Presentiamo un protocollo per l'uso di una piattaforma microfluidica al fine di modellare le interazioni tra tumore e sistema immunitario in un ambiente tridimensionale (3D). I nostri risultati hanno rivelato che le cellule Natural Killer (NK) mantengono la loro attività anti-tumorale anche in condizioni di compressione meccanica.
Articolo metodologico
Una piattaforma microfluidica per studiare il ruolo della compressione meccanica nelle interazioni tra cellule tumorali e cellule immunitarie in una matrice extracellulare 3D
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le forze meccaniche influenzano in modo significativo la capacità delle cellule immunitarie di uccidere le cellule tumorali nel contesto dell'immunoterapia cellulare. Per eliminare le cellule tumorali, le cellule immunitarie devono esercitare forze sulla cellula bersaglio e formare una sinapsi immunitaria, attraverso la quale vengono rilasciate molecole citotossiche — tra cui la granzima B. Nonostante la loro importanza, rimane poco chiaro come i segnali meccanici possano essere sfruttati per potenziare l'uccisione mediata dal sistema immunitario. Questa lacuna conoscitiva è in parte dovuta alla mancanza di strumenti in grado di applicare uno stress meccanico ben controllato alle colture cellulari in un ambiente fisiologicamente realistico. In questo studio descriviamo un dispositivo microfluidico di compressione che permette di applicare una compressione statica o dinamica a sferoidi tumorali inclusi in una matrice extracellulare (ECM), consentendo al contempo l'acquisizione in tempo reale di immagini delle interazioni tra tumore e sistema immunitario mediante microscopia ottica.
La piattaforma microfluidica è composta da 12 compartimenti (6 di controllo e 6 funzionali). Ogni compartimento contiene una camera per cellule posizionata direttamente al di sotto dell'unità di controllo della pressione. Gli sferoidi inclusi nella matrice extracellulare (ECM) vengono posizionati all'interno della camera per cellule. Utilizzando questa piattaforma, abbiamo analizzato l'efficienza di uccisione delle cellule Natural Killer (NK) nei confronti di sferoidi tumorali del seno (MCF-7) in condizioni di compressione meccanica definita. I risultati hanno mostrato che le cellule NK sono rimaste i principali responsabili della morte degli sferoidi tumorali indipendentemente dalla compressione meccanica in collagene a 1,5 mg/mL. Pertanto, si suggerisce che le cellule NK possano mantenere la loro attività antitumorale sotto stress compressivo. Questi risultati dimostrano l'utilità di questa piattaforma nello studio del ruolo delle forze meccaniche nelle interazioni tra tumore e sistema immunitario. Studi in corso stanno identificando i meccanismi molecolari che consentono alle cellule immunitarie di adattarsi allo stress compressivo. Le conoscenze ottenute da questi studi potrebbero rivelare una promettente via terapeutica.
Introduzione
L'immunoterapia antitumorale basata su cellule è un approccio terapeutico che utilizza cellule immunitarie per colpire le cellule tumorali1. Questa strategia ha dimostrato un notevole successo nel trattamento dei tumori ematologici2,3,4. Tuttavia, il livello di successo osservato nei tumori ematologici non è stato ancora completamente ottenuto nel trattamento dei tumori solidi5,6,7. Uno dei principali motivi di questa limitazione è il microambiente tumorale immunosoppressivo (TME), specifico dei tumori solidi.
Il microambiente tumorale (TME) è caratterizzato da segnali meccanici distinti che possono regolare il comportamento cellulare. L'uccisione efficace delle cellule tumorali da parte delle cellule immunitarie richiede che queste ultime esercitino forze sulle cellule bersaglio e stabiliscano una sinapsi immunitaria attraverso la quale vengono rilasciate molecole citotossiche8. Pertanto, comprendere come le forze meccaniche influenzino la funzione delle cellule immunitarie potrebbe portare alla scoperta di nuove strategie terapeutiche per migliorare l'efficacia delle immunoterapie cellulari contro i tumori solidi.
Una caratteristica meccanica fondamentale del microambiente tumorale solido (TME) è lo stress compressivo che il microambiente tumorale esercita sul tumore in crescita9,10. Ad oggi, la maggior parte degli studi sulla compressione si è concentrata sugli effetti sul comportamento delle cellule tumorali10,11. Solo di recente l'attenzione si è spostata verso la comprensione di come la compressione influisca sulle cellule immunitarie all'interno del TME12. Di conseguenza, i meccanismi attraverso cui lo stress compressivo influenza la migrazione delle cellule Natural Killer (NK), la formazione della sinapsi immunitaria e l'attività citotossica rimangono poco chiari e insufficientemente quantificati. Questa lacuna rappresenta una limitazione fondamentale nella nostra comprensione di come i segnali meccanici all'interno del TME possano essere sfruttati per potenziare il targeting immunitario dei tumori solidi.
Un ostacolo principale per affrontare questa domanda è la mancanza di piattaforme sperimentali in grado di applicare una compressione controllata e quantificabile all'interno di microambienti tridimensionali fisiologicamente rilevanti, consentendo al contempo l'acquisizione in tempo reale di immagini delle interazioni tra tumore e sistema immunitario. I primi approcci sperimentali allo studio dello stress compressivo prevedevano l'inclusione di sferoidi in gel di agarosio13. Sebbene questo metodo catturasse efficacemente il confinamento fisico, eliminava le interazioni native tra matrice extracellulare (ECM) e cellule. Dolega et al. hanno applicato una pressione osmotica per indurre stress compressivo; tuttavia, i sferoidi erano sospesi nel mezzo di coltura e quindi rimanevano privi di interazioni con la ECM9. Pandey et al. hanno utilizzato un inserto tipo transwell e pesi per comprimere sferoidi inclusi nel collagene, preservando così le interazioni ECM-cellula, ma limitando l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione necessaria per quantificare la motilità delle cellule immunitarie e la loro attività citotossica14. Nel complesso, questi limiti evidenziano la necessità di piattaforme sperimentali che consentano l'acquisizione in tempo reale di immagini delle risposte morfologiche delle cellule alla compressione all'interno del microambiente tumorale (TME).
In questo studio, presentiamo un protocollo per un dispositivo microfluidico di compressione15 che permette l'applicazione controllata di stress compressivo mantenendo interazioni fisiologicamente rilevanti tra la matrice extracellulare e le cellule, e supportando l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di dinamiche cellulari vive tra cellule immunitarie e tumorali. Il protocollo comprende la preparazione dei componenti del dispositivo (Sezione 1), il montaggio del dispositivo (Sezione 2) e l'acquisizione delle immagini relative alle interazioni tra tumore e sistema immunitario (Sezione 3). Illustreremo il flusso di lavoro utilizzando un saggio di lisi mediata da cellule NK su sferoidi tumorali marcati con proteina verde fluorescente (GFP). Oltre a questa applicazione, la piattaforma può essere facilmente adattata per studiare gli effetti delle forze meccaniche su un'ampia varietà di tipi cellulari e interazioni cellulari in microambienti tridimensionali.
Protocollo
1. Preparazione dei componenti del dispositivo
- Attivazione della superficie della camera di caricamento del campione
- Posizionare una maschera sulla camera di caricamento del campione (Strato 1, L1) in modo che siano esposti soltanto i pozzetti.
- Esporre il Layer 1 mascherato al plasma di ossigeno per 15 s utilizzando l'impostazione ad alta potenza (45 W).
- Posizionare il Livello 1 in una piastra di Petri, quindi proseguire con i seguenti passaggi all'interno di una cappa a sicurezza biologica.
- Trattare ogni pozzetto con 10 µL di PEI (polietilenimina) al 1% per 10 min.
- Rimuovere il PEI dai pozzetti mediante aspirazione sotto vuoto partendo dai quattro angoli di ciascun pozzetto, per evitare di graffiare la superficie di vetro.
- Lavare le pozzette con 10 µL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS), quindi rimuovere il lavaggio mediante aspirazione a vuoto dal lato.
- Trattare le pozzette con 10 µL di glutaraldeide 0,1% per 30 min, quindi rimuovere la glutaraldeide mediante aspirazione sotto vuoto dagli angoli.
- Lavare i pozzetti con PBS per tre volte, rimuovendo il liquido dagli angoli dopo ogni lavaggio.
- Avvolgere la piastra di Petri contenente lo strato 1 con della pellicola di alluminio e lasciarla nell'armadio a sicurezza biologica per tutta la notte.
- Sterilizzazione del telaio metallico
- Immergere il disco di 38 mm × Cornice metallica da 88 mm e le dodici viti testa cilindrica M2.5 in etanolo al 70% per tutta la notte.
- Priming dell'unità di controllo della pressione
- Esponi l'unità di controllo della pressione a un plasma di ossigeno per 30 s utilizzando l'impostazione ad alta potenza (45 W).
- Immergere l'unità di controllo della pressione, con le caratteristiche rivolte verso il basso, in acqua deionizzata (DI) per tutta la notte per riempire i canali e le camere dell'unità di controllo della pressione.
- Il giorno successivo, rimuovere l'unità di controllo della pressione dall'acqua deionizzata in cui era immersa.
- Riempire un serbatoio microfluidico con 50 mL di acqua deionizzata.
NOTA: Il serbatoio microfluidico è costituito da un tubo conico da 50 mL dotato di un coperchio personalizzato contenente due connessioni per tubi: una linea per tubo pneumatico e una linea per tubo di somministrazione del fluido. - Collegare una siringa piena d'aria alla linea del tubo pneumatico.
- Premere lentamente lo stantuffo della siringa per pressurizzare il serbatoio e far scorrere l'acqua deionizzata attraverso il tubo di erogazione del fluido fino a quando il tubo non sarà completamente riempito e l'acqua inizierà a gocciolare dal tubo.
- Collegare il tubo di somministrazione del fluido, già riempito e gocciolante, attraverso il collettore in policarbonato e quindi all'ingresso da 1,5 mm situato sul retro dell'unità di controllo della pressione.
- Lasciare asciugare all'aria l'unità di controllo della pressione e il gruppo collettore per 2 h. Una volta completamente asciutti, l'unità di controllo della pressione e il gruppo collettore sono pronti per il passaggio successivo.
2. Assemblaggio del dispositivo
- Preparazione del collagene con cellule incorporate
- Rimuovere e asciugare la struttura metallica e le viti dall'etanolo al 70%.
- Nella cappa biologica, posizionare tre 600 µL microtubi sul ghiaccio. Etichettare i tubi come segue: "N" (neutralizzazione) "sp" (sferoidi MCF-7), e "sp+NK" (Sferoidi di MCF-7 con cellule NK)
- Preparare la miscela di neutralizzazione aggiungendo 10× il volume richiesto di Mezzo 199 (M199) e idrossido di sodio (NaOH) al "N" tubo
- Trasferire il volume appropriato della miscela M199:NaOH nel "sp" e "sp+NK" tubi per ottenere un finale 1× concentrazione
- Raccogliere gli sferoidi tumorali e centrifugare a 141 × g per 3 min per consentire agli sferoidi di sedimentare sul fondo del tubo.
NOTA: gli sferoidi tumorali di circa 200 µm di diametro sono stati generati utilizzando una piattaforma di micropozzetti in agarosio precedentemente descritta16. In breve, 3 × 106 Le cellule MCF-7 sono state seminate in una piastra a 36 × matrice di 36 micropozzetti in agarosio costituita da pozzetti 200 µm di diametro e 200 µm in profondità e poi coltivati per 7 giorni per produrre gli sferoidi tumorali utilizzati negli esperimenti. - Rimuovere con attenzione il soprannatante e risospendere gli sferoidi in 200 µL di mezzo completo MCF-7/NK 50:50 (Tabella 1 e Tabella 2).
- Raccogliere le cellule NK in un tubo conico da 50 mL, centrifugare a 141 × g per 4 min e conta le cellule.
NOTA: la vitalità delle cellule NK deve essere >85% il giorno dell'esperimento. - Risospendere il pellet risultante in 200 µL di mezzo NK completo.
- Aggiungere il volume appropriato della soluzione madre di collagene in ogni provetta per microcentrifuga.
- Aggiungere il volume appropriato di sospensione cellulare in ciascuna provetta per ottenere un volume finale di 200 µL contenente 1,5 mg/mL di collagene.
NOTA: Il "sp" la sospensione contiene solo sferoidi tumorali, mentre il "sp+NK" la sospensione contiene sferoidi tumorali e 1,5 × 106 Cellule NK - Mescolare delicatamente mediante pipettaggio per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule e del collagene, minimizzando la formazione di bolle.
- Assemblaggio del dispositivo e caricamento delle cellule
- Posizionare il Livello 1 all'interno della cornice metallica essiccata.
- Caricare 9 µL della miscela di collagene in ogni pozzetto.
- Allineare l'unità di controllo della pressione e il gruppo collettore con le camere cellulari sul livello 1 utilizzando un microscopio.
- Inserire le viti essiccate attraverso il collettore e nel telaio metallico, fissando l'unità di controllo della pressione e lo Strato 1 tra il collettore e il telaio metallico.
- Posizionare il dispositivo assemblato in un 37 °C, 5% CO₂₂ incubatore per 45 min per consentire la polimerizzazione del collagene.
- Aggiungere mezzo di coltura cellulare completo MCF-7/NK in rapporto 50:50 attraverso le quattro porte per il mezzo.
3. Imaging delle interazioni tumore-immunitarie
- Posizionare il dispositivo assemblato all'interno dell'incubatore da palco montato su un microscopio a epifluorescenza invertito per l'acquisizione di immagini di cellule vive.
NOTA: L'incubatore da palco ha mantenuto una temperatura di 37 °C e un'umidità di circa il 50% per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini. - Posizionare una scatola di contenimento secondaria sopra il dispositivo assemblato per mantenere l'ambiente interno a 37 °C, umidità al 100% e 5% di CO₂ per tutta la durata dell'acquisizione.
- Collegare il dispositivo al controllore di pressione utilizzando il tubo pneumatico.
- Acquisire immagini in campo chiaro e in GFP degli sferoidi tumorali prima di applicare la compressione, al fine di valutare la deformazione degli sferoidi successivamente alla compressione.
- Applicare una pressione costante di 120 mbar per tutta la durata dell'acquisizione delle immagini.
NOTA: Il software del controllore di pressione consente all'utente di definire il profilo e l'intensità della pressione applicata durante l'esperimento. Supplementary Figure 1 contiene uno schema del sistema di controllo della pressione. - Iniziare l'acquisizione in time-lapse acquisendo immagini in campo chiaro e in GFP ogni 10 minuti per 18 ore.
NOTA: Le immagini sono state acquisite nel piano Z centrale di ciascuno sferoide tumorale utilizzando un obiettivo da 20× su un microscopio a epifluorescenza invertito. Le immagini in campo chiaro e in fluorescenza GFP sono state catturate con tempi di esposizione rispettivamente di 200,1 ms e 298,9 ms.
Risultati
Per i seguenti esperimenti, è stato utilizzato un dispositivo microfluidico di compressione15 per modellare le interazioni tumore-immunitarie all'interno di un microambiente tridimensionale fisiologicamente rilevante, e allo stesso tempo, è in grado di applicare compressioni statiche e dinamiche agli sferoidi tumorali (Figura 1). I componenti del dispositivo (Figura 1A1) e il loro ordine di assemblaggio (Figura 1A2) sono mostrati nella Figura 1A. La struttura metallica funge da base del dispositivo, con lo strato della camera cellulare (L1) posizionato all'interno della struttura. L'unità di controllo della pressione, costituita da L2 e L3 legati mediante plasma, viene posizionata sopra L1, seguita dal collettore (Figura 1A2). Insieme, L1 e l'unità di controllo della pressione formano il dispositivo microfluidico funzionale e sono inseriti tra la struttura metallica e il collettore mediante viti. Il collettore contiene porte di ingresso per i tubi fluidici per fornire pressione al dispositivo, nonché serbatoi di mezzo che facilitano esperimenti di imaging cellulare vitale a lungo termine.
Figura 1: Dispositivo microfluidico a compressione per lo studio delle interazioni tra cellule immunitarie e sferoidi tumorali sotto compressione meccanica. (A1) Fotografia dei componenti necessari per l'assemblaggio del dispositivo, mostrati da sinistra a destra: collettore, unità di controllo della pressione (L2 + L3), strato della camera cellulare (L1) e telaio metallico. (A2) Schema tridimensionale dei componenti del dispositivo, mostrati dall'alto verso il basso: collettore, unità di controllo della pressione (L2 + L3), strato della camera cellulare (L1) e telaio metallico. Gli strati in PDMS L2 e L3 sono uniti mediante legame al plasma per formare l'unità di controllo della pressione, posizionata sopra la camera cellulare. Il collettore e il telaio metallico fissano il dispositivo assemblato. (B1) Schema della sezione trasversale di un'unità di compressione prima e dopo la compressione. Sferoidi tumorali inclusi nella matrice extracellulare (ECM) e cellule NK vengono posizionati nella camera cellulare. La distanza iniziale tra il fondo di L1 e il fondo di L2 prima della compressione è indicata con h. Applicando pressione all'unità di controllo della pressione, L2 si flette verso il basso, causando la compressione dello sferoide tumorale da parte del pistone in PDMS. Lo spostamento verso il basso di L2 dopo la compressione è indicato con Δh. (B2) Immagini sovrapposte in campo chiaro e GFP di uno sferoide tumorale MCF-7 con cellule NK prima (a sinistra) e dopo (a destra) la compressione. Le cellule MCF-7 sono marcate con GFP, mentre le cellule NK non sono marcate. Le cellule NK rappresentative sono cerchiate in blu, mentre i contorni gialli delimitano i margini degli sferoidi tumorali. Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Una volta assemblato, il dispositivo microfluidico di compressione può essere utilizzato per comprimere sferoidi tumorali come illustrato nella Figura 1B. In questo caso, gli sferoidi tumorali inclusi nel collagene con cellule NK vengono introdotti nella camera cellulare (L1). Applicando pressione alla camera di pressione (L3), lo strato di membrana deformabile (L2) si flette verso il basso, causando la trasmissione delle forze compressive al sferoide da parte del pistone in polidimetilsilossano (PDMS). La camera di pressione è controllata da una sorgente di pressione esterna. Ulteriori dettagli riguardo alla progettazione, fabbricazione e caratterizzazione del dispositivo microfluidico di compressione sono stati precedentemente pubblicati in un altro studio15.
Definiamo la distanza tra il fondo della camera della cella (L1) e il fondo della membrana deformabile (L2) come h (Figura 1B1, pannello sinistro). Prima della compressione, questa distanza è di 200 µm. Applicando una pressione fluida all'unità di controllo della pressione, la membrana deformabile si flette verso il basso, riducendo la distanza h di Δh (Δh; Figura 1B1, pannello destro) e comprimendo così lo sferoide tumorale incorporato nel collagene. In questo sistema, la deformazione compressiva è definita come Δh/h, dove h è la distanza iniziale tra L1 e L2 prima della compressione, e Δh è lo spostamento verso il basso di L2 dopo la compressione. Lo spostamento della membrana è stato precedentemente calibrato visualizzando delle microsfere fluorescenti aderenti al fondo di L2. Una descrizione dettagliata della procedura di calibrazione e del calcolo della deformazione compressiva è disponibile in uno studio precedente17. Un esempio di curva di calibrazione è mostrato nella Figura Suppletiva 2.
Figura 1B2 mostra un'immagine sovrapposta rappresentativa in campo chiaro e GFP di uno sferoide MCF-7 con cellule NK incorporate in collagene 1,5 mg/mL prima (pannello sinistro) e dopo la compressione (pannello destro). I confini dello sferoide tumorale sono stati evidenziati in giallo. Dopo la compressione, lo sferoide ha mostrato un aumento dell'area proiettata, indicando una deformazione in risposta all'applicazione efficace di un carico meccanico. Per tutti gli esperimenti presentati in questo manoscritto, abbiamo utilizzato una deformazione da compressione di Δh/h = 50%. Si osserva che il diametro dello sferoide varia da 140 µm a 200 µm. Ciò significa che la deformazione reale applicata allo sferoide è leggermente inferiore al 50%. Video Supplementare 1 e Video Supplementare 2 mostrano rispettivamente z-stack rappresentativi acquisiti nel canale di fluorescenza GFP di uno sferoide MCF-7 incorporato in collagene 1,5 mg/mL prima e dopo l'applicazione di una deformazione compressiva del 50%.
Il dispositivo microfluidico di compressione è stato utilizzato per studiare gli effetti delle cellule NK, della compressione e della loro combinazione sulla morte degli sferoidi tumorali (Figura 2). Questo è reso possibile dalla progettazione del dispositivo, che contiene 12 pozzetti di coltura. Di questi pozzetti, sei possono essere sottoposti a compressione, mentre i restanti sei fungono da controlli non compressi. Questa configurazione permette quattro condizioni sperimentali (Figura 2A): sferoidi da soli senza compressione (sp), sferoidi con cellule NK ma senza compressione (+NK), sferoidi sottoposti a compressione (+comp) e sferoidi esposti sia a compressione che a cellule NK (+comp+NK).
Figura 2: La compressione meccanica modula l'uccisione mediata da cellule NK di sferoidi tumorali. (A) Immagini di fluorescenza a intervallo temporale di sferoidi MCF-7 inclusi in collagene 1,5 mg/mL in quattro condizioni: controllo solo sferoide (sp), sferoidi con cellule NK (+NK), sferoidi con compressione (+comp) e sferoidi con entrambi compressione e cellule NK (+comp+NK). La fluorescenza GFP etichetta le cellule tumorali vitali MCF-7. Il contorno giallo indica la regione di interesse (ROI), definita utilizzando l'immagine a 18 h ed applicata a tutti i punti temporali per la quantificazione della fluorescenza. L'intensità totale di fluorescenza GFP all'interno della ROI è stata misurata e utilizzata per le analisi successive. Barra della scala = 50 µm. (B) Intensità totale di fluorescenza GFP di un singolo sferoide nel tempo in 4 condizioni. Ogni linea colorata rappresenta l'intensità totale di fluorescenza di un singolo sferoide, normalizzata rispetto all'intensità iniziale al tempo t = 0. La linea nera è l'adattamento polinomiale del secondo ordine dei dati di intensità di fluorescenza ottenuti da 7 sferoidi coltivati nella condizione di controllo ed è stata utilizzata come riferimento per il calcolo della perdita di cellule tumorali in (C). (C) La perdita normalizzata di GFP per le condizioni +comp, +NK e +comp+NK è stata calcolata sottraendo l'intensità di GFP al tempo t = 18 h di ciascun sferoide dalla linea di riferimento del solo sferoide (sp). Pertanto, ogni punto dati rappresenta la perdita normalizzata di GFP di un singolo sferoide. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Gli effetti delle cellule NK, della compressione e della loro combinazione sui sferoidi tumorali possono essere visualizzati nelle immagini rappresentative dei sferoidi MCF-7 in collagene 1,5 mg/mL (Figura 2A). Poiché le cellule MCF-7 utilizzate per generare i sferoidi tumorali erano marcate con GFP, la vitalità tumorale è potuta essere monitorata attraverso le variazioni della fluorescenza GFP. Le immagini in GFP e in campo chiaro sono state acquisite ogni 10 min per 18 h mediante un microscopio invertito a epifluorescenza. In particolare, i sferoidi sottoposti a compressione hanno mostrato un'area proiettata maggiore rispetto ai sferoidi non compressi, confermando la corretta trasmissione del carico meccanico dalla membrana deformabile al sferoide tumorale. Nel tempo, si è osservata una perdita progressiva della fluorescenza GFP nelle condizioni +NK e +comp+NK (Figura 2A), indicativa dell'uccisione delle cellule tumorali mediata dalle cellule NK.
Utilizziamo la perdita della fluorescenza GFP come indicatore della morte delle cellule tumorali. Le cellule MCF-7 marcate con GFP utilizzate in questo studio sono state ottenute mediante trasduzione lentivirale. In breve, è stato utilizzato un vettore lentivirale per introdurre una cassetta espressiva di proteina fluorescente verde migliorata (eGFP) sotto il controllo del promotore del fattore di allungamento-1α (EF1α), insieme a un gene di resistenza alla puromicina sotto il controllo del promotore del virus del sarcoma di Rous (RSV). Dopo l'infezione, le cassette espressive lentivirali si sono integrate nel DNA genomico delle cellule MCF-7, determinando un'espressione stabile di GFP. Successivamente, è stata effettuata una selezione con puromicina per eliminare le cellule non trasdotte. L'etichettatura con GFP delle cellule MCF-7 ha permesso di quantificare la vitalità delle cellule tumorali monitorando nel tempo le variazioni dell'intensità della fluorescenza GFP (Figura 2B). È già stato dimostrato un forte collegamento tra la perdita della fluorescenza GFP e marcatori consolidati della morte cellulare, tra cui il marcatore vitale/morto ioduro di propidio (PI) e il marcatore apoptotico annexina-V18, confermando la perdita della fluorescenza GFP come misura surrogata della morte delle cellule tumorali.
Per quantificare gli effetti delle quattro condizioni sperimentali sulla vitalità del tumore, l'intensità totale della fluorescenza GFP di ogni sferoide tumorale è stata misurata in ogni punto temporale, sottratta del fondo e normalizzata al valore iniziale (Figura 2B). L'intensità totale della fluorescenza dello sferoide è stata calcolata all'interno di una regione di interesse (ROI) predefinita. Questa ROI è stata ottenuta delineando manualmente il contorno dello sferoide tumorale nell'immagine a 18 h (contorno giallo nel pannello 18 h, Fig. 2A) mediante uno script MATLAB interno. L'intensità totale della fluorescenza all'interno di questa ROI è stata quindi calcolata per ogni punto temporale e corretta sottraendo la fluorescenza media di fondo misurata da una ROI separata selezionata altrove nell'immagine. I valori di fluorescenza corretti per il fondo sono stati successivamente normalizzati all'intensità iniziale della fluorescenza dello sferoide.
Ogni curva colorata rappresenta l'intensità normalizzata della GFP di un singolo sferoide in una specifica condizione sperimentale mostrata in Figura 2B. La curva è ottenuta mediante un'interpolazione polinomiale del secondo ordine sui dati sperimentali. Le curve viola rappresentano sferoidi sottoposti esclusivamente a compressione (+comp, Figura 2B), le curve rosse rappresentano sferoidi con cellule NK (+NK, Figura 2B), e le curve blu rappresentano sferoidi esposti sia a compressione che a cellule NK (+comp+NK, Figura 2B). Al contrario, la curva nera corrisponde all'interpolazione polinomiale del secondo ordine ottenuta dai dati di sette sferoidi coltivati nella condizione di solo sferoide, utilizzata come controllo (sp, Figura 2B). In Figura 2B, per chiarezza, sono mostrati soltanto i dati interpolati con il polinomio, e non i singoli punti sperimentali. È importante notare che l'intensità della fluorescenza GFP nelle condizioni di solo sferoide (sp) e di sferoide + compressione (+comp) ha mostrato un andamento generalmente crescente nel tempo (Figura 2B), coerente con una crescita tumorale continua o con il mantenimento della vitalità. Al contrario, le condizioni +NK e +comp+NK hanno mostrato una diminuzione progressiva dell'intensità della fluorescenza GFP (Figura 2B), indicativa di morte delle cellule tumorali.
La perdita cumulativa di cellule tumorali è stata quantificata sottraendo l'intensità normalizzata della fluorescenza GFP, interpolata per ogni sferoide in una determinata condizione (+comp, +NK o +comp+NK), rispetto alla condizione di controllo a 18 h (Figura 2C). Di conseguenza, ogni punto dati rappresenta la perdita normalizzata di GFP di un singolo sferoide rispetto al controllo costituito solo da sferoidi (Figura 2C). Pertanto, la condizione +comp riflette la perdita di GFP dovuta esclusivamente alla compressione (viola, Figura 2C), la condizione +NK riflette la perdita di GFP dovuta esclusivamente alle cellule NK (rosso, Figura 2C), e la condizione +comp+NK riflette la perdita di GFP dovuta agli effetti combinati di compressione e cellule NK (blu, Figura 2C). La condizione +comp ha mostrato il grado minore di perdita di GFP (Figura 2C), suggerendo che la compressione da sola ha un effetto minimo sulla vitalità degli sferoidi. Al contrario, sia la condizione +NK che la condizione +comp+NK hanno mostrato una perdita di GFP significativamente maggiore rispetto alla condizione +comp (Figura 2C), indicando che le cellule NK sono i principali responsabili della morte delle cellule tumorali. Sebbene la condizione +comp+NK abbia mostrato una perdita media di GFP maggiore rispetto alla condizione +NK, questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica (Figura 2C). Questi risultati suggeriscono che la compressione non compromette l'uccisione mediata dalle cellule NK delle cellule tumorali. Nel complesso, questi risultati dimostrano che il dispositivo microfluidico per la compressione può essere utilizzato con successo per quantificare gli effetti indipendenti e combinati della compressione e delle cellule NK sulla vitalità degli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale fisiologicamente rilevante.
Al contrario, possono verificarsi risultati subottimali quando (1) gli sferoidi si trovano al di fuori del limite del pistone, (2) gli sferoidi sono posizionati troppo vicino al limite del pistone e (3) più sferoidi si trovano a una distanza inferiore al diametro di un singolo sferoide l'uno dall'altro (Figura 3). In questi casi, i campi corrispondenti devono essere esclusi dall'analisi.
Figura 3: Esempio rappresentativo di una sequenza di immagini di sferoidi esclusi dall'analisi. Mostrate sono immagini a intervalli di tempo in campo chiaro (BF), di fluorescenza GFP e immagini sovrapposte di sferoidi MCF-7 con cellule NK in collagene 1,5 mg/mL prima (colonna di sinistra) e dopo compressione (due colonne di destra). Le immagini pre-compressione sono state acquisite 20 min prima dell'applicazione della pressione e 10 min prima dell'inizio dell'acquisizione a intervalli di tempo. Successivamente, le immagini sono state raccolte ogni 10 min per 18 h, dove lo 0 h corrisponde alla prima immagine acquisita immediatamente dopo la compressione e le 18 h rappresentano la fine dell'esperimento. La freccia blu indica il margine del pistone in PDMS (L2). Questo campo di imaging è stato escluso dall'analisi perché erano presenti due sferoidi all'interno della regione compressa e si trovavano troppo vicini al confine del pistone. Di conseguenza, la deformazione dei sferoidi e l'intensità della fluorescenza GFP non hanno potuto essere quantificate in modo affidabile durante la compressione. Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
(1) Gli sferoidi situati al di fuori del limite del pistone non subiscono compressione poiché la pressione viene applicata esclusivamente all'interno della regione del pistone. Questi sferoidi devono pertanto essere esclusi sia dalle condizioni compresse che da quelle di controllo. (2) Gli sferoidi posizionati sul o vicino al limite del pistone (Figura 3, sferoide superiore) devono essere esclusi, poiché lo sferoide è soggetto a un carico meccanico non uniforme. (3) Gli sferoidi situati entro un diametro di sferoide da sferoidi adiacenti devono essere esclusi (Figura 3). La vicinanza tra sferoidi complica la quantificazione dell'intensità della fluorescenza GFP poiché la regione di interesse (ROI) viene definita utilizzando il punto temporale finale. Nel tempo, i confini degli sferoidi possono diventare indistinguibili, rendendo difficile delimitare un'area di interesse che comprenda accuratamente un singolo sferoide. Questi problemi possono essere ridotti al minimo assicurandosi che gli sferoidi siano centrati all'interno della regione di compressione durante il caricamento del dispositivo. Un'attenzione accurata alla distribuzione, al posizionamento degli sferoidi e alla configurazione del dispositivo è essenziale per ottenere una compressione uniforme e generare risultati sperimentali affidabili e riproducibili.
| Componenti | Concentrazione |
| Mezzo α-MEM | |
| Suero bovino fetale (FBS) | 10% |
| Penicillina/streptomicina | 1% |
Tabella 1: Mezzo completo per MCF-7.
| Componenti | Concentrazione |
| Mezzo α-MEM | |
| Mio-inositolo | 0,2 mM |
| 2-mercaptoetanolo | 0,1 mM |
| Siero bovino fetale (FBS) | 12,50% |
| Acido folico | 0,02 mM |
| Siero equino (HS) | 12,50% |
| Penicillina/streptomicina | 1% |
Tabella 2: Mezzo completo per cellule NK.
Figura supplementare 1: Schema del sistema di controllo della pressione. Un compressore d'aria fornisce aria compressa (fino a 20 psi) al regolatore di pressione. Il regolatore di pressione controlla la pressione dell'aria inviata al serbatoio pressurizzato in base alle impostazioni definite dall'utente. Il regolatore ha una pressione operativa massima di 200 mbar, una stabilità della pressione dello 0,005% della portata massima (FS), una risoluzione della pressione dello 0,003% FS e un tempo di risposta di 9 ms, consentendo un controllo della pressione preciso e riproducibile. Il regolatore è collegato a un computer tramite interfaccia seriale universale (USB), consentendo all'utente di programmare l'entità e il profilo della pressione applicata mediante il software fornito. Il software supporta diverse forme d'onda di compressione, tra cui compressione costante, sinusoidale, triangolare e periodica. In questo schema, la pressione è impostata a 120 mbar e l'aria compressa a questa pressione viene inviata al serbatoio pressurizzato attraverso il tubo pneumatico. Il serbatoio pressurizzato contiene 50 mL di acqua deionizzata (DI) e ha la funzione di convertire la pressione pneumatica in pressione fluidica. Una volta pressurizzato, il serbatoio spinge il fluido attraverso un tubo di alimentazione fino all'unità di controllo della pressione del dispositivo microfluidico di compressione (vedere Figura 1 per i dettagli del dispositivo), dove la pressione fluidica viene utilizzata per applicare una compressione allo sferoide tumorale. Si noti che si utilizza la pressione del fluido per evitare la formazione di bolle d'aria nel dispositivo in PDMS. Cliccare qui per scaricare il file.
Figura supplementare 2: Curva di calibrazione per il dispositivo microfluidico di compressione che mostra la relazione tra lo spostamento del pistone (, µm) e la pressione applicata alla camera di controllo della pressione (KPa). Le misurazioni sperimentali sono rappresentate da punti, mentre la linea continua corrisponde alla simulazione COMSOL. Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM) ottenuto da otto misurazioni sperimentali indipendenti, ma sono troppo piccole per essere visibili. Questa figura è riprodotta da Suh et al.15 con autorizzazione della Royal Society of Chemistry. Cliccare qui per scaricare questo file.
Video supplementare 1: Acquisizione a z-stack X-Y di un sferoide MCF-7 marcato con GFP prima della compressione. Il sferoide è stato incorporato in collagene 1,5 mg/mL all'interno del dispositivo microfluidico per compressione ed acquisito mediante il canale di fluorescenza GFP con un passo in z di 1 µm. Successivamente, è stato utilizzato ImageJ per migliorare il contrasto. Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per scaricare il file.
Video supplementare 2: È stata quindi applicata una deformazione compressiva del 50% (Δh/h = 50%) al sferoide di MCF-7 marcato con GFP, incorporato in collagene a 1,5 mg/mL. Dopo la compressione, è stata acquisita una serie z in modalità X–Y nel canale di fluorescenza GFP con un passo di 1 µm ed elaborata con ImageJ per migliorare il contrasto. Barra della scala = 50 µm. Cliccare qui per scaricare il file.
Discussione
Questo metodo descrive l'uso di un dispositivo microfluidico di compressione per studiare gli effetti dello stress compressivo sulle interazioni tra tumore e sistema immunitario. Questo sistema è in grado di applicare una compressione meccanica controllata a sferoidi tumorali inclusi in una matrice tridimensionale di collagene. Il substrato di vetro che costituisce la base della camera per cellule (L1) permette un'immagine ad alta risoluzione di cellule vive, rendendo la piattaforma particolarmente adatta per studi volti a quantificare la motilità, l'infiltrazione e l'attività citotossica delle cellule immunitarie. In modo significativo, il sistema preserva le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice pur consentendo un controllo preciso dell'ambiente meccanico. Al contrario, molti approcci sperimentali esistenti per lo studio dello stress compressivo richiedono un compromesso tra le interazioni cellulari mediate dalla matrice extracellulare9,13 e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione14.
Nel presente studio, le cellule NK e gli sferoidi tumorali della mammella MCF-7 sono stati utilizzati come sistema modello. Tuttavia, il dispositivo microfluidico di compressione non è limitato a questi tipi cellulari. Ad oggi, la piattaforma è stata applicata con successo a diversi modelli cellulari della mammella, inclusi gli sferoidi tumorali della mammella MDA-MB-231 e gli sferoidi della mammella MCF-10A15,17. La piattaforma può essere facilmente adattata per studiare le interazioni tumore-immunitarie in una varietà di altri modelli tumorali, inclusi sferoidi tumorali cerebrali e polmonari. Analogamente, la piattaforma è compatibile con un'ampia gamma di popolazioni di cellule immunitarie oltre alle cellule NK, consentendo lo studio di diverse interazioni tumore-immunitarie sotto compressione meccanica. Inoltre, il dispositivo non è limitato a studi basati su sferoidi e può essere adattato per esperimenti su singole cellule. Nel complesso, queste caratteristiche rendono la piattaforma uno strumento versatile per esaminare come le forze meccaniche regolino il comportamento cellulare in una vasta gamma di contesti biologici e patologici.
Un altro vantaggio di questo sistema è il controllo preciso sull'entità e sul modello di compressione applicati ai campioni. Nello studio attuale, è stata applicata una deformazione compressiva statica del 50% per tutta la durata dell'esperimento. Tuttavia, il livello di deformazione può essere facilmente modificato in base all'obiettivo sperimentale. Inoltre, utilizzando il sistema di controllo della pressione esterna, è possibile applicare ai sferoidi una compressione dinamica con diverse forme d'onda, tra cui onde quadre e onde sinusoidali. La compressione ad onda quadra prevede intervalli alternati di compressione e rilascio17, mentre la compressione sinusoidale prevede aumenti e diminuzioni graduali della compressione nel tempo15. Queste capacità, combinate con l'imaging quantitativo e la modellizzazione predittiva, possono essere utilizzate per studiare l'influenza della compressione dinamica sull'efficienza di uccisione immunitaria.
Si osserva che questo dispositivo di compressione è stato inizialmente sviluppato per caratterizzare le proprietà meccaniche dei tumori17. Incorporando un sensore di forza in situ e uno strato di gel di poliacrilamide (PAA) al di sotto dello sferoide tumorale, è possibile caratterizzare quantitativamente le proprietà meccaniche dello sferoide, come rigidità e viscoelasticità15,17. Questa modifica amplia l'utilità della piattaforma, estendendola dalla modellizzazione dello stress compressivo alla misurazione diretta del comportamento meccanico del tumore.
Nell'insieme, il dispositivo microfluidico di compressione ha un'ampia gamma di applicazioni, dalla misurazione delle proprietà meccaniche degli sferoidi all'analisi delle interazioni tra tumore e sistema immunitario in un ambiente meccanicamente modulabile. Tuttavia, sono necessari diversi passaggi critici per un funzionamento corretto del dispositivo. Gli sferoidi tumorali devono essere posizionati vicino al centro di ogni pozzetto per garantire una compressione uniforme. L'unità di controllo della pressione deve essere allineata correttamente con lo strato della camera cellulare (L1) per assicurare una trasmissione accurata della pressione. Quando l'unità di controllo della pressione viene posizionata sopra L1, potrebbero formarsi bolle d'aria, che possono compromettere la qualità delle immagini e i risultati sperimentali. Per evitare questo problema, è necessario prestare attenzione a non introdurre bolle durante il caricamento della miscela di collagene, aggiungendo 8 µL di miscela di collagene in ciascun pozzetto in modo da riempire leggermente in eccesso la camera prima di posizionare l'unità di controllo della pressione. Questo accorgimento favorisce un contatto completo tra gli strati e riduce la probabilità di intrappolamento di aria.
In conclusione, questo dispositivo consente una modellizzazione controllata dello stress compressivo all'interno di una matrice tridimensionale di collagene fisiologicamente rilevante, che supporta le interazioni tra tumore e sistema immunitario. Questa piattaforma fornisce uno strumento per indagare come le forze meccaniche statiche e dinamiche regolino l'uccisione mediata dal sistema immunitario e il comportamento tumorale all'interno del microambiente tumorale. Attualmente, stiamo identificando il meccanismo molecolare alla base della modulazione meccanica dell'uccisione immunitaria delle cellule tumorali. Questi studi potrebbero portare all'individuazione di nuovi potenziali bersagli terapeutici farmacologici.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione del National Cancer Institute (Grant R01CA221346), dalla Lance R. Collins Fellowship del College of Engineering della Cornell University assegnata a FM e dal Cornell Provost’s Fund for Research Resilience assegnato a FM. Parte di questo lavoro è stata svolta presso il Cornell NanoScale Facility, membro della National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), che è sostenuta dalla National Science Foundation (Grant NNCI-2025233).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 N NaoH | Sigma-Aldrich | 79724 | 7 µL |
| Mezzo M199 10× | Sigma-Aldrich | M0650 | 200 µL |
| 2-mercaptoetanolo | ThermoFisher | 313500100 | |
| Compressore d'aria | Elveflow | Jun-Air Model 3 Compressor | |
| Stadio microscopico automatico X-Y | Applied Scientific Instrumentation | MS-2000 | |
| Camera CCD | Hamamtsu Photonics | ORCA-R2 | |
| Serum bovino fetale (FBS) | GeminiBio | S11150 | |
| Tubazione per somministrazione di fluidi | Eleveflow | PTFE tubing spare roll | Diametro esterno di 1/16 in |
| Sorgente luminosa a fluorescenza | Excelitas Technologies | X-Cite series 120 PC unit | |
| Acido folico | Sigma | F7876 | |
| Glutaraldeide | EM Sciences | 16019 | 0,10% |
| Pulitore al plasma Harrick | Harrick Plasma | PDC-001-HP | Impostazione ad alta potenza (45 W) |
| Serum equino (HS) | ThermoFisher | 16050-122 | |
| Microscopio invertito epifluorescente | Olympus | IX81 | Obiettivo 20x (NA = 0,25), utilizzato con il software Olympus CellSens |
| Maschera | Artus | 10 Sheet Aluminum Shim Stock | Spessore di 0,0125" (0,75 mm) |
| Linea cellulare stabile MCF-7/GFP (Puromicina) | GenTarget Inc | SC050-G | |
| Cornice metallica | Prodotto su misura | Prodotto su misura | |
| Reservoir microfluidico | Eleveflow | 50 mL microfluidic reservoir | |
| Microscopio | Olympus | CKX41 | Obiettivo 4x (NA = 0,1) |
| Mio-inositolo | Sigma | I7508 | |
| NK-92 MI | ATCC | CRL-2407 | |
| Penicillina/streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | ThermoFisher | 10010072 | |
| Tubazione pneumatica | Eleveflow | PUR polyether clear pipe input | Diametro esterno di 4" mm |
| Polietilenimmina (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | 1% |
| Controllore di pressione | Elveflow | OB1 NK4 | Utilizzato con il software Elveflow Smart Interface |
| Collagene di tipo I da coda di ratto | Corning | 354249 | 31,3 µL di collagene stock a 9,6 mg/mL |
| Viti | Phillips | M2.5 a testa piana | 12 viti |
| Incubatore per palco | Precision Plastic | Prodotto su misura | |
| Siringa | Becton Dickinson | 303134 | Abbinata a un connettore maschio luer con blocco integrale da 3/32" OD Barb di Eleveflow |
| Mezzo α-MEM | ThermoFisher | 12561056 |
Riferimenti
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