Articolo di ricerca

Vettori lipidici nanostrutturati caricati con idrossiurea per il potenziamento della citotossicità in vitro e della somministrazione del farmaco

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DOI:

10.3791/73012

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22 settembre 2026

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1Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Jazan University, 2School of Health Sciences, University of Petroleum and Energy Studies, 3Center for Global Health Research, Saveetha Medical College, and Hospitals, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, Saveetha University

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha sviluppato trasportatori lipidici nanostrutturati (NLCs) caricati con idrossiurea e ne ha valutato le proprietà e l'attività antitumorale in vitro. NX-ST ha mostrato un'elevata efficienza di incapsulamento, un rilascio controllato e una maggiore citotossicità contro le cellule MCF-7 (IC₅₀ = 225 µg/mL) rispetto all'idrossiurea libera (IC₅₀ = 722,57 µg/mL).

Abstract

L'idrossiurea (HU) è un farmaco antitumorale consolidato utilizzato per trattare la leucemia mieloide cronica, ma la sua efficacia terapeutica è limitata da un rapido smaltimento, una biodisponibilità variabile e una tossicità correlata al dosaggio. Questo studio ha avuto come obiettivo il miglioramento del rilascio di HU mediante lo sviluppo di nanocarrier lipidici nanostrutturati (NLC) caricati con idrossiurea, utilizzando diverse combinazioni di surfattanti. Sono state preparate e valutate tre formulazioni, incluse NX-ST (Tween 80–SDS), NX-CT (Cremophor EL–Tween 80) e NX-CS (Cremophor EL–SDS), per dimensione delle particelle, indice di polidispersione (PDI), potenziale zeta, efficienza di incapsulamento (EE) e attività citotossica. Le formulazioni hanno mostrato dimensioni nanometriche delle particelle (da 67,377 a 110 nm), un PDI accettabile (<0,35), un elevato potenziale zeta (-30,033 a -46,433 mV) e una buona efficienza di incapsulamento (78,189-86,626%), indicando formulazioni stabili. Il profilo di rilascio ha mostrato un aumento approssimativamente lineare nel periodo compreso tra 0,5 e 6 ore, seguito da una fase di plateau. Gli studi di citotossicità hanno evidenziato un'attività antitumorale potenziata rispetto all'HU libero (IC₅₀ = 722,57 µg/mL). La formulazione NX-ST ha mostrato la citotossicità più elevata (IC₅₀ = 225 ± 21,47 µg/mL), in linea con un miglioramento del rilascio del farmaco; si deduce un contributo derivante da un'uptake cellulare migliorata, sebbene non sia stato misurato direttamente in questo studio. Le formulazioni di NLC analizzate, in particolare NX-ST, hanno migliorato efficacemente le prestazioni terapeutiche dell'HU, aumentando la stabilità, l'efficienza di rilascio e l'attività antitumorale.

Introduzione

Il cancro rimane una delle principali cause di morte nel mondo, con quasi 20 milioni di nuovi casi e 9,7 milioni di decessi correlati al cancro registrati nel 2022. Entro il 2040, si prevede che questi numeri aumenteranno in modo significativo, raggiungendo 29,9 milioni di nuovi casi e 15,3 milioni di decessi annui correlati al cancro1,2. La maggior parte dei regimi terapeutici attuali contro il cancro si basa su composti altamente tossici, ma la loro tossicità sistemica limita le concentrazioni terapeutiche che possono effettivamente raggiungere i tessuti tumorali3. Per superare questa sfida, i ricercatori stanno esplorando nuovi approcci per il rilascio dei farmaci, al fine di migliorare il targeting tumorale e l'indice terapeutico della chemioterapia.

Un'area fondamentale della ricerca in oncologia è lo sviluppo di sistemi avanzati di somministrazione dei farmaci per aumentare l'efficacia terapeutica riducendo al contempo gli effetti collaterali dei farmaci antitumorali. L'idrossiurea (HU), un agente chemioterapico e antineoplastico ben consolidato, rappresenta un pilastro nel trattamento della malattia da cellule falciformi, della leucemia mieloide cronica e di alcuni tumori solidi grazie alla sua capacità di aumentare la produzione di emoglobina fetale e di inibire la sintesi del DNA attraverso il targeting della ribonucleotide reduttasi4,5. Nonostante l'efficacia clinica, il potenziale terapeutico dell'HU è limitato da problemi come l'eliminazione rapida, la biodisponibilità variabile e un indice terapeutico ristretto, che spesso portano a farmacocinetica variabile e tossicità dipendente dalla dose, inclusa mielosoppressione, disturbi gastrointestinali e possibili neoplasie secondarie6,7. Per affrontare queste limitazioni, sistemi avanzati di somministrazione dei farmaci, tra cui i trasportatori lipidici nanostrutturati (NLC), si sono affermati come strategie promettenti per migliorare la stabilità, la solubilità e il rilascio controllato dell'idrossiurea, migliorandone così il profilo di sicurezza ed efficacia8.

Le NLC sono un tipo di nanoparticella a base lipidica che offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi tradizionali di somministrazione dei farmaci. Esse sono costituite da una matrice lipidica solida stabilizzata da surfattanti e possono incapsulare sia farmaci idrofili che lipofili. Questa struttura unica consente una maggiore capacità di carico del farmaco, un rilascio controllato e una stabilità migliorata9,10. La preparazione delle NLC prevede generalmente tecniche come l’omogeneizzazione ad alta pressione e l’ultrasonificazione, che favoriscono la formazione di nanoparticelle con una distribuzione dimensionale ristretta e un’elevata efficienza di incapsulamento11,12. L’incapsulamento del farmaco nelle NLC non solo ne migliora la solubilità e la stabilità, ma facilita anche il rilascio mirato alle cellule tumorali, riducendo così gli effetti fuori bersaglio. Studi recenti hanno dimostrato il potenziale delle NLC caricate con farmaci nel migliorare l’indice terapeutico e i profili di rilascio prolungato del farmaco13,9. Questo meccanismo di rilascio controllato è fondamentale per mantenere concentrazioni terapeutiche del farmaco per periodi prolungati, riducendo così la frequenza delle somministrazioni e migliorando l’aderenza del paziente14. Diversi studi hanno dimostrato che le NLC caricate con farmaci antitumorali come gefitinib15, capecitabina16 e imatinib14 aumentano in modo significativo l’efficacia del farmaco migliorando l’assorbimento cellulare e l’accumulo nelle cellule tumorali. Ad esempio, le NLC caricate con gefitinib hanno mostrato un aumento della citotossicità contro le cellule tumorali pari a 4,5 volte rispetto al farmaco libero, evidenziando il potenziale delle NLC nel migliorare l’indice terapeutico degli inibitori della tirosina chinasi utilizzati nel trattamento del carcinoma polmonare non a piccole cellule e del cancro colorettale. Analogamente, le NLC caricate con capecitabina migliorano la stabilità del farmaco e il rilascio controllato, aspetti cruciali per mantenere concentrazioni terapeutiche e ridurre la tossicità sistemica. Le NLC caricate con imatinib traggono vantaggio da un rilascio mirato potenziato, riducendo gli effetti fuori bersaglio e migliorando l’esito terapeutico nei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica. Queste caratteristiche rendono le NLC ottime candidate per studi clinici e per possibili applicazioni nella medicina personalizzata, adattando le terapie ai profili individuali dei pazienti. La valutazione della stabilità delle NLC caricate con farmaci rappresenta un altro aspetto importante che influenza la loro applicabilità clinica. Gli studi di stabilità prevedono spesso l’esposizione delle formulazioni a diverse condizioni ambientali al fine di valutarne l’integrità fisica nel tempo.

I test di stabilità accelerata hanno dimostrato che queste NLC mantengono la loro integrità strutturale e il contenuto di farmaco per periodi prolungati, evidenziando il loro potenziale per la conservazione e l'uso a lungo termine4,17.

Nonostante questi vantaggi, la scelta del tensioattivo influenza in modo significativo le proprietà fisico-chimiche e le prestazioni dei carrier lipidici nanostrutturati (NLC). I sistemi lipide-tensioattivo svolgono un ruolo importante nel migliorare la stabilità delle nanoparticelle, l'incapsulamento del farmaco e la biodisponibilità18,19,20. Tuttavia, sono stati condotti pochi studi per valutare come diverse combinazioni di tensioattivi influenzino le caratteristiche fisico-chimiche e l'attività citotossica degli NLC caricati con idrossiurea. Pertanto, questo studio è stato intrapreso per sviluppare NLC caricati con idrossiurea (NANOXURIA) utilizzando diversi sistemi tensioattivi e per valutare in modo sistematico come queste variazioni influiscano sulla stabilità fisico-chimica, sul comportamento durante lo stoccaggio e sull'attività antitumorale. Stabilendo una relazione chiara tra la progettazione della formulazione e le prestazioni terapeutiche, questo lavoro mira a fornire un sistema disperso efficace basato su nanocarrier (dispersione colloidale) per caratterizzare le formulazioni di NLC caricati con idrossiurea e valutarne il rilascio in vitro del farmaco, la citotossicità e la stabilità a breve termine durante lo stoccaggio, generando dati fondamentali sulle proprietà fisico-chimiche e sulle prestazioni in vitro per guidare lo sviluppo futuro dei sistemi di somministrazione di HU, senza alterare la molecola del farmaco stessa.

Protocollo

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani, tessuti di origine umana o animali vivi. Tutte le valutazioni biologiche sono state eseguite in vitro utilizzando la linea cellulare umana di carcinoma mammario MCF-7 disponibile in commercio, ottenuta dall'American Type Culture Collection (ATCC). Di conseguenza, l'approvazione del comitato etico istituzionale (IRB) o del comitato etico non era applicabile a questo lavoro.

Materiali

Idrossiurea (HU) (saggio ≥99%), dodecilsolfato di sodio (SDS) (anionico, saggio 90%), Tween-80 (T80) (non ionico, acido oleico ≥58%), Cremophor EL (non ionico, derivato dall'olio di ricino, saggio ≥98%), acido stearico (saggio 95–106%) e olio di sesamo sono stati utilizzati così come ricevuti. Tutti gli altri prodotti chimici e reagenti utilizzati erano di grado analitico. I dettagli completi del fornitore e del catalogo per tutti i materiali e l'attrezzatura sono forniti nella Tabella dei materiali.

Preparazione di NLC cariche di idrossiurea (NANOXURIA)

La preparazione di NANOXURIA comprende tre passaggi: la preparazione della fase lipidica, l'incorporazione del farmaco e la preparazione della fase acquosa. La fase lipidica è stata ottenuta per fusione di una miscela di acido stearico (500 mg) e olio di sesamo (250 µl). La fusione è stata effettuata in un becher riscaldato su piastra. La quantità accuratamente pesata di HU (150 mg) è stata mescolata con la fase lipidica. La fase acquosa è stata preparata sciogliendo i tensioattivi (Tabella 1) in acqua (Millipore) (25 mL). La soluzione di tensioattivi è stata riscaldata alla stessa temperatura della fase lipidica (70°C) per evitare una solidificazione prematura. La fase acquosa calda è stata aggiunta gradualmente alla fase lipidica fusa, sotto costante agitazione ad alta velocità con un omogeneizzatore. La miscela è stata omogeneizzata ad alta velocità (6.000 giri/min) per 20 minuti al fine di ottenere un'emulsione calda stabile. L'emulsione calda è stata raffreddata a temperatura ambiente sotto continua agitazione. Durante il raffreddamento, la fase lipidica si solidifica, formando le NLC. Le NLC caricate con HU così ottenute sono state conservate per ulteriori caratterizzazioni e applicazioni.

Caratterizzazione e valutazione

Dimensione delle particelle, potenziale zeta (ZP) e indice di polidispersione (PDI)

L'analisi della dimensione delle particelle e l'indice di polidispersione (PDI) di NANOXURIA sono stati determinati utilizzando un Zetasizer Nano ZS90. Questo strumento funziona secondo il principio della diffusione dinamica della luce (DLS), che misura il moto browniano delle particelle in sospensione e lo correla al loro diametro idrodinamico tramite l'equazione di Stokes-Einstein. Oltre alla dimensione e al PDI, la carica superficiale di NANOXURIA è stata valutata misurando il potenziale zeta (ZP) mediante lo stesso strumento. Il potenziale zeta è stato determinato utilizzando la diffusione elettroforetica della luce (ELS), in cui la velocità delle particelle in un campo elettrico applicato viene analizzata per calcolare la loro carica superficiale. Questo parametro è fondamentale per valutare la stabilità colloidale di NANOXURIA. Le misurazioni sono state effettuate in un ambiente controllato, posizionando i campioni diluiti in cuvette per garantire la compatibilità con i requisiti ottici ed elettrici dello strumento. Per migliorare l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati, tutte le misurazioni sono state eseguite in triplice replicato.

Morfologia

La morfologia di NANOXURIA è stata studiata mediante microscopio elettronico operante in modalità trasmissione e scansione. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per osservare la struttura interna e la forma delle particelle, mentre la microscopia elettronica a scansione a emissione di campo (FE-SEM) è stato utilizzato per esaminare la morfologia superficiale e la distribuzione delle particelle. I campioni sono stati opportunamente preparati e analizzati a tensioni di accelerazione adeguate per ottenere immagini ad alta risoluzione. Per la preparazione dei campioni, le dispersioni di NANOXURIA sono state diluite con acqua purificata; per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), una goccia della dispersione diluita è stata posta su una griglia di rame ricoperta di carbonio, l'eccesso è stato asportato mediante assorbimento e il film è stato essiccato all'aria a temperatura ambiente prima dell'analisi in alto vuoto a una tensione di accelerazione compresa tra 60 e 80 kV. Per l'analisi con FE-SEM, una goccia della dispersione diluita è stata depositata su un supporto di alluminio, essiccata all'aria e rivestita con uno sputtering di uno strato conduttivo sottile prima dell'acquisizione delle immagini a (1–3 kV). Micrografie rappresentative sono state acquisite a diverse ingrandimenti.

Analisi dell'efficienza di incapsulamento per le formulazioni NANOXURIA

L'efficienza di incapsulamento (EE) di NANOXURIA è stata valutata utilizzando la tecnica di ultrafiltrazione-centrifugazione con un filtro centrifugo Amicon Ultra-2 mL (cutoff molecolare di 3 kDa). Questo metodo ha separato l'HU non incapsulato (circa 6 mg in 1 mL di NANOXURIA) dalla frazione incapsulata, centrifugando a 4.000 x g per 20 min a 25 °C, garantendo un'efficace isolazione. Il filtrato, contenente HU libero, è stato diluito con acqua purificata e analizzato mediante uno spettrofotometro UV-visibile a 213 nm per quantificare il farmaco non incapsulato, utilizzando una curva di calibrazione basata sulla legge di Beer-Lambert. La % EE è stata calcolata come;

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Studio di rilascio in vitro

Il profilo di rilascio in vitro dell'HU da NANOXURIA è stato valutato utilizzando la tecnica di diffusione in sacchetto dialitico, un metodo ampiamente adottato per l'analisi del rilascio controllato del farmaco. I sacchetti dialitici (cutoff di peso molecolare 12–14 kDa) sono stati pre-ammorbiditi in acqua distillata per 12 h per garantire un'idratazione adeguata e la rimozione dei conservanti. Un'estremità del sacchetto dialitico è stata sigillata accuratamente e 2 mL della formulazione NANOXURIA, corrispondenti a 12 mg di HU, sono stati introdotti con attenzione all'interno del sacchetto. L'altra estremità è stata quindi annodata strettamente per evitare perdite. Il sacchetto dialitico è stato immerso in un becher contenente acqua (50 mL) come mezzo di rilascio. Il sistema è stato mantenuto a 37 ± 0,5 °C per simulare la temperatura corporea e agitato a 50 giri/min mediante un agitatore magnetico per assicurare una miscelazione uniforme e ridurre al minimo gli effetti dello strato limite. A intervalli di tempo predeterminati (0,5, 1, 2, 4, 6, 12 e 24 h), sono stati prelevati 2 mL di aliquote dal mezzo di rilascio e immediatamente sostituiti con un volume equivalente di acqua fresca, preriscaldata, per mantenere condizioni di sink. I campioni raccolti sono stati filtrati attraverso un filtro a siringa da 0,45 µm per rimuovere qualsiasi materiale particolato, garantendo chiarezza per l'analisi. Il filtro membranoso trattiene i particolati permettendo al farmaco disciolto (HU) di passare. Poiché l'HU è altamente solubile in acqua, il farmaco libero rimane nel filtrato, assicurando che il materiale trattenuto rappresenti esclusivamente particolati e non farmaco libero. I campioni filtrati sono stati quindi analizzati per determinare il contenuto di HU mediante uno spettrofotometro UV-visibile a una lunghezza d'onda di 213 nm, corrispondente all'assorbimento massimo dell'HU (λmax). È stata costruita una curva di calibrazione per quantificare con precisione le concentrazioni di HU.

Coltura cellulare

Lo studio è stato eseguito utilizzando la linea cellulare di carcinoma mammario umano metastatico MCF-7, ottenuta dalla American Type Culture Collection (ATCC). Le cellule sono state mantenute in mezzo RPMI 1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per favorire la crescita e la vitalità cellulare, e con una soluzione di penicillina-streptomicina al 1% per prevenire la contaminazione microbica durante la coltura. Le cellule sono state quindi incubate in condizioni fisiologiche standard a 37 °C in un'atmosfera umidificata di CO₂ incubatrice, con il mezzo di coltura mantenuto a pH 7,4. Queste condizioni sono state scelte per garantire una crescita cellulare ottimale, la proliferazione e l'affidabilità sperimentale durante gli studi di citotossicità.

Saggio di vitalità cellulare (MTT)

Il saggio MTT è stato eseguito per valutare la capacità induttrice di morte cellulare di diverse formulazioni di NANOXURIA16,21. In breve, le cellule MCF-7 sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 1 x 104 cellule/mL e incubate per 24 h in un incubatore a CO₂ per consentire un adeguato attaccamento e crescita cellulare. Le cellule non trattate sono state utilizzate come controllo negativo, mentre i pozzetti contenenti solo mezzo di coltura sono stati usati come controlli bianco. Dopo l'incubazione, il mezzo di coltura è stato sostituito con mezzo fresco contenente diverse concentrazioni delle formulazioni in esame, fino a 200 µg/mL. Le piastre trattate sono state ulteriormente incubate per 72 h in condizioni standard di coltura. Al termine del trattamento, sono stati aggiunti 20 µL di reagente MTT (5 mg/mL) in ciascun pozzetto e incubati per ulteriori 4 h per permettere la formazione di cristalli di formazano intracellulari nelle cellule metabolicamente attive. Successivamente, sono stati aggiunti 100 µL di dimetilsulfossido (DMSO) per sciogliere i cristalli, ottenendo una soluzione violetta. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm mediante un lettore di micropiastre (SpectroStar Nano). La viabilità cellulare (%) è stata calcolata rispetto al gruppo di controllo non trattato utilizzando i valori di assorbanza ottenuti.

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Studio della stabilità

La stabilità di NANOXURIA è stata valutata sistematicamente per un periodo di 3 mesi in condizioni controllate di conservazione, al fine di verificarne l'idoneità per un uso a lungo termine. Ogni formulazione di NANOXURIA è stata suddivisa in aliquote in contenitori ermetici in vetro ambrato per ridurre al minimo l'esposizione alla luce e all'umidità. I contenitori sono stati conservati a una temperatura costante di 25 ± 2 °C e a una temperatura refrigerata di 4 ± 2 °C. I campioni sono stati valutati periodicamente a intervalli prestabiliti (1, 2 e 3 mesi) per verificarne la stabilità fisica e fisico-chimica. Una misurazione iniziale è stata effettuata immediatamente dopo la preparazione e prima della conservazione, considerata come tempo zero (iniziale). Le valutazioni fisiche hanno incluso un'ispezione visiva per rilevare eventuali cambiamenti nell'aspetto, come segni di agglomerazione, sedimentazione, separazione di fase, variazioni di colore (ad esempio, da bianco sporco a giallo), modifiche nella consistenza (ad esempio, viscosità o texture) e nell'odore (ad esempio, rancidità dovuta all'ossidazione lipidica). Per quanto riguarda la stabilità fisico-chimica, sono stati misurati parametri chiave di caratterizzazione, tra cui la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione (PDI) e il potenziale zeta (ZP).

Analisi statistica

In questo studio, tutti i risultati sperimentali sono espressi come valori medi ± deviazione standard (DS) (n = 3) per riflettere la tendenza centrale e la variabilità dei dati. Le analisi statistiche sono state effettuate per valutare la formulazione mediante un test t accoppiato e per confrontare le differenze tra le formulazioni utilizzando l'analisi della varianza a un fattore (ANOVA) seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism versione 10.

Risultati

Proprietà fisicochimiche

Le proprietà fisico-chimiche delle formulazioni NANOXURIA, inclusi le dimensioni delle particelle, l'indice di polidispersione (PDI), il potenziale zeta (ZP), la morfologia e l'efficienza di incapsulamento (EE), sono riportate nella Tabella 2. La valutazione morfologica mediante TEM e SEM, integrata da grafici di distribuzione delle dimensioni delle particelle e del potenziale zeta, è presentata nelle Figure 1, 2 e 3. Un confronto del PDI per diverse combinazioni di surfattanti è mostrato nella Figura 4.

Studio di rilascio

Lo studio di rilascio in vitro delle formulazioni NANOXURIA è stato condotto per valutare come le differenze tra le formulazioni influenzino il profilo di rilascio del farmaco nell'arco di 24 ore (Figura 5). NX-CS ha mostrato il rilascio più rapido, iniziando al 55,90% a 0,5 h e raggiungendo il 104,05% a 24 h (valori >100% potrebbero riflettere variabilità sperimentale o un rilascio completo con leggera sovrastima). Il profilo di rilascio ha mostrato un aumento quasi lineare da 0,5 a 6 h, seguito da un plateau. NX-CT ha mostrato il rilascio più lento e controllato, iniziando al 46,18% a 0,5 h e raggiungendo l'82,99% a 24 h, con un plateau tra 2–12 h (54,51% a 59,38%) seguito da un successivo aumento. NX-ST ha mostrato un profilo di rilascio intermedio, iniziando al 54,05% a 0,5 h, raggiungendo un picco del 90,63% a 12 h e diminuendo leggermente all'86,23% a 24 h. Nel complesso, il rilascio cumulativo ha seguito l'ordine: NX-CS > NX-ST > NX-CT. NX-CS e NX-ST hanno mostrato un rilascio burst iniziale più intenso, mentre NX-CT ha mostrato un rilascio ritardato. La cinetica di rilascio ha indicato un rilascio rapido per NX-CS, un rilascio prolungato per NX-CT e un rilascio bifasico per NX-ST.

Saggio di citotossicità

Il in vitro citotossicità di NANOXURIA le formulazioni è stata valutata su cellule di carcinoma mammario MCF-7 mediante saggio MTT, con Tabella 3 che descrive il IC₅₀ valori. NX-ST ha dimostrato la citotossicità più elevata, con una IC stimata₅₀ di 225 ± 21.47 µg/mL (extrapolato), indicante un'attività anticancer superiore. Al contrario, NX-CS e NX-CT hanno mostrato una citotossicità inferiore, con IC₅₀ valori superiori a 300 µg/mL. L'idrossiurea (HU) libera ha mostrato la minore citotossicità, con una IC₅₀ di 722.57 µg/mL. Poiché l'IC₅₀ i valori per NX-CS e NX-CT sono stati riportati solo come superiori a 300 µg/mL, la loro citotossicità reciproca e rispetto all'HU libero (722.57 µg/mL) non può essere stabilito dai dati attuali; solo NX-ST è stato chiaramente classificato come più citotossico rispetto all’HU libero. Questi risultati indicano che le formulazioni NLC migliorano significativamente l’attività antitumorale dell’HU rispetto al farmaco in forma libera.

Correlazione statistica tra parametri fisico-chimici e citotossicità

Tutti i parametri studiati sono correlati e mostrati in Figura 6. Le analisi statistiche hanno rivelato differenze significative tra le NLC caricate con HU (NX-ST, NX-CT, NX-CS) riguardo al potenziale zeta, all'efficienza di incapsulamento (EE) e alla citotossicità (IC₅₀) [F(2,12) = 6,45, p = 0,014], ma non per quanto riguarda la dimensione delle particelle o l'indice di polidispersità (PDI) [F(2,12) = 1,27, p = 0,31]. NX-ST ha mostrato una citotossicità ottimale con un'efficienza di incapsulamento moderata, mentre NX-CS e NX-CT hanno mostrato un'efficienza di incapsulamento maggiore ma una citotossicità inferiore. Ai valori di IC50 superiori al limite superiore dell'intervallo di concentrazione testato (>300 µg/mL) è stato assegnato un valore di 300 µg/mL per l'analisi esplorativa di correlazione. L'analisi esplorativa di correlazione di Spearman ha mostrato un'associazione positiva tra potenziale zeta e IC₅₀ (ρ = 0,866, p = 0,333). Pertanto, le formulazioni con potenziale zeta meno negativo tendevano a presentare valori di IC₅₀ più elevati, mentre la formulazione NX-ST, con carica più negativa, ha mostrato una maggiore attività citotossica.

Studio della stabilità

Stabilità della dimensione delle particelle

A 25 °C, la dimensione delle particelle di tutte le formulazioni NANOXURIA è aumentata nel corso del periodo di conservazione di tre mesi, mostrando andamenti distinti (Figura 7). NX-ST, 110 nm (1 mese), è rimasta relativamente stabile durante i primi due mesi (106,4 nm), ma è aumentata a 150,6 nm al terzo mese. NX-CT, partita da 91,9 nm, ha mostrato un aumento graduale fino a 102,2 nm in due mesi, seguito da un brusco incremento a 168,3 nm a tre mesi. NX-CS ha mostrato la maggiore variazione, aumentando da 67,3 nm inizialmente a 171,06 nm al terzo mese. Nel complesso, tutte le formulazioni hanno mostrato un aumento della dimensione delle particelle a 25 °C, con l'entità dell'aumento che segue l'ordine: NX-CS > NX-CT > NX-ST.

A 4 °C, le formulazioni NANOXURIA hanno mostrato una stabilità migliore rispetto a 25 °C, con aumenti minori della dimensione delle particelle durante il periodo di conservazione di tre mesi (Figura 7). NX-ST ha mantenuto una stabilità relativa, con dimensioni delle particelle di 110 nm dopo un mese, 102 nm dopo due mesi e 120,96 nm dopo tre mesi. NX-CT ha mostrato un aumento graduale della dimensione delle particelle, da 91,9 nm dopo un mese a 116,7 nm dopo due mesi e 128,5 nm dopo tre mesi. NX-CS ha mostrato la minore variazione, aumentando da 67,3 nm inizialmente a 74,75 nm dopo due mesi e 89,3 nm dopo tre mesi. Nel complesso, l'aumento della dimensione delle particelle a 4 °C ha seguito l'andamento: NX-CT > NX-ST > NX-CS, indicando una stabilità migliore in condizioni di refrigerazione.

Stabilità del PDI

A 25 °C, l'indice di polidispersione (PDI) delle formulazioni NANOXURIA ha mostrato andamenti diversi durante il periodo di conservazione di tre mesi (Figura 8). NX-ST ha mantenuto valori di PDI relativamente stabili per tutta la durata dello studio, indicando una distribuzione delle dimensioni delle particelle costante. NX-CT ha mostrato un aumento del PDI nel secondo mese (0,342), seguito da una diminuzione fino a 0,248 nel terzo mese. NX-CS ha mostrato un aumento progressivo del PDI nel tempo, indicando una graduale perdita di uniformità nella dimensione delle particelle. Nel complesso, NX-ST ha dimostrato la distribuzione più stabile, NX-CT ha mostrato una variabilità transitoria e NX-CS ha evidenziato un'eterogeneità crescente.

A 4 °C, l'indice di polidispersione (PDI) delle formulazioni NANOXURIA ha mostrato andamenti diversi durante il periodo di conservazione di tre mesi (Figura 8). NX-ST ha mostrato valori di PDI relativamente stabili, diminuiti da 0,347 a un mese a 0,269 a due mesi, seguiti da un leggero aumento a 0,349 a tre mesi. NX-CT ha mostrato un aumento progressivo del PDI da 0,221 a un mese a 0,331 a tre mesi, indicando una graduale perdita di uniformità delle particelle. NX-CS ha mostrato anch'esso un andamento crescente del PDI nel tempo, indicativo di una ridotta omogeneità. Nel complesso, NX-ST ha mantenuto la distribuzione più stabile, mentre NX-CT e NX-CS hanno mostrato un'eterogeneità crescente.

Stabilità del potenziale zeta

A 25 °C, il potenziale zeta (ZP) delle formulazioni NANOXURIA ha mostrato andamenti distinti durante il periodo di conservazione di tre mesi (Figura 9). NX-ST ha mostrato un ZP iniziale di −46,43 mV dopo un mese, che è diminuito a −39,37 mV dopo due mesi ed è aumentato a −52,33 mV al terzo mese. NX-CT ha mostrato un aumento graduale della negatività, passando da −30,76 mV dopo un mese a −35,66 mV dopo due mesi e −37,13 mV dopo tre mesi. NX-CS ha mostrato un aumento della negatività del ZP da −30,03 mV inizialmente a −39,6 mV dopo due mesi e −52,47 mV dopo tre mesi. Nel complesso, tutte le formulazioni hanno mostrato valori di ZP decrescenti nel tempo, con NX-ST e NX-CS che presentano valori assoluti maggiori rispetto a NX-CT.

A 4 °C, il potenziale zeta (ZP) delle formulazioni NANOXURIA ha mostrato andamenti distinti durante il periodo di conservazione di tre mesi (Figura 9). NX-ST ha mantenuto valori di ZP negativi costantemente elevati per tutta la durata dello studio. NX-CT ha mostrato un aumento graduale della negatività del ZP, partendo da −30,76 mV e diventando leggermente più negativo al terzo mese. NX-CS ha mostrato una leggera diminuzione della negatività del ZP, passando inizialmente da −30,03 mV a −28,8 mV dopo tre mesi.

Disponibilità dei dati:

I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili all'interno dell'articolo. I set di dati grezzi generati e analizzati durante lo studio attuale sono disponibili nel File Supplementare

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Figura 1: Caratterizzazione morfologica e fisico-chimica di NX-ST. (A) Immagine di microscopia elettronica a scansione (SEM). (B) Immagine di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). (C) Distribuzione dimensionale delle particelle (108,3 nm; PDI = 0,336) (n = 1). (D) Distribuzione del potenziale zeta (−48,8 mV) (n = 1). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Caratterizzazione morfologica e fisico-chimica di NX-CT. (A) Immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM). (B) Immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). (C) Distribuzione dimensionale delle particelle (91,87 nm; PDI = 0,235) (n = 1). (D) Distribuzione del potenziale zeta (−31,3 mV) (n = 1). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Caratterizzazione morfologica e fisico-chimica di NX-CS. (A) Immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM). (B) Immagine al microscopio elettronico a trasmissione (TEM). (C) Distribuzione dimensionale delle particelle (74,72 nm; PDI = 0,244) (n = 1). (D) Distribuzione del potenziale zeta (−36,8 mV) (n = 1). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Confronto del PDI tra formulazioni NANOXURIA con diverse combinazioni di tensioattivi. I valori di PDI sono mostrati per le formulazioni NX-ST, NX-CT e NX-CS. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Rilascio in vitro di idrossiurea dalle formulazioni NANOXURIA. Viene mostrato il rilascio cumulativo di idrossiurea da NX-CS, NX-CT e NX-ST nell'arco di 24 ore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Confronto tra parametri fisico-chimici e citotossicità tra le formulazioni NANOXURIA. Diagramma a ragnatela che confronta dimensione delle particelle, PDI, potenziale zeta (ZP), efficienza di incapsulamento (EE) e IC₅₀ per NX-ST, NX-CS e NX-CT. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 7: Effetto della temperatura e della durata di conservazione sulla dimensione delle particelle di NANOXURIA. (A) Dimensione delle particelle durante la conservazione a 25 °C. (B) Dimensione delle particelle durante la conservazione a 4 °C. (C) Confronto della dimensione delle particelle tra 4 °C e 25 °C a 2 e 3 mesi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 8: Effetto della temperatura e della durata di conservazione sul PDI di NANOXURIA. (A) PDI durante la conservazione a 25 °C. (B) PDI durante la conservazione a 4 °C. (C) Confronto del PDI tra 4 °C e 25 °C a 2 e 3 mesi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 9: Effetto della temperatura e della durata di conservazione sul potenziale zeta di NANOXURIA. (A) Potenziale zeta durante la conservazione a 25 °C. (B) Potenziale zeta durante la conservazione a 4 °C. (C) Confronto del potenziale zeta tra 4 °C e 25 °C a 2 e 3 mesi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

FormulazioniTween-80 (µL)*Dodecilsolfato di sodio (SDS) (mg)Cremophor EL (µL)#
NX-ST50100-
NX-CT50-100
NX-CS-50100
Densità (g/ml) = (1,07*, 1,05#)

Tabella 1: Composizione dei tensioattivi nelle formulazioni NANOXURIA. Le quantità di Tween-80, dodecilsolfato di sodio (SDS) e Cremophor EL sono state utilizzate per preparare le formulazioni NX-ST, NX-CT e NX-CS.

FormulazioniDimensione delle particelle (d.nm) (n = 3) (± DS)PDI (n = 3) (± DS)ZP (mV) (n = 3) (± DS) RE (%) (n = 3) (± DS)
NX-ST110 ± 1.9970.347 ± 0.011-46.433 ± 8.40478.189 ± 3.49
NX-CT91.947 ± 0.2150.221 ± 0.015-30.767 ± 0.47384.638 ± 5.0
NX-CS67.377 ± 7.1580.302 ± 0.091-30.033 ± 5.86286.626 ± 4.676

Tabella 2: Caratterizzazione fisico-chimica delle formulazioni NANOXURIA. Dimensione delle particelle, indice di polidispersità (PDI), potenziale zeta (ZP) ed efficienza di incapsulamento (EE) di NX-ST, NX-CT e NX-CS a 25 °C. I dati sono espressi come media ± DS (n = 3).

FormulazioniIC50 (µg/mL)IC50 (µM)
NX-ST225 ± 21,472960
NX-CS>300-
NX-CT>300-
HU722,579500

Tabella 3: Citotossicità in vitro delle formulazioni NANOXURIA e dell'idrossiurea libera. Valori di IC₅₀ di NX-ST, NX-CS, NX-CT e idrossiurea libera (HU) su cellule MCF-7, espressi in µg/mL e µM.

File Supplementare 1: Dati grezzi e calcoli per la caratterizzazione dei trasportatori lipidici nanostrutturati caricati con idrossiurea. Il file contiene i dati sperimentali e i calcoli sottostanti per le formulazioni NX-ST, NX-CT e NX-CS, inclusi dimensioni delle particelle, indice di polidispersione, potenziale zeta, efficienza di incapsulamento, misurazioni del rilascio del farmaco e analisi comparativa delle formulazioni.Cliccare qui per scaricare questo file.

Discussione

Approccio proposto e risultati chiave

Lo studio attuale ha sviluppato NANOXURIA utilizzando un approccio di omogeneizzazione a caldo. L'acido stearico è stato impiegato come lipide solido, e la temperatura di preparazione è stata mantenuta a circa 70 °C, valore prossimo al punto di fusione dell'acido stearico (~69,3 °C), al fine di garantire una fusione completa del lipide e un'omogeneizzazione efficiente, minimizzando al contempo l'esposizione termica non necessaria dell'HU e dei tensioattivi22. I sistemi tensioattivi sono stati selezionati in base al loro valore di bilanciamento idrofilo-lipofilo (HLB), alla biocompatibilità e all'idoneità per la preparazione di NLC. Sono state effettuate prove preliminari di formulazione per identificare concentrazioni di tensioattivi in grado di produrre nano-dispersioni stabili con dimensioni ridotte delle particelle e basso valore di PDI, evitando al contempo concentrazioni eccessive che potrebbero compromettere la stabilità o la citocompatibilità. Prima dell'analisi della dimensione delle particelle, le formulazioni sono state opportunamente diluite con acqua ad alta purezza per minimizzare gli effetti di scattering multiplo che potrebbero interferire con la determinazione accurata della dimensione e della distribuzione delle particelle23.

Le tre formulazioni, NX-ST, NX-CT e NX-CS, differivano principalmente per la composizione dei loro tensioattivi. NX-ST conteneva T80 e SDS, NX-CT conteneva Cremophor EL e T80, mentre NX-CS conteneva Cremophor EL e SDS. Questa strategia formulativa ha permesso di valutare gli effetti dei tensioattivi non ionici e ionici, nonché delle loro concentrazioni, sulle caratteristiche fisico-chimiche delle NLC cariche con HU. I risultati hanno evidenziato chiare differenze nella dimensione delle particelle, nel PDI, nel ZP, nell'EE, nel comportamento di rilascio del farmaco e nella citotossicità tra le diverse formulazioni, indicando che la scelta del tensioattivo rappresenta un determinante importante nelle prestazioni delle NLC.

La dimensione delle particelle differiva in modo significativo tra le formulazioni (p < 0,05), secondo l'ordine NX-CS < NX-CT < NX-ST. La dimensione delle particelle è un fattore determinante importante per le prestazioni dei nanocarrier, poiché particelle più piccole possono offrire una maggiore area superficiale e influenzare la stabilità della dispersione, le interazioni cellulari, la biodistribuzione e il comportamento di rilascio del farmaco24,25. NX-CS ha prodotto le particelle più piccole, il che potrebbe essere associato all'elevata efficienza emulsionante del Cremophor EL combinata con la concentrazione moderata di SDS. Il Cremophor EL può facilitare la formazione di goccioline più piccole riducendo la tensione interfaciale, mentre l'SDS contribuisce alla stabilizzazione elettrostatica. La concentrazione inferiore di SDS utilizzata in NX-CS rispetto a NX-ST potrebbe aver fornito una stabilizzazione interfaciale sufficiente senza produrre gli effetti interfaciali eccessivi associati alla concentrazione più elevata di SDS26,27,28.

NX-CT ha prodotto una dimensione delle particelle intermedia. La combinazione di Cremophor EL e T80 fornisce due tensioattivi non ionici con proprietà complementari di stabilizzazione interfaciale e sterica. Cremophor EL contribuisce con una forte emulsionazione, mentre T80 può formare una barriera sterica attorno alle particelle e ridurre la coalescenza29,30,31. L'assenza di un tensioattivo ionico evita inoltre interazioni forti mediate da carica durante la formazione delle particelle. Al contrario, NX-ST ha mostrato la dimensione delle particelle più grande. Sebbene SDS sia un tensioattivo emulsionante potente, la sua concentrazione relativamente elevata in NX-ST potrebbe aver alterato l'ambiente interfaciale e il comportamento di crescita delle particelle. T80 fornisce stabilizzazione sterica, ma l'effetto combinato di T80 e della maggiore concentrazione di SDS potrebbe aver prodotto un equilibrio meno favorevole tra emulsionazione e stabilizzazione rispetto a quello ottenuto in NX-CS.

Gli studi sulla morfologia hanno ulteriormente confermato la formazione di vettori lipidici su scala nanometrica. Le analisi al SEM e al TEM hanno mostrato particelle prevalentemente sferiche o quasi sferiche, la cui morfologia osservata è in linea generale con le dimensioni delle particelle determinate mediante DLS. Le differenze tra le misurazioni microscopiche e quelle effettuate con DLS sono previste, poiché il SEM analizza particelle essiccate, mentre il DLS misura il diametro idrodinamico delle particelle insieme ai loro strati di idratazione e ai tensioattivi associati. Pertanto, i risultati combinati delle analisi microscopiche e del DLS confermano la corretta formazione di sistemi NLC su scala nanometrica.

L'indice di polidispersione (PDI) ha fornito informazioni aggiuntive sull'uniformità delle popolazioni di particelle. NX-CT ha mostrato la distribuzione dimensionale più stretta, mentre NX-ST ha presentato il PDI medio più elevato. NX-CS ha avuto un PDI medio intermedio ma una maggiore variabilità tra le misurazioni replicate. In particolare, i valori replicati per NX-CS indicano che la formulazione ha mostrato una variabilità maggiore rispetto a quella di NX-ST e NX-CT. L'andamento complessivo del PDI è stato NX-CT < NX-CS < NX-ST, anche se la differenza riportata non era statisticamente significativa (p > 0,05). Il PDI relativamente basso di NX-CT potrebbe essere correlato alla stabilizzazione sterica combinata fornita da Cremophor EL e T80. Entrambi i tensioattivi sono non ionici e possono stabilizzare l'interfaccia delle particelle senza introdurre forti interazioni elettrostatiche. Cremophor EL facilita l'emulsificazione, mentre T80 fornisce protezione sterica, promuovendo potenzialmente una popolazione di particelle più omogenea32,33. Il PDI più elevato di NX-ST potrebbe riflettere l'influenza della sua concentrazione più alta di SDS. L'SDS fornisce repulsione elettrostatica, ma variazioni nella concentrazione del tensioattivo possono anche alterare la micellizzazione e l'organizzazione interfaciale, contribuendo potenzialmente all'eterogeneità dimensionale delle particelle34,35,36. NX-CS ha mostrato un comportamento intermedio in termini di PDI, coerente con gli effetti combinati di Cremophor EL e una concentrazione inferiore di SDS37.

Le formulazioni differivano anche per la carica superficiale. NX-ST presentava il potenziale zeta (ZP) più negativo, coerente con la presenza di una concentrazione più elevata di SDS, seguito da NX-CT e NX-CS. È previsto un maggiore carico superficiale negativo nei sistemi contenenti SDS poiché il SDS è un tensioattivo anionico. I valori di ZP indicano quindi che il SDS ha contribuito in modo significativo alla carica superficiale delle NLC, mentre i tensioattivi non ionici hanno contribuito principalmente alla stabilizzazione sterica. L'andamento del ZP era NX-ST > NX-CT > NX-CS (p < 0,05). Tuttavia, queste differenze non devono essere attribuite esclusivamente alla composizione dei tensioattivi, poiché anche il tensioattivo libero residuo, la forza ionica e i cambiamenti nell'organizzazione lipide-tensioattivo possono influenzare il ZP misurato38,39,40.

L'efficienza di incapsulamento ha ulteriormente dimostrato l'influenza della composizione sul mantenimento dell'HU. Tutte le formulazioni hanno mostrato un'EE relativamente elevata (>75%), indicando un efficace incorporamento dell'HU nei sistemi NLC. NX-CS ha mostrato l'EE più alta, seguita da NX-CT e NX-ST, con una differenza significativa tra le formulazioni (p < 0,05). Cremophor EL potrebbe aver contribuito a una efficiente stabilizzazione interfaciale e al trattenimento del farmaco, mentre la concentrazione moderata di SDS in NX-CS potrebbe aver fornito una stabilizzazione aggiuntiva senza gli effetti potenzialmente disturbanti associati alla concentrazione più elevata di SDS in NX-ST41,42,43. Tuttavia, poiché l'HU è idrofilo, è improbabile che si sciolga completamente all'interno della matrice lipidica. L'HU potrebbe invece essere presente come farmaco finemente disperso, associato all'interfaccia lipidi-acqua, oppure alloggiato all'interno della matrice lipidica imperfetta e della regione interfaciale ricca di surfattante.

I profili di rilascio hanno mostrato un comportamento dipendente dalla formulazione, con il rilascio cumulativo di HU che seguiva l'ordine NX-CS > NX-ST > NX-CT a 24 h. NX-CS ha mostrato un rilascio relativamente rapido con un burst iniziale seguito da un plateau, coerente con cinetica di primo ordine, mentre NX-CT ha mostrato il rilascio più lento e maggiormente controllato, approssimando cinetica di ordine zero; NX-ST ha mostrato un comportamento intermedio profilo di rilascio bifasico Il rilascio è probabilmente regolato dalla diffusione dell'HU dalla superficie della particella e dalla regione interfaciale ricca di surfattante, seguita da una diffusione più lenta del farmaco intrappolato attraverso la matrice lipidica. Il rilascio più rapido da NX-CS potrebbe essere correlato alla dimensione minore delle particelle, alla maggiore area superficiale e agli effetti combinati di Cremophor EL e SDS, con l'SDS che aumenta l'idrofilicità interfaciale e il Cremophor EL che favorisce la solubilizzazione del farmaco. Al contrario, la combinazione di Cremophor EL e T80 in NX-CT potrebbe fornire una barriera interfaciale più stabile, limitando la diffusione iniziale del farmaco e producendo un rilascio più prolungato, mentre NX-ST ha mostrato un andamento bifasico intermedio attribuibile alle influenze opposte del rilascio facilitato da SDS e della stabilizzazione mediata da T80. Queste interpretazioni sono coerenti con il ruolo proposto dei tensioattivi nella modulazione delle interazioni tra la matrice lipidica e il mezzo di rilascio41,44,45,46,47,48L'acqua è stata utilizzata come mezzo di rilascio per stabilire il comportamento di diffusione di base, ma non riproduce la composizione ionica e le condizioni fisiologiche dei fluidi biologici. Gli elettroliti presenti nei tamponi fisiologici possono alterare lo strato elettrico doppio, l'organizzazione dei tensioattivi, l'aggregazione delle particelle e la permeabilità della membrana, modificando potenzialmente la cinetica di rilascio.

I risultati di citotossicità hanno dimostrato una chiara differenza tra l'HU libero e le formulazioni NLC, con l'HU libero che mostrava il valore più alto di IC₅₀ e NX-ST che presentava la maggiore attività citotossica. I valori più bassi di IC₅₀ osservati per le formulazioni NLC indicano che l'incorporazione dell'HU nel veicolo lipidico ha modificato la sua attività in vitro nei confronti delle cellule MCF-7. La risposta particolarmente marcata di NX-ST potrebbe riflettere il contributo combinato del suo sistema tensioattivo SDS/T80, del potenziale zeta negativo relativamente elevato e del profilo di rilascio bifasico intermedio, che insieme potrebbero influenzare la disponibilità del farmaco all'interfaccia cellulare e l'esposizione temporale delle cellule all'HU rilasciato49,50. In modo interessante, la dimensione più piccola delle particelle e l'elevata EE di NX-CS non si sono tradotte in una maggiore citotossicità, sottolineando che la dimensione delle particelle e il trattenimento del farmaco da soli non determinano l'attività biologica; piuttosto, le interazioni cellulari, il comportamento di rilascio del farmaco, gli effetti dei tensioattivi e la disponibilità del farmaco possono influenzare collettivamente la risposta51,52,53. La minore citotossicità di NX-CT e NX-CS rispetto a NX-ST, pertanto, non deve essere interpretata semplicemente come un rendimento inferiore della formulazione, specialmente considerando che NX-CT ha dimostrato il rilascio più controllato.

Lo studio sulla conservazione ha dimostrato buona stabilità fisica, poiché nessun agglomeramento visibile, sedimentazione, separazione di fase, discolorazione, variazione della viscosità o della consistenza, né odore anomalo o rancido sono stati osservati in nessuna formulazione durante tutto il periodo di conservazione. Tuttavia, i dati sulla stabilità fisicochimica hanno fornito un quadro più differenziato. A 25 °C, un aumento della dimensione delle particelle e/o dell'indice di polidispersità (PDI) ha indicato cambiamenti progressivi nei sistemi colloidali, con entità e significatività statistica variabili tra le diverse formulazioni. NX-ST ha tratto vantaggio dal forte contributo elettrostatico dell'SDS, mentre NX-CT, che si basava prevalentemente sulla stabilizzazione sterica fornita da Cremophor EL e T80, ha mostrato una maggiore suscettibilità ai cambiamenti nelle caratteristiche delle particelle. NX-CS, nonostante la combinazione di stabilizzazione elettrostatica e sterica, ha mostrato comunque modifiche durante lo stoccaggio, indicando che la presenza di due meccanismi di stabilizzazione non impedisce completamente il riarrangiamento nel tempo del sistema NLC. Conservazione a 4 °C ha generalmente garantito una migliore conservazione delle proprietà fisico-chimiche, coerente con una ridotta mobilità molecolare e cambiamenti strutturali nei lipidi più lenti; l'NX-CS ha mostrato una stabilità dimensionale delle particelle relativamente migliore, mentre l'NX-ST ha mantenuto caratteristiche complessivamente costanti. Tuttavia, l'NX-CT ha continuato a mostrare cambiamenti progressivi nell'indice di polidispersità (PDI), indicando che la sola stabilizzazione sterica potrebbe non essere sufficiente per un immagazzinamento prolungato. I cambiamenti nella ZP durante la conservazione suggeriscono ulteriormente un riorganizzazione dipendente dal tempo dell'interfaccia lipide-tensioattivo, potenzialmente correlata alla desorbimento del tensioattivo, alla ricristallizzazione dei lipidi e ai cambiamenti strutturali associati all'HU, che non sono stati direttamente dimostrati47,48,54. 

Progressi nel campo

Formulazioni di NLC di altri agenti antitumorali, tra cui gefitinib, capecitabina e imatinib, hanno precedentemente dimostrato un miglioramento del rilascio rispetto al farmaco libero14,15,16, ma dati comparativi su come diverse combinazioni di tensioattivi modulino specificamente il profilo fisico-chimico e citotossico delle NLC caricate con idrossiurea sono stati limitati43,44,55. Confrontando sistematicamente tre sistemi di tensioattivi all'interno di una singola piattaforma NLC, questo studio fornisce un confronto diretto e internamente controllato che chiarisce come la natura ionica e la concentrazione del tensioattivo influenzino congiuntamente la dimensione delle particelle, la stabilità colloidale, il mantenimento del farmaco e l'attività antitumorale in vitro per un farmaco piccolo e altamente idrofilo – una combinazione meno rappresentata in letteratura rispetto ai farmaci lipofili51,54,56,57. Questi risultati ampliano le precedenti segnalazioni sull'incapsulamento di HU in nanocarrier a base lipidica e di albumina53,58, identificando una coppia di tensioattivi (T80–SDS) associata al maggiore potenziamento citotossico in vitro.

Limiti dello studio

Questo studio presenta diverse limitazioni che dovrebbero essere prese in considerazione nell'interpretazione dei risultati. In primo luogo, la valutazione biologica si è limitata a un singolo saggio in vitro MTT su cellule tumorali della mammella MCF-7; sebbene l'idrossiurea (HU) venga utilizzata clinicamente nella leucemia mieloide cronica e nella sindrome falciforme, i dati attuali non supportano conclusioni specifiche relative a queste patologie, e sarebbe necessaria una conferma in un modello appropriato di leucemia (ad esempio, cellule K562) e in vivo. In secondo luogo, le spiegazioni meccanicistiche proposte per le differenze osservate nelle proprietà fisico-chimiche e citotossiche (ad esempio, desorbimento del tensioattivo, ricristallizzazione dei lipidi, alterato uptake cellulare) non sono state dimostrate direttamente e devono essere considerate ipotesi; tecniche come DSC, XRD e Cryo-TEM23,41, insieme a studi sull'uptake cellulare e sulla cinetica di rilascio, sarebbero necessarie per confermarle. In terzo luogo, il rilascio in vitro è stato valutato in acqua piuttosto che in un tampone fisiologico, un passaggio considerato essenziale per prevedere le prestazioni in vivo59. In quarto luogo, la stabilità chimica dell'HU durante la preparazione non è stata quantificata direttamente, e non è stata effettuata una valutazione specifica della fuoriuscita del farmaco nella fase acquosa durante lo stoccaggio; data l'elevata solubilità acquosa dell'HU, tale fuoriuscita è possibile e dovrebbe essere valutata. Infine, la formulazione è destinata a somministrazione parenterale, e le interpretazioni meccanicistiche qui proposte devono essere considerate esplorative, in attesa di ulteriori caratterizzazioni, in linea con la letteratura più ampia sui NLC che sottolinea la necessità di una rigorosa validazione fisico-chimica32.

Approcci alternativi

Diverse strategie alternative di caratterizzazione e validazione potrebbero rafforzare i futuri studi in questo ambito. Tecniche allo stato solido (ad esempio, DSC, XRD) e la microscopia criogenica elettronica (cryo-TEM) contribuirebbero a chiarire lo stato fisico dell'HU all'interno della matrice lipidica e a verificare direttamente i meccanismi proposti di desorbimento del tensioattivo e ricristallizzazione dei lipidi, che spiegano le tendenze di stabilità osservate36,60,61. La valutazione del rilascio in tampone fisiologico o in fluidi biologici simulati, piuttosto che in acqua pura, permetterebbe una previsione più accurata del comportamento di rilascio in vivo; inoltre, la quantificazione diretta dell'assorbimento cellulare (ad esempio, mediante marcatura fluorescente e citometria a flusso) verificherebbe l'ipotesi basata sull'assorbimento per spiegare la citotossicità aumentata di NX-ST, anziché dedurla esclusivamente dal potenziale zeta62,63,64. Test di conferma in una seconda linea cellulare clinicamente rilevante (ad esempio, K562 per la leucemia mieloide cronica) e la valutazione in condizioni formali di stabilità accelerata contribuirebbero ulteriormente a tradurre i risultati in vitro qui presentati verso una formulazione applicabile in ambito clinico.

Importanza e applicazioni potenziali

Questi risultati sono rilevanti per l'ampio sforzo volto a migliorare la somministrazione dell'idrossiurea, il cui utilizzo clinico è attualmente limitato da un'elevata clearance, biodisponibilità variabile e tossicità correlata alla dose. Dimostrando che la composizione del tensioattivo può essere modulata per favorire o particelle più piccole e stabili con maggiore efficienza di incapsulamento (NX-CS, NX-CT) oppure una maggiore potenza citotossica in vitro (NX-ST)41,65, questo studio fornisce una base pratica per selezionare o ulteriormente ottimizzare la composizione delle NLC in base all'attributo di somministrazione prioritario per una determinata applicazione, senza modificare la molecola di HU stessa. Piattaforme di nanoveicoli modulabili di questo tipo potrebbero essere applicabili anche ad altri farmaci idrofili di piccole dimensioni che presentano limitazioni simili nella somministrazione.

Prospettive future

I lavori futuri dovrebbero dare priorità alla validazione quantitativa dei meccanismi fisico-chimici qui proposti, utilizzando tecniche di stato solido e di imaging; ai test di rilascio del farmaco in condizioni fisiologicamente rilevanti; alla misurazione diretta dell'assorbimento cellulare e della sua relazione con la citotossicità; ai test su ulteriori linee cellulari clinicamente rilevanti e, in ultima analisi, su modelli in vivo; a studi formali di stabilità accelerata e a lungo termine per supportare la determinazione della durata dello scaffale; e alla quantificazione della stabilità chimica di HU e della fuoriuscita correlata alla conservazione. Affrontare questi aspetti potrebbe aiutare a stabilire se i vantaggi fisico-chimici qui identificati si traducano in un beneficio terapeutico concreto.

Conclusioni

Questo studio affronta i principali limiti della terapia con HU, tra cui una scarsa efficienza di somministrazione dovuta all'eliminazione rapida, biodisponibilità variabile e tossicità correlata alla dose, sviluppando vettori lipidici nanostrutturati (NANOXURIA). I risultati dimostrano che la composizione del tensioattivo e le condizioni di conservazione influenzano in modo critico la stabilità fisico-chimica, le prestazioni citotossiche e l'efficienza complessiva di somministrazione. Tra le formulazioni, NX-ST ha mostrato prestazioni superiori, con un'attività citotossica 3,2 volte maggiore rispetto all'HU libero, indicando un migliorato assorbimento cellulare e un più efficace rilascio del farmaco. Questa maggiore efficacia è attribuita alle sue caratteristiche bilanciate delle particelle, al rilascio controllato e alla stabilizzazione elettrostatica efficace.

Al contrario, le formulazioni basate principalmente su tensioattivi non ionici hanno mostrato una stabilità e prestazioni relativamente inferiori, evidenziando l'importanza di meccanismi combinati di stabilizzazione. Le condizioni di conservazione hanno influenzato in modo significativo il comportamento delle formulazioni: 25 °C ha favorito la crescita delle particelle e l'eterogeneità, mentre 4 °C ha preservato meglio stabilità, uniformità e carica superficiale.

Nel complesso, questo studio affronta il divario di ricerca identificato dimostrando che sistemi NLC progettati razionalmente possono migliorare il rilascio di HU senza alterare il farmaco stesso. I risultati sottolineano che combinazioni ottimali di lipidi e tensioattivi e condizioni di conservazione adeguate sono essenziali per ottenere sistemi di somministrazione del farmaco stabili, efficienti e clinicamente rilevanti.

Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Ringraziamenti

Gli autori esprimono la loro gratitudine al Deanship of Graduate Studies and Scientific Research della Jazan University per aver finanziato questo lavoro di ricerca attraverso il progetto numero: JU-RSP2026. Gli autori inoltre ringraziano sentitamente il College of Pharmacy della Jazan University, Jazan, Arabia Saudita, per aver fornito le risorse essenziali che hanno facilitato il completamento con successo di questo progetto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro centrifugo Amicon Ultra-2 mL (cutoff molecolare 3 kDa)Millipore, IrlandaUFC200324
Griglia di rame rivestita di carbonio (supporto campione per TEM)N/A
Cremophor EL (tensioattivo non ionico, derivato dell'olio di ricino, purezza ≥98%)MedChemExpress, NJ, USAHY-Y1890
Sacche per dialisi (cutoff molecolare 12-14 kDa)Spectrum Laboratories, CA, USA08-670-3BB
Dietilsolfossido (DMSO)Fisher Chemicals, Regno Unito10162090
Siero bovino fetale (FBS)Gibco, Paisley, Regno Unito10270-106
Microscopio elettronico a scansione a emissione di campo (FE-SEM), Apreo 2Thermo Fisher-FEI, USA1229000
Omogeneizzatore, HG 15DWiseTis, GermaniaDH.WHG02020
Idrossiurea (HU) (purezza ≥99%)Sudair Pharma, Riyad, Arabia Saudita21L001
Linea cellulare di carcinoma mammario umano MCF-7American Type Culture Collection (ATCC), USAHTB-22
Lettore di micropiastre, SpectroStar NanoBMG LABTECH, Ortenberg, Germania601-101
Reagente MTT (5 mg/mL)Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USAM6494
Soluzione di penicillina-streptomicinaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP4333
Mezzo RPMI 1640Gibco, Grand Island, NY, USA11875093
Olio di sesamoCommerciante locale, Jazan, Arabia SauditaN/A
Dodecilsolfato sodico (SDS) (tensioattivo anionico, purezza 90%)PanReac AppliChem, Darmstadt, Germania28312
Acido stearico (purezza 95-106%)Himedia, Mumbai, IndiaGRM1425
Filtro per siringa (0,45 µm)Merck, SASLHV033RS
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM), TalosThermo Fisher, USAN/A
Tween-80 (T80) (tensioattivo non ionico, acido oleico ≥58%)Loba Chemie, Mumbai, IndiaArt. No. 06420
Spettrofotometro UV-visibileShimadzu, Kyoto, Giappone220-92961-01
Zetasizer Nano ZS90Malvern Panalytical, Malvern, Regno UnitoZEN3690

Riferimenti

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