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La capsula Yangjing attenua la disfunzione spermatogenica nei topi inibendo la via QKI-5/p38 MAPK attraverso l'upregolazione dell'incRNA NONMMUT031883.2

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DOI:

10.3791/73166

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28 agosto 2026

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1Department of Andrology, The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine, 2Medical College of Qinghai University, 3Department of Traditional Chinese Medicine, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 4Anorectal Surgery, Jiangbei Branch of Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 5Department of Andrology, Shaanxi Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio valuta gli effetti protettivi della capsula Yangjing sulla disfunzione spermatogenica indotta dal ciclofosfamide nei topi e ne esamina il coinvolgimento nel percorso di segnalazione lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Abstract

La disfunzione spermatogenica è una causa importante di infertilità maschile e il ciclofosfamide (CP) può compromettere la spermatogenesi inducendo apoptosi anormale degli spermatogoni. La capsula Yangjing (YC) è stata utilizzata per migliorare la funzione riproduttiva, ma il suo meccanismo molecolare sottostante rimane poco chiaro. Questo studio ha indagato gli effetti protettivi della YC in un modello murino di disfunzione spermatogenica indotta da CP e in cellule spermatogoniali GC-1. Sono stati valutati il numero e la motilità degli spermatozoi, la fertilità maschile, i livelli sierici degli ormoni sessuali e le alterazioni istopatologiche nei testicoli e nell'epididimo. Nelle cellule GC-1 sono stati analizzati la vitalità cellulare, il rilascio di lattato deidrogenasi, l'apoptosi e le proteine correlate all'apoptosi. Sono state utilizzate la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa, saggi di pull-down dell'RNA, immunofluorescenza e Western blotting per esaminare l'RNA lungo NONMMUT031883.2, la Quaking-5 (QKI-5) e la via di segnalazione della p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK). La YC ha migliorato in modo dose-dipendente la qualità dello sperma, i livelli sierici degli ormoni sessuali, la morfologia degli organi riproduttivi, l'istopatologia testicolare e la fertilità nei topi trattati con CP. Nelle cellule GC-1, la YC ha aumentato la vitalità cellulare e ridotto i danni cellulari e l'apoptosi. L'RNA lungo NONMMUT031883.2 ha interagito fisicamente con QKI-5 e il trattamento con YC ha aumentato l'espressione dell'RNA lungo NONMMUT031883.2, riducendo al contempo l'espressione di QKI-5 e la fosforilazione della p38. Il trattamento con YC ha inibito l'apoptosi indotta dal silenziamento dell'RNA lungo NONMMUT031883.2 nelle cellule GC-1, mentre la sovraespressione di QKI-5 ha ridotto gli effetti antiapoptotici della YC. Questi risultati suggeriscono che la YC attenua la disfunzione spermatogenica indotta dal CP e che i suoi effetti protettivi sono mediati dalla regolazione della via lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK.

Introduzione

La disfunzione spermatogenetica indica un'alterazione riproduttiva causata da anomalie nella produzione, maturazione o funzione degli spermatozoi nel sistema riproduttivo maschile. È caratterizzata da ridotto numero di spermatozoi, diminuita motilità e aumento della frequenza di anomalie spermatiche.1,2La patogenesi della disfunzione spermatogenica è complessa e associata a fattori genetici, disturbi autoimmuni, tossine ambientali, danni indotti dalla chemioterapia e lesioni degli organi riproduttivi3-5. Farmaci chemioterapici come il ciclofosfamide (CP) possono danneggiare direttamente i tubuli seminiferi testicolari e indurre l'apoptosi degli spermatogoni, contribuendo così alla disfunzione spermatogenica maschile6,7. Attualmente vengono utilizzate come interventi clinici la terapia sostitutiva ormonale, la supplementazione con antiossidanti e le tecnologie di riproduzione assistita. Tuttavia, questi approcci presentano un'efficacia inconsistente e notevoli effetti avversi.8,9,10Pertanto, identificare interventi sicuri ed efficaci e chiarirne le relative molecole bersaglio riveste un'importanza clinica fondamentale per migliorare i risultati sulla fertilità nei pazienti con disfunzione della spermatogenesi.

La medicina erboristica cinese ha mostrato un potenziale nel proteggere la funzione riproduttiva maschile e nel trattare la disfunzione spermatogenetica grazie alle sue proprietà multitarget e alla tossicità relativamente bassa11,12. La capsula Yangjing (YC) è un medicinale brevettato tradizionale cinese composto da Rehmannia glutinosa, Epimedium, placenta, Polygonatum sibiricum, Angelica sinensis e altre erbe cinesi. È utilizzata per tonificare il rene e l'essenza, nutrire il sangue e il midollo e regolare la funzione riproduttiva13. Studi precedenti hanno dimostrato che la YC può regolare i livelli ormonali sessuali negli animali maschi, migliorare la qualità dello sperma, riparare i danni ai tessuti testicolari e proteggere dalle lesioni riproduttive indotte da agenti chimici14,15. Le cellule spermatogoniali costituiscono la base della spermatogenesi e l'apoptosi anomala delle spermatogonie rappresenta un evento centrale nello sviluppo della disfunzione spermatogenetica16. È stato inoltre riportato che la YC migliora la vitalità delle spermatogonie, aumenta la proporzione di cellule in fase S e inibisce l'apoptosi17. Tuttavia, i suoi effetti protettivi e i meccanismi molecolari specifici nella disfunzione spermatogenetica indotta da CP rimangono poco chiari.

Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) sono molecole di RNA più lunghe di 200 nucleotidi che non possiedono capacità di codifica proteica18. Gli lncRNA possono regolare l'espressione genica attraverso meccanismi che includono il silenziamento cromosomico, la modificazione della cromatina, l'imprinting genomico e l'attivazione trascrizionale19,20. La proteina legante l'RNA Quaking-5 (QKI-5) partecipa a processi fisiologici e patologici, inclusi la proliferazione cellulare e l'apoptosi, regolando lo splicing alternativo di geni downstream21. La via di segnalazione della chinasi mitogen-attivata p38 (p38 MAPK) è coinvolta nella regolazione dell'apoptosi e svolge anche un ruolo importante nella fertilità maschile e nello sviluppo testicolare22,23. Uno studio precedente ha dimostrato che la sovraespressione di QKI-5 attiva la via p38 MAPK nelle cellule di carcinoma epatocellulare24. Inoltre, è stato mostrato che l'lncRNA NONMMUT074098.2 si lega a QKI-5 nelle spermatogonie, mentre il silenziamento di QKI-5 inibisce la via p38 MAPK e riduce l'apoptosi delle spermatogonie25. Questo studio ha utilizzato un modello murino di disfunzione spermatogenica indotta da CP per indagare se YC regola l'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 e l'asse di segnalazione QKI-5/p38 MAPK, riducendo così l'apoptosi anomala delle spermatogonie e attenuando la disfunzione spermatogenica indotta da CP (Figura 1). L'obiettivo era chiarire il meccanismo molecolare alla base degli effetti protettivi di YC sulla spermatogenesi e approfondire la comprensione del suo ruolo farmacologico nella protezione della funzione riproduttiva maschile.

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Figura 1: Schema del disegno sperimentale. Il pannello superiore riassume gli esperimenti in vitro effettuati su cellule spermatogoniali GC-1. L'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è stato utilizzato per indurre apoptosi e danno cellulare, seguito dall'abbattimento di QKI-5 per valutarne gli effetti sull'apoptosi e sul danno cellulare. Il pannello inferiore riassume gli esperimenti in vivo condotti su modelli murini di disfunzione spermatogenetica indotta da ciclofosfamide (CP). I topi hanno ricevuto il trattamento con Yangjing Capsule e/o interventi sull'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 o su QKI-5. Successivamente sono stati valutati fertilità, livelli sierici di ormoni, tessuti testicolari ed epididimali, sospensione spermatica, riserve spermatiche, qualità dello sperma e danno istopatologico testicolare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida ARRIVE e con la guida degli Istituti Nazionali di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Tutti i protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico per gli Animali dell'Università del Sudest (numero di approvazione 20230216022).

1. Preparazione del siero contenente Yangjing Capsules (YC)
Due Yangjing Capsules (YC; 0,5 g/capsula) sono state aperte e 0,8 g del contenuto è stato pesato. È stato aggiunto del fisiologico fino a un volume finale di 10 mL, quindi la miscela è stata vortexata accuratamente per preparare una sospensione da 80 mg/mL. Topi maschi BALB/c specific pathogen-free del peso di 22–25 g e di 8 settimane di età sono stati mantenuti a 22 °C e umidità del 55%–60% in un ciclo luce/buio di 12 ore, con cibo e acqua disponibili ad libitum. Dopo una settimana di ambientamento, i topi hanno ricevuto YC per gavaggio orale a una dose di 800 mg/kg di peso corporeo in un volume di 10 mL/kg, una volta al giorno per 5 giorni consecutivi. Due ore dopo l’ultima somministrazione, i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico al 1%, e sono stati prelevati campioni di sangue per la preparazione del siero contenente YC. Il siero è stato inattivato a 56 °C per 30 minuti, filtrato attraverso una membrana da 0,22 µm e conservato a −80 °C fino all’uso.

2. Coltura cellulare e trasfezione
Le cellule spermatogoniali murine GC-1 sono state mantenute in DMEM contenente 1% di penicillina-streptomicina e 10% di siero fetale bovino. Tutte le colture sono state mantenute a 37 °C in un'atmosfera contenente 5% di CO₂ (v/v).

Sono stati sintetizzati e costruiti un RNA a forcina corta specifico per lncRNA (sh-lncRNA), un plasmide di sovraespressione di QKI-5 (OE-QKI-5), un RNA interferente specifico per QKI-5 (si-QKI-5) e i corrispondenti controlli negativi (sh-NC, OE-NC e si-NC). Le cellule GC-1 sono state trasfettate con sh-lncRNA o sh-NC, si-QKI-5 o si-NC, oppure OE-QKI-5 o OE-NC seguendo le istruzioni del reagente di trasfezione. Dopo un'incubazione di 48 h, l'efficienza di trasfezione è stata valutata misurando l'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 o di QKI-5.

Per il gruppo sh-lncRNA + si-QKI-5 + etoposide, le cellule GC-1 sono state trasfettate con sh-lncRNA e si-QKI-5 e successivamente trattate con 100 µM di etoposide per 12 h26. Per i successivi saggi di vitalità cellulare, le cellule GC-1 sono state coltivate in mezzo integrato con siero contenente YC al 5%, 10% o 20% e designate rispettivamente come gruppi YC a bassa dose (L-YC), YC a dose media (M-YC) e YC ad alta dose (H-YC). Le concentrazioni di siero contenente YC (5%, 10% e 20% YC) sono state determinate in base ai risultati di esperimenti preliminari a gradiente di concentrazione. Per i gruppi sh-lncRNA + H-YC + OE-NC e sh-lncRNA + H-YC + OE-QKI-5, le cellule GC-1 sono state trasfettate con sh-lncRNA più OE-NC o con sh-lncRNA più OE-QKI-5 per 48 h e successivamente esposte a siero contenente YC al 20% per 24 h.

3. Saggio con Cell Counting Kit-8
Le cellule GC-1 sono state seminate in piastre a 96 pozzetti a una densità di 5 × 103 cellule/pozzetto e coltivate per 24 h. Dopo l'adesione cellulare, il mezzo originale è stato sostituito con 100 µL di mezzo completo integrato con siero contenente YC, e le cellule sono state incubate per 6, 12 o 24 h. Al termine dell'incubazione, sono stati aggiunti 10 µL di reagente Cell Counting Kit-8 in ogni pozzetto, seguiti da un'ulteriore incubazione a 37 °C al buio per 2 h. L'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore per micropiastre.

4. Saggio della lattato deidrogenasi
Dopo 48 h di trasfezione con sh-NC o sh-lncRNA, il mezzo di coltura cellulare GC-1 è stato raccolto ed è stato ottenuto il sopranatante mediante centrifugazione. Secondo le istruzioni del kit per il saggio della lattato deidrogenasi, il sopranatante è stato delicatamente mescolato con la soluzione di rilevamento working e trasferito in una piastra a 96 pozzetti. La piastra è stata incubata a 25 °C al buio per 30 min. L'assorbanza a 490 nm è stata misurata utilizzando un lettore per micropiastre e il rilascio della lattato deidrogenasi è stato calcolato per valutare il danno cellulare.

5. Colorazione con Calcein AM/ioduro di propidio
Dopo 48 h di trasfezione con sh-NC o sh-lncRNA, la sopravvivenza delle cellule GC-1 è stata valutata mediante colorazione con Calcein AM/ioduro di propidio (PI). Le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti a una densità di 5 × 104 cellule/pozzetto e coltivate fino al raggiungimento di una confluenza del 60%–70%. Le cellule sono state delicatamente risciacquate con soluzione salina tamponata al fosfato e in ogni pozzetto sono stati aggiunti 500 µL di soluzione di colorazione con Calcein AM/PI. Le cellule sono state quindi incubate a 37 °C al buio per 30 minuti e osservate al microscopio a fluorescenza. Il numero di cellule vive e morte è stato determinato mediante software di analisi delle immagini e la proporzione di cellule sopravvissute è stata calcolata.

6. Citometria a flusso
Le cellule GC-1 sono state raccolte mediante centrifugazione e delicatamente lavate con soluzione salina tamponata al fosfato. Il pellet cellulare è stato risospeso in 500 µL di buffer di legame a una densità di 5 × 105 cellule/mL. Sono stati quindi aggiunti 5 µL di Annexina V-APC e 5 µL di PI, e la sospensione è stata mescolata accuratamente e incubata a 25 °C al buio per 10 minuti. L'apoptosi è stata analizzata mediante citometria a flusso utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 633/660 nm per APC e 488/630 nm per PI. Il tasso di apoptosi è stato valutato mediante software di analisi per citometria a flusso.

7. Saggio di attività della caspasi-3
Dopo i trattamenti indicati, circa 1 × 106 cellule GC-1 sono state raccolte, lavate e risospese in soluzione salina tamponata al fosfato. Le cellule sono state mescolate con 100 µL del reagente II del kit per il saggio di attività della caspasi-3 e lisate sul ghiaccio per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, sono stati prelevati 50 µL del sopranatante del lisato e mescolati con 40 µL del reagente I e 10 µL del reagente III. La miscela è stata incubata a 37 °C per 2 ore. L'assorbanza a 405 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre e l'attività della caspasi-3 è stata valutata secondo le istruzioni del kit.

8. Saggio di pull-down dell'RNA
I filamenti senso e antisenso dell'RNA lungo NONMMUT031883.2 sono stati sintetizzati in base alla sequenza corrispondente e marcati con biotina. Le cellule sono state lisate nel buffer di lisi per immunoprecipitazione su ghiaccio per 30 minuti, e il sopranatante contenente le proteine è stato raccolto mediante centrifugazione. Le perle magnetiche di streptavidina sono state lavate tre volte con buffer di legame per l'RNA e incubate nel buffer di legame contenente il 1% di albumina sierica bovina per 30 minuti.

Le perle pretrattate sono state combinate con le sonde marcate con biotina e incubate a 25 °C per 30 min. Le sonde non legate sono state rimosse mediante separazione magnetica. Successivamente è stato aggiunto il surnatante del lisato cellulare, e la miscela è stata incubata a 4 °C per 4 h per formare complessi di perle magnetiche-RNA-proteina. Le perle magnetiche sono state lavate tre volte con tampone di lavaggio per rimuovere le proteine legate in modo non specifico. Il tampone di lavaggio è stato rimosso mediante separazione magnetica, ed è stato aggiunto un buffer di caricamento SDS 2×. I campioni sono stati riscaldati a 95 °C per 10 min, e il surnatante è stato raccolto mediante separazione magnetica per l'analisi successiva mediante Western blot.

9. Costruzione di un modello murino di disfunzione della spermatogenesi
Dopo 5 giorni di ambientamento, topi maschi BALB/c specificati come liberi da agenti patogeni, del peso di 22–25 g e di 8 settimane di età, hanno ricevuto ciclofosfamide (CP) per via intraperitoneale a 50 mg/kg una volta al giorno per 7 giorni al fine di stabilire un modello di disfunzione della spermatogenesi14,27. I topi correttamente modellati sono stati assegnati casualmente, mediante una tabella di numeri casuali, ai gruppi CP, YC 200 mg/kg, YC 400 mg/kg, YC 800 mg/kg, YC 800 mg/kg + sh-NC e YC 800 mg/kg + sh-lncRNA, con sei topi per ciascun gruppo.

I topi nei gruppi trattati con YC hanno ricevuto la dose corrispondente di YC per via orale una volta al giorno per 30 giorni13. Per i gruppi 800 mg/kg YC + sh-NC e 800 mg/kg YC + sh-lncRNA, dopo il corretto completamento del modello, i topi sono stati anestetizzati mediante inalazione di isoflurano al 2%. Dopo aver verificato l'assenza del riflesso di ritrazione plantare e la stabilità della frequenza respiratoria in ciascun topo, l'area chirurgica è stata rasata e disinfettata con iodopovidone. In condizioni asettiche, è stata eseguita un'incisione mediana ventrale attraverso la cute e la parete corporea, in posizione anteriore ai genitali. Il testicolo è stato esposto manipolando con attenzione il cuscinetto adiposo epididimale, avendo cura di evitare danni vascolari. Utilizzando un micromanipolatore, sono stati visualizzati i tubuli seminiferi e 1 µL di sospensione adenovirale (1 × 1010 TU/mL) sono stati iniettati lentamente mediante un ago per microiniezione28. L'ago è stato mantenuto in sede per 5 minuti dopo l'iniezione, prima di essere estratto lentamente, e l'emostasi è stata ottenuta con un batuffolo di cotone sterile. La stessa procedura è stata successivamente eseguita sul testicolo controlaterale. L'incisione è stata quindi suturata e i topi sono stati lasciati riprendere conoscenza su un tappetino riscaldante nel periodo postoperatorio. I topi del gruppo di controllo hanno ricevuto giornalmente un volume equivalente di soluzione salina sia per via orale che mediante iniezione.

10. Valutazione della fertilità
Al termine della somministrazione del farmaco, i topi maschi di ciascun gruppo sono stati accoppiati liberamente con topi femmine BALB/c in un rapporto di 1:2 per 7 giorni. La formazione del tappo vaginale nelle femmine è stata monitorata e registrata quotidianamente. Dopo aver confermato l'accoppiamento avvenuto, i maschi sono stati rimossi e le femmine sono state alloggiate singolarmente fino al parto naturale. Sono state ottenute e incluse nell'analisi nove femmine gravide per gruppo. La dimensione media della nidiata è stata registrata per valutare la fertilità maschile in ciascun gruppo.

Al termine del periodo sperimentale, i topi sono stati sottoposti a eutanasia mediante somministrazione intraperitoneale di pentobarbital sodico a 100 mg/kg. Questo metodo di eutanasia è stato approvato dal Comitato Etico per gli Animali dell'Università del Sudest (numero di approvazione 20230216022). I testicoli e le epididimi sono stati accuratamente separati, fotografati e pesati. Gli indici di testicolo ed epididimo sono stati calcolati come rapporto tra peso dell'organo e peso corporeo. Da ciascun topo è stato prelevato un epididimo, tagliato in pezzi, posto in 1 mL di soluzione salina tamponata al fosfato preriscaldata (37 °C) ed incubato per 20 minuti per consentire allo sperma di fuoriuscire29. La sospensione spermatica è stata delicatamente mescolata e 10 µL della sospensione sono stati posizionati su una piastra per il conteggio delle cellule del sangue preriscaldata. Lo sperma è stato contato manualmente al microscopio ottico con un ingrandimento di 200× e i risultati sono stati espressi in 106/L. Inoltre, la percentuale di spermatozoi con movimento progressivo rispetto al numero totale di spermatozoi è stata calcolata come motilità spermatica13.

11. Determinazione dei livelli degli ormoni sessuali
Il sangue è stato prelevato dalla vena orbitale dei topi di ciascun gruppo ed è stato lasciato riposare a 25 °C per 30 min. Il siero è stato ottenuto mediante centrifugazione a 3.000 × g per 10 min30. I livelli sierici di testosterone, ormone luteinizzante (LH) e ormone follicolo-stimolante (FSH) sono stati misurati utilizzando i corrispondenti kit per saggio immunoenzimatico (ELISA).

12. Saggio di stabilità dell'RNA
Le cellule GC-1 sono state seminate in piastre da coltura a 96 pozzetti, trasfettate con si-QKI-5 o si-NC e coltivate per 48 h. È stato quindi aggiunto attinomicina D a 5 µg/mL e le cellule sono state raccolte a 0, 3, 6 e 9 h. È stato isolato l'RNA totale e il livello di espressione relativo dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è stato determinato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa a seguito di trascrizione inversa. Il livello relativo di RNA in ciascun punto temporale è stato calcolato utilizzando il livello di espressione a 0 h come 100%.

13. Reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa
Le cellule GC-1 e i tessuti testicolari di topo sono stati lavati con soluzione salina tamponata al fosfato e lisati per l'isolamento dell'RNA totale. Il DNA complementare è stato ottenuto mediante trascrizione inversa utilizzando la trascrittasi inversa AMV. L'amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi è stata eseguita utilizzando un sistema di PCR in tempo reale e un kit di PCR quantitativa, impiegando il DNA complementare come stampo per l'amplificazione. U6 è stato utilizzato come riferimento interno per l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, e GAPDH è stato utilizzato come riferimento interno per QKI-5. L'espressione relativa del gene bersaglio è stata calcolata utilizzando il 2−ΔΔCt metodo25L'RNA è stato inoltre isolato separatamente dalle frazioni citoplasmatica e nucleare per determinare la localizzazione subcellulare dell'lncRNA NONMMUT031883.2. Le sequenze dei primer sono fornite in Tabella 1.

GenePrimer diretto (5' a 3')Primer inverso (5' a 3')
QKI-5CTGTCATGCCAAACGGAACGATGGACACGCATATCGTG
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
lncRNA NONMMUT031883.2CCACTGTGGCACATTGAAGTATTAAGTTAATGGGTGCTGTGTT
U6 RNACTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT

Tabella 1: Sequenze di primer utilizzate per la reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa. Le sequenze dei primer diretti e inversi sono elencate nella direzione 5′–3′ per l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, QKI-5, U6 e GAPDH.

14. Colorazione con ematossilina ed eosina
I tessuti testicolari ed epididimali di topo sono stati immersi in paraformaldeide al 4% e fissati a 4 °C per 24 h. Dopo il lavaggio con soluzione salina fosfato tampone, i tessuti sono stati disidratati mediante una serie di etanolo a concentrazione crescente, inclusi in paraffina e tagliati in sezioni di 5 µm. Le sezioni sono state riscaldate a 60 °C per 60 min e desparaffinate in xilolo per 30 min.

Dopo l'idratazione mediante una serie di etanolo a concentrazione crescente, i campioni sono stati colorati con ematossilina per 5 min, trattati con soluzione differenziante di acido cloridrico-etanolo per 10 s, lavati con acqua corrente per la rivelazione della tonalità blu, e colorati con eosina al 1% per 2 min. I campioni sono stati quindi disidratati in etanolo al 95% e in etanolo assoluto e chiarificati in xilene per 30 min. Dopo l'essiccazione all'aria, i campioni sono stati montati con gomma neutra. I cambiamenti morfologici nei testicoli e nelle vie spermatiche sono stati osservati al microscopio.

15. Immunofluorescenza
Sezioni paraffiniche di testicolo murino sono state disparaffinate e idratate mediante una serie di etanoli a concentrazione decrescente, seguite da recupero dell'antigene mediato da microonde in tampone citrato a pH 6,0. Dopo raffreddamento spontaneo a temperatura ambiente, le sezioni sono state incubate con Triton X-100 al 0,3% per 10 minuti. Le sezioni sono state bloccate con albumina sierica bovina al 5% a 25 °C per 60 minuti, risciacquate con soluzione salina fosfato tampone e incubate per tutta la notte a 4 °C con un anticorpo primario anti-Ki67. Il giorno successivo, è stato applicato un anticorpo secondario di immunoglobulina G marcato con fluorocromo, e le sezioni sono state incubate a 37 °C al buio per 60 minuti. Dopo il risciacquo con soluzione salina fosfato tampone, le sezioni sono state controcolorate con DAPI per 10 minuti ed esaminate al microscopio a fluorescenza. L'intensità della fluorescenza è stata analizzata mediante software di analisi delle immagini.

Per la colorazione mediante immunofluorescenza delle cellule GC-1, le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti a una densità di 1 × 105 cellule/pozzetto e incubate per 24 h. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 30 minuti, permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,3% per 10 minuti, bloccate con albumina sierica bovina al 5% ed incubate tutta la notte a 4 °C con un anticorpo primario contro QKI-5. La procedura rimanente è stata eseguita come descritto per le sezioni di tessuto testicolare.

16. Colorazione TUNEL
Sezioni paraffiniche di testicolo murino sono state disparaffinate, idratate mediante una serie alcolica graduale e incubate con il 0,1% di Triton X-100 per 5 minuti per aumentare la permeabilità della membrana cellulare. È stata applicata uniformemente una soluzione working di proteinasi K a 20 µg/mL senza DNasi, seguita da incubazione a 37 °C per 15 minuti. È stata aggiunta la soluzione di rilevamento TUNEL e le sezioni sono state incubate a 37 °C al buio per 90 minuti. Dopo l'incubazione con DAPI per 10 minuti, è stato applicato un mezzo di montaggio antifade e il tessuto testicolare è stato osservato al microscopio a fluorescenza.

Le cellule GC-1 sono state seminate in piastre da 12 pozzetti e fissate con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Dopo la permeabilizzazione con Triton X-100 allo 0,1% per 5 minuti, è stata applicata alle cellule la soluzione di rilevamento TUNEL, seguita da incubazione al buio per 60 minuti. Le cellule sono state quindi colorate con DAPI per 10 minuti e osservate al microscopio a fluorescenza.

17. Immunoblotting
I tessuti testicolari di topo e le cellule GC-1 sono stati lisati nel buffer di lisi cellulare per immunoprecipitazione su ghiaccio per 30 minuti e sottoposti a ultrasuoni. Dopo la centrifugazione, è stato raccolto il sopranatante contenente le proteine e la concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit per saggio con acido bicinconinico. Il sopranatante proteico è stato mescolato con buffer di caricamento SDS e riscaldato in acqua bollente per 10 minuti. Dopo la separazione mediante elettroforesi su gel, le proteine sono state trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene e bloccate con albumina sierica bovina al 5% per 2 h31.

Le membrane sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro caspasi-3 clivata (1:500), Bcl-2 (1:1000), caspasi-3 (1:2000), Bax (1:500), QKI-5 (1:1000), p38 fosforilata (1:1000) o p38 (1:500). Il giorno successivo, le membrane sono state risciacquate con soluzione salina tamponata al Tris contenente Tween 20 e incubate con immunoglobulina G anti-coniglio prodotta in capra in rapporto 1:10000 per 2 h a 25 °C. È stata applicata sulla superficie delle membrane la soluzione di lavoro per chemiluminescenza avanzata e le bande proteiche sono state visualizzate mediante un sistema di imaging per gel. L'intensità delle bande è stata analizzata utilizzando un software di analisi delle immagini e l'espressione proteica relativa è stata normalizzata rispetto a GAPDH (1:3000).

Cicloesimidina a 50 µg/mL è stata utilizzata per inibire la sintesi proteica. Per determinare l'emivita di QKI-5, le cellule sono state raccolte a 0, 3, 6 e 9 h, e i livelli proteici di QKI-5 sono stati successivamente determinati mediante immunoblotting25.

18. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati analizzati statisticamente e rappresentati graficamente mediante software statistici, di grafica e di analisi delle immagini. Il test di Shapiro-Wilk è stato utilizzato per valutare la normalità dei dati. I dati sperimentali sono espressi come media ± deviazione standard. Per valutare le differenze tra i gruppi è stata utilizzata l'analisi della varianza ad un fattore. Il test t di LSD è stato impiegato per confronti a coppie post hoc quando le varianze erano omogenee, mentre il test T3 di Dunnett è stato utilizzato quando le varianze erano eterogenee. Un valore di p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

L'inibizione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 induce l'apoptosi negli spermatogoni
Le cellule GC-1 sono state trasfettate con sh-RNA lungo non codificante per ridurre l'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. Rispetto alle cellule trasfettate con sh-NC, il livello trascrizionale dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è risultato notevolmente ridotto dopo la trasfezione con sh-RNA lungo non codificante, confermando un efficace abbattimento dell'espressione (Figura 2A). Dopo l'inibizione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, la vitalità delle cellule GC-1 è risultata significativamente ridotta (Figura 2B), mentre il rilascio di LDH è aumentato in modo significativo, indicando un danno cellulare maggiore (Figura 2C). La colorazione con Calcein-AM/PI ha mostrato un numero maggiore di cellule GC-1 positive al PI e una proporzione ridotta di cellule vitali nel gruppo sh-RNA lungo non codificante (Figura 2D, E). Il tasso di apoptosi delle cellule GC-1 è aumentato notevolmente dopo l'inibizione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 (Figura 2F, G). Anche il tasso di positività al test TUNEL è risultato significativamente più elevato nel gruppo sh-RNA lungo non codificante, ulteriore indicazione di un aumento dell'apoptosi (Figura 2H, I). Inoltre, l'inibizione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 ha aumentato in modo significativo l'attività della caspasi-3 nelle cellule GC-1 (Figura 2J). Nel gruppo sh-RNA lungo non codificante, l'espressione di Bax è risultata marcatamente aumentata, quella di Bcl-2 ridotta e il rapporto caspasi-3 clivata/caspasi-3 totale significativamente elevato (Figura 2K, L). Questi risultati indicano che l'inibizione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 induce apoptosi nelle cellule GC-1. Tutti i dati quantificati sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 2: L'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 induce l'apoptosi negli spermatogoni. (A) Analisi di reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) dell'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 in cellule GC-1. (B) Saggio con Cell Counting Kit-8 (CCK-8) della vitalità cellulare delle cellule GC-1 dopo l'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. (C) Rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) da parte delle cellule GC-1 dopo l'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. (D, E) Colorazione con Calcein-AM/ioduro di propidio (PI) della sopravvivenza delle cellule GC-1 (20×; barra della scala, 100 µm). (F, G) Analisi citometrica in flusso dell'apoptosi dopo l'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. (H, I) Analisi TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) delle cellule GC-1 (40×; barra della scala, 50 µm). (J) Attività della caspasi-3 dopo l'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. (K, L) Analisi di Western blot dell'espressione di Bcl-2, Bax, caspasi-3 e caspasi-3 clivata dopo la trasfezione con sh-lncRNA. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto a sh-NC. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'interazione tra l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5
L'interazione tra l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5 è stata esaminata per chiarire il meccanismo molecolare alla base dell'apoptosi degli spermatogoni. Dopo la separazione delle frazioni nucleare e citoplasmatica, l'analisi di qRT-PCR ha mostrato che l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 era localizzato principalmente nei nuclei delle cellule GC-1 (Figura 3A). L'analisi mediante immunofluorescenza ha mostrato che anche QKI-5 era concentrato nel nucleo, fornendo una base spaziale per l'interazione tra l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5 (Figura 3B). La vita media dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è stata misurata dopo il trattamento con actinomicina D per valutare se QKI-5 regolasse la stabilità dell'RNA lungo. L'abbattimento di QKI-5 non ha avuto alcun effetto significativo sulla vita media del trascritto dell'RNA lungo (Figura 3C). Dopo l'inibizione della sintesi proteica mediante cicloesimide, l'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 non ha alterato l'espressione proteica di QKI-5 (Figura 3D, E). L'efficienza di cattura della sonda antisenso marcata con biotina, specifica per l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, è stata quindi valutata mediante qRT-PCR. La sonda antisenso ha arricchito in modo efficiente l'RNA lungo bersaglio ed è stata pertanto utilizzata per il successivo saggio di pull-down dell'RNA (Figura 3F). Il pull-down dell'RNA seguito da immunoblotting ha evidenziato un'interazione fisica specifica tra l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5 (Figura 3G, H). Questi risultati indicano che l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5 colocalizzano nei nuclei delle cellule GC-1 e interagiscono in modo specifico. I dati quantitativi delle Figure 3C e 3D, F sono stati ottenuti con n = 3, mentre il resto dei dati quantitativi è stato ottenuto con n = 6.

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Figura 3: LncRNA NONMMUT031883.2 interagisce con QKI-5. (A) Analisi qRT-PCR della distribuzione nucleare e citoplasmatica dell'lncRNA NONMMUT031883.2 in cellule GC-1. (B) Analisi di immunofluorescenza della localizzazione subcellulare di QKI-5 in cellule GC-1 (40×; barra della scala, 50 µm). (C) Analisi qRT-PCR della emivita dell'lncRNA NONMMUT031883.2 dopo trattamento con actinomicina D e silenziamento di QKI-5 (n = 3). (D, E) Analisi di Western blot dell'espressione proteica di QKI-5 dopo trattamento con cicloesimide e silenziamento dell'lncRNA NONMMUT031883.2 (n = 3). (F) Convalida mediante qRT-PCR dell'efficienza di arricchimento della sonda antisenso marcata con biotina rivolta all'lncRNA NONMMUT031883.2. (G, H) Analisi di pull-down dell'RNA e di Western blot dell'interazione tra lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'inibizione di QKI-5 inibisce l'apoptosi degli spermatogoni mediante la soppressione della via di segnalazione p38 MAPK
È stato esaminato il ruolo di QKI-5 e della via p38 MAPK a valle nell'apoptosi degli spermatogoni. Dopo la trasfezione con si-QKI-5, i livelli proteici di QKI-5 sono risultati significativamente ridotti nelle cellule GC-1, confermando un efficace silenziamento (Figura 4A, B). L'inibizione dell'lnRNA NONMMUT031883.2 ha aumentato significativamente il rapporto p-p38/p38, mentre la contemporanea inibizione di QKI-5 ha ridotto tale rapporto, indicando un'inibizione dell'attivazione della via p38 MAPK (Figura 4C, D). L'inibizione di QKI-5 ha attenuato il danno alle cellule GC-1 indotto dall'inibizione dell'lnRNA NONMMUT031883.2, mentre il trattamento con l'induttore di apoptosi etoposide ha ridotto in modo significativo la vitalità cellulare (Figura 4E). L'inibizione di QKI-5 ha ridotto significativamente il tasso di apoptosi nelle cellule GC-1, mentre il trattamento con etoposide ha marcatamente aumentato l'apoptosi (Figura 4F, G). La trasfezione con si-QKI-5 ha inoltre ridotto significativamente l'attività della caspasi-3, mentre il trattamento con etoposide ne ha aumentato l'attività (Figura 4H). L'inibizione di QKI-5 ha ridotto l'espressione di Bax, aumentato l'espressione di Bcl-2 e significativamente diminuito il rapporto caspasi-3 clivata/caspasi-3, mentre il trattamento con etoposide ha invertito questi profili di espressione (Figura 4I, J). Questi risultati indicano che l'inibizione di QKI-5 sopprime l'apoptosi negli spermatogoni GC-1 inibendo la via di segnalazione p38 MAPK. Tutti i dati quantificati sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 4: La riduzione di QKI-5 inibisce l'apoptosi degli spermatogoni sopprimendo la via di segnalazione p38 MAPK. (A, B) Analisi mediante Western blot dell'espressione di QKI-5 in cellule GC-1 dopo trasfezione con si-NC o si-QKI-5. (C, D) Analisi mediante Western blot dell'espressione di p38 fosforilata (p-p38) e di p38 totale. (E) Analisi CCK-8 della vitalità cellulare delle cellule GC-1 nei diversi gruppi sottoposti a trattamento. (F, G) Analisi citometrica del flusso dell'apoptosi dopo trattamento con etoposide. (H) Attività della caspasi-3 nei diversi gruppi sottoposti a trattamento. (I, J) Analisi mediante Western blot dell'espressione di Bax, Bcl-2, caspasi-3 e caspasi-3 scissa in cellule GC-1. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto a si-NC o sh-NC; ###p < 0,001 rispetto a sh-lncRNA; &&&p < 0,001 rispetto a sh-lncRNA + si-QKI-5. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

YC inibisce l'apoptosi degli spermatogoni tramite il percorso dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
Dopo il trattamento delle cellule GC-1 con siero contenente YC per 6, 12 e 24 h, la vitalità cellulare è aumentata gradualmente all'aumentare delle concentrazioni di YC e dei tempi di esposizione. Pertanto, queste concentrazioni sono state selezionate per esperimenti successivi, con una durata del trattamento di 24 h (Figura 5A). Il trattamento con YC per 24 h ha notevolmente aumentato il livello trascrizionale dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 nelle cellule GC-1 (Figura 5B) e potenziato la sua capacità di legame con QKI-5 (Figura 5C, D). Dopo il trattamento con YC, l'espressione di QKI-5 e il rapporto p-p38/p38 sono risultati notevolmente ridotti nelle cellule GC-1, suggerendo un'inibizione della via di segnalazione p38 MAPK (Figura 5E, F). Il trattamento con YC ha inoltre notevolmente ridotto la percentuale di apoptosi (Figura 5G, H), attività ridotta della caspasi-3 (Figura 5I), aumento dell'espressione di Bcl-2 e riduzione dell'espressione di Bax e del rapporto caspasi-3 clivata/caspasi-3 (Figura 5J, K).

Per valutare ulteriormente la specificità della via di segnalazione, le cellule GC-1 sono state trasfettate con OE-NC o OE-QKI-5. L'espressione proteica di QKI-5 è risultata significativamente aumentata nelle cellule trasfettate con OE-QKI-5, confermando un'efficace sovraespressione (Figura 5L, M). L'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 ha ridotto significativamente la vitalità cellulare, mentre il trattamento con YC ha invertito questo effetto. La sovraespressione di QKI-5 ha attenuato l'effetto citoprotettivo di YC (Figura 5N). Il trattamento con YC ha inoltre ridotto l'apoptosi indotta dall'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 (Figura 5O, P), diminuito l'attività della caspasi-3 (Figura 5Q), ridotto l'espressione di Bax, aumentato l'espressione di Bcl-2 e diminuito il rapporto tra caspasi-3 clivata e caspasi-3 totale (Figura 5R, S). Al contrario, la sovraespressione di QKI-5 ha attenuato gli effetti antiapoptotici di YC. Questi risultati indicano che YC regola positivamente l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e ne promuove il legame con QKI-5, inibendo così la via di segnalazione p38 MAPK e sopprimendo l'apoptosi nelle cellule GC-1. Tutti i dati quantificati sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 5: YC inibisce l'apoptosi degli spermatogoni tramite il percorso dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analisi con CCK-8 della vitalità cellulare delle cellule GC-1 dopo esposizione a siero contenente Yangjing Capsule (YC) per 6, 12 e 24 h. (B) Analisi di qRT-PCR dell'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 in cellule GC-1 dopo 24 h di trattamento con YC. (C, D) Analisi di pull-down dell'RNA per valutare il legame tra l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e QKI-5 dopo il trattamento con YC. (E, F) Analisi mediante Western blot dell'espressione di QKI-5, p-p38 e p38 dopo il trattamento con YC. (G, H) Analisi citofluorimetrica dell'apoptosi delle cellule GC-1 dopo il trattamento con YC. (I) Attività della caspasi-3 dopo il trattamento con YC. (J, K) Analisi mediante Western blot dell'espressione di Bcl-2, Bax, caspasi-3 e caspasi-3 scissa dopo il trattamento con YC. (L, M) Analisi mediante Western blot dell'espressione di QKI-5 dopo trasfezione con OE-NC o OE-QKI-5. (N) Analisi della vitalità cellulare delle cellule GC-1 mediante CCK-8 (O, P) Analisi citofluorimetrica dell'apoptosi in cellule GC-1 dopo la sovraespressione di QKI-5 (Q) Attività della caspasi-3 in seguito alla sovraespressione di QKI-5 (R, S) Analisi mediante Western blot dell'espressione di Bax, Bcl-2, caspasi-3 e caspasi-3 scissa dopo la sovraespressione di QKI-5. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto al controllo; ###p < 0,001 rispetto a sh-lncRNA; &&&p < 0,001 rispetto a sh-lncRNA + H-YC + OE-NC. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

YC migliora la disfunzione spermatogenica indotta da CP nei topi
Gli effetti protettivi di YC sono stati valutati in topi con disfunzione spermatogenica. I testicoli e le epididimi dei topi nel gruppo CP mostravano un marcato atrofia, volume ridotto e aspetto opaco. Dopo il trattamento con diverse dosi di YC, la morfologia, la pienezza e il colore degli organi riproduttivi sono migliorati gradualmente (Figura 6A). I pesi relativi di testicoli ed epididimi sono aumentati significativamente, con l'effetto maggiore osservato nel gruppo trattato con 800 mg/kg di YC (Figura 6B, C).

Il tasso di anomalie spermatiche è risultato significativamente aumentato nel gruppo CP, con anomalie frequenti che includevano deformità della testa, arrotolamento della coda e danni strutturali. Il numero di spermatozoi e la loro motilità erano inoltre notevolmente ridotti. Dopo il trattamento con YC, la morfologia spermatica è migliorata (Figura 6D), il numero di spermatozoi è aumentato (Figura 6E) e la motilità spermatica è risultata significativamente potenziata (Figura 6F). Esperimenti di accoppiamento hanno mostrato che la fertilità e la dimensione della cucciolata erano notevolmente ridotte nel gruppo CP, mentre il trattamento con YC ha migliorato la fertilità (Figura 6G). I livelli sierici di testosterone, ormone follicolo-stimolante e ormone luteinizzante erano inoltre marcatamente ridotti nel gruppo CP e sono aumentati dopo il trattamento con YC (Figura 6H-J). Questi risultati indicano che YC migliora l'atrofia degli organi riproduttivi, la qualità degli spermatozoi, la fertilità e la secrezione di ormoni sessuali in topi con disfunzione spermatogenetica. I dati quantitativi della Figura 6G sono stati ottenuti con n = 9, mentre tutti gli altri dati quantitativi sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 6: YC migliora la disfunzione spermatogenetica indotta da CP nei topi. (A-C) Morfologia degli organi riproduttivi nei gruppi di controllo, ciclofosfamide (CP) e trattamento con YC (A), indice del testicolo (B) e indice dell'epididimo (C). (D-F) Morfologia degli spermatozoi (D) (40×; barra della scala, 50 µm), densità spermatica (E) e motilità spermatica (F). (G) Fertilità maschile valutata mediante esperimenti di accoppiamento (n = 9). (H-J) Livelli sierici di ormone follicolo-stimolante (FSH), testosterone e ormone luteinizzante (LH) misurati utilizzando kit per saggio immunoenzimatico (ELISA). I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto al controllo; #p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto a CP. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

YC migliora i danni istopatologici testicolari nei topi con disfunzione della spermatogenesi
L'effetto riparativo di YC sui danni del tessuto testicolare è stato valutato mediante colorazione istologica. La colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato una struttura tissutale integra, strati cellulari ben definiti e un numero adeguato di cellule nel gruppo di controllo. Al contrario, il gruppo CP ha mostrato un marcato atrofia dei tubuli seminiferi e una disorganizzazione strutturale, una riduzione del numero di cellule e un collasso della lume dell'epididimo. Dopo il trattamento con YC, i danni testicolari ed epididimali sono risultati ridotti, la struttura dei tubuli seminiferi è stata gradualmente ripristinata e le cellule sono diventate più ordinate e aumentate numericamente (Figura 7A, B).

La proporzione di cellule TUNEL-positive nel tessuto testicolare è risultata significativamente aumentata nel gruppo CP e significativamente ridotta dopo il trattamento con YC (Figura 7C, D). L'espressione di Bax e il rapporto caspasi-3 tagliata/caspasi-3 sono risultati notevolmente aumentati nel gruppo CP, mentre l'espressione di Bcl-2 è risultata ridotta. Il trattamento con YC ha invertito questi profili di espressione (Figura 7E, F). L'analisi mediante immunofluorescenza ha mostrato che l'intensità della fluorescenza di Ki67 era marcatamente ridotta nel gruppo CP e significativamente aumentata dopo il trattamento con YC, suggerendo un ripristino della proliferazione delle cellule spermatogenetiche (Figura 7G, H). Questi risultati indicano che YC riduce i danni istopatologici indotti da CP nei testicoli e nelle vie seminali, inibisce l'apoptosi eccessiva e promuove la proliferazione delle cellule spermatogenetiche. Tutti i dati quantificati sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 7: YC migliora i danni istopatologici indotti da CP nel tessuto testicolare del mouse. (A, B) Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) dei testicoli (A) e delle epididimi (B) successivamente al trattamento con YC (20×; barra della scala, 100 µm). (C, D) Analisi TUNEL dell'apoptosi nel tessuto testicolare del mouse (40×; barra della scala, 50 µm). (E, F) Analisi mediante Western blot dell'espressione di Bax, Bcl-2, caspasi-3 e caspasi-3 clivata nel tessuto testicolare dopo il trattamento con YC. (G, H) Analisi mediante immunofluorescenza dell'espressione di Ki67 nel tessuto testicolare del mouse (40×; barra della scala, 50 µm). I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto al controllo; p < 0,001 rispetto a CP. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

YC migliora la disfunzione spermatogenica e i danni patologici testicolari nei topi attraverso il percorso lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK
L'interessamento del percorso lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK negli effetti di YC è stato ulteriormente valutato. L'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 era significativamente ridotta nel tessuto testicolare dei topi del gruppo CP, mentre l'espressione di QKI-5 e il rapporto p-p38/p38 erano marcatamente aumentati (Figura 8A-D). Dopo il trattamento con YC, l'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 è aumentata, mentre l'espressione di QKI-5 e il rapporto p-p38/p38 sono diminuiti.

Per valutare ulteriormente la specificità della via di segnalazione, l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è stato silenziato in topi mediante sh-RNA lungo non codificante. Il livello di espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 è risultato significativamente ridotto, confermando un efficace silenziamento (Figura 8E). Dopo il silenziamento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, il livello di QKI-5 nel tessuto testicolare non è cambiato in modo significativo, mentre il rapporto p-p38/p38 è aumentato significativamente (Figura 8F, G). Il trattamento con sh-RNA lungo non codificante ha attenuato gli effetti di YC a 800 mg/kg, determinando una riduzione dell'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 nel tessuto testicolare (Figura 8H) e un aumento dei livelli di p-p38/p38 (Figura 8I, J). Il trattamento con YC ha aumentato significativamente il numero e la motilità degli spermatozoi dopo l'induzione con CP, mentre il silenziamento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 ha attenuato tali effetti (Figura 8K, L). Il trattamento con YC ha inoltre aumentato i livelli di testosterone, ormone follicolostimolante e ormone luteinizzante nel gruppo CP, effetti che sono stati attenuati dal silenziamento dell'RNA lungo non codificante (Figura 8M-O).

La colorazione con ematossilina ed eosina ha mostrato che YC migliora i danni testicolari indotti da CP, inclusa l'atrofia dei tubuli seminiferi e il disordine nell'organizzazione delle cellule spermatogenetiche. L'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2 ha attenuato questi effetti protettivi (Figura 8P). Dopo il trattamento con YC, l'espressione di Bax e il rapporto tra caspasi-3 clivata e caspasi-3 sono risultati ridotti, mentre l'espressione di Bcl-2 è aumentata. L'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2 ha invertito questi effetti sulle proteine legate all'apoptosi (Figura 8Q, R). Questi risultati indicano che YC migliora la qualità dello sperma e riduce i danni al tessuto testicolare dopo l'induzione con CP mediante l'upregolazione dell'lncRNA NONMMUT031883.2, la downregolazione di QKI-5 e l'inibizione della via di segnalazione p38 MAPK. Tutti i dati quantificati sono stati ottenuti con n = 6.

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Figura 8: YC migliora la spermatogenesi e riduce i danni istopatologici testicolari attraverso il percorso lncRNA NONMMUT031883.2/QKI-5/p38 MAPK. (A) Analisi qRT-PCR dell'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 nel tessuto testicolare murino. (B-D) Analisi mediante Western blot dell'espressione di QKI-5, p-p38 e p38 nel tessuto testicolare murino dopo trattamento con YC. (E) Convalida mediante qRT-PCR dell'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2 nel tessuto testicolare murino dopo somministrazione di sh-lncRNA. (F, G) Analisi mediante Western blot dei livelli di QKI-5 e p-p38/p38 nel tessuto testicolare dei topi dopo abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2. (H) Analisi qRT-PCR dell'espressione dell'lncRNA NONMMUT031883.2 nel tessuto testicolare murino dopo trattamento con YC e somministrazione di sh-lncRNA. (I, J) Analisi mediante Western blot dell'espressione di p-p38 e p38 nel tessuto testicolare murino. (K, L) Numero di spermatozoi (K) e motilità spermatica (L) nei diversi gruppi trattati. (M-O) I livelli sierici di FSH, testosterone e LH sono stati misurati utilizzando kit per saggio immunoenzimatico (ELISA). (P) Colorazione con ematossilina-eosina (HE) del tessuto testicolare nei topi trattati con CP (20×; barra della scala, 100 µm). (Q, R) Analisi mediante Western blot dell'espressione di Bcl-2, Bax, caspasi-3 clivata e caspasi-3 nel tessuto testicolare murino. I dati sono espressi come media ± deviazione standard; n = 6. ***p < 0,001 rispetto al controllo; p < 0,001 rispetto a CP; p < 0,001 rispetto a 800 mg/kg YC + sh-NC. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Disponibilità dei dati:
I dati grezzi che supportano i risultati di questo studio sono forniti come File Supplementare 1.

File supplementare 1: Dati originali. Questo file Excel contiene i dati numerici grezzi alla base delle analisi quantitative presentate nelle Figure da 2 a 8. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

La disfunzione spermatogenica acquisita indotta dalla chemioterapia è una causa importante di infertilità maschile32,33,34. Tuttavia, i meccanismi molecolari specifici non sono ancora completamente compresi. I risultati di questo studio dimostrano che la Yangjing Capsule (YC) migliora in modo dose-dipendente le alterazioni degli ormoni sessuali, i danni istopatologici testicolari e il deterioramento della fertilità indotti dal ciclofosfamide (CP) nei topi maschi. Questi miglioramenti sono stati associati all'upregolazione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 e all'inibizione della via di segnalazione QKI-5/p38 MAPK, suggerendo che la YC possa agire attraverso questo asse per ridurre l'apoptosi anomala degli spermatogoni.

La tossicità riproduttiva del CP è stata ampiamente documentata. Il suo metabolita, l'acroleina, può accumularsi nel tessuto testicolare e indurre l'apoptosi delle cellule germinali attraverso lo stress ossidativo, il danno al DNA e altre vie. Gli spermatogoni, essendo le cellule iniziali della spermatogenesi, sono particolarmente sensibili agli effetti citotossici del CP35,36. Cao et al. hanno scoperto che nel tessuto testicolare di pazienti con azoospermia dopo chemioterapia con CP vi era un significativo arricchimento della segnalazione del checkpoint del danno al DNA, mentre i geni associati allo sviluppo degli spermatozoi erano significativamente downregolati e l'integrità strutturale dei tubuli seminiferi era compromessa37. Bcl-2 è una proteina anti-apoptotica che agisce mantenendo l'integrità della membrana mitocondriale38. Bax è una proteina pro-apoptotica, e la sua upregolazione può favorire il rilascio del citocromo c dai mitocondri nel citoplasma, attivare la cascata delle caspasi e indurre l'apoptosi39,40. Saleh et al. hanno dimostrato che l'esposizione al CP ha causato atrofia dei tubuli seminiferi ed edema interstiziale nei topi, accompagnata da downregolazione di Bcl-2 e upregolazione di Bax, con conseguente riduzione del numero e della motilità degli spermatozoi41. Pertanto, l'inibizione dell'eccessiva apoptosi degli spermatogoni indotta dal CP potrebbe rappresentare un obiettivo importante per la protezione della funzione riproduttiva dopo la chemioterapia. Nello studio attuale, l'intervento con YC ha ridotto in modo dose-dipendente le alterazioni indotte dal CP nella secrezione ormonale sessuale sierica, riparato il danno ai tubuli seminiferi e migliorato la motilità degli spermatozoi e la fertilità maschile. YC ha inoltre aumentato l'espressione di Bcl-2 e ridotto l'espressione di Bax, il rapporto cleaved caspase-3/caspase-3 e il numero di cellule TUNEL-positive nel tessuto testicolare. In vitro, il siero contenente YC ha notevolmente ridotto l'apoptosi delle cellule GC-1 e aumentato la vitalità cellulare, ulteriormente confermando un effetto inibitorio sull'apoptosi degli spermatogoni.

Gli RNA non codificanti lunghi (lncRNA) svolgono importanti ruoli regolatori in processi fisiologici e patologici, inclusi la spermatogenesi e l'apoptosi delle cellule germinali42,43. Un'espressione anomala degli lncRNA può compromettere la funzione spermatogenetica testicolare attraverso la regolazione dello stress ossidativo e delle vie apoptotiche, rappresentando un importante meccanismo molecolare dell'infertilità maschile44. Wang et al. hanno scoperto che lncRNA DNM3OS regola l'asse miR-214-5p/E2F2, determinando una ridotta attività delle cellule spermatogoniali e un aumento dell'apoptosi e della senescenza, contribuendo infine all'azoospermia non ostruttiva45. Ricerche precedenti hanno inoltre mostrato che l'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT074098.2 nelle spermatogonie induce apoptosi25. Questi studi indicano che gli lncRNA sono importanti regolatori dell'apoptosi delle spermatogonie e della spermatogenesi. Nello studio attuale, l'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2 ha indotto l'apoptosi delle spermatogonie. La sua espressione è risultata significativamente ridotta nei tessuti testicolari di topo dopo l'induzione con CP, mentre l'intervento con YC ha parzialmente ripristinato la sua espressione. Inoltre, l'intervento con YC ha attenuato l'apoptosi anomala delle spermatogonie indotta dall'abbattimento dell'lncRNA NONMMUT031883.2, suggerendo che l'effetto protettivo di YC potrebbe essere associato alla regolazione di questo lncRNA.

QKI-5 è una proteina legante l'RNA appartenente alla famiglia STAR e partecipa a diversi processi fisiologici e patologici regolando lo splicing, la stabilità e l'efficienza traduttiva dell'mRNA bersaglio46,47. Studi precedenti hanno stabilito che QKI-5 è un regolatore importante nel sistema riproduttivo e che la sua espressione anomala può promuovere l'apoptosi delle cellule germinali e compromettere la funzione spermatica attraverso l'attivazione della via p38 MAPK a valle25. Li et al. hanno scoperto che l'inibizione dell'attivazione della via p38 MAPK riduceva i danni al tessuto testicolare indotti dal CP e ripristinava la funzione della barriera emato-testicolare nei ratti48. Questi risultati suggeriscono che l'asse QKI-5/p38 MAPK potrebbe rappresentare una via importante nel regolare l'apoptosi degli spermatogoni ed essere un potenziale bersaglio per il trattamento della disfunzione spermatogenica. Nel presente studio, l'espressione di QKI-5 e la fosforilazione di p38 sono risultate significativamente aumentate nel tessuto testicolare di topo dopo l'induzione con CP, mentre l'intervento con YC ha ridotto l'espressione di QKI-5 e l'attivazione della via p38 MAPK. L'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 si è legato direttamente a QKI-5, mentre l'espressione di QKI-5 non ha influenzato la stabilità dell'RNA lungo non codificante, suggerendo che l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 possa regolare la funzione di QKI-5 attraverso un'interazione diretta. L'abbattimento di QKI-5 ha attenuato i danni alle cellule GC-1 causati dall'abbattimento dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, mentre l'overespressione di QKI-5 ha ridotto gli effetti protettivi di YC sulle cellule GC-1. Li et al. hanno riportato che l'RNA lungo non codificante NONMMUT074098.2 regola l'apoptosi delle cellule germinali legandosi a QKI-525. I risultati attuali mostrano che anche l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 si lega a QKI-5 ed è coinvolto nel regolare l'apoptosi degli spermatogoni. Nel complesso, questi dati suggeriscono che YC potrebbe upregolare l'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, inibire la via QKI-5/p38 MAPK, ridurre l'apoptosi anomala degli spermatogoni e alleviare la disfunzione spermatogenica indotta dal CP. Tuttavia, va notato che YC è una formulazione erboristica multicomponente che probabilmente agisce su più bersagli. Altri meccanismi, come gli effetti antiossidanti diretti dei componenti di YC, la modulazione di altre vie di segnalazione o la regolazione epigenetica indipendente dall'asse RNA lungo non codificante-QKI-5, non possono essere esclusi e potrebbero contribuire agli effetti protettivi osservati.

Vanno riconosciute diverse limitazioni. Lo studio è stato condotto esclusivamente su un modello murino e sulla linea cellulare GC-1, senza validazione mediante campioni clinici provenienti da pazienti con infertilità. La spermatogenesi è un processo complesso, e il ciclo completo di spermatogenesi nei topi dura circa 35 giorni49,50. Il regime di trattamento con YC della durata di 30 giorni utilizzato in questo studio non copre un intero ciclo spermatogenetico. Pertanto, studi futuri che impiegano protocolli di intervento di almeno 35 giorni sono necessari per valutare in modo sistematico gli effetti terapeutici di YC su un ciclo spermatogenetico completo. Inoltre, gli eventi molecolari precisi che seguono il legame dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 con QKI-5, come le alterazioni dell'attività di splicing di QKI-5 e della sua localizzazione subcellulare, nonché il riconoscimento e la regolazione di bersagli di splicing a valle, restano da chiarire. Inoltre, sebbene il trattamento con YC abbia aumentato l'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2, i fattori trascrizionali a monte e i meccanismi epigenetici coinvolti restano da definire. Studi futuri che includano analisi del promotore e saggi di immunoprecipitazione della cromatina saranno necessari per chiarire la base molecolare dell'espressione indotta da YC dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2. Infine, studi futuri dovrebbero valutare gli effetti di YC in pazienti con infertilità maschile associata alla chemioterapia e analizzare l'espressione dell'RNA lungo non codificante NONMMUT031883.2 nel tessuto testicolare o nel liquido seminale, al fine di determinarne il potenziale valore clinico come marcatore diagnostico o terapeutico.

In conclusione, YC regola in modo positivo l'lncRNA NONMMUT031883.2 e inibisce l'attivazione della via di segnalazione QKI-5/p38 MAPK, riducendo così l'apoptosi degli spermatogoni e i danni testicolari e alleviando la disfunzione della spermatogenesi nei topi. Questi risultati chiariscono il meccanismo molecolare alla base degli effetti protettivi di YC contro la disfunzione della spermatogenesi ed ampliano la comprensione attuale dei ruoli dell'lncRNA NONMMUT031883.2 e della via QKI-5/p38 MAPK nella regolazione della spermatogenesi. L'lncRNA NONMMUT031883.2 e QKI-5 potrebbero rappresentare potenziali bersagli terapeutici per la disfunzione della spermatogenesi maschile.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi finanziari o non finanziari.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (grant no. 82374257), dal Quarto Batch del Programma di Formazione per il Personale Accademico di Eccellenza dell'Ospedale Provinciale di Medicina Cinese del Jiangsu (grant no. k2026yrc74) e dai Progetti di Ricerca Scientifica sulla Medicina Tradizionale Cinese e sulla Medicina Integrata Cinese e Occidentale della Provincia di Jiangsu (grant no. CYTF2026019).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Actinomicina DMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17559Inibitore della trascrizione utilizzato per saggi di stabilità dell'RNA
Trascrittasi inversa AMVTakara, Tokyo, Giappone2621Enzima per la sintesi del DNA complementare
Kit di rilevamento Annexina V-APC/PIBioLab Technology, Pechino, CinaKFS191Kit per l'analisi citofluorimetrica dell'apoptosi
Mezzo di montaggio antiossidanteMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K1042Mezzo di montaggio per la conservazione della fluorescenza
Anticorpo primario BaxAffinity Biosciences, OH, USAAF0120Anticorpo primario per il rilevamento di Bax
Kit BCAMacklin, Shanghai, CinaB917925Kit per la determinazione della concentrazione proteica
Anticorpo primario Bcl-2Affinity Biosciences, OH, USAAF0769Anticorpo primario per il rilevamento di Bcl-2
Albumina sierica bovinaBioLab Technology, Pechino, CinaBTN131070Reagente bloccante
Kit di rilevamento Calceina/PIBeyotime, Shanghai, CinaC2015MKit per la colorazione di cellule vive/morte
Kit per saggio dell'attività della caspasi-3BioLab Technology, Pechino, CinaQN2866Kit per la misurazione dell'attività della caspasi-3
Anticorpo primario caspasi-3Abcam, MA, USAab184787Anticorpo primario per il rilevamento della caspasi-3
Reagente CCK-8MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0301Reagente per la valutazione della vitalità cellulare
Anticorpo primario caspasi-3 clivataAbcam, MA, USAab32042Anticorpo primario per il rilevamento della caspasi-3 clivata
CicloesimideMacklin, Shanghai, CinaH823111Inibitore della sintesi proteica utilizzato per saggi di stabilità proteica
CiclofosfamideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-17420Utilizzato per indurre disfunzione spermatogenetica
Reagente DAPIBeyotime, Shanghai, CinaC1006Controstain nucleare
Mezzo DMEMWuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, CinaSNLM-302Mezzo di coltura cellulare per cellule GC-1
Soluzione lavorativa ECLSolarbio, Pechino, CinaSW2030Substrato chemiluminescente per il rilevamento di bande proteiche
EtoposideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-13629Agente induttore dell'apoptosi
Citometro a flussoBD Biosciences, CA, USABD FACSCaliburStrumento per l'analisi dell'apoptosi
Software FlowJoBD Biosciences, CA, USAv10.8Software per l'analisi dei dati di citometria a flusso
Microscopio a fluorescenzaLeica, Heidelberg, GermaniaDM3000Strumento per l'imaging a fluorescenza
Anticorpo secondario IgG marcato con fluorescenzaServicebio, Wuhan, CinaGB22303Anticorpo secondario per il rilevamento immunofluorescente
Kit ELISA per ormone follicolostimolanteHuamei Biotech, Wuhan, CinaCSB-E06871mKit per la misurazione dell'ormone follicolostimolante sierico
Anticorpo primario GAPDHAffinity Biosciences, OH, USAT0004Anticorpo di controllo di carico per il Western blotting
Cellule GC-1Wuhan Sunncell Biotechnology, Hubei, CinaSNL-302Linea cellulare di spermatogoni murini
Sistema di imaging per gelJinpeng Analysis Instrument, Shanghai, CinaJP-2880Sistema di imaging per la visualizzazione di gel e blot
Sistema di imaging per gelInvitrogen, Carlsbad, CA, USAiBright CL1500Sistema di imaging chemiluminescente per Western blot
Capra anti-coniglio IgGServicebio, Wuhan, CinaGB23303Anticorpo secondario per il Western blotting
Soluzione di ematossilinaBioLab Technology, Pechino, CinaYT165Colorante nucleare per l'analisi istologica
Soluzione di differenziazione etanolo-acido cloridricoBeyotime, Shanghai, CinaC0163SReagente di differenziazione per la colorazione con ematossilina
Software ImageJNational Institutes of Health, USA1.54hSoftware per la quantificazione delle immagini
Tampone di lisi cellulare per immunoprecipitazione (IP)Beyotime, Shanghai, CinaP0013Tampone di lisi per immunoprecipitazione ed estrazione proteica
Anticorpo primario Ki67Affinity Biosciences, OH, USAAF0198Anticorpo primario per il rilevamento di Ki67
Kit per saggio di citotossicità LDHBeyotime, Shanghai, CinaC0016Kit per la misurazione del rilascio di lattato deidrogenasi e del danno cellulare
Microscopio otticoOlympus, Tokyo, GiapponeCKX53Utilizzato per il conteggio degli spermatozoi e l'osservazione morfologica
Lipofectamina 3000Invitrogen, Carlsbad, CA, USAL3000001Reagente di trasfezione
Lettore di micropiastreMolecular Devices, CA, USASpectraMax MiniStrumento per misurazioni di assorbanza
Kit ELISA per ormone luteinizzante murinoHuamei Biotech, Wuhan, CinaCSB-E12770mKit per la misurazione dell'ormone luteinizzante sierico
Kit ELISA per testosterone murinoHuamei Biotech, Wuhan, CinaCSB-E05101mKit per la misurazione del testosterone sierico
Gomma neutraBioLab Technology, Pechino, CinaQN1253Mezzo di montaggio per sezioni istologiche
Anticorpo primario p38Affinity Biosciences, OH, USAAF6456Anticorpo primario per il rilevamento di p38 totale
ParaformaldeideMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-Y0333Fissativo per cellule e tessuti
Kit PARISInvitrogen, Carlsbad, CA, USAAM1921Kit per la frazionatura dell'RNA nucleare e citoplasmatico
Sistema PCRABI, CA, USAABI PRISM 7300Strumento per PCR in tempo reale
Anticorpo primario p-p38Affinity Biosciences, OH, USAAF3455Anticorpo primario per il rilevamento di p38 fosforilata
Soluzione di proteinasi KBeyotime, Shanghai, CinaST532Reagente per la permeabilizzazione del tessuto prima della colorazione TUNEL
Membrane PVDFMillipore, MA, USAISEQ00010Membrane per il trasferimento proteico nel Western blotting
Anticorpo primario QKI-5Abcam, MA, USAab126742Anticorpo primario per il rilevamento di QKI-5
Tampone di legame per RNAInvitrogen, Carlsbad, CA, USA65040DTampone per reazioni di legame RNA-proteina
Tampone di caricamento SDSBeyotime, Shanghai, CinaP0286Tampone di caricamento del campione per SDS-PAGE
Perle magnetiche streptavidinaMedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-K0208Perle magnetiche per il catturare sonde per RNA marcate con biotina
Kit TB Green FAST qPCRTakara, Tokyo, GiapponeCN830SKit di reagenti per PCR quantitativa
Triton X-100Macklin, Shanghai, CinaT824275Reagente di permeabilizzazione
Reagente TRIzolInvitrogen, Carlsbad, CA, USA15596018CNReagente per l'estrazione totale di RNA
Soluzione di rilevamento TUNELBeyotime, Shanghai, CinaC1086Reagente per il rilevamento della frammentazione del DNA
XileneMacklin, Shanghai, CinaX821391Reagente per la rimozione della paraffina e la chiarificazione del tessuto

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