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Articolo metodologico

Valutazione guidata da rete del $\beta$-sitosterolo in modelli di cellule mesangiali infiammatorie e profibrotiche pertinenti alla glomerulonefrite cronica

107 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/73000

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28 agosto 2026

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1Hemodialysis Room, Hospital of Traditional Chinese Medicine of Qiqihar, 2Department of Nephrology, Ezhou Central Hospital, 3Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The First Hospital of Qiqihar, 4Department of Nephrology, Shanghai Minhang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio integra la farmacologia delle reti, il docking molecolare validato e esperimenti in vitro per valutare le relazioni tra composti candidati e bersagli tra i costituenti del Cordyceps sinensis e i processi associati alla glomerulonefrite cronica. Il β-sitosterolo è stato selezionato per la validazione a livello del composto ed è risultato attenuare l'attivazione infiammatoria e profibrotica nei modelli di cellule mesangiali.

Abstract

La glomerulonefrite cronica (CGN) è caratterizzata da un danno infiammatorio persistente e da un rimodellamento fibrotico progressivo, tuttavia le relazioni tra composti e bersagli alla base degli interventi basati su prodotti naturali non sono ancora completamente definite. Questo studio ha integrato la farmacologia di rete, il docking molecolare validato e esperimenti in vitro per valutare i costituenti candidati del Cordyceps sinensis (C. sinensis) nei processi patologici associati alla CGN. Sono stati selezionati i costituenti candidati del C. sinensis e i bersagli associati ai composti derivati dalla Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform sono stati incrociati con i geni associati alla CGN. Sono state utilizzate analisi di arricchimento funzionale e di interazione proteina-proteina per individuare i processi biologici e i bersagli centrali prioritari. PTGS2 è stato identificato come un bersaglio sovrapposto chiave. Il docking molecolare è stato eseguito utilizzando una struttura di COX-2 legata al celecoxib. Il re-docking del ligando celecoxib co-cristallizzato ha riprodotto la conformazione cristallografica con un RMSD di 0,876 Å, supportando così il protocollo di docking. Il β-sitosterolo e l'acetato di linoleile hanno mostrato una compatibilità predetta con la regione di docking di COX-2, con affinità di legame rispettivamente di −7,2 e −7,5 kcal/mol. Il β-sitosterolo è stato selezionato per la validazione a livello di composto in cellule mesangiali glomerulari di ratto HBZY-1. Tra 0,5 e 10 µM, il β-sitosterolo non ha ridotto in modo significativo la vitalità cellulare. In cellule stimolate dal lipopolisaccaride (LPS), il β-sitosterolo ha ridotto l'espressione di Tnf, Il6 e Ptgs2, ha diminuito la produzione di prostaglandina E2 (PGE2) e ha ridotto l'abbondanza proteica della cicloossigenasi-2 (COX-2). In cellule trattate con fattore di crescita trasformante β1 (TGF-β1), il β-sitosterolo ha ridotto l'espressione di Col1a1 e Acta2 e ha diminuito l'abbondanza proteica dell'actina alfa del muscolo liscio (α-SMA). Questi risultati forniscono evidenze generatrici di ipotesi secondo cui il β-sitosterolo modula l'attivazione infiammatoria e profibrotica nei modelli di cellule mesangiali, ma non dimostrano un'inibizione diretta dell'attività enzimatica della COX-2 né un'efficacia terapeutica nella CGN.

Introduzione

La glomerulonefrite cronica (CGN) comprende un gruppo eterogeneo di disturbi glomerulari che possono progredire fino a malattia renale cronica e insufficienza renale terminale1. È caratterizzata da danno glomerulare persistente, attivazione infiammatoria e rimodellamento fibrotico progressivo2,3. Sebbene corticosteroidi e agenti immunosoppressori vengano utilizzati in pazienti selezionati, il controllo a lungo termine della malattia rimane difficile in molti casi, e gli effetti avversi correlati al trattamento sono comuni1,4,5. La progressione della CGN coinvolge processi patologici interagenti, tra cui attivazione immunitaria, disfunzione endoteliale, stress ossidativo e accumulo della matrice extracellulare3,6,7. Pertanto, l'identificazione di nodi molecolari che collegano le risposte infiammatorie e profibrotiche potrebbe contribuire a generare ipotesi verificabili per strategie terapeutiche pertinenti alla malattia.

Cordyceps sinensis (C. sinensis) è stato utilizzato in contesti clinici e sperimentali legati ai reni ed è stato riportato per esercitare effetti anti-infiammatori, anti-apoptotici e citoprotettivi in diversi modelli di malattia8,9,10. Tuttavia, la base molecolare attraverso la quale i suoi costituenti candidati potrebbero interagire con bersagli rilevanti per la glomerulonefrite rimane insufficientemente definita11. Data la natura multicomponente di C. sinensis e l'eterogeneità meccanicistica della CGN, la farmacologia di rete fornisce un quadro utile per prioritizzare le relazioni tra composti candidati, bersagli e percorsi biologici12,13.

In questo studio, lo screening di composti, il recupero di target, l'analisi dell'intersezione geni-malattia, l'arricchimento funzionale, l'analisi della rete di interazione proteina-proteina, il docking molecolare e la validazione in vitro sono stati integrati per esplorare potenziali relazioni molecolari tra i costituenti candidati di C. sinensis e i processi patologici associati alla CGN. La prostaglandina-endoperossido sintasi 2 (PTGS2) è stata identificata come target centrale nella rete composti-malattia ed è stata valutata mediante docking molecolare utilizzando una struttura della cicloossigenasi-2 (COX-2) legata al celecoxib, con validazione mediante redocking. Sulla base dei risultati della rete, dell'analisi di docking e delle evidenze precedenti relative all'attività antinfiammatoria e antifibrotica, il β-sitosterolo è stato selezionato come composto candidato rappresentativo per la validazione successiva14,15,16. Sono state utilizzate cellule mesangiali stimolate dal lipopolisaccaride (LPS) per valutare l'attivazione infiammatoria e la risposta associata a COX-2/prostaglandina E2 (PGE2), mentre è stato incluso un modello indotto da fattore di crescita trasformante β1 (TGF-β1) per valutare l'espressione dei marcatori profibrotici.

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Protocollo

Le analisi di farmacologia delle reti e di bioinformatica si sono basate su database pubblicamente disponibili e non hanno coinvolto partecipanti umani o animali. Gli esperimenti in vitro sono stati condotti utilizzando una linea cellulare stabilita e non richiedevano l'approvazione etica secondo i requisiti istituzionali.

Selezione dei costituenti candidati e recupero delle proteine bersaglio

I costituenti candidati e i loro corrispondenti bersagli sono stati recuperati dal Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) utilizzando il termine di ricerca “dongchongxiacao” il 13 luglio 2025. Sono stati mantenuti i composti con una biodisponibilità orale predetta di almeno il 30% e una somiglianza ai farmaci di almeno 0,18. Sette costituenti candidati hanno soddisfatto entrambi i criteri di selezione. Il peso molecolare, la biodisponibilità orale, la somiglianza ai farmaci e altri descrittori farmacocinetici disponibili sono stati registrati dal TCMSP per un confronto descrittivo.

Le informazioni relazionate a composti e target associate ai costituenti conservati sono state scaricate direttamente da TCMSP. Le voci duplicate dei target sono state rimosse manualmente durante la costruzione del set di target non ridondante, mentre le relazioni originali tra composti e target sono state mantenute per la successiva costruzione della rete. Poiché TCMSP forniva i nomi dei target nella loro forma estesa anziché con simboli genici standardizzati, ciascun target è stato ricercato nel database UniProt (accesso effettuato il 14 luglio 2025). È stata selezionata la voce corrispondente all'essere umano e il nome del target è stato convertito nel relativo simbolo genico ufficiale. Il dataset standardizzato di composti e target è stato utilizzato per l'analisi dell'intersezione con i target delle malattie e per la costruzione della rete composto-target.

Raccolta di geni associati alla glomerulonefrite e intersezione degli obiettivi

I geni associati alla malattia sono stati recuperati da GeneCards, DisGeNET, PharmGKB e dal Therapeutic Target Database utilizzando il termine di ricerca “glomerulonephritis” il 14 luglio 2025. Per GeneCards, sono state mantenute le voci con punteggi di rilevanza superiori al punteggio mediano di 10. Le voci idonee provenienti dagli altri database sono state incluse in base alle loro annotazioni curate tra malattia e bersaglio. I nomi dei geni sono stati standardizzati ai simboli ufficiali dei geni umani e le voci duplicate sono state rimosse. Questa procedura ha prodotto 1.134 geni unici associati alla glomerulonefrite. Poiché la ricerca ha utilizzato il termine più generale “glomerulonephritis”, si è ritenuto che il set di dati risultante fosse pertinente ai processi molecolari associati alla glomerulonefrite cronica piuttosto che specifico per un singolo sottotipo istopatologico.

I bersagli associati ai composti derivati da TCMSP sono stati incrociati con il set genico associato alla malattia utilizzando R. Sono stati identificati 23 bersagli sovrapposti. I diagrammi di Venn sono stati generati utilizzando il pacchetto R venn, mentre la rete tra composti e bersagli sovrapposti è stata costruita e visualizzata mediante Cytoscape. Le relazioni tra i costituenti candidati e i bersagli sovrapposti sono riassunte nella Tabella 1.

Analisi di arricchimento funzionale e interazioni proteina-proteina

Sono state eseguite analisi di arricchimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) in R utilizzando clusterProfiler e org.Hs.eg.db. I termini Gene Ontology sono stati analizzati nelle categorie processo biologico, componente cellulare e funzione molecolare. I valori P sono stati corretti per i test multipli mediante il metodo di Benjamini-Hochberg e sono stati mantenuti i termini o i percorsi con valori P corretti inferiori a 0,05. I termini e i percorsi arricchiti sono stati visualizzati utilizzando grafici a barre e grafici a punti generati autonomamente.

I 23 bersagli sovrapposti sono stati sottoposti a STRING, selezionando Homo sapiens come organismo e un punteggio minimo di interazione superiore a 0,4. La rete di interazione proteina-proteina risultante è stata importata in Cytoscape. La topologia della rete è stata valutata utilizzando CytoNCA in base al grado, alla centralità di intermediazione, alla centralità di vicinanza, alla centralità degli autovettori, alla connettività media locale e alla centralità della rete. I bersagli principali (hub) sono stati definiti come nodi per i quali i valori di grado, centralità di intermediazione, centralità di vicinanza, centralità degli autovettori, connettività media locale e centralità della rete erano tutti superiori ai rispettivi valori mediani della rete. Questa analisi ha individuato nove bersagli principali per l'interpretazione successiva.

Docking molecolare e validazione mediante redocking

Il docking molecolare è stato eseguito utilizzando la struttura della cicloossigenasi-2 legata al celecoxib, con identificativo PDB 3LN1. La catena A e il relativo gruppo eme sono state mantenute come recettore, mentre durante la preparazione del recettore sono state rimosse le molecole di acqua cristallografica e il ligando di celecoxib co-cristallizzato. La conformazione nativa del celecoxib è stata estratta separatamente dalla catena A per la validazione mediante redocking. Gli atomi di idrogeno polari e le cariche di Gasteiger sono stati aggiunti utilizzando AutoDockTools, e il recettore è stato salvato in formato PDBQT. L'identificativo PDB 3LN1 corrisponde a una struttura della COX-2 murina legata al celecoxib con risoluzione di 2,40 Å. Le strutture del β-sitosterolo e dell'acetato di linoleile sono state ottenute da PubChem e preparate utilizzando Open Babel. Sono stati aggiunti atomi di idrogeno e cariche parziali di Gasteiger, sono stati assegnati i legami ruotabili e ciascun ligando è stato convertito in formato PDBQT. Celecoxib, β-sitosterolo e acetato di linoleile sono stati sottoposti a docking utilizzando AutoDock Vina con lo stesso recettore e gli stessi parametri di ricerca.

La scatola di docking è stata centrata sulla regione di legame nativa della celecoxib utilizzando le seguenti coordinate: center_x = 30,9886 center_y = -22,2836 center_z = -16,5072 size_x = 26 Å size_y = 26 Å size_z = 26 Å. Il valore di esauribilità è stato impostato a 16, il numero di modalità di output a 10 e l'intervallo energetico a 3 kcal/mol. La conformazione con il punteggio migliore, basata sull'energia di legame prevista più bassa, è stata mantenuta per la visualizzazione. Per la validazione del protocollo, la celecoxib nativa è stata re-dockata nelle stesse condizioni e la deviazione quadratica media degli atomi pesanti tra le conformazioni cristallografica e re-dockata è stata calcolata utilizzando PyMOL. Una deviazione quadratica media inferiore a 2 Å è stata considerata una riproduzione accettabile della conformazione di riferimento. I residui situati entro 4 Å da ciascun ligando dockato sono stati identificati in PyMOL. I punteggi di docking e le conformazioni sono stati interpretati come stime della compatibilità strutturale e non come prova diretta di legame al bersaglio o di inibizione enzimatica.

Coltura cellulare e preparazione del composto

Le cellule mesangiali glomerulari di ratto HBZY-1 sono state coltivate in terreno di Eagle modificato da Dulbecco ad alto contenuto di glucosio, integrato con siero fetale bovino al 10% e penicillina-streptomicina all'1%, a 37 °C in condizioni umidificate con 5% di CO₂. Per tutti gli esperimenti sono state utilizzate cellule ai passaggi 2–7, e lo stato privo di micoplasmi è stato verificato prima dell'uso. Il β-sitosterolo e la celecoxib sono stati utilizzati come composti chimicamente definiti. Il β-sitosterolo è stato disciolto in etanolo assoluto per ottenere una soluzione madre da 10 mM (circa 4,15 mg/mL). Se necessario, sono state effettuate brevi sonificazioni e riscaldamento a 50–60 °C per ottenere una soluzione chiara alla vista. La celecoxib è stata disciolta in dimetilsulfossido per preparare una soluzione madre da 10 mM (circa 3,81 mg/mL). Le soluzioni madri sono state allicate e conservate a −20 °C. Prima del trattamento, le soluzioni madri sono state diluite direttamente nel mezzo di coltura preriscaldato e immediatamente miscelate.

Le concentrazioni del veicolo sono state bilanciate all'interno di ciascun esperimento. Nel saggio di vitalità cellulare, la concentrazione finale di etanolo è stata aggiustata allo 0,2% v/v in tutti i gruppi poiché la concentrazione più alta di β-sitosterolo testata era di 20 µM. Nell'esperimento infiammatorio indotto da LPS, le concentrazioni finali di etanolo e dimetilsulfossido sono state aggiustate rispettivamente allo 0,1% e allo 0,01% v/v in tutti i gruppi. Nell'esperimento profibrotico indotto da TGF-β1, la concentrazione finale di etanolo è stata aggiustata allo 0,1% v/v in tutti i gruppi. Sono stati aggiunti volumi equivalenti dei rispettivi veicoli ai gruppi Controllo, LPS e TGF-β1.

Saggio di vitalità cellulare

Le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 5 × 103 cellule per pozzetto in 100 µL di mezzo completo e lasciate aderire per 24 h. Per valutare l'intervallo di concentrazione del β-sitosterolo, le cellule sono state incubate con 0,5, 1, 5, 10 o 20 µM di β-sitosterolo per 24 h. Per il saggio di vitalità cellulare correlato alla LPS, le cellule sono state pretrattate con β-sitosterolo a 1, 5 o 10 µM per 2 h, seguito da esposizione a 1 µg/mL di lipopolisaccaride per ulteriori 24 h.

I gruppi di trattamento erano: Controllo, β-sitosterolo a 0,5 µM, β-sitosterolo a 1 µM, β-sitosterolo a 5 µM, β-sitosterolo a 10 µM, β-sitosterolo a 20 µM, LPS, LPS più β-sitosterolo a 1 µM, LPS più β-sitosterolo a 5 µM e LPS più β-sitosterolo a 10 µM. Il reagente del Cell Counting Kit-8 è stato aggiunto in quantità di 10 µL per pozzetto e le piastre sono state incubate per 2 h. Successivamente, l'assorbanza è stata registrata a 450 nm. La vitalità cellulare è stata determinata sottraendo il valore del bianco senza cellule ed espressa in rapporto al gruppo di Controllo. Ogni condizione comprendeva sei pozzetti tecnici per ciascuno dei sei esperimenti biologici indipendenti. I valori dei pozzetti tecnici di ogni esperimento sono stati mediati per ottenere un singolo valore di replicato biologico da utilizzare nell'analisi statistica.

Attivazione infiammatoria indotta da LPS

Per esperimenti di attivazione infiammatoria, le cellule HBZY-1 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 105 cellule per pozzetto e trattate dopo aver raggiunto una confluenza di circa il 70%–80%. Le cellule sono state mantenute in mezzo integrato con il 1% di siero fetale bovino per 12 h prima del trattamento. Il β-sitosterolo o il celecoxib sono stati somministrati 2 h prima della stimolazione con LPS. Successivamente, le cellule sono state esposte a 1 µg/mL di LPS per 24 h.

I gruppi sperimentali erano: Controllo, β-sitosterolo a 10 µM, LPS, LPS più β-sitosterolo a 1 µM, LPS più β-sitosterolo a 5 µM, LPS più β-sitosterolo a 10 µM e LPS più celecoxib a 1 µM. Il celecoxib è stato incluso come controllo positivo funzionale per l'inibizione della produzione di prostaglandine dipendente da COX-2. Al termine del trattamento, i supernatanti di coltura sono stati raccolti per la misurazione del PGE2. Le cellule sono state raccolte separatamente per l'analisi quantitativa in tempo reale mediante PCR di Tnf, Il6 e Ptgs2 e per l'analisi mediante western blot di COX-2.

Attivazione profibrotica indotta da TGF-β1

È stato utilizzato un modello indotto da TGF-β1 separato per valutare l'attivazione profibrotica. Le cellule HBZY-1 sono state seminate in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 105 cellule per pozzetto e mantenute in mezzo integrato con 1% di siero fetale bovino per 12 h prima del trattamento. Le cellule sono state pretrattate con β-sitosterolo per 2 h, seguite da stimolazione con 10 ng/mL di TGF-β1 ricombinante per 48 h.

I gruppi di trattamento includevano Controllo, β-sitosterolo (10 µM), TGF-β1, TGF-β1 + β-sitosterolo (5 µM) e TGF-β1 + β-sitosterolo (10 µM). Al termine del periodo di trattamento, le cellule sono state raccolte per l'analisi di Col1a1 e Acta2 mediante PCR quantitativa in tempo reale e per l'analisi della proteina alfa-actina muscolare liscia (α-SMA) mediante western blot.

PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale è stato isolato da cellule trattate utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA a base di fenolo-guanidinio, seguendo il protocollo del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate mediante spettrofotometro. Solo i campioni con un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,0 sono stati utilizzati per la trascrizione inversa. Per ciascun campione, 1 µg di RNA totale è stato trascritto in DNA complementare in un volume finale di reazione di 20 µL. Il DNA complementare ottenuto è stato diluito di cinque volte con acqua priva di nucleasi prima della PCR quantitativa. La PCR quantitativa è stata eseguita in un volume totale di 20 µL contenente 10 µL di master mix 2× SYBR Green, 0,4 µL ciascuno di primer diretto e inverso a 10 µM, 2 µL di DNA complementare diluito e 7,2 µL di acqua priva di nucleasi. Le condizioni di amplificazione prevedevano un passaggio iniziale di denaturazione a 95 °C per 30 s, seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 s e di ibridazione-estensione a 60 °C per 30 s. Successivamente, è stata effettuata un'analisi della curva di denaturazione da 65 °C a 95 °C per verificare la specificità dell'amplificazione.

I geni misurati erano Tnf, Il6, Ptgs2, Col1a1, Acta2 e Gapdh. Gapdh è stato utilizzato come gene di riferimento interno. L'espressione genica relativa è stata determinata utilizzando il metodo 2−ΔΔCt, con il gruppo Controllo utilizzato come calibratore. Le sequenze dei primer sono riportate nella Tabella Supplementare 1. Ogni campione è stato analizzato in triplicato tecnico e sono stati eseguiti sei esperimenti biologici indipendenti. I valori ottenuti dai replicati tecnici sono stati mediati prima dell'analisi statistica.

Misurazione del PGE2 mediante saggio immunoenzimatico (ELISA)

I supernatanti di coltura sono stati raccolti dopo 24 h di stimolazione con LPS e centrifugati a 1.000 ×g per 10 min a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari. Le concentrazioni di PGE2 sono state determinate utilizzando un kit commerciale per saggio immunoenzimatico (ELISA) secondo le istruzioni del produttore.

Standard e campioni sono stati caricati sulla piastra del saggio in duplicato. Al termine dei passaggi di legame dell'anticorpo e di sviluppo del colore, l'assorbanza è stata registrata a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre. Le concentrazioni di PGE2 sono state determinate mediante una curva standard logistica a quattro parametri ed espresse in pg/mL. Sono stati analizzati i sopranatanti di sei esperimenti cellulari indipendenti. Le misurazioni duplicate per ciascun campione biologico sono state mediate prima dell'analisi statistica.

Immunoblotting

Le cellule trattate sono state lisate in un buffer per saggio di immunoprecipitazione radioattiva integrato con una miscela di inibitori delle proteasi. I lisati sono stati incubati sul ghiaccio per 30 minuti e centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Le concentrazioni proteiche nei soprannatanti sono state determinate mediante un saggio proteico con acido bicinconinico. Quantità uguali di proteina (30 µg per pozzetto) sono state mescolate con buffer di caricamento e denaturate a 95 °C per 5 minuti. Le proteine provenienti dagli esperimenti con LPS sono state separate su gel di elettroforesi in poliacrilamide contenenti dodecilsolfato di sodio al 10%, mentre quelle provenienti dagli esperimenti con TGF-β1 sono state separate su gel al 12%. Le proteine separate sono state successivamente trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene.

Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 allo 0,1% per 1 h a temperatura ambiente, quindi incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro COX-2 (1:1000), α-SMA (1:1000) e GAPDH (1:5000). L'analisi di COX-2 è stata effettuata su campioni provenienti dall'esperimento con LPS, mentre l'analisi di α-SMA è stata effettuata su campioni provenienti dall'esperimento con TGF-β1. Dopo il lavaggio, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari marcati con perossidasi di rafano (1:5000) per 1 h a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante un substrato chemiluminescente migliorato e acquisite con un sistema di imaging chemiluminescente. I tempi di esposizione sono stati di circa 10 s per COX-2, 10 s per α-SMA e 2 s per GAPDH.

Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando ImageJ. I segnali di COX-2 e α-SMA sono stati normalizzati rispetto al corrispondente segnale di GAPDH. Il western blotting è stato eseguito utilizzando campioni proteici ottenuti da sei esperimenti indipendenti di coltura cellulare e trattamento.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando GraphPad Prism. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Per ogni analisi quantitativa sono stati eseguiti sei esperimenti indipendenti di coltura cellulare e trattamento, ciascuno dei quali rappresenta un replicato biologico. Le misurazioni dei replicati tecnici ottenute dallo stesso esperimento biologico sono state mediate prima dell'analisi statistica e non sono state considerate osservazioni indipendenti.

Per il saggio di vitalità cellulare, ogni esperimento biologico includeva sei pozzetti tecnici per ogni condizione. Le reazioni di PCR quantitativa sono state eseguite in triplicato tecnico per ogni campione biologico, e le misurazioni di PGE2 sono state effettuate in duplicato. La quantificazione del Western blot si basava su sei campioni proteici preparati indipendentemente. Pertanto, ogni barra quantitativa contiene sei valori provenienti da replicati biologici individuali.

Le differenze tra più gruppi sono state analizzate mediante analisi della varianza ad un fattore seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. Un valore di P bilaterale < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. I valori individuali dei replicati biologici sono stati mostrati insieme alla media e alla deviazione standard.

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Risultati

Selezione dei costituenti candidati, recupero delle proteine bersaglio e intersezione dei bersagli

Il flusso di lavoro per l'identificazione dei potenziali bersagli comuni tra composti e malattie è riassunto nella Figura 1A. Sette composti candidati di C. sinensis hanno soddisfatto i criteri predeterminati di screening, con un OB ≥30% e un DL ≥0,18, tra cui acido arachidonico, acetato di linoleile, β-sitosterolo, perossiergosterolo, cerev...

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Discussione

Questo studio ha integrato la farmacologia delle reti, il docking molecolare validato mediante ligandi di riferimento e esperimenti a livello di composti per esaminare un'ipotesi associata a PTGS2, derivata da costituenti candidati di C. sinensis. Sette costituenti hanno soddisfatto i criteri predeterminati di screening TCMSP e 23 bersagli si sono sovrapposti all'insieme genico associato alla glomerulonefrite. L'analisi dell'interazione proteica ha individuato nove bersagli centrali, tra cui PTGS2

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti. Strumenti basati sull'intelligenza artificiale (ChatGPT, OpenAI) sono stati utilizzati per assistere nella revisione linguistica e nella progettazione preliminare delle figure schematiche. L'intelligenza artificiale generativa è stata impiegata per assistere nella preparazione di bozze grafiche preliminari delle Figure 1A e 7, successivamente rivedute e modificate dagli autori per garantire coerenza con i metodi e i risultati riportati. Tutti gli output assistiti dall'IA sono stati attentamente valutati e approvati dagli autori. Gli autori hanno verificato il contenuto finale delle figure e si assumono piena responsabilità per l'integrità e l'accuratezza del manoscritto.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla Specialità Caratteristica di Nefropatia con Medicina Tradizionale Cinese Integrata e Medicina Occidentale (ZYTSZK2-3) e dallo Studio sulla Strategia di Intervento della Medicina Tradizionale Cinese nella Malattia Renale Cronica dal Punto di Vista della Gestione delle Malattie Croniche (202240169).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Etanolo assolutoSigma-Aldrich/MerckE7023Etanolo di grado biologia molecolare, 200 proof, non denaturato; solvente per la soluzione madre di β-sitosterolo.
AutoDock VinaScripps ResearchVersione 1.1.2Simulazione di docking molecolare
Cappa a sicurezza biologicaThermo Fisher Scientific1300 Series A2Operazioni sterili per colture cellulari
CelecoxibMedChemExpressHY-14398Inibitore selettivo della COX-2 utilizzato come controllo positivo; soluzione madre da 10 mM in DMSO. 
Cell Counting Kit-8Dojindo Molecular Technologies, Inc.CK04Saggio colorimetrico WST-8 per la vitalità cellulare; assorbanza misurata a 450 nm.
Sistema di imaging chemiluminescenteBio-Rad LaboratoriesChemiDoc MPAcquisizione di immagini di Western blot
Pacchetto R clusterProfilerBioconductorVersione 4.10.0Analisi di arricchimento GO e KEGG
Incubatore per colture cellulari a CO2Thermo Fisher ScientificForma Series II 3111Incubazione delle colture cellulari a 37 °C e 5% CO2
Anticorpo monoclonale coniglio anti-COX-2 (D5H5)Cell Signaling Technology12282Validato per Western blot per COX-2 umana, murina e di ratto; utilizzato in diluizione 1:1.000.
Plugin CytoNCANegozio di applicazioni CytoscapeVersione 2.1.6Analisi topologica dei target centrali
Software CytoscapeConsortium CytoscapeVersione 3.8.0Visualizzazione e analisi di reti
DietilsolfossidoSigma-Aldrich/MerckD2650Reagente BioReagent filtrato sterile, ≥99,7%; solvente per la soluzione madre di celecoxib.
Database DisGeNETGruppo di Informatica Biomedica IntegrataNon applicabileRecupero geni-malattia per glomerulonefrite
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)Gibco/Thermo Fisher ScientificC11995500BTMezzo basale per la coltura cellulare HBZY-1
Substrato chemiluminescente potenziatoBeyotime BiotechnologyP0018SVisualizzazione delle bande in Western blot
Serum fetale bovinoGibco/Thermo Fisher Scientific10099-141CIntegratore sierico per colture cellulari
Anticorpo monoclonale coniglio anti-GAPDH (D16H11)Cell Signaling Technology5174Controllo di caricamento per Western blot; reattivo per GAPDH umana, murina e di ratto; utilizzato in diluizione 1:5.000 dopo ottimizzazione in laboratorio.
Database GeneCardsIstituto Weizmann di ScienzeNARecupero di geni associati alla glomerulonefrite
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersione 9.0.0.121Analisi statistica dei dati sperimentali in vitro
Anticorpo secondario capra anti-IgG coniugato con HRPProteintech GroupSA00001-2Anticorpo secondario per anticorpi primari conigli
Software ImageJIstituti Nazionali di SaluteVersione 1.54Analisi densitometrica di Western blot
Microscopio invertito a contrasto di faseOlympusCKX53Osservazione della morfologia cellulare
Pacchetto R org.Hs.eg.dbBioconductorVersione 3.18.0Annotazione genica umana per analisi di arricchimento
Soluzione di penicillina-streptomicinaGibco/Thermo Fisher Scientific15140122Integratore antibiotico per colture cellulari
Kit per saggio parametri PGE2R&D Systems, marchio Bio-TechneKGE004BELISA competitivo multispécie per supernatanti di colture cellulari; intervallo del saggio 39–2.500 pg/mL; rilevamento colorimetrico a 450 nm.
Database PharmGKBPharmacogenomics KnowledgebaseNARecupero di target associati a malattie
Database PubChemCentro Nazionale per l'Informatica BiotecnologicaNARecupero di strutture di ligandi
Membrana PVDFMillipore/MerckIPVH00010Membrana per trasferimento proteico in Western blot
Sistema grafico molecolare PyMOLSchrödinger, LLCVersione 2.6.2Visualizzazione delle pose di docking
Software RFondazione R per il Calcolo StatisticoVersione 4.3.2Analisi di intersezione e arricchimento dei target
Linea cellulare di cellule mesangiali glomerulari di ratto (HBZY-1)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0117Modello di validazione in vitro per cellule mesangiali
RCSB Protein Data BankResearch Collaboratory for Structural BioinformaticsID PDB: 3LN1Recupero della struttura cristallina di PTGS2/COX2
Proteina ricombinante umana TGF-β1PeproTech, marchio Thermo Fisher Scientific100-21-10UGTGF-β1 umana ricombinante derivata da HEK293; stimolazione profibrotica a 10 ng/mL. 
Sistema di elettroforesi SDS-PAGEBio-Rad LaboratoriesMini-PROTEAN TetraSeparazione proteica mediante SDS-PAGE
Database STRINGELIXIR/Consortium STRINGVersione 12.0Costruzione di reti di interazione proteina-proteina
Database TCMSPTraditional Chinese Medicine Systems Pharmacology DatabaseNASelezione di composti candidati da Cordyceps sinensis
Therapeutic Target DatabaseGruppo di Ricerca su Farmaci Innovativi e Informatica BiomedicaNARecupero di target terapeutici
Anticorpo primario anti-α-SMAProteintech Group14395-1-APRilevamento dell'espressione proteica di α-SMA
β-Sitosterolo (purezza >98%)MedChemExpressHY-N0171ACAS 83-46-5; composto definito utilizzato per il trattamento cellulare; soluzione madre da 10 mM in etanolo assoluto. 

Riferimenti

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