Viene descritto un approccio modificato per l'estrazione del primo molare mandibolare nei topi e confrontato con l'approccio convenzionale al fine di valutare l'efficienza e la riproducibilità della procedura. L'approccio modificato migliora la coerenza procedurale e riduce le difficoltà tecniche nella creazione di un modello murino di guarigione dell'alveolo dentale mandibolare.
Articolo metodologico
Un approccio modificato per l'estrazione dentale volto a migliorare l'efficienza e la coerenza procedurale in un modello di guarigione dell'alveolo dentale mandibolare murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il modello di guarigione dell'alveolo dentale (TSHM) è un modello animale ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione ossea. Sebbene il modello TSHM mandibolare murino sia utile per indagare processi patologici specifici della mandibola, la sua realizzazione rimane tecnicamente impegnativa a causa delle caratteristiche anatomiche e biomeccaniche della regione molare mandibolare. Questo protocollo descrive un approccio modificato per l'estrazione del primo molare mandibolare nei topi e ne confronta le prestazioni con la tecnica convenzionale, al fine di migliorare l'efficienza e la riproducibilità della procedura. In condizioni sperimentali controllate, l'approccio modificato ha ridotto significativamente il tempo medio di estrazione da 29 a 10 minuti. Inoltre, il gruppo trattato con la tecnica modificata ha mostrato un numero inferiore di complicanze legate all'estrazione, tra cui fratture radicolari e dell'osso alveolare, indicando una maggiore coerenza procedurale. Un'analisi mediante tomografia computerizzata microfocale (μCT) ha ulteriormente dimostrato un migliore mantenimento dell'architettura dell'alveolo estrattivo durante le fasi iniziali di guarigione. Questi risultati indicano che l'approccio modificato all'estrazione migliora l'efficienza e la riproducibilità della procedura, riducendo al contempo le difficoltà tecniche associate all'estrazione dentale murina della mandibola. Questo protocollo potrebbe facilitare un'implementazione più uniforme dei modelli di guarigione dell'alveolo dentale murino, in particolare per ricercatori con esperienza limitata in microchirurgia.
Introduzione
Il modello di guarigione dell'alveolo dentario (TSHM) è un modello classico per lo studio della rigenerazione ossea1. Questo modello crea una lesione impegnativa ma subcritica all'interno dell'osso alveolare, consentendo una riparazione naturale favorevole senza interventi aggiuntivi1. I topi sono ampiamente utilizzati come organismi modello grazie al loro background genetico, alle somiglianze con il metabolismo osseo umano, ai costi relativamente bassi di allevamento e alla facilità di mantenimento2. Negli ultimi decenni, i rapidi progressi nella tecnologia di editing genico hanno reso i topi indispensabili per indagare i meccanismi molecolari alla base della rigenerazione ossea3. Di conseguenza, l'estrazione dei molari in topi transgenici è stata ampiamente utilizzata per stabilire il modello TSHM allo scopo di studiare i meccanismi regolatori della rigenerazione ossea4,5,6.
La maggior parte degli studi precedenti ha stabilito il modello murino di TSHM utilizzando la mascella4,5,6, poiché la mandibola è meccanicamente più rigida e meno compliant rispetto alla mascella7, il che aumenta la difficoltà tecnica dell'estrazione dentale. Inoltre, il campo chirurgico per l'estrazione dei molari mascellari è relativamente più accessibile e la mascella è più facile da stabilizzare rispetto alla mandibola, rendendo la procedura tecnicamente meno complessa. Nonostante queste difficoltà, la morfologia radicolare apicale curva e ingrandita del primo molare mandibolare del topo aumenta il fissaggio meccanico all'interno dell'osso alveolare circostante8,9, complicando ulteriormente l'estrazione (Figura 1). Tuttavia, i modelli di estrazione mandibolare rimangono indispensabili per lo studio di processi patologici specifici della mandibola, inclusi l'osteomielite, l'osteonecrosi mascellare correlata a farmaci, l'osseointegrazione degli impianti e la rigenerazione ossea mediante biomateriali10,11,12. Pertanto, un metodo riproducibile e affidabile per l'estrazione dei molari mandibolari nei topi è fondamentale per studi che richiedono modelli di guarigione dell'alveolo dentale specifici per la mandibola.
Figura 1. Confronto schematizzato della morfologia del dente negli esseri umani e nei topi.
(A) Illustrazione schematica di un dente umano adulto. (B) Illustrazione schematica del primo molare mandibolare di un topo adolescente. (C) Illustrazione schematica del primo molare mandibolare di un topo adulto. I diagrammi evidenziano le differenze nella morfologia delle radici e nella distribuzione del cemento che contribuiscono al maggiore fissaggio meccanico dei primi molari mandibolari nei topi adulti all'interno dell'osso alveolare. Lo smalto, la dentina e il cemento sono indicati dai corrispondenti colori riportati nella legenda. Le caratteristiche anatomiche si basano su descrizioni pubblicate8,9,15. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Una tecnica precedentemente sviluppata dal nostro gruppo di ricerca per l'estrazione dentaria utilizza siringhe modificate in elevatori dentali13. Sebbene questo metodo consenta l'estrazione con successo del primo molare mandibolare destro nei topi, richiede un elevato livello di precisione tecnica e presenta una curva di apprendimento ripida, che necessita di un'ampia pratica. Operatori inesperti potrebbero involontariamente provocare lesioni alle strutture anatomiche adiacenti. Inoltre, l'estrazione del primo molare mandibolare sinistro richiede un ulteriore addestramento "a immagine speculare" per raggiungere la competenza procedurale. Queste difficoltà possono compromettere l'integrità della sede alveolare post-estrattiva, ridurre la coerenza dei risultati di guarigione tra gli animali e limitare l'accessibilità del modello per ricercatori con esperienza microchirurgica limitata.
Questo protocollo descrive un approccio modificato per l’estrazione del primo molare mandibolare nei topi, volto a migliorare l’accessibilità e la riproducibilità della procedura. Il protocollo è stato validato in topi maschi C57BL/6 di 8 settimane per la realizzazione di un modello murino di TSHM del primo molare mandibolare. L’approccio modificato è stato confrontato sistematicamente con la tecnica convenzionale al fine di valutare l’efficienza procedurale, il successo dell’estrazione e le complicanze legate alla procedura. Inoltre, sono stati analizzati i principali modi di fallimento tecnico riscontrati durante l’apprendimento del metodo, al fine di fornire indicazioni pratiche ai ricercatori che intendono stabilire un modello murino di TSHM mandibolare.
Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico della Scuola di Stomatologia di West China, Università di Sichuan (WCHSIRB-D-2025-188), e sono state eseguite nel rispetto delle linee guida istituzionali per la cura degli animali.
NOTA: Utilizzare topi maschi C57BL/6 di 8 settimane di età, del peso di 22–29 g. Mantenere gli animali con una dieta standard a base di mangime e acqua fornita ad libitum in condizioni abitative standard (21°C–24°C, umidità 40%–60%, ciclo luce-buio di 12 ore). Utilizzare i materiali e gli strumenti elencati nella Tabella dei Materiali. Utilizzare 24 topi per la valutazione comparativa e la presentazione dei casi falliti. Utilizzare topi aggiuntivi per la formazione dell'operatore prima dell'esperimento comparativo.
1. Preparazione preoperatoria
- Preparazione dello strumento
- Preparare aghi per siringa da 25 G da utilizzare come elevatori (opzionale). Curvare la punta smussata di ciascun ago a circa 20°–40°13.
- Preparare pinzette oftalmiche dentate da utilizzare come pinze dentali. Ispezionare la punta dentata con l'ausilio di una lente d'ingrandimento per verificare che i denti siano correttamente allineati e privi di deformazioni.
- Assemblare un retrattore per bocca utilizzando un elastico e quattro aghi per siringa da 25 G. Preparare una tavola di polistirolo o cartone come piattaforma operatoria, del nastro adesivo per fissare gli arti del topo e una lampada frontale per illuminare il campo operatorio.
- Preparare una piastra riscaldante per il recupero postoperatorio e preriscaldarla a circa 38°C prima dell'intervento. Preparare batuffoli di cotone per l'emostasi e una quantità adeguata di soluzione fisiologica per la pulizia della cavità orale.
- Preparare un copridito da indossare sul pollice per proteggere l'operatore durante la procedura di estrazione.
- Posizionare un tessuto non tessuto sterile sulla superficie operatoria e sulla piastra riscaldante per mantenere un campo sterile.
- Preparazione dell'anestesia
- Disinfettare l'addome del topo utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione antisettica a base di povidone-iodio. Somministrare pentobarbital sodico al 1% (50 mg/kg) per via intraperitoneale14. Valutare la profondità dell'anestesia mediante il test di pizzicamento delle dita dei piedi e somministrare anestetico supplementare se necessario.
NOTA: Se il riflesso al pizzicamento delle dita dei piedi ritorna o se la procedura si avvicina alla durata anestetica prevista, interrompere l'intervento e somministrare anestetico supplementare secondo il protocollo veterinario istituzionale approvato. - Applicare immediatamente dopo l'anestesia un unguento oftalmico veterinario su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccamento della cornea.
- Disinfettare l'addome del topo utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione antisettica a base di povidone-iodio. Somministrare pentobarbital sodico al 1% (50 mg/kg) per via intraperitoneale14. Valutare la profondità dell'anestesia mediante il test di pizzicamento delle dita dei piedi e somministrare anestetico supplementare se necessario.
- Preparazione della disinfezione e sterilizzazione
- Disinfettare la piattaforma chirurgica, la piastra riscaldante, il nastro adesivo, il copridito e l'area di lavoro circostante con etanolo al 75%. Utilizzare nuovi bastoncini sterili, tessuto non tessuto, elastici e aghi per ogni topo. Sterilizzare le pinzette dentate e la soluzione fisiologica seguendo il protocollo istituzionale standard di sterilizzazione a vapore prima dell'uso.
ATTENZIONE: L'etanolo al 75% è infiammabile. Utilizzarlo in un'area ben ventilata, lontano da fonti di calore, scintille, fiamme libere e altri possibili inneschi. Indossare l'apposita attrezzatura di protezione individuale. Attendere che strumenti e superfici trattati con etanolo siano completamente asciutti prima di iniziare la procedura. - Eseguire l'igiene delle mani prima di iniziare la procedura. Indossare camice chirurgico pulito, cuffia sterile, mascherina chirurgica e guanti sterili.
- Disinfettare la piattaforma chirurgica, la piastra riscaldante, il nastro adesivo, il copridito e l'area di lavoro circostante con etanolo al 75%. Utilizzare nuovi bastoncini sterili, tessuto non tessuto, elastici e aghi per ogni topo. Sterilizzare le pinzette dentate e la soluzione fisiologica seguendo il protocollo istituzionale standard di sterilizzazione a vapore prima dell'uso.
2. Procedura chirurgica
- Fissazione e pulizia del topo
- Posizionare il topo in posizione supina sulla piastra di fissaggio e fissare gli arti con del nastro adesivo. Inserire due aghi da 25 G nel supporto in schiuma a livello del piano orbito-auricolare e inserire altri due aghi da 25 G al di sotto della mandibola.
- Posizionare l'elastico sugli aghi e attraverso gli incisivi per mantenere la bocca aperta. Ritirare delicatamente la lingua e posizionarla sul lato opposto al sito di estrazione per evitare ostruzioni del campo operatorio. Utilizzare il primo molare mandibolare destro come esempio rappresentativo in tutto il protocollo.
- Rimuovere i residui di cibo e altri materiali estranei dalla cavità orale utilizzando una piccola pallina di cotone inumidita con soluzione salina.
NOTA: Spremere accuratamente il cotone per rimuovere l'eccesso di soluzione salina ed evitare che il liquido entri nella cavità orale, il che potrebbe causare soffocamento.
- Eliminazione della resistenza distale e mesiale (opzionale)
- Utilizzare la pinzetta con la mano sinistra per ritirare l'angolo destro della bocca ed esporre completamente il primo molare mandibolare destro e i tessuti molli buccali e linguale circostanti.
- Impugnare la pinzetta con la mano destra. Successivamente, tenere un ago da 25 G con la mano sinistra e inserire con attenzione l'ago nel legamento parodontale buccale adiacente alla radice distale per creare uno spazio nel legamento parodontale.
- Avanzare lentamente l'ago verso la regione periapicale ruotandolo in direzione mesiale e linguale verso il molare, per allentare la radice dal suo alveolo.
- Inserire un ago da 25 G nella biforcazione radicolare dal lato buccale ed elevarlo in direzione occlusale con la mano sinistra. Inserire un secondo ago da 25 G nel legamento parodontale linguale adiacente alla radice mesiale con la mano destra per creare uno spazio nel legamento parodontale, quindi ruotare l'ago in direzione distale e buccale.
- Ritirare entrambi gli aghi dal campo operatorio dopo aver completato l'allentamento preliminare del legamento parodontale.
NOTA: Eseguire l'allentamento preliminare del legamento parodontale solo quando il dente presenta scarsa mobilità e una resistenza marcata dopo le prime oscillazioni con la pinzetta.
- Oscillazione ed estrazione
- Stabilizzare la testa del topo utilizzando l'indice e il medio della mano sinistra. Appoggiare il pollice, protetto da un manicotto per dito, sugli incisivi mandibolari per ottenere un supporto stabile mentre si impugna la pinzetta con la mano destra.
- Posizionare le punte della pinzetta perpendicolari al piano occlusale e parallele all'asse longitudinale del dente. Posizionare le punte dentellate all'interno della biforcazione radicolare per ottenere una trazione stabile.
NOTA: Non afferrare direttamente la radice del dente con la pinzetta poiché ciò potrebbe causare frattura radicolare. - Agganciare la corona con la pinzetta ed esercitare movimenti oscillatori leggeri in direzione buccolinguale. Limitare l'angolo di oscillazione verso la parte buccale a 30° e quello verso la parte linguale a 50°. Eseguire un movimento oscillatorio ogni 1–1,5 s.
- Mantenere la trazione lungo l'asse longitudinale del molare, dall'apice verso la corona, esercitando contemporaneamente un supporto contrapposto stabile contro gli incisivi mandibolari con il pollice sinistro per stabilizzare la mandibola.
NOTA: Mantenere un supporto contrapposto continuo e stabile, evitando compressioni eccessive o spostamenti degli incisivi e dei tessuti molli adiacenti. - Continuare i movimenti oscillatori finché il dente diventa gradualmente mobile e la superficie occlusale si solleva visibilmente al di sopra dei molari adiacenti. Mantenere le punte della pinzetta parallele all'asse longitudinale del dente per tutta la durata della procedura, quindi estrarre il dente una volta raggiunta la mobilità sufficiente.
NOTA: Prima di applicare la forza finale di estrazione, valutare la mobilità del dente oscillando delicatamente la corona in direzione buccolinguale. Procedere con l'estrazione solo quando la corona può essere spostata con minima resistenza e l'ampiezza del movimento buccolinguale raggiunge circa metà della larghezza della corona. Rivalutare immediatamente la profondità dell'anestesia prima dell'estrazione completa. Somministrare anestesia supplementare se necessario (Figura 2).
Figura 2. Confronto tra i metodi convenzionali e modificati di estrazione del primo molare mandibolare murino.
(A) Illustrazione schematica del metodo convenzionale di estrazione, in cui un ago curvato da 25 G viene inserito nel legamento parodontale e utilizzato come leva per lussare il dente. (B) Illustrazione schematica del metodo di estrazione modificato, in cui pinze oftalmiche dentate afferrano la corona ed esercitano una trazione parallela all’asse longitudinale del dente. (C) Immagine rappresentativa della punta curvata dell’ago da 25 G utilizzato come sollevatore. (D) Immagine rappresentativa delle pinze oftalmiche dentate utilizzate come strumento microchirurgico per l’estrazione. (E) Immagine intraoperatoria rappresentativa che mostra la cavità alveolare immediatamente dopo l’estrazione del primo molare mandibolare; le linee tratteggiate indicano le cavità alveolari. (F) Vista vestibolare di un primo molare mandibolare estratto con successo. (G) Vista linguale dello stesso primo molare mandibolare estratto. Le barre della scala corrispondono a 2 mm (C,D) e 400 µm (E–G). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Esame dei denti estratti e delle alveole di estrazione
- Esaminare il dente estratto per confermare l'avvenuta rimozione completa e l'integrità strutturale. Verificare che la morfologia radicolare sia preservata, con una radice mesiale più lunga, una radice distale più corta e un allargamento apicale15. Accertarsi che non siano presenti frammenti ossei alveolari ancora attaccati al dente estratto.
- Esaminare l'alveolo estrattivo per confermare che sia pulito e privo di frammenti radicolari residui (Figura 2).
NOTA: Se durante l'estrazione si sospetta la presenza di una radice residua o fratturata, evitare manovre ripetute poiché tentativi eccessivi potrebbero peggiorare i difetti dell'alveolo. Ispezionare la sede estrattiva con l'ausilio della magnificazione per confermare la presenza di frammenti radicolari residui. Registrare i casi con radici residue o fratturate come estrazioni fallite ed escluderli dalla successiva valutazione del modello. Gestire questi animali in conformità al protocollo animale approvato.
4. Cura postoperatoria
- Applicare cotone asciutto per ottenere emostasi. Pulire la cavità orale utilizzando una piccola pallina di cotone inumidita con soluzione salina e quindi riposizionare la lingua.
NOTA: Inumidire la pallina di cotone con il volume minimo di soluzione salina sterile necessario ad ammorbidirne la superficie senza produrre liquido libero. - Somministrare carprofene (5 mg/kg, per via sottocutanea) dopo l'intervento chirurgico per l'analgesia postoperatoria.
- Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante e monitorarlo continuamente fino al recupero della coscienza.
- Dopo il risveglio dall'anestesia, fornire cibo standard ammorbidito o una dieta in gel sulla base della gabbia per 3 giorni, con acqua disponibile ad libitum. Riprendere la dieta standard con cibo solido dopo aver confermato un comportamento alimentare normale.
- Monitorare l'assunzione di cibo, il peso corporeo, l'attività, il comportamento di toeletta, il gonfiore facciale, il sanguinamento orale e i segni di dolore o malessere a intervalli predeterminati.
5. Formazione degli operatori
- Assegnare casualmente due operatori, nessuno dei quali abbia esperienza pregressa con modelli di rigenerazione dei tessuti duri del topo, al gruppo di estrazione convenzionale o modificato. Addestrare i due operatori separatamente sotto la supervisione dello stesso istruttore, esperto sia nell'approccio convenzionale che in quello modificato.
- Nella prima settimana, istruire ciascun operatore ad esercitarsi sulla procedura di estrazione assegnata utilizzando cadaveri di topo, al fine di familiarizzare con il flusso chirurgico.
- Nella seconda settimana, supervisionare l’addestramento su topi vivi per valutare e perfezionare l’applicazione pratica di ciascuna tecnica. Monitorare ogni procedura per garantire un’adeguata anestesia e prevenire complicazioni chirurgiche impreviste, come lesioni accidentali ai tessuti molli circostanti causate da un uso improprio degli strumenti o danni alle strutture alveolari. Confermare la competenza dell’operatore quando riesce a eseguire in modo indipendente tre estrazioni consecutive con successo. Al termine dell’addestramento supervisionato, procedere agli esperimenti comparativi di estrazione.
6. Preparazione del campione
- Eutanasia i topi mediante dislocazione cervicale. Disseca le mandibole dalla testa e rimuovi i tessuti molli aderenti.
- Fissare le mandibole in soluzione di paraformaldeide al 4% per 48 h. Conservare i campioni in PBS prima di µCT scansione
7. µCT e analisi
- Scansionare le mandibole utilizzando un µCT scanner. Impostare i parametri di scansione su 80 kV, 500 µA, 10 µm risoluzione del voxel e scansione strato per strato.
- Calibrare il µCT sistema utilizzando un fantoccio in idrossiapatite. Scansionare il fantoccio ed esportare le immagini ricostruite utilizzando DataViewer.
- Analizzare le immagini del fantoccio utilizzando CTAn. Stabilire una curva di calibrazione correlando i valori misurati di attenuazione TC dei settori del fantoccio con le loro densità minerali note, al fine di convertire i valori di attenuazione in DMO.
- Applicare parametri di scansione e ricostruzione identici a tutti i campioni.
- Ricostruire tutti i dataset utilizzando il flusso di lavoro di ricostruzione standardizzato in CTAn associato al µCT Sistema. Applicare identiche impostazioni di ricostruzione, definizione di ROI e criteri di analisi quantitativa a tutti i campioni. Eseguire la ricostruzione tridimensionale separatamente utilizzando Mimics Research per una visualizzazione rappresentativa, seguendo la stessa definizione di ROI utilizzata per l'analisi quantitativa con CTAn.
- Definire la regione di interesse (ROI) selezionando la regione apicale della radice del primo molare mandibolare estratto. Acquisire 100 sezioni trasversali consecutive che si estendono in direzione apicale dalla giunzione amelo-cementizia del secondo molare adiacente.
- Delimitare manualmente la regione di interesse (ROI) in ogni sezione lungo il margine dell'osso alveolare neoformato che circonda la cavità estrattiva. Eseguire il successivo processamento delle immagini e l'analisi quantitativa utilizzando CTAn con parametri di analisi identici per tutti i campioni.
- Eseguire la ricostruzione tridimensionale utilizzando Mimics Research. Calcolare l'incidenza di fratture radicolari e difetti della parete alveolare come proporzione dei campioni mandibolari che presentano ciascuna condizione rispetto al numero totale di campioni mandibolari.
- Eseguire tutte le analisi statistiche e generare i grafici utilizzando GraphPad Prism v10.1.2. Valutare la normalità delle variabili continue mediante il test di Shapiro–Wilk.
- Definire il singolo topo e la relativa alveolo di estrazione come unità sperimentale per tutte le analisi.
- Confrontare il tempo di estrazione, la densità minerale ossea (BMD) e il rapporto BV/TV tra i gruppi utilizzando un test t di Student a due code non appaiato t test. Confrontare l'incidenza di fratture radicolari e difetti della parete alveolare mediante il test esatto di Fisher.
- Indicare la significatività statistica come segue: *, p < 0.05; **, p < 0,01; e ***, p < 0,001. Utilizzare "ns" per indicare l'assenza di differenza statisticamente significativa tra i due gruppi.
Risultati
Le caratteristiche anatomiche rilevanti per l'estrazione del primo molare mandibolare sono illustrate nella Figura 1, mentre i metodi estrattivi convenzionale e modificato sono mostrati schematicamente nelle Figure 2A,B. Immagini rappresentative dell'ago preparato e della pinzetta oftalmica dentata, dei siti estrattivi freschi e del primo molare mandibolare estratto sono mostrate nelle Figure 2C–G. L'intero flusso di procedura è riassunto nella Figura 3. Per confrontare l'efficienza e la riproducibilità dei due approcci, due operatori con pari esperienza nella manipolazione dei topi sono stati assegnati casualmente per eseguire l'estrazione del primo molare mandibolare utilizzando il metodo convenzionale o quello modificato. Tutti i topi erano maschi C57BL/6 di 8 settimane. Il tempo di estrazione e le complicanze correlate alla procedura sono stati registrati immediatamente dopo l'estrazione, mentre i siti estrattivi sono stati valutati mediante µCT dopo 2 settimane di guarigione. Il tempo di estrazione è stato registrato durante la procedura e pertanto non poteva essere valutato in modo cieco; i denti estratti e i dataset µCT sono stati codificati prima della valutazione, in modo che il valutatore fosse cieco rispetto al metodo di estrazione.
Figura 3. Flusso di lavoro delle procedure convenzionali e modificate di estrazione del primo molare mandibolare murino.
Il flusso di lavoro inizia con la preparazione degli strumenti, l'anestesia, la disinfezione e sterilizzazione, e il fissaggio del topo. Il protocollo si divide successivamente in due approcci: convenzionale e modificato. L'approccio convenzionale prevede l'eliminazione sequenziale della resistenza distale e mesiale prima dell'estrazione del dente, mentre l'approccio modificato include un eventuale allentamento preliminare del legamento parodontale seguito da movimenti oscillatori ed estrazione del dente mediante pinzette oftalmiche dentate. Entrambi gli approcci si concludono con l'esame del dente estratto e dell'alveolo, seguito dalle cure postoperatorie. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le immagini rappresentative di µTC ottenute immediatamente dopo l'estrazione e dopo 2 settimane di guarigione sono mostrate in Figura 4A–D. L'approccio modificato ha ridotto significativamente il tempo medio di estrazione rispetto all'approccio convenzionale (10 min contro 29 min, p = 0,0006; Figura 4E). La frattura radicolare si è verificata in 2/6 topi (33,3%) nel gruppo modificato e in 4/6 topi (66,7%) nel gruppo convenzionale, senza differenza statisticamente significativa tra i gruppi (p = 0,5455; Figura 4F). Difetti della parete alveolare sono stati osservati in 0/6 topi nel gruppo modificato e in 4/6 topi (66,7%) nel gruppo convenzionale; questa differenza non è risultata statisticamente significativa (p = 0,0606; Figura 4G). Dopo 2 settimane di guarigione, l'analisi mediante µTC ha mostrato valori significativamente più elevati di BMD e BV/TV nel gruppo modificato rispetto al gruppo convenzionale (p = 0,0188 e p = 0,0253, rispettivamente; Figura 4H,I). Questi risultati dimostrano tempi di estrazione più brevi con l'approccio modificato e suggeriscono una maggiore coerenza dell'estrazione nelle condizioni sperimentali testate.
Figura 4Confronto tra gli approcci convenzionale e modificato per l'estrazione del primo molare mandibolare murino e la successiva guarigione dell'alveolo dentale.
(A–D) Tomografia computerizzata microscopica rappresentativa (µCT) immagini degli alveoli estrattivi immediatamente dopo l'estrazione (A,B) e a 2 settimane dall'estrazione (C,D) utilizzando l'approccio convenzionale (A,C) o modificato (B,D). I pannelli 1–3 mostrano rispettivamente le viste sagittale, coronale e trasversale, mentre il pannello 4 mostra la corrispondente ricostruzione tridimensionale. Le linee tratteggiate rosse delimitano i contorni originali delle radici. Le linee tratteggiate bianche e le frecce rosse indicano difetti della parete alveolare. Le linee continue arancioni in A1, B1, C1 e D1 indicano le posizioni corrispondenti delle viste in sezione trasversale. Le linee tratteggiate blu in C1, C2, D1 e D2 indicano l'estensione dell'osso neoformato all'interno dell'alveolo estrattivo. L'osso neoformato è evidenziato in rosso nelle ricostruzioni tridimensionali (C4,D4). (E–I) Confronto quantitativo delle prestazioni estrattive e della fase iniziale di guarigione dell'alveolo, comprendente il tempo di estrazione (E), l'incidenza di fratture radicolari (F), l'incidenza di difetti della parete alveolare (G), la densità minerale ossea (BMD; H) e il rapporto tra volume osseo e volume del tessuto (BV/TV; I). Per gli esiti procedurali (E–G), n = 6 topi per gruppo; per µCT analisi della guarigione dell'alveolo (H,I), n = 3 topi per gruppo. Il topo singolo e l'alveolo corrispondente da cui è stato estratto il dente sono stati considerati l'unità sperimentale. I risultati quantitativi in E, H e I sono riportati come media ± deviazione standard (DS) e sono stati confrontati mediante un test t di Student a due code non appaiato t test. Gli esiti categoriali in F e G sono riportati come conteggi assoluti e percentuali e sono stati confrontati utilizzando il test esatto di Fisher. Fratture radicolari si sono verificate in 4/6 topi (66,7%) nel gruppo convenzionale e in 2/6 topi (33,3%) nel gruppo modificato. Difetti della parete alveolare si sono verificati in 4/6 topi (66,7%) nel gruppo convenzionale e in 0/6 topi nel gruppo modificato. Significatività statistica: *, p < 0.05; ***, p < 0.001. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'estrazione è stata considerata di successo quando il primo molare mandibolare è stato completamente rimosso senza frammenti residui di radice, preservando al contempo l'architettura della cavità alveolare per la successiva valutazione della guarigione, come illustrato nella Figura 4A–D. Un'estrazione è stata considerata non riuscita quando la rimozione incompleta del dente o danni legati alla procedura hanno compromesso la successiva valutazione della guarigione alveolare. Gli esiti non riusciti rappresentativi sono mostrati nella Figura 5A–F. La frattura della corona è mostrata nella Figura 5A, la frattura della radice distale nella Figura 5B e un difetto della radice mesiale nella Figura 5C. Frammenti radicolari residui e frattura dell'apice radicolare sono mostrati rispettivamente nella Figura 5D,E. I danni strutturali nella regione del canale del nervo alveolare inferiore sono mostrati nella Figura 5F. Questi esiti non riusciti sono stati associati a un controllo inadeguato dell'angolo o della profondità di inserimento dell'ago, a traiettorie di estrazione inappropriate, all'applicazione di forza eccessiva o a manipolazioni eccessive. L'inclusione sia di esiti positivi che subottimali dimostra la varietà di risultati che possono verificarsi durante l'applicazione del protocollo e fornisce criteri per interpretare il successo o il fallimento dell'estrazione.
Figura 5. Esempi rappresentativi di estrazioni fallite del primo molare mandibolare murino.
(A–F) Immagini di tomografia computerizzata microscopica (µCT) e ricostruzioni tridimensionali che illustrano complicanze comuni legate all'estrazione. (A) Frattura della corona. (B) Frattura della radice distale. (C) Difetto della radice mesiale. (D) Frammento residuo di radice. (E) Frattura dell'apice radicolare. (F) Danno alle strutture anatomiche circostanti. Le linee tratteggiate rosse delimitano i contorni originali della radice. Le linee tratteggiate bianche delimitano difetti ossei o strutture anatomiche adiacenti. Le frecce rosse indicano i siti di lesione o i frammenti radicolari residui. Le radici fratturate e i denti adiacenti sono evidenziati in rosso nelle ricostruzioni tridimensionali mostrate nei pannelli A, B, D ed E. I pannelli C e F includono viste trasversali rappresentative delle ricostruzioni tridimensionali. Tutti i campioni sono stati raccolti 2 settimane dopo l'estrazione del dente. Barre della scala = 200 µm. Abbreviazione: µCT, tomografia computerizzata microscopica. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussione
L'instaurazione con successo del TSHM richiede la rimozione completa del dente preservando al contempo l'architettura alveolare circostante, poiché lesioni correlate all'estrazione possono compromettere la successiva rigenerazione ossea16. Pertanto, la riproducibilità della procedura di estrazione rappresenta un determinante critico dell'affidabilità del modello17. In questo studio, un approccio modificato per l'estrazione del primo molare mandibolare mediante pinze è stato confrontato sistematicamente con una tecnica convenzionale basata su leva, in condizioni standardizzate di addestramento. Il metodo modificato ha dimostrato una maggiore efficienza e riproducibilità procedurale, come evidenziato da un tempo di estrazione significativamente più breve e da un minor numero di complicanze correlate all'estrazione. In particolare, dopo lo stesso periodo di addestramento di due settimane, il tempo medio di estrazione si è ridotto da 29 min con l'approccio convenzionale a 10 min con l'approccio modificato. Inoltre, nessun difetto della parete del seno alveolare è stato osservato nel gruppo modificato, mentre questa complicanza si è verificata frequentemente nel gruppo convenzionale. Sebbene l'incidenza di frattura radicolare non differisse in modo significativo tra i gruppi, la frequenza inferiore osservata con il metodo modificato suggerisce una maggiore coerenza procedurale nelle attuali condizioni sperimentali. In aggiunta, un migliore mantenimento dell'architettura del sito di estrazione è stato associato a un potenziamento della guarigione ossea precoce dopo due settimane. Nel complesso, questi risultati indicano che la tecnica modificata potrebbe ridurre la variabilità dipendente dall'operatore durante l'instaurazione del modello.
L'ispezione diretta del dente estratto e dell'alveolo è sufficiente per l'identificazione routinaria di fratture radicolari evidenti e difetti alveolari maggiori. In questo studio comparativo, la µCT è stata utilizzata come strumento oggettivo di validazione per identificare frammenti radicolari residui e difetti sottili della parete alveolare, nonché per quantificare gli esiti precoci della guarigione alveolare. Le prestazioni migliorate dell'approccio modificato possono essere attribuite alle differenze nella strategia meccanica impiegata per l'estrazione dentale. Le tecniche convenzionali di estrazione dei molari mandibolari murini TSHM si basano generalmente su procedure di lussazione13,18, in cui la forza meccanica viene applicata mediante strumenti inseriti attorno al molare e gradualmente utilizzata per mobilizzare il dente. Tuttavia, poiché i primi molari mandibolari murini presentano una morfologia radicolare apicale ingrandita e un accesso chirurgico limitato9, tali procedure possono generare uno stress meccanico localizzato nel sito di inserzione e nelle strutture alveolari circostanti. Al contrario, l'approccio modificato sposta il punto principale di applicazione della forza dalla regione radicolare alla corona, più stabile. Applicando una trazione controllata parallela all'asse longitudinale del dente mentre si stabilizza contemporaneamente la mandibola, questa strategia potrebbe facilitare un'espansione graduale dell'alveolo di estrazione e ridurre la concentrazione di stress non controllata. È importante notare che questa modifica semplifica anche la fase principale di controllo della forza durante l'estrazione, potenzialmente abbassando la soglia tecnica per ricercatori con esperienza limitata in microchirurgia.
Nonostante questi vantaggi, diverse considerazioni tecniche rimangono fondamentali per l'efficace applicazione di questo protocollo, poiché l'esito dipende ancora dalla tecnica dell'operatore. In primo luogo, mantenere la direzione della forza applicata parallela all'asse longitudinale del dente per migliorare la presa della corona e ridurre al minimo la concentrazione di stress e la frattura radicolare associata all'applicazione di forze fuori asse. In secondo luogo, evitare un'inserzione eccessiva delle pinzette dentate o manipolazioni eccessive, poiché entrambe potrebbero compromettere l'integrità dell'alveolo estrattivo. In terzo luogo, durante il passaggio facoltativo di allentamento preliminare del legamento parodontale, inserire l'ago parallelamente all'asse longitudinale della radice del dente per ridurre al minimo i danni all'osso alveolare circostante, in linea con quanto riportato in precedenza dagli autori13. Pertanto, sebbene l'approccio modificato migliori l'accessibilità della procedura, un'adeguata formazione e una manipolazione standardizzata rimangono essenziali per ottenere risultati costanti.
Nell'interpretare questi risultati, è necessario considerare diversi limiti. In primo luogo, la dimensione del campione per la valutazione con µCT era relativamente limitata. Pertanto, le differenze osservate nella fase iniziale di guarigione ossea devono essere interpretate come evidenza di supporto di un miglioramento nell'allestimento del modello, piuttosto che come prova definitiva di una guarigione potenziata. In secondo luogo, nello studio sono stati inclusi soltanto due operatori. Di conseguenza, la valutazione della variabilità tra operatori è risultata limitata e potrebbe aver introdotto un bias legato all'operatore. In terzo luogo, il protocollo è stato convalidato esclusivamente nei primi molari mandibolari destri di topi maschi di 8 settimane. Non sono state effettuate comparazioni quantitative riguardo al successo dell'estrazione, alle complicanze correlate alla procedura e alla guarigione dell'alveolo in diversi gruppi di età. Di conseguenza, è necessaria un'ulteriore indagine per determinare se i vantaggi osservati possano essere generalizzati ad animali di diversa età o sesso.
In sintesi, questo studio presenta un approccio ottimizzato per l'estrazione del primo molare mandibolare del topo e ne convalida le prestazioni attraverso un confronto diretto con la tecnica convenzionale. Il metodo modificato facilita un'istituzione più riproducibile del modello murino di guarigione della tasca alveolare mandibolare, riducendo al contempo la difficoltà tecnica iniziale per i principianti. Questi risultati offrono indicazioni pratiche ai ricercatori che sviluppano modelli di guarigione della tasca alveolare mandibolare.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (Grant No. 82571084) e dal programma scientifico e tecnologico della provincia di Sichuan (Grant No. 2024JDKXJ0001).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aghi per siringa 25 G | Beyotime | FS802-30pcs | Aghi per siringa monouso utilizzati per il retrattore orale e il pre-allentamento facoltativo del legamento parodontale |
| Soluzione di paraformaldeide al 4% | Solarbio | P1110 | Soluzione di paraformaldeide al 4% utilizzata per la fissazione del campione |
| Etilene al 75% | Ouse Medical Devices Store | N/A | Etilene di grado medico al 75% utilizzato per la disinfezione superficiale |
| Topi C57BL/6 | Charles River | 213 | Topi maschi C57BL/6 di 8 settimane, del peso di 22–29 g |
| Carprofene | Solarbio | C5350 | Analgesico postoperatorio somministrato per via sottocutanea a 5 mg/kg |
| Palline di cotone | Ouning Medical Devices | N/A | Palline di cotone sterili utilizzate per la pulizia orale e l’emostasi |
| CTAn v1.18.4.0+ | SkyScan | N/A | Software utilizzato per l’analisi delle immagini μCT |
| DataViewer v1.5.6.2 | SkyScan | N/A | Software utilizzato per visualizzare ed esportare le immagini μCT ricostruite |
| Guaine per dita | LeSu Office | MEKU-1/2/3B | Guaine per dita utilizzate per proteggere il pollice durante l’estrazione |
| Tavola in polistirolo espanso | Dongguan Lijianglong Industrial Co., Ltd. | N/A | Tavola in polistirolo espanso utilizzata come piattaforma operatoria e di fissazione |
| Dieta in gel | ReadyDietech | J10001 | Dieta postoperatoria fornita sul fondo della gabbia per 3 giorni, quando utilizzata |
| GraphPad Prism v10.1.2 | GraphPad | RRID: SCR_002798 | Software utilizzato per l’analisi statistica e la generazione di grafici |
| Lampada frontale | Bazhou Pengen Protective Equipment Factory | N/A | Lampada frontale utilizzata per illuminare il campo operatorio |
| Pad riscaldante | Shijiazhuang Jianuan Electrical Appliances Co., Ltd. | N/A | Pad riscaldante preriscaldato a circa 38 °C per il recupero postoperatorio |
| Fantoccio di idrossiapatite | QRM | QRM-70127 | Fantoccio di calibrazione utilizzato per convertire i valori di attenuazione TC in densità minerale ossea |
| Dispositivo di ingrandimento | Olympus Corporation | SZX10 | Dispositivo utilizzato per ispezionare le punte delle pinzette dentate e l’alveolo estrattivo con ingrandimento |
| Mascherina | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | Mascherina chirurgica |
| Scanner di microtomografia computerizzata | Bruker SkyScan | SkyScan 1276 | Scanner μCT utilizzato a 80 kV, 500 μA e risoluzione del voxel di 10 μm |
| Mimics Research v21.0 | Materialise | RRID: SCR_015802 | Software utilizzato per la ricostruzione tridimensionale |
| Sodio pentobarbitale | Sigma-Aldrich | P3761 | Sale di sodio del pentobarbital utilizzato come soluzione anestetica al 1% |
| Soluzione salina tamponata al fosfato | Solarbio | P1010 | Polvere di soluzione salina tamponata al fosfato 0,01 M, pH 7,2–7,4 |
| Soluzione antisettica di iodopovidone | Belkon Pharmacy Flagship Store | N/A | Soluzione di iodopovidone utilizzata per la disinfezione addominale |
| Elaster | Foshan Puli Rubber Products Factory | N/A | Elaster utilizzati per assemblare il retrattore orale |
| Soluzione salina | Thermo Fisher | BR0053G | Compresse saline utilizzate per preparare la soluzione per la pulizia orale |
| Dieta standard in mangime | Jiangsu Xietong Pharmaceutical and Biotechnology Engineering Co., Ltd. | XTC01WC-001 | Mangime standard utilizzato per l’alloggio abituale e ammorbidito per l’alimentazione postoperatoria |
| Sterilizzatore a vapore | Struttura istituzionale | N/A | Attrezzatura utilizzata per sterilizzare le pinzette dentate e la soluzione salina |
| Tampone di cotone sterile | Kangbailai Medical Devices Store | N/A | Tampone di cotone sterile monouso |
| Guanti sterili | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | Guanti sterili in lattice |
| Tessuto non tessuto sterile | Shandong Xinhua Infection Control Supplies Hangzhou Store | N/A | Tessuto non tessuto sterile utilizzato per coprire la superficie operatoria e il pad riscaldante |
| Cuffia chirurgica sterile | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | Cuffia chirurgica sterile |
| Tenuta chirurgica | Senlun Medical Devices Specialty Store | N/A | Tenuta chirurgica pulita indossata durante la procedura |
| Nastro adesivo | Thermo Fisher | 15947 | Nastro adesivo utilizzato per fissare gli arti del topo |
| Pinzette oftalmiche dentate | Beyotime | FS229 | Pinze oftalmiche dentate utilizzate come pinze dentali |
| Unguento oftalmico veterinario | Dechra Veterinary Products | 143-16 | Unguento oftalmico applicato dopo l’anestesia per prevenire l’essiccazione della cornea |
Riferimenti
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