati separatamente in brodo BHI con il 2% di NaCl fino al raggiungimento di una densità cellulare di 1,5 x 104 UFC/mL. Successivamente, 1 mL di ciascun ceppo di Vibrio è stato inoculato separatamente in 100 mL di tampone fosfato (PBS, 0,85% NaCl, aggiustato a pH 4, 6 e 9). La sospensione batterica è stata quindi combinata con 4,6 g di ACB pre-preparato ed agitata a 150 giri/min per 15, 30 e 60 minuti per favorire il contatto. Dopo ciascun tempo di contatto stabilito, un'aliquote di 0,1 mL è stata accuratamente prelevata, spalmata su agar TCBS e incubata a 37 °C per 24 ore prima di effettuare il conteggio delle colonie.
5. Valutazione del limite di rilevamento di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus e V. alginolyticus in campioni di ostriche, gamberi e pesce trattati con carbone attivo e bentonite
Ogni specie di Vibrio utilizzata in questo studio è stata coltivata in brodo BHI e le densità cellulari sono state accuratamente regolate a 1,5 x 104, 7,5 x 103, 3,8 x 103, 1,5 x 103, 7,5 x 102, 3 x 102, 1,5 x 102 e 76 UFC/mL (A600 nm ~0,25), misurate mediante spettrofotometro. Successivamente, 1 mL di ciascuna coltura di Vibrio è stato utilizzato per inoculare 50 g di ciascun campione (ostriche, pesce, gamberi) precedentemente trattato per eliminare qualsiasi presenza di Vibrio. I campioni inoculati sono stati omogeneizzati in un agitatore meccanico a pale a 360 giri/min per 30 secondi e diluiti con 450 mL di APW (pH 6). La miscela è stata quindi centrifugata a 260 x g per 5 minuti a 4 °C per separare i detriti più grandi. Il sopranatante ottenuto è stato travasato in beute contenenti 23 g di ACB, agitato a 150 giri/min per 15 minuti per assorbire gli inibitori e filtrato mediante carta da filtro, ottenendo un eluato limpido privo di particelle di grandi dimensioni. Questo eluato è stato quindi centrifugato a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C, ottenendo un pellet cellulare visibile sul fondo del tubo, successivamente utilizzato per l'estrazione del DNA. Ogni specie di Vibrio è stata identificata mediante il metodo LAMP. I controlli negativi consistevano in campioni inoculati con ceppi di Escherichia coli ATCC 25922, Cronobacter sakazakii ATCC 12868, Listeria monocytogenes ATCC 49594 e Salmonella Typhimurium ATCC 14028. La miscela di reazione è stata incubata in un bagno termostatato a 65 °C per 60 minuti. Al termine dell'incubazione, i prodotti di amplificazione sono stati separati su un gel di agarosio al 1,5% e colorati con un colorante fluorescente per il DNA. I gel sono stati visualizzati su un transilluminatore a luce blu. Infine, 4 μL di idrossinaftolo blu (125 μM) sono stati aggiunti a ciascun tubo per la rilevazione ad occhio nudo24.
6. Determinazione del valore predittivo positivo, del valore predittivo negativo, della specificità e della sensibilità del metodo LAMP
La sensibilità, la specificità e i valori predittivi del metodo LAMP sono stati determinati utilizzando 30 campioni (10 di gamberi, 10 di ostriche e 10 di pesce). Ciascun campione è stato inoculato con la concentrazione minima rilevabile stabilita per ciascuna specie di Vibrio. Per determinare la percentuale di sensibilità e specificità, nonché il valore predittivo negativo (VPN) e il valore predittivo positivo25, è stata utilizzata una tabella di contingenza per riassumere i veri positivi (VP), i veri negativi (VN), i falsi positivi (FP) e i falsi negativi (FN) ottenuti durante gli esperimenti. (Tabella 2). A partire da questi dati, sono state applicate le seguenti formule:
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Risultati
Stirpi batteriche utilizzate ed estrazione del DNA
Il DNA è stato estratto con successo da tutte le stirpi patogene e dai controlli negativi da utilizzare come template per i saggi LAMP successivi.
Procedura LAMP
Gli inneschi utilizzati in questo studio erano specifici per l'amplificazione della sequenza molecolare bersaglio in ciascuna specie di Vibrio. I prodotti di amplificazione ottenuti mediante LAMP quando sono stati utilizzati ceppi di ...
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Discussione
Questo studio stabilisce condizioni ottimizzate per aumentare la sensibilità dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) nella rilevazione di V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus e V. vulnificus in campioni di prodotti ittici contaminati. Evitando la tradizionale fase di pre-arricchimento, il tempo diagnostico viene notevolmente ridotto, offrendo un approccio altamente efficiente e rapido per l'identificazione diretta di patogeni nei prodotti della pesca.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carbonio attivo | Sigma-Aldrich | C2764 | |
| Bentonite | Sigma-Aldrich | 682659 | |
| Betaina | Sigma-Aldrich | B0300 | |
| Transilluminatore Bio-Image systems | Bio-Image systems | MBE-CP-01 | |
| Polimerasi del DNA Bst | New England Biolabs | M0374 | |
| Centrifuga (modello J2-HS) | Beckman Coulter | https://www.americaninstrument.com/products/beckman-j2-hs-high-speed-1273g-centri | |
| Cronobacter sakazakii | ATCC | 12868 | |
| Miscela di dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0241 | |
| Escherichia coli | ATCC | 25922 | |
| Blu di idrossinaftolo | Sigma-Aldrich | 219916 | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 49594 | |
| Midori Green Advanced | Nippon Genetics | MG01 | |
| Software di analisi MS 1D | Major Science | MBE-IMG-SW | |
| Salmonella Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| Spectrofotometro (modello 6300) | Jenway | 630531 | |
| Stomacher Circulator (modello 400) | Seward | 0400/000/AJ | |
| Vibrio alginolyticus | ATCC | 17749 | |
| Vibrio cholerae no O1 | CECT | 55 | |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC | 17802 | |
| Vibrio vulnificus | ATCC | 29037 | |
| Carta Whatman | Whatman | 1001-055 |
Riferimenti
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