Agopuntura Standardizzata più Decotto Modificato Xiaoxuming per l'Ictus Ischemico Acuto: Un Trial Controllato Randomizzato

Sommario

Questo studio controllato randomizzato fornisce un protocollo riproducibile di agopuntura standardizzata abbinata alla Decozione Xiaoxuming modificata come trattamento aggiuntivo nella gestione dell'ictus ischemico acuto. L'intervento è stato associato a un lieve miglioramento neurologico al giorno 28 e a differenze in alcuni biomarcatori selezionati; le analisi a livello individuale non hanno supportato un effetto di mediazione né un'asserzione di mediazione causale.

Abstract

L'ictus ischemico acuto è accompagnato da infiammazione sistemica e alterazione della microflora intestinale. Questo studio controllato randomizzato, in singolo cieco, monocentrico ha verificato se l'agopuntura standardizzata associata alla Decozione modificata di Xiaoxuming, aggiunta alle cure standard, migliorasse il recupero neurologico precoce ed fosse associata a biomarcatori intestinali e infiammatori predeterminati. Gli adulti con ictus ischemico acuto confermato mediante imaging entro 72 ore e un punteggio della scala dell'ictus del National Institutes of Health (NIHSS) compreso tra 4 e 15 sono stati randomizzati in rapporto 1:1 a ricevere cure standard oppure l'intervento combinato per 28 giorni, con 64 partecipanti per gruppo. L'endpoint primario è stato il punteggio NIHSS al giorno 28, aggiustato per il valore basale di NIHSS, età, sesso, terapia di ripristino del flusso ematico e tempo tra insorgenza e randomizzazione, con i dati mancanti gestiti mediante imputazione multipla 30-fold. Gli outcome secondari ed esplorativi includevano l'Indice di Barthel, la scala modificata di Rankin (mRS) al giorno 90, eventi avversi, marcatori infiammatori, lipopolisaccaride (LPS), diversità microbica fecale, generi selezionati e acidi grassi a catena corta. L'analisi con imputazione multipla ha stimato un punteggio NIHSS al giorno 28 più basso nel gruppo di intervento (differenza aggiustata: −1,30 punti; intervallo di confidenza al 95%: −2,36 a −0,24; P = 0,017). L'Indice di Barthel al giorno 28 era più elevato, mentre i valori di NIHSS, Indice di Barthel e mRS 0–2 osservati al giorno 90 non differivano in modo significativo. Al giorno 28, il gruppo di intervento presentava una maggiore diversità secondo Shannon e livelli fecali più elevati di butirrato, nonché livelli più bassi di interleuchina-6 e LPS. Le variazioni individuali nei livelli di butirrato, interleuchina-6, LPS e diversità secondo Shannon non erano significativamente associate alla variazione del punteggio NIHSS; pertanto, non è stata effettuata un'analisi di mediazione. Non è stato identificato alcun evento avverso grave correlato all'intervento. L'intervento combinato è risultato associato a un modesto miglioramento neurologico precoce e a differenze in alcuni biomarcatori selezionati, ma i risultati biologici sono di tipo esplorativo e non dimostrano un percorso causale tra cervello e intestino.

Introduzione

L'ictus rimane una delle principali cause di morte e di disabilità a lungo termine in tutto il mondo, e l'ictus ischemico ne rappresenta la maggior parte dei casi. L'approccio terapeutico standard prevede una diagnosi rapida, la riperfusione quando indicata, una terapia antiaggregante, la gestione dei fattori di rischio, la prevenzione delle complicanze e la riabilitazione^1,2. Anche con queste misure, i deficit neurologici residui sono comuni, il che giustifica la valutazione di interventi aggiuntivi riproducibili.

L'infiammazione post-ischemica, lo stress endoteliale e della barriera emato-encefalica, l'attivazione immunitaria periferica e le alterazioni metaboliche contribuiscono al danno secondario e al recupero³. L'ictus può inoltre alterare la motilità intestinale, la permeabilità, la composizione microbica e la segnalazione immunitaria di origine intestinale, creando associazioni bidirezionali comunemente descritte come asse cervello-intestino⁴.

Studi clinici hanno associato l'ictus ischemico acuto a disbiosi intestinale, alterazioni dei profili di acidi grassi a catena corta (SCFA) e esiti peggiori⁵. Il butirrato è di particolare interesse perché sostiene l'integrità della barriera epiteliale e regola il segnale immunitario⁶. Queste osservazioni giustificano la misurazione della diversità microbica, dei metaboliti microbici, dell'esposizione all'endotossina e dei mediatori infiammatori insieme agli esiti neurologici, pur riconoscendo che cambiamenti paralleli non dimostrano una relazione di mediazione.

L'agopuntura è stata valutata come terapia aggiuntiva per l'ictus, ma gli studi pubblicati differiscono per tempistica, selezione dei punti di agopuntura, frequenza e valutazione degli esiti^7,8. Un protocollo riproducibile richiede quindi procedure esplicite relative alla tecnica di inserimento dell'ago, alla stimolazione, al tempo di permanenza, alla sicurezza e al rispetto delle indicazioni. Il Decotto Xiaoxuming è una formula erboristica classica utilizzata per condizioni correlate all'ictus. Studi sistematici e farmacologici riportano un possibile beneficio, ma le evidenze cliniche rimangono limitate da dimensioni campionarie ridotte, eterogeneità e rischio di bias^9,10. Il suo contributo non può essere separato da quello dell'agopuntura in un disegno sperimentale con due gruppi e intervento combinato.

Questo studio ha valutato un intervento combinato standardizzato utilizzando esiti clinici e biomarcatori esplorativi predefiniti a livello intestinale e infiammatorio¹¹. L'ipotesi era che l'aggiunta di agopuntura standardizzata più la Decozione Xiaoxuming modificata alle cure standard migliora il recupero neurologico precoce e modifica favorevolmente i biomarcatori predefiniti correlati all'asse cervello-intestino.

Protocollo

L'approvazione etica per questo studio è stata rilasciata dal Comitato di Etica Medica dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese e Medicina Occidentale della città di Dazhou il 10 giugno 2025 (numero di approvazione 2025–29; valida fino al 9 giugno 2027). Ogni partecipante o rappresentante legalmente autorizzato ha fornito il consenso informato scritto prima della randomizzazione. Il consenso includeva l'agopuntura, il trattamento a base di erbe, il prelievo di sangue e feci, la protezione dei dati sul microbioma e la possibilità di ritirarsi dal campionamento biologico senza perdita di cure standard. Le procedure hanno seguito la Dichiarazione di Helsinki. Gli strumenti di ricerca utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali. Lo studio non è stato registrato in via preliminare perché la registrazione non era stata completata prima dell'inizio del reclutamento dei partecipanti.

1. Progettazione dello studio e randomizzazione

I partecipanti sono stati reclutati dal 1° marzo al 31 dicembre 2025 e ciascun partecipante è stato seguito per 90 giorni. Lo studio ha adottato un disegno monocentrico, in cieco per i valutatori, a gruppi paralleli, con un intervento attivo della durata di 28 giorni. Ai partecipanti idonei è stato assegnato in rapporto 1:1 un trattamento di cura standard oppure il trattamento di cura standard più agopuntura e Decotto Xiaoxuming modificato. La randomizzazione è stata effettuata mediante blocchi generati al computer di 4 o 6 unità e stratificata in base al punteggio NIHSS basale (4–8 vs. 9–15). L'assegnazione è stata nascosta utilizzando buste sigillate, opache e numerate in modo sequenziale.

L'intervento finale della durata di 28 giorni è stato completato il 28 gennaio 2026, il follow-up finale è stato completato il 31 marzo 2026, il database è stato bloccato il 15 aprile 2026 e l'analisi prestabilita è stata completata entro il 30 aprile 2026. Lo studio ha seguito i principi CONSORT¹²; il flusso dei partecipanti è mostrato in Figura 1 e il programma delle valutazioni è riportato in Tabella 1.

2. Selezione e arruolamento dei partecipanti

I pazienti con ictus ischemico acuto confermato mediante tomografia computerizzata o risonanza magnetica sono stati sottoposti a screening entro 72 ore dall'esordio dei sintomi o dall'ultima volta in cui erano in buone condizioni. I partecipanti idonei erano adulti di età compresa tra 40 e 80 anni con un punteggio alla scala dell'ictus del National Institutes of Health (NIHSS) compreso tra 4 e 15, segni vitali stabili dopo la valutazione d'urgenza, la capacità di iniziare l'intervento assegnato entro 24 ore e la disponibilità a fornire campioni di sangue e feci. Le valutazioni NIHSS sono state effettuate da valutatori qualificati¹³.

I criteri di esclusione erano emorragia intracerebrale; attacco ischemico transitorio senza infarto; coma; intervento chirurgico decompressivo programmato; assunzione orale non sicura; infezione attiva che richiede antibiotici sistemici; uso di antibiotici, integratori probiotici o integratori prebiotici entro 4 settimane; malattia infiammatoria intestinale; diarrea cronica; intervento chirurgico gastrointestinale negli ultimi 6 mesi; malattia neoplastica; disfunzione epatica o renale grave; ipertensione non controllata; malattia coronarica instabile; aritmia non idonea; conta piastrinica < 80 × 10⁹/L; controindicazione all'agopuntura; allergia alla formula a base di erbe; gravidanza o allattamento; partecipazione a un altro studio interventistico negli ultimi 3 mesi; o incapacità di completare il follow-up. Gli alimenti vegetali comuni, le verdure sott'aceto e il tofu fermentato non sono stati classificati come prodotti vietati perché le diete cinesi abituali non potevano essere completamente standardizzate.

3. Cura standard ed esposizioni pertinenti al microbioma

Entrambi i gruppi hanno ricevuto cure orientate dalle linee guida, incluse trombolisi endovenosa e/o trombectomia meccanica quando indicato; terapia antiaggregante, riduzione dei livelli di lipidi, controllo della pressione arteriosa e della glicemia; idratazione e nutrizione; screening per la disfagia; prevenzione della polmonite e della trombosi venosa profonda; riabilitazione; e prevenzione secondaria¹⁴. La terapia di riperfusione non è stata ritardata né sostituita a causa della partecipazione allo studio.

Dalla randomizzazione fino al giorno 28, erano vietati l'agopuntura non di studio, la moxibustione, le prescrizioni erboristiche per l'ictus, gli integratori probiotici/prebiotici/simbiotici e i preparati mirati alla microbiota. Ai partecipanti e agli assistenti è stato comunicato che queste restrizioni si applicavano agli integratori e ai prodotti probiotici commercializzati, e non agli alimenti di uso comune.

Sono state registrate la terapia di riperfusione e le deviazioni dal protocollo. Dieta, gravità della disfagia, nutrizione enterale, antibiotici somministrati dopo la randomizzazione, uso di inibitori della pompa protonica, costipazione e durata del ricovero sono stati registrati come possibili fattori confondenti legati al microbioma. Queste variabili non sono state incluse come covariate nei modelli statistici del microbioma e sono state pertanto considerate fattori confondenti residui.

4. Oscuramento della randomizzazione

La sequenza di randomizzazione è stata generata da uno statistico indipendente. Una coordinatrice, non coinvolta nel reclutamento, nel trattamento, nella valutazione degli esiti, nei lavori di laboratorio o nell'analisi statistica, ha preparato delle buste sigillate, opache e contrassegnate con numeri in sequenza. La busta successiva veniva aperta solo dopo il consenso informato, la conferma dei criteri di idoneità e il completamento delle valutazioni iniziali. La sequenza di randomizzazione è stata conservata in un file protetto da password, inaccessibile ai valutatori degli esiti, al personale di laboratorio e agli analisti fino al completamento dell'analisi primaria.

5. Oscuramento dell'esito, del laboratorio e dell'analisi

Le valutazioni NIHSS, Barthel Index e scala di Rankin modificata (mRS) sono state effettuate da valutatori separati dalla somministrazione del trattamento. Ai partecipanti e agli operatori sanitari è stato richiesto di non rivelare l'assegnazione al trattamento ai valutatori degli esiti. I campioni biologici sono stati etichettati utilizzando identificatori codificati e il personale di laboratorio e gli statistici sono rimasti ciechi rispetto ai codici di gruppo fino al completamento delle analisi prestabilite. Gli eventi accidentali di svelamento del cieco sono stati documentati.

6. Agopuntura manuale standardizzata

L'agopuntura è stata iniziata entro 24 ore dalla randomizzazione, dopo che il neurologo responsabile ne ha confermato la stabilità emodinamica e il rischio emorragico accettabile. Il trattamento era programmato con una sessione da 30 minuti al giorno, 5 giorni alla settimana per 4 settimane, per un totale di 20 sessioni previste.

I partecipanti sono stati posizionati in modo sicuro e la cute è stata disinfettata prima della puntura con ago. I punti Baihui (GV20), Shuigou (GV26), Fengchi bilaterali (GB20), Quchi (LI11), Hegu (LI4), Zusanli (ST36), Yanglingquan (GB34) e Sanyinjiao (SP6) sono stati punti secondo la lateralità e la profondità specificate nella Tabella 2¹⁵.

Sono stati utilizzati aghi sterili monouso in acciaio inossidabile per agopuntura, di dimensioni 0,25 mm × 40 mm. Gli aghi sono stati inseriti a profondità comprese tra 10 e 25 mm in base al punto di agopuntura e al biotipo corporeo. Sono state applicate manualmente le tecniche di sollevamento-spinta e rotazione fino al raggiungimento del deqi o di una risposta locale alla puntura. Gli aghi sono stati mantenuti in sede per 30 minuti e stimolati manualmente ogni 10 minuti. Non è stata utilizzata l'elettroagopuntura.

L'agopuntura è stata eseguita da agopuntori autorizzati con almeno 5 anni di esperienza clinica. Le sedute sono state rinviate in caso di febbre, pressione sanguigna instabile, deterioramento neurologico, emorragia attiva, agitazione o affaticamento severi, o rifiuto da parte del partecipante. Il motivo del rinvio e qualsiasi evento avverso associato sono stati registrati.

7. Decotto Xiaoxuming modificato

Ogni dose giornaliera conteneva Ephedrae Herba 6 g, Cinnamomi Ramulus 9 g, Paeoniae Radix Alba 12 g, Saposhnikoviae Radix 9 g, Zingiberis Rhizoma Recens 6 g, Glycyrrhizae Radix et Rhizoma 6 g, Angelicae Sinensis Radix 10 g, Chuanxiong Rhizoma 10 g, Astragali Radix 20 g, Poria 15 g e Paeoniae Radix Rubra 12 g. L'identità delle erbe grezze prescritte è stata verificata dalla farmacia dell'ospedale prima della preparazione, e sono state seguite le procedure abituali di dispensazione e decottura. La formula è descritta in dettaglio nella Tabella 3⁹˒¹⁶.

Erano consentite solo modifiche predefinite. Cannabis Fructus 10 g poteva essere aggiunta in caso di stitichezza, la Poria poteva essere aumentata fino a 20 g in caso di feci molli e la Radice di Astragalo poteva essere aumentata fino a 30 g in caso di sudorazione spontanea marcata. Ogni modifica, dose non assunta, episodio di vomito e interruzione del trattamento veniva registrata.

Una dose giornaliera è stata decotta in farmacia ospedaliera e concentrata fino a 400 mL. La preparazione è stata suddivisa in due porzioni da 200 mL e somministrata dopo colazione e cena per 28 giorni. La somministrazione è stata sospesa in caso di deglutizione non sicura, vomito persistente, allergia, alanina/aspartato aminotransferasi >3× il limite superiore della norma, velocità stimata di filtrazione glomerulare <45 mL/min/1.73 m², pressione arteriosa non controllata, tachiarritmia clinicamente significativa, nuovo dolore toracico o rischio determinato dallo sperimentatore.

8. Restrizioni del gruppo di controllo

Ai partecipanti assegnati al gruppo di controllo è stata somministrata esclusivamente la terapia standard. È stato vietato l'uso di agopuntura non conforme al protocollo, moxibustione, terapie erboristiche correlate all'ictus, integratori probiotici/prebiotici/simbionti e prodotti mirati alla microbiota fino al giorno 28. Eventuali utilizzi di questi interventi sono stati registrati come scostamenti dal protocollo.

9. Monitoraggio dell'aderenza e della sicurezza

L'aderenza all'agopuntura è stata calcolata come numero di sessioni completate diviso per le 20 sessioni previste. L'aderenza all'erboristeria è stata valutata mediante i pacchetti restituiti e i diari dei farmaci. L'aderenza per protocollo è stata definita come il completamento di almeno 16 sessioni di agopuntura e l'assunzione di almeno l'80% delle dosi prescritte di decotto. I pazienti ricoverati sono stati osservati quotidianamente, mentre i pazienti ambulatoriali sono stati monitorati durante i controlli programmati. Gli eventi avversi registrati includevano sanguinamento locale, ematoma, dolore, capogiri, sincope, infezione, sintomi gastrointestinali, eruzione cutanea, anomalie epatiche o renali, palpitazioni, fluttuazioni della pressione sanguigna e reazioni allergiche. Gli eventi avversi gravi e la loro attribuzione sono stati classificati indipendentemente da due clinici come non correlati, possibilmente correlati, probabilmente correlati o sicuramente correlati.

10. Valutazione dell'esito clinico

Il NIHSS è stato valutato al basale e ai giorni 14, 28 e 90. Il NIHSS al giorno 28, aggiustato per il valore basale, è stato l'endpoint primario. L'Indice di Barthel è stato valutato al basale e ai giorni 28 e 90, mentre il mRS è stato valutato al giorno 90. I casi di ictus ricorrente, decesso per qualsiasi causa e gli eventi avversi sono stati registrati fino al giorno 90¹⁷. Un esito favorevole al giorno 90 è stato definito come un valore di mRS compreso tra 0 e 2. Gli esiti clinici e biologici, i tempi di valutazione, le definizioni e le classificazioni delle analisi sono riassunti nella Tabella 4.

11. Raccolta del sangue e saggi dei biomarcatori

Il sangue venoso è stato raccolto al basale prima dell'intervento e ai giorni 14 e 28, preferibilmente tra le 06:30 e le 08:30 dopo un digiuno notturno. La raccolta in condizioni non digiune è stata documentata quando applicabile.

I campioni sono stati processati entro 2 h. La centrifugazione è stata eseguita a 850 × g per 10 min a 4 °C. Il siero e il plasma sono stati aliquotati in cryovials sterili e conservati a −80 °C. I campioni dello stesso partecipante sono stati mantenuti nello stesso lotto di saggio ogni volta che possibile.

La proteina C-reattiva ad alta sensibilità, l'interleuchina-6 (IL-6), il fattore di necrosi tumorale-alfa, il lipopolisaccaride (LPS) e la zonulina sono stati quantificati utilizzando i saggi specificati. L'IL-6, il fattore di necrosi tumorale-alfa, il LPS e la zonulina sono stati misurati in duplicato e le misurazioni sono state ripetute quando il coefficiente di variazione tra i duplicati superava il 15%.

Le specifiche di catalogo dichiarate dal produttore, piuttosto che i risultati di validazione specifici dello studio, erano le seguenti: sensibilità per hs-CRP, 5,36 pg/mL; intervallo, 18,75–1.200 pg/mL; CV intra-/inter-saggio su siero, 1,4%/4,0%; sensibilità per IL-6, 0,7 pg/mL; intervallo, 3,12–300 pg/mL; CV intra-saggio su siero/plasma, 1,6%–4,2%; CV inter-saggio, 3,3%–6,4%; sensibilità per il fattore di necrosi tumorale-alfa, 6,23 pg/mL; intervallo, 15,6–1.000 pg/mL; CV intra-saggio, 2,2%–3,0%; CV inter-saggio, 7,3%–8,4%; limite di rilevazione della zonulina, 0,183 ng/mL; limite di quantificazione, 0,183 ng/mL; linearità, 3,03–40,25 ng/mL; CV di ripetibilità, 3,5%–6,0%; e CV di riproducibilità, 7,7%–8,3%. Il limite di rilevazione e il limite di quantificazione della zonulina sono stati riportati dal produttore prima dell'applicazione del fattore di diluizione del campione.

Le concentrazioni di LPS sono state riportate in EU/mL e le concentrazioni plasmatiche di trimetilammina N-ossido sono state riportate in µmol/L. Entrambe le misurazioni sono state considerate risultati esplorativi di biomarcatori.

12. Raccolta delle feci e sequenziamento dell'RNA 16S

I campioni fecali sono stati raccolti al basale e al giorno 28 in provette sterili, e sono stati registrati i tempi di defecazione e di congelamento. Quando un partecipante non riusciva a defecare entro l'intervallo di raccolta previsto, la prima evacuazione spontanea successiva veniva raccolta non appena clinicamente fattibile. Tutti i partecipanti randomizzati hanno infine fornito campioni fecali idonei per le analisi del microbioma e degli acidi grassi a catena corta; procedure di raccolta ritardate non hanno comportato la mancanza di campioni fecali per le analisi previste basate sulle feci. Il ritardo nella raccolta e lo stato di costipazione sono stati documentati, e i lassativi non sono stati somministrati esclusivamente per il campionamento di ricerca.

Le feci fresche sono state trasportate entro 2 h. Quando il trasporto immediato non era possibile, i campioni venivano conservati a 4 °C per non più di 6 h prima dell'immagazzinamento a −80 °C. Si sono evitati cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. L'estratto del DNA è stato effettuato utilizzando il kit specificato per l'estrazione del DNA fecale. La regione V3–V4 è stata amplificata con le primers 338F e 806R, ed è stata eseguita una sequenziazione a estremità unite di 300 bp. In QIIME 2 versione 2024.10.1 (RRID: SCR_021258), le letture sono state demultiplexate e i primers sono stati rimossi. DADA2 è stato utilizzato per il filtraggio della qualità, la denoising, l'unione delle letture accoppiate, la rimozione delle chimere e l'inferenza delle varianti di sequenza degli amplificoni. L'assegnazione tassonomica è stata effettuata rispetto alla release SILVA 138.1 (RRID: SCR_006423).

Gli indici di Shannon e Chao1 sono stati calcolati per la diversità alfa. Le distanze di Bray-Curtis e l'analisi delle coordinate principali sono state utilizzate per la diversità beta, e l'analisi multivariata della varianza per permutazione (PERMANOVA) è stata impiegata per valutare le differenze nella diversità beta¹⁸.

13. Quantificazione degli acidi grassi a catena corta nelle feci

Circa 100 mg di feci scongelate sono stati mescolati con 1,0 mL di acido fosforico allo 0,5%, vortexati per 60 s e centrifugati a 14.000 × g per 10 min a 4 °C. Il soprannatante è stato estratto con acetato di etile contenente acido 4-metilvalerico come standard interno.

Un'aliquote di 1 µL è stata analizzata mediante cromatografia a gas accoppiata a rilevazione massima selettiva, utilizzando una colonna DB-FFAP di 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm. L'elio è stato utilizzato a 1,0 mL/min con un rapporto di split 10:1 e ionizzazione a elettroni a 70 eV.

Acetato, propionato, butirrato, isobutirrato, valerato e isovalerato sono stati quantificati, e gli acidi grassi a catena corta totali sono stati definiti come la loro somma. Gli analisti sono rimasti ciechi rispetto all'assegnazione del trattamento, e le analisi degli acidi grassi a catena corta sono state considerate esplorative.

14. Risposta esplorativa del biomarcatore

La risposta composita esplorativa è stata definita come la presenza di almeno due dei quattro cambiamenti al giorno 28: aumento dell'indice di Shannon > 0,20, aumento del butirrato fecale > 20%, diminuzione del LPS plasmatico > 15% e diminuzione dell'IL-6 > 20%. Queste soglie pragmatiche avevano lo scopo di superare piccole fluttuazioni analitiche, non erano state validate clinicamente e sono state utilizzate esclusivamente per una descrizione esplorativa. Non è stata utilizzata alcuna soglia di Shannon < 1,5.

15. Calcolo della dimensione del campione

Il calcolo della dimensione del campione ha ipotizzato una differenza tra i gruppi di 1,2 punti nel cambiamento del NIHSS al giorno 28, una deviazione standard di 2,3, un livello alfa bilaterale di 0,05 e una potenza dell'80%. Questo calcolo richiedeva 58 partecipanti per gruppo. Prevedendo il 10% di endpoint primari incompleti, l'arruolamento mirato è stato fissato a 64 partecipanti per gruppo, per un totale di 128 partecipanti randomizzati¹⁹.

16. Gestione dei dati e controllo della qualità

I dati clinici sono stati registrati utilizzando moduli standardizzati di segnalazione dei casi e sono stati sottoposti a doppia immissione dei dati. Sono stati effettuati controlli di intervallo e di coerenza prima del blocco della base di dati, e le discrepanze sono state risolte confrontandole con i documenti originali. I valutatori dell'esito sono stati formati prima dell'arruolamento. La raccolta dei campioni, il tempo di lavorazione, la temperatura di conservazione, il ciclo di congelamento-scongelamento, il lotto del saggio e il lotto del sequenziamento sono stati monitorati utilizzando identificatori codificati.

17. Analisi statistica

Tutti i 128 partecipanti randomizzati sono stati inclusi nell'analisi primaria di intenzione-a-trattare. La popolazione per-protocollo è stata definita in base al completamento della valutazione al giorno 28, alla ricezione di almeno l'80% dell'esposizione all'intervento assegnato e all'assenza di violazioni gravi del protocollo. Tutti i partecipanti trattati sono stati inclusi nelle analisi di sicurezza. Le analisi del microbioma e degli acidi grassi a catena corta sono state effettuate utilizzando campioni fecali valutabili raccolti al basale e al giorno 28. Poiché tutti i partecipanti randomizzati hanno fornito campioni fecali analizzabili, nessun partecipante è stato escluso e non è stata necessaria alcuna imputazione per campioni mancanti nelle analisi basate su feci.

I valori NIHSS al giorno 28 mancanti sono stati imputati 30 volte secondo un'assunzione di mancata casualità, utilizzando modelli bayesiani a cresta basati su equazioni concatenate che includevano il trattamento, i valori NIHSS basali e al giorno 14, l'Indice di Barthel basale, l'età, il sesso, la terapia di ripristino del flusso ematico e il tempo tra l'esordio e la randomizzazione. Le stime sono state combinate utilizzando le regole di Rubin, ed è stata effettuata un'analisi su casi completi come analisi di sensibilità.

Sono stati esaminati istogrammi e grafici Q–Q, e sono stati applicati test di Shapiro–Wilk ai residui del modello. I residui dell'ANCOVA primaria basata sui casi completi erano compatibili con la normalità (P = 0.308). I biomarcatori fortemente asimmetrici a destra sono stati trasformati prima della modellizzazione lineare, quando necessario. Per la regressione logistica, non è richiesta la normalità della distribuzione dell'esito binario; sono state valutate la linearità dei predittori continui e la presenza di osservazioni influenti.

È stato utilizzato un'analisi della covarianza (ANCOVA) per il NIHSS al giorno 28, includendo nel modello il trattamento, il NIHSS basale, l'età, il sesso, la terapia di ripristino del flusso ematico, e il tempo tra l'esordio e la randomizzazione²⁰. Per gli esiti esplorativi continui al giorno 28 sono stati utilizzati modelli lineari aggiustati per i valori basali. Per le proporzioni sono stati impiegati test chi-quadrato o test esatto di Fisher, mentre per le distanze di Bray–Curtis è stata utilizzata la PERMANOVA con 9.999 permutazioni. Le analisi della diversità e della struttura della comunità microbica non sono state aggiustate per dieta, gravità della disfagia, nutrizione enterale, antibiotici somministrati dopo la randomizzazione, uso di inibitori della pompa protonica, stitichezza o durata del ricovero; questi fattori sono stati considerati possibili confondenti residui.

È stata applicata la correzione del tasso di falsa scoperta di Benjamini–Hochberg ai tre generi mostrati, e sono stati riportati sia i valori P nominali sia i valori q. Per le associazioni esplorative a livello di partecipante è stato utilizzato il rho di Spearman con 5.000 ricampionamenti bootstrap, mentre i coefficienti di correlazione di Pearson non sono stati utilizzati per l'interpretazione inferenziale. L'analisi di mediazione è stata pianificata solo se entrambe le associazioni esposizione–mediatore e mediatore–esito erano supportate. Per gli esiti clinici primari e prefissati è stato adottato un valore P bilaterale < 0,05.

Figura 1: Flusso dei partecipanti e programma di valutazione. (A) Diagramma di flusso in stile CONSORT che mostra lo screening (n = 176), le esclusioni (n = 48), la randomizzazione (64/gruppo), la trombolisi endovenosa (16 controllo; 18 intervento), il trombectoma meccanico (4; 5), la disponibilità del NIHSS a 28 giorni (59; 58), il follow-up osservato a 90 giorni (57; 56) e le popolazioni analizzate. (B) Programma dell'intervento e delle valutazioni. NIHSS, Scala del ictus degli Istituti Nazionali di Sanità; ITT, analisi per assegnazione originaria (intention-to-treat); mRS, Scala di Rankin modificata. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Procedura dello studio	Screening	Baseline	Giorno 1–28	Giorno 14	Giorno 28	Giorno 90
Finestra temporale	1 mar–31 dic 2025	Stesso giorno della randomizzazione	Mar 2025–Gen 2026	±2 giorni	±3 giorni	±7 giorni
Valutazione dell'idoneità	✓
Consenso informato scritto	✓
Conferma TC/RMN dell'ictus ischemico	✓
Raccolta dei dati demografici e clinici		✓
Randomizzazione		✓
Trattamento standard dell'ictus ischemico acuto		✓	✓	✓	✓	✓
Agopuntura manuale standardizzata			✓
Decotto modificato di Xiaoxuming			✓
Valutazione NIHSS		✓		✓	✓	✓
Valutazione dell'Indice di Barthel		✓			✓	✓
Valutazione della Scala di Rankin modificata						✓
Raccolta del campione di sangue periferico		✓		✓	✓
Raccolta del campione fecale		✓			✓
Monitoraggio degli eventi avversi		✓	✓	✓	✓	✓
Completamento del follow-up clinico finale						Entro il 31 mar 2026
Pulizia dei dati e analisi statistica						1 apr–30 apr 2026

Tabella 1: Programma dello studio, esposizione all'intervento, raccolta dei campioni e valutazione degli esiti. CT, tomografia computerizzata; MRI, risonanza magnetica; NIHSS, Scala per l'ictus degli Istituti Nazionali di Sanità.

Punto di agopuntura	Categoria di localizzazione	Lateralità	Profondità dell'ago	Metodo di stimolazione	Tempo di permanenza	Frequenza del trattamento	Precauzioni di sicurezza
Baihui (GV20)	Punto del cuoio capelluto	Singolo	10–15 mm	Inserzione obliqua con stimolazione manuale leggera	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare una stimolazione eccessiva nei pazienti con segni vitali instabili
Shuigou (GV26)	Punto facciale	Singolo	5–10 mm	Inserzione obliqua con stimolazione manuale leggera	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare la puntura nei pazienti con lesioni cutanee locali, infezioni o scarsa collaborazione
Fengchi (GB20)	Punto della testa e del collo	Bilaterale	15–25 mm	Inserzione obliqua; evitare la puntura profonda mediale	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare l'inserzione profonda verso il canale spinale o la regione dell'arteria vertebrale
Quchi (LI11)	Punto dell'arto superiore	Bilaterale	15–25 mm	Sollevamento-manovella manuale e rotazione	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare la puntura attraverso cute contusa, edematosa o infetta
Hegu (LI4)	Punto dell'arto superiore	Bilaterale	10–20 mm	Sollevamento-manovella manuale e rotazione	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare manovre eccessive in pazienti fragili o con scarsa tolleranza al dolore
Zusanli (ST36)	Punto dell'arto inferiore	Bilaterale	20–25 mm	Sollevamento-manovella manuale e rotazione	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare la puntura in aree con edema, infezione o trauma locale
Yanglingquan (GB34)	Punto dell'arto inferiore	Bilaterale	20–25 mm	Sollevamento-manovella manuale e rotazione	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare la puntura in pazienti con dolore grave agli arti, trauma o agitazione
Sanyinjiao (SP6)	Punto dell'arto inferiore	Bilaterale	15–25 mm	Sollevamento-manovella manuale e rotazione	30 min	5 sedute/settimana per 4 settimane	Evitare durante la gravidanza e in pazienti con lesioni cutanee locali

Tabella 2: Prescrizione standardizzata di agopuntura e protocollo operativo. Note operative: sono stati utilizzati aghi sterili monouso in acciaio inossidabile delle dimensioni di 0,25 mm × 40 mm. È stata applicata una stimolazione manuale fino alla segnalazione della sensazione di deqi o all’osservazione di una risposta locale alla puntura. Gli aghi sono stati mantenuti in sede per 30 min e la stimolazione manuale è stata ripetuta ogni 10 min durante il tempo di permanenza.

Componente	Nome farmaceutico latino	Dose giornaliera	Ruolo funzionale nella formula	Note sulla qualità e sulla sicurezza
Ephedra	Ephedrae Herba	6 g	Componente che disperde il vento e apre i canali	Pressione sanguigna, palpitazioni, disagio toracico e insonnia sono state monitorate durante il trattamento
Rametto di cannella	Cinnamomi Ramulus	9 g	Componente riscaldante e che sostiene la circolazione	Utilizzato con cautela in pazienti con sudorazione eccessiva o sintomi correlati al calore
Radice di peonia bianca	Paeoniae Radix Alba	12 g	Componente armonizzante e antispastico	Erano richiesti autenticazione in farmacia e documentazione del lotto
Radice di saposhnikovia	Saposhnikoviae Radix	9 g	Componente che disperde il vento	Erano richiesti autenticazione in farmacia e documentazione del lotto
Zenzero fresco	Zingiberis Rhizoma Recens	6 g	Componente armonizzante per il tratto gastrointestinale	L'amministrazione è stata sospesa in caso di vomito persistente
Radice di liquirizia	Glycyrrhizae Radix et Rhizoma	6 g	Componente armonizzante della formula	Disturbi elettrolitici ed edema sono stati monitorati nei pazienti a rischio
Radice di angelica	Angelicae Sinensis Radix	10 g	Componente nutritivo del sangue e che sostiene la circolazione	L'uso concomitante di antiaggreganti o anticoagulanti è stato registrato
Rizoma di chuanxiong	Chuanxiong Rhizoma	10 g	Componente attivatore del sangue	Gli eventi avversi correlati al sanguinamento sono stati monitorati e registrati
Radice di astragalo	Astragali Radix	20 g	Componente che sostiene il Qi	Poteva essere aumentata fino a 30 g in caso di sudorazione spontanea marcata, se registrata come modifica definita dal protocollo
Poria	Poria	15 g	Componente che sostiene la milza e risolve l'umidità	Poteva essere aumentata fino a 20 g in caso di feci molli, se registrata come modifica definita dal protocollo
Radice di peonia rossa	Paeoniae Radix Rubra	12 g	Componente attivatore del sangue e antinfiammatorio	Erano richiesti autenticazione in farmacia e documentazione del lotto
Seme di canapa	Cannabis Fructus	10 g, se necessario	Solo per regolare la stitichezza	Aggiunto solo in caso di stitichezza e registrato come modifica definita dal protocollo

Tabella 3: Composizione e protocollo di somministrazione della Decozione Xiaoxuming modificata. Protocollo di somministrazione: una dose giornaliera veniva preparata mediante decottura dalla farmacia dell'ospedale e concentrata fino a 400 mL. La decottura veniva suddivisa in due dosi da 200 mL ciascuna e somministrata per via orale dopo colazione e cena per 28 giorni consecutivi. La somministrazione veniva sospesa nei pazienti con deglutizione non sicura, vomito persistente, sospetta reazione allergica, alanina aminotransferasi o aspartato aminotransferasi superiori a tre volte il limite superiore del valore normale, velocità di filtrazione glomerulare stimata inferiore a 45 mL/min/1.73 m², pressione arteriosa non controllata nonostante la terapia standard, tachiaritmia clinicamente significativa, nuovo dolore toracico o qualsiasi altra preoccupazione per la sicurezza ritenuta tale dall'investigatore.

Categoria dell'esito	Variabile	Tempo di valutazione	Definizione o misurazione	Classificazione dell'analisi
Difetto neurologico	Punteggio NIHSS	Basale, giorno 14, giorno 28, giorno 90	Scala del ictus del National Institutes of Health valutata da neurologi in cieco	Esito clinico primario al giorno 28; secondario ai giorni 14/90
Funzione nelle attività quotidiane	Indice di Barthel	Basale, giorno 28, giorno 90	Punteggio delle attività della vita quotidiana valutato da valutatori addestrati e in cieco	Esito clinico secondario
Disabilità globale	Scala di Rankin modificata	Giorno 90	Punteggio di disabilità funzionale da 0 a 6	Esito clinico secondario; distribuzione osservata e dicotomia ITT analizzata separatamente
Esito funzionale favorevole	mRS 0–2	Giorno 90	Partecipanti con mRS 0, 1 o 2	Esito clinico secondario
Ricorrenza dell'ictus	Ictus ischemico ricorrente	Fino al giorno 90	Diagnosi da parte di neurologo con imaging quando disponibile	Esito correlato alla sicurezza
Mortalità	Morte per qualsiasi causa	Fino al giorno 90	Morte per qualsiasi causa	Esito di sicurezza
Infiammazione sistemica	hs-CRP, IL-6, TNF-alfa	Basale, giorno 14, giorno 28	Concentrazioni sieriche/plasmatiche	Esito esplorativo del biomarcatore
Marcatore di endotossina/barriera	LPS, zonulina	Basale, giorno 14, giorno 28	Concentrazioni nel sangue	Esito esplorativo del biomarcatore
Metabolita microbico	TMAO	Basale, giorno 28	Concentrazione plasmatica	Esito esplorativo del biomarcatore
Diversità della microbiota intestinale	Shannon, Chao1, Bray–Curtis	Basale, giorno 28	Diversità derivata da 16S rRNA	Esito esplorativo del biomarcatore
Composizione microbica	Generi selezionati	Giorno 28	Abbondanza relativa a livello di genere	Esplorativo; valore P nominale e q BH-FDR su tre generi forniti
Acidi grassi a catena corta	Acetato, propionato, butirrato, SCFA totali	Giorno 28	Concentrazioni fecali mediante GC-MS	Esito esplorativo del biomarcatore
Risposta esplorativa	Risposta composita	Giorno 28	Almeno due tra: Shannon >0,20; butirrato >20%; riduzione LPS >15%; riduzione IL-6 >20%	Esplorativo; soglie non validate clinicamente
Sicurezza dell'intervento	Eventi avversi e eventi avversi gravi	Giorno 1–90	Eventi registrati dall'investigatore e attribuzione	Esito di sicurezza

Tabella 4: Esiti clinici e biologici, finestre temporali, definizioni e classificazione dell'analisi. Questa tabella riassume gli esiti clinici e biologici predeterminati, i tempi di valutazione, le definizioni operative e le classificazioni dell'analisi. FDR, tasso di falsa scoperta; hs-CRP, proteina C-reattiva ad alta sensibilità; IL-6, interleuchina-6; LPS, lipopolisaccaride; mRS, scala di Rankin modificata; NIHSS, scala dell'ictus dei National Institutes of Health; SCFA, acido grasso a catena corta; TMAO, trimetilammina N-ossido.

Risultati

Flusso dei partecipanti e popolazioni analizzate

Dei 176 pazienti sottoposti a screening, 48 sono stati esclusi prima della randomizzazione e 128 sono stati randomizzati (64/gruppo; Figura 1). Tutti i partecipanti randomizzati sono stati inclusi nelle popolazioni per intento di trattamento e di sicurezza. Il punteggio NIHSS al giorno 28 è stato rilevato in 59 partecipanti del gruppo di controllo e in 58 del gruppo di intervento; il follow-up al giorno 90 è stato completato rispettivamente da 57 e 56 partecipanti. Le popolazioni per protocollo comprendevano 58 e 57 partecipanti (Figura 2).

Caratteristiche alla linea di base

Le caratteristiche alla baseline erano simili tra i gruppi (Tabella 5). L'età media era di 65,1 ± 8,7 versus 64,7 ± 9,1 anni, il punteggio NIHSS alla baseline era di 8,6 ± 2,6 versus 8,4 ± 2,9, e l'Indice di Barthel alla baseline era di 43,5 ± 13,2 versus 44,8 ± 12,7. La trombolisi endovenosa è stata somministrata a 16/64 (25,0%) partecipanti del gruppo di controllo e a 18/64 (28,1%) del gruppo di intervento; la trombectomia meccanica è stata eseguita rispettivamente in 4/64 (6,3%) e in 5/64 (7,8%).

Adesione all'intervento

Nel gruppo di intervento, il numero mediano di sedute di agopuntura è stato di 18 (intervallo interquartile, 17–20); 57 partecipanti hanno completato ≥ 16 sedute e 58 hanno assunto ≥ 80% della decotto. L'uso non conforme al protocollo di probiotici/prebiotici si è verificato in due partecipanti del gruppo di controllo e in un partecipante del gruppo di intervento; questi partecipanti sono stati inclusi nell'analisi di intenzione-a-trattare, ma esclusi dall'analisi per protocollo (Supplementary Table 1).

Esiti clinici

Il NIHSS osservato è diminuito da 8,6 ± 2,6 a 5,5 ± 3,1 nel gruppo di controllo (n = 59 al giorno 28) e da 8,4 ± 2,9 a 4,1 ± 2,9 nel gruppo di intervento (n = 58; Figura 3A). Le variazioni medie osservate sono state rispettivamente di −3,34 ± 4,14 e −3,97 ± 4,03 punti (Figura 3B). Nell’ANCOVA prespecificata con 30 imputazioni, il NIHSS aggiustato al giorno 28 è risultato inferiore di 1,30 punti nel gruppo di intervento (intervallo di confidenza al 95% [CI], da −2,36 a −0,24; P = 0,017).

Il punteggio NIHSS al giorno 14 era di 5,49 ± 2,45 versus 4,61 ± 2,23 (P aggiustata per il valore basale = 0,041), e il punteggio NIHSS osservato al giorno 90 era di 3,68 ± 2,68 (n = 57) versus 2,88 ± 2,36 (n = 56; P = 0,091; Figura 3A).

L'indice di Barthel al giorno 28 è stato di 61,39 ± 18,80 versus 68,82 ± 19,36 (P aggiustato per il valore basale = 0,040); i valori osservati al giorno 90 sono stati 75,56 ± 19,22 versus 81,49 ± 17,67 (P = 0,098; Figura 3C). Tra i partecipanti inclusi nell'analisi del mRS a caso osservato al giorno 90, un esito favorevole si è verificato in 32/57 controlli (56,1%) e in 38/56 partecipanti al gruppo di intervento (67,9%; P = 0,200). La distribuzione completa per categorie del mRS nei casi osservati è mostrata nella Figura 3D e nella Tabella supplementare 1. Le stime ITT per l'esito mRS dicotomizzato ottenute mediante imputazione multipla (36/64 versus 44/64; P = 0,144) sono riportate separatamente.

Biomarcatori associati all'asse cervello-intestino

Campioni fecali erano disponibili e sono stati analizzati con successo per tutti i partecipanti randomizzati (64 per gruppo) al momento pianificato per l'analisi. L'indice di diversità di Shannon al giorno 28 era di 3,08 ± 0,52 versus 3,31 ± 0,57 (P aggiustato per il valore basale = 0,019; Figura 4A), mentre la concentrazione fecale di butirrato era di 10,21 ± 4,27 versus 12,91 ± 5,08 µmol/g (P = 0,002; Figura 4B).

L'IL-6 era di 18,23 ± 9,44 versus 15,62 ± 8,06 pg/mL al giorno 14 (P nominale = 0,095) e di 14,61 ± 8,18 versus 11,84 ± 6,83 pg/mL al giorno 28 (P aggiustato per il valore basale = 0,041; Figura 4C). Il LPS era di 0,85 ± 0,32 versus 0,78 ± 0,30 EU/mL al giorno 14 (P = 0,204) e di 0,78 ± 0,31 versus 0,66 ± 0,28 EU/mL al giorno 28 (P aggiustato per il valore basale = 0,023; Figura 4D).

Al giorno 28, Faecalibacterium e Roseburia erano più abbondanti nel gruppo di intervento (P nominale = 0,006 e 0,009; entrambi q = 0,013), mentre Bifidobacterium non ha raggiunto la significatività nominale (P = q = 0,056; Figura 4E). È stata applicata la correzione di Benjamini–Hochberg sui tre generi mostrati.

La risposta composita esplorativa si è verificata in 21/64 controlli (32,8%) e in 34/64 partecipanti all'intervento (53,1%; P = 0,020). I risultati dei singoli componenti sono riportati in Figura 4F e nel Tabella Supplementare 2; le soglie sono di tipo esplorativo e non sono state validate clinicamente.

Associazioni esplorative a livello dei partecipanti

Le associazioni esplorative a livello individuale sono state valutate utilizzando il rho di Spearman con 5.000 ricampionamenti bootstrap. Le variazioni del butirrato fecale, dell'IL-6, del LPS e della diversità di Shannon non sono risultate significativamente associate ai corrispondenti cambiamenti neurologici o nei biomarcatori (Figura 5).

I cambiamenti nel butirrato fecale e nel NIHSS non erano significativamente associati (rho di Spearman = −0,05; intervallo di confidenza [CI] bootstrap al 95%, da −0,23 a 0,13; P = 0,601; n = 117). Il cambiamento di IL-6 non era associato al cambiamento del NIHSS (rho = −0,01; CI bootstrap al 95%, da −0,18 a 0,15; P = 0,887; n = 117) e il cambiamento di LPS non era associato al cambiamento di IL-6 (rho = −0,14; CI bootstrap al 95%, da −0,29 a 0,03; P = 0,125; n = 128).

La variazione della diversità di Shannon non è risultata significativamente associata alla variazione del NIHSS (rho = −0.15; IC 95%, −0.34 a 0.06; P = 0.119; n = 117). Poiché non sono stati riscontrati i prespecificati rapporti partecipante-livello tra esposizione e mediatore e tra mediatore ed esito, non è stata effettuata un'analisi di mediazione, e non è stato dedotto alcun effetto indiretto né alcun percorso causale cervello-intestino.

Esiti in termini di sicurezza

Si è verificato un evento avverso in 8/64 controlli e in 11/64 partecipanti al gruppo di intervento (12,5%) contro 17,2%; P = 0,456). L'insorgenza di ecchimosi nel sito dell'ago si è verificata in 0 contro 5 partecipanti (P = 0,023) e si è risolta senza trattamento; un lieve fastidio gastrointestinale è insorto in 3 contro 6 partecipanti (P = 0,300; Tabella 6).

Si sono verificati eventi avversi gravi in 3 controlli e in 2 partecipanti al gruppo di intervento (P = 0,648). Si è verificato un decesso in ciascun gruppo; nessun evento avverso grave è stato giudicato sicuramente correlato all'agopuntura o alla Decozione Xiaoxuming modificata.

In sintesi, l'intervento combinato è stato associato a un lieve miglioramento del NIHSS al giorno 28 e di alcuni biomarcatori selezionati al giorno 28. Le differenze cliniche al giorno 90 non sono risultate statisticamente significative, e i dati a livello individuale non hanno sostenuto una mediazione attraverso i biomarcatori misurati.

Figura 2: Flusso di lavoro per il campionamento clinico e biologico. Sono stati raccolti campioni di sangue e feci per analisi relative al microbioma, agli acidi grassi a catena corta (SCFA), all'infiammazione e alla barriera intestinale. Il flusso di lavoro definisce associazioni esplorative e non afferma un meccanismo causale tra cervello e intestino. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Esiti clinici. (A) Andamento del NIHSS; i punti rappresentano la media ± DS, con n indicato a ciascun punto temporale. (B) Variazione osservata del NIHSS dal basale al giorno 28, espressa come media ± DS (controllo n = 59; intervento n = 58); l'annotazione riporta l'ANCOVA aggiustata per 30 imputazioni multipli in base al NIHSS basale, età, sesso, riperfusione e tempo dall'esordio alla randomizzazione. (C) Indice di Barthel, presentato come media ± DS, con n indicato. (D) Categorie della mRS al giorno 90 nei casi osservati (controllo n = 57; intervento n = 56); le percentuali utilizzano denominatori osservati. I valori P sono a due code. Non vengono utilizzati simboli di significatività. CI, intervallo di confidenza; MI, imputazione multipla; DS, deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Biomarcatori esplorativi. Le barre e i punti rappresentano la media ± DS. Tutti i partecipanti randomizzati hanno fornito campioni valutabili per le analisi corrispondenti; pertanto, per ogni gruppo era disponibile n = 64 per ciascun pannello. I campioni fecali sono stati raccolti e processati con successo da tutti i partecipanti, inclusi coloro che hanno richiesto una raccolta posticipata entro la finestra di raccolta prestabilita. (A) Indice di Shannon e (B) butirrato fecale: modelli lineari aggiustati per il basale al giorno 28. (C) Andamenti di IL-6 e (D) LPS: test di Welch al giorno 14 e modelli aggiustati per il basale al giorno 28. (E) Generi selezionati al giorno 28: test di Welch con correzione di Benjamini–Hochberg sui tre generi mostrati; sono riportati sia il valore P nominale sia il valore q. (F) Componenti della risposta: test chi-quadrato di Pearson. Tutti i valori P sono a due code; non vengono utilizzati simboli di significatività. IL-6, interleuchina-6; LPS, lipopolisaccaride; SCFA, acido grasso a catena corta; DS, deviazione standard. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Associazioni esplorative a livello individuale. (A) Variazione del butirrato rispetto alla variazione del NIHSS (n = 117). (B) Variazione dell'IL-6 rispetto alla variazione del NIHSS (n = 117). (C) Variazione del LPS rispetto alla variazione dell'IL-6 (n = 128). Le linee sono mostrate solo a scopo illustrativo e non rappresentano un'analisi inferenziale basata su regressione. L'inferenza statistica si è basata sul coefficiente rho di Spearman con 5.000 ricampionamenti bootstrap. (D) Stime di Spearman con intervalli di confidenza bootstrap al 95% ottenuti da 5.000 ricampionamenti, inclusa la variazione dell'indice di Shannon rispetto alla variazione del NIHSS (n = 117). Nessuna associazione ha raggiunto un valore di P < 0,05; pertanto, non è stata effettuata un'analisi di mediazione. Non sono stati utilizzati simboli di significatività. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Variabile	Gruppo di controllo (n = 64)	Gruppo di intervento (n = 64)	Valore P
Età, anni	65,1 ± 8,7	64,6 ± 9,0	0,775
Sesso maschile, n (%)	40 (62,5)	39 (60,9)	0,855
Tempo dall'esordio alla randomizzazione, h	41,7 ± 14,9	40,9 ± 15,7	0,773
Punteggio NIHSS basale	8,6 ± 2,6	8,4 ± 2,9	0,665
Indice di Barthel basale	43,5 ± 13,2	44,8 ± 12,7	0,573
Ipertensione, n (%)	42 (65,6)	41 (64,1)	0,855
Diabete mellito, n (%)	18 (28,1)	17 (26,6)	0,839
Trombolisi endovenosa, n (%)	16 (25,0)	18 (28,1)	0,690
Trombectomia meccanica, n (%)	4 (6,3)	5 (7,8)	0,732
hs-CRP, mg/L	7,21 ± 4,18	7,04 ± 4,03	0,813
IL-6, pg/mL	24,03 ± 10,14	23,62 ± 9,96	0,817
TNF-alfa, pg/mL	30,5 ± 11,2	30,0 ± 11,0	0,799
Indice di Shannon	2,84 ± 0,55	2,86 ± 0,56	0,833
Butirrato fecale, µmol/g	8,41 ± 3,99	8,53 ± 4,04	0,859
LPS, UE/mL	0,94 ± 0,34	0,93 ± 0,35	0,870
Zonulina, ng/mL	54,50 ± 15,60	54,11 ± 15,08	0,885

Tabella 5: Caratteristiche demografiche, cliniche e dei biomarcatori alla linea di base. Questa tabella riassume le caratteristiche demografiche, cliniche, relative al trattamento e ai biomarcatori alla linea di base nei gruppi di controllo e di intervento. I valori sono espressi come media ± deviazione standard o n (%). La trombolisi endovenosa e la trombectomia meccanica sono riportate come categorie distinte di trattamento standard.

Esito in termini di sicurezza	Gruppo di controllo (n=64)	Gruppo sottoposto all'intervento (n=64)	Valore P
Qualsiasi evento avverso, n (%)	8 (12.5)	11 (17.2)	0.456
Ematoma nel sito dell'ago, n (%)	0	5 (7.8)	0.023
Disagio gastrointestinale lieve, n (%)	3 (4.7)	6 (9.4)	0.3
Vertigine transitoria, n (%)	2 (3.1)	3 (4.7)	0.648
Eruzione cutanea lieve, n (%)	1 (1.6)	2 (3.1)	0.56
Alterazione della funzionalità epatica, n (%)	1 (1.6)	2 (3.1)	0.56
Alterazione della funzionalità renale, n (%)	1 (1.6)	1 (1.6)	1
Fluttuazione della pressione sanguigna, n (%)	2 (3.1)	3 (4.7)	0.648
Palpitazioni, n (%)	0	1 (1.6)	0.315
Evento avverso grave, n (%)	3 (4.7)	2 (3.1)	0.648
Evento avverso grave correlato all'intervento, n (%)	0	0	--
Mortalità per qualsiasi causa, n (%)	1 (1.6)	1 (1.6)	1

Tabella 6: Eventi avversi ed eventi avversi gravi. Questa tabella riassume gli eventi avversi, gli eventi avversi gravi, gli eventi avversi gravi correlati all'intervento e i decessi per qualsiasi causa nei gruppi di controllo e di intervento. I valori sono espressi come n (%).

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati anonimizzati a livello di partecipante che supportano le analisi cliniche, dei biomarcatori, del microbioma, dell'aderenza e della sicurezza riportate sono disponibili pubblicamente su Zenodo (https://zenodo.org/records/22725409).

Tabella supplementare 1: Follow-up, aderenza e risultati clinici. Le popolazioni analizzate osservate e imputate sono indicate separatamente. La stima principale utilizza un'imputazione multipla 30 volte e un'ANCOVA aggiustata per il punteggio NIHSS basale, età, sesso, riperfusione e tempo tra insorgenza e randomizzazione. CI, intervallo di confidenza; IQR, intervallo interquartile; mRS, scala di Rankin modificata; NIHSS, scala dell'ictus del National Institutes of Health.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Risultati esplorativi dei biomarcatori. I valori sono espressi come media ± DS o n (%). Sono indicati i valori P nominali e i valori q aggiustati per FDR. La risposta composita richiedeva almeno due dei quattro cambiamenti prestabiliti ed è priva di validazione clinica. Le analisi di correlazione sono di tipo esplorativo; non è stata effettuata un'analisi di mediazione poiché le associazioni a livello individuale necessarie non erano significative.Cliccare qui per scaricare il file.

File supplementare 1: i dati grezzi corrispondenti a figure e tabelle.Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il protocollo combinato ha prodotto un lieve miglioramento del deficit neurologico precoce, con l'analisi della covarianza con imputazione multipla che stimava una differenza di -1,30 punti nell'NIHSS al giorno 28. L'Indice di Barthel al giorno 28 e alcuni biomarcatori selezionati al giorno 28 differivano anch'essi, mentre gli esiti al giorno 90 non hanno raggiunto la significatività statistica. Questi risultati sostengono la valutazione dell'intervento combinato come terapia aggiuntiva piuttosto che come sostituto della riperfusione, della terapia antitrombotica, della riabilitazione o di altre cure standard.

L'effetto clinico osservato in questo studio è coerente con la crescente opinione secondo cui l'agopuntura potrebbe contribuire al recupero post-ictus oltre la semplice modulazione dei sintomi. Studi precedenti hanno suggerito che l'agopuntura potrebbe migliorare la funzione neurologica e ridurre l'attività infiammatoria nell'ictus ischemico acuto, sebbene l'entità e la durata del beneficio rimangano variabili tra gli studi²¹. I risultati attuali estendono questa linea di evidenza esaminando l'agopuntura come parte di un intervento combinato con una formula erboristica standardizzata e collegando l'effetto clinico a biomarcatori predefiniti correlati all'asse cervello-intestino. L'entità dell'effetto è stata modesta piuttosto che drammatica, un aspetto importante per l'interpretazione. Una differenza aggiustata di 1 punto nel punteggio NIHSS può essere significativa nell'ictus da lieve a moderato quando accompagnata da segnali funzionali e biologici, ma non deve essere interpretata come prova che l'intervento da solo determini il recupero. I passaggi più sensibili per quanto riguarda la riproducibilità sono un tempismo coerente nell'inclusione dei partecipanti, l'assegnazione cieca, la puntura sicura, l'esposizione standardizzata alla decotto, la valutazione degli esiti in cieco e la rapida lavorazione dei campioni con controllo della temperatura. I problemi operativi comuni includono sessioni di agopuntura saltate, deglutizione non sicura, ritardo nella produzione di feci e scongelamento durante il trasporto. Questi problemi sono stati affrontati documentando i rinvii, sospendendo il trattamento orale quando non sicuro, raccogliendo la prima evacuazione spontanea senza l'uso di lassativi esclusivamente per la ricerca, registrando la stitichezza e i ritardi nella raccolta, e monitorando la storia della lavorazione e dei cicli di congelamento-scongelamento.

Le differenze a 28 giorni nella diversità di Shannon, butirrato, IL-6 e LPS erano associazioni esplorative a livello di gruppo. Le analisi esplorative a livello individuale sulle associazioni tra butirrato–NIHSS, IL-6–NIHSS, LPS–IL-6 e Shannon–NIHSS non hanno sostenuto le relazioni prerequisito necessarie per un'analisi di mediazione; pertanto, l'analisi di mediazione non è stata eseguita e i dati non dimostrano un percorso causale tra cervello e intestino. Approcci alternativi, inclusa la metagenomica shotgun, la metabolomica mirata con standard marcati isotopicamente, registri dietetici seriali e campionamenti ripetuti di biomarcatori, caratterizzerebbero la funzione e l'ordine temporale in modo più diretto rispetto al sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S e a due punti temporali fecali^22,23,24.

L'interpretazione è limitata dal campione monocentrico, dalla mancanza di cecità nei partecipanti, dall'assenza di registrazione prospettica dello studio prima dell'arruolamento e dal disegno dell'intervento combinato, privo di gruppi con solo agopuntura o solo decotto. Di conseguenza, il disegno non consente di attribuire gli effetti a un singolo componente o a un effetto sinergico. La dieta abituale, la gravità della disfagia, la nutrizione enterale, l'uso di antibiotici dopo la randomizzazione, l'impiego di inibitori della pompa protonica, la costipazione, l'intensità della riabilitazione e la durata del ricovero potrebbero alterare gli esiti relativi al microbioma. Questi fattori non sono stati inclusi nei modelli statistici aggiustati per il microbioma e pertanto rimangono potenziali fattori confondenti residui. La correzione FDR per i generi selezionati si è limitata ai tre generi mostrati, e le soglie esplorative di risposta non sono state validate esternamente. Le analisi dei biomarcatori erano di tipo esplorativo; alcune concentrazioni di IL-6 e TNF-alfa sono risultate al di sotto degli intervalli nominali indicati dai produttori per i saggi e devono essere interpretate con cautela.

Lavori futuri dovrebbero utilizzare la registrazione prospettica, il reclutamento multicentrico, un disegno fattoriale, dati sulle co-interventi verificati alla fonte, la raccolta standardizzata di dati su dieta ed esposizioni e procedure per microbioma e metabolomica indipendentemente riproducibili. Sono necessari campioni più ampi e un campionamento più frequente prima di testare la mediazione, gli effetti dei singoli componenti del trattamento o la selezione del trattamento basata sul microbioma. Il monitoraggio della sicurezza non ha identificato eventi avversi gravi sicuramente correlati all'intervento, ma il campione era troppo piccolo per escludere danni rari. Particolare attenzione dovrebbe essere mantenuta sui rischi di emorragia, sicurezza della deglutizione, intolleranza gastrointestinale, funzionalità epatica/renale, pressione sanguigna e aritmie quando si integra l'agopuntura e la terapia a base di erbe con il trattamento dell'ictus acuto.

In conclusione, l'agopuntura standardizzata associata alla Decozione Xiaoxuming modificata si è correlata a un modesto miglioramento neurologico a 28 giorni e a differenze in alcuni biomarcatori quando aggiunta al trattamento standard. I risultati biologici generano ipotesi ma non dimostrano un meccanismo causale tra cervello e intestino.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido 4-metilvalerico	Sigma-Aldrich, USA	142342	Standard interno per GC-MS
Primers del gene 16S rRNA (regione V3–V4)	Sangon Biotech, China	Sintesi su misura	Coppia di primer 341F/806R
Aghi per agopuntura	Hwato (Suzhou Medical Appliance Factory), China	0.25 × 40 mm	Aghi sterili monouso in acciaio inossidabile
Valutazione dell'indice di Barthel	Non applicabile	Non applicabile	Valutazione delle attività della vita quotidiana
Provette criogeniche	Corning, USA	430659	Conservazione dei campioni di feci
Acetato di etile (grado cromatografico)	Merck, Germany	109623	Solvente per estrazione organica
Punte filtranti per pipetta	Axygen, USA	Vari	Privi di RNasi/DNasi
Cromatografo a gas	Agilent Technologies, USA	7890B GC	Sistema di separazione GC
Kit ELISA per IL-6 umana	R&D Systems, USA	D6050	Quantificazione dell'IL-6 sierica
Kit ELISA per lipopolisaccaride (LPS) umano	Cusabio, China	CSB-E13066h	Quantificazione del LPS sierico
Kit per saggio TMAO umano	Sigma-Aldrich, USA	MAK264	Quantificazione colorimetrica/fluorometrica del TMAO
Rivelatore selettivo di massa	Agilent Technologies, USA	5977B MSD	Spettrometro di massa a quadrupolo
Software MassHunter Workstation	Agilent Technologies, USA	G1701EA	Acquisizione ed analisi dei dati GC-MS
Micropipette	Eppendorf, Germany	Serie Research plus	Maneggiamento di liquidi in laboratorio
Kit di reagenti MiSeq v3 (600 cicli)	Illumina, USA	MS-102-3003	Sequenziamento a estremità unite 2 × 300 bp
Sistema MiSeq	Illumina, USA	SY-410-1003	Piattaforma di sequenziamento a estremità unite; chimica di sequenziamento 2 × 300 bp
Valutazione della scala di Rankin modificata (mRS)	Non applicabile	Non applicabile	Valutazione dell'esito funzionale al giorno 90
Decotto modificato di Xiaoxuming (formula erboristica)	Farmacia ospedaliera, Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese e Medicina Occidentale della città di Dazhou	Non applicabile	Preparato secondo gli standard farmaceutici istituzionali; autenticato e dispensato dai farmacisti ospedalieri
Modulo di valutazione della scala del ictus del NIH (NIHSS)	National Institute of Neurological Disorders and Stroke	Non applicabile	Strumento standardizzato di valutazione clinica
NumPy	Sviluppatori di NumPy	RRID: SCR_008633	Versione 1.26.x
pandas	Squadra di sviluppo di pandas	RRID: SCR_018239	Versione 2.1.x
Acido fosforico	Sigma-Aldrich, USA	79619	Reagente di grado analitico
Python	Fondazione Python Software	RRID: SCR_008394	Versione 3.11.x
QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit	Qiagen, Germany	51804	Estrazione del DNA del microbioma fecale
QIIME 2	Squadra di sviluppo di QIIME 2	RRID: SCR_008249	Versione 2024.5
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	Q32851	Quantificazione del DNA basata sulla fluorescenza
scikit-learn	Sviluppatori di scikit-learn	RRID: SCR_002577	Versione 1.4.x
SciPy	Sviluppatori di SciPy	RRID: SCR_008058	Versione 1.11.x
Database rRNA SILVA	Progetto SILVA	RRID: SCR_006423	Versione 138.1
Congelatore ad ultra bassa temperatura	Thermo Fisher Scientific	TSX60086A	Conservazione a −80 °C