Effetti nefroprotettivi dell'etanolo e del fomepizolo in un modello di ratto di intossicazione da metanolo pretrattato con metotrexato

Sommario

Questo studio confronta gli effetti nefroprotettivi dell'etanolo e della fomepizolo in un modello di ratto pretrattato con metotrexato di intossicazione da metanolo, progettato per ridurre la clearance del formiato dipendente dal folato. Gli esiti renali sono stati valutati mediante misurazioni della funzione renale, biomarcatori del danno renale, marcatori infiammatori, biomarcatori legati al redox e risultati istopatologici.

Abstract

L'intossicazione da metanolo provoca acidosi metabolica, lesioni d'organo e morte; le lesioni renali predicono esiti avversi. Etanolo e fomepizolo sono stati confrontati in un modello di ratto pretrattato con metotressato di intossicazione da metanolo. Trenta ratti Wistar maschi sono stati assegnati a cinque gruppi: Controllo, metotressato (MTX), MTX + metanolo, MTX + metanolo + fomepizolo e MTX + metanolo + etanolo (n = 6 per gruppo). Il MTX è stato somministrato per gavaggio orale a 0,3 mg/kg/die nei giorni 1-7. I tre gruppi esposti al metanolo hanno ricevuto 3 g/kg di metanolo per gavaggio orale il giorno 8. Il fomepizolo è stato somministrato per via intraperitoneale a 15 mg/kg 4 ore dopo la somministrazione di metanolo, seguito da 10 mg/kg a 12, 24 e 36 ore. L'etanolo è stato somministrato una volta per gavaggio orale a 0,5 g/kg 4 ore dopo la somministrazione di metanolo. I campioni sono stati raccolti il giorno 10. Nessun esito primario è stato designato in via prospettica. Sono state valutate la funzione renale, le lesioni nell'omogenato renale, i biomarcatori infiammatori, i biomarcatori legati al redox derivati dal sangue e i reperti istopatologici. L'analisi della varianza (ANOVA) ha rivelato differenze significative tra i gruppi per la cistatina C nell'omogenato renale (p = 0,003), l'interleuchina-6 (IL-6; p = 0,013), la molecola-1 di lesione renale (KIM-1; p = 0,017), l'urea sierica (p = 0,017) e la creatinina sierica (p < 0,001). Il test post hoc di Duncan ha mostrato valori inferiori per questi parametri in entrambi i gruppi con antidoto rispetto al gruppo MTX + metanolo. Non sono state identificate differenze biochimiche significative tra i due gruppi con antidoto. I punteggi istopatologici erano inferiori nei gruppi con antidoto. Sebbene il fomepizolo abbia mostrato un andamento descrittivo più favorevole, i risultati non ne dimostrano la superiorità rispetto all'etanolo. L'eterogeneità della varianza, i test multipli, i regimi di antidoto non equivalenti, l'assenza di misurazioni tossicocinetiche e dell'equilibrio acido-base e il breve periodo di osservazione limitano l'interpretazione. Studi futuri dovrebbero includere misurazioni dirette di metanolo e formiato, l'attività renale dell'alcol deidrogenasi citosolica, le correlazioni con gli esiti biochimici renali, periodi di osservazione più lunghi e regimi di antidoto comparabili.

Introduzione

L'avvelenamento da alcol metilico (metanolo) è un'importante emergenza tossicologica associata a una significativa morbilità e mortalità a livello mondiale, in particolare in seguito al consumo di bevande alcoliche illegali o prodotte abusivamente. Sebbene il metanolo stesso abbia una tossicità relativamente bassa, esso viene principalmente metabolizzato nel fegato dall'alcol deidrogenasi (ADH) in formaldeide e successivamente in acido formico; l'accumulo risultante di formiato può causare acidosi metabolica ad elevato gap anionico, neuropatia ottica e danno multiorgano.^1,2. Il formaldeide è un intermedio a vita breve, mentre l'accumulo di formiato è considerato il principale responsabile della tossicità, in quanto inibisce la citocromo ossidasi mitocondriale, causando ipossia cellulare e stress ossidativo³. La diagnosi precoce, la correzione dell'acidosi metabolica, la terapia antidotica e l'emodialisi rappresentano i principali approcci terapeutici per ridurre la mortalità².

Nell'intossicazione da metanolo, le manifestazioni cliniche diventano tipicamente evidenti dopo un periodo latente. Nausea, vomito, dolore addominale e una lieve depressione del sistema nervoso centrale possono essere seguite da acidosi metabolica con gap anionico elevato, dispnea, alterazione dello stato mentale e sintomi visivi^1,2. Offuscamento della vista, fotofobia, midriasi, edema del disco ottico e, nei casi gravi, cecità permanente sono tra gli effetti tossici più caratteristici associati all'inibizione mediata dall'acido formico della citocromo ossidasi mitocondriale^1,2. Le attuali strategie terapeutiche includono cure di supporto; correzione dell'acidosi metabolica con bicarbonato di sodio; integrazione con acido folinico o acido folico; inibizione della alcol deidrogenasi con etanolo o fomepizolo; e, in alcuni casi gravi selezionati, emodialisi per accelerare l'eliminazione di metanolo e formiato^3,4. Il fomepizolo è sempre più considerato un antidoto di prima scelta grazie alla sua farmacocinetica più prevedibile, alla semplicità del dosaggio e al minor rischio di effetti avversi; tuttavia, l'etanolo rimane un'alternativa importante per la sua disponibilità e il costo inferiore^4,5,6,7.

Sebbene lesioni del nervo ottico e del sistema nervoso centrale siano state tradizionalmente considerate le manifestazioni predominanti della tossicità del metanolo, il rene è stato sempre più riconosciuto come un organo bersaglio clinicamente rilevante^8,9,10. In coorti specifiche per il metanolo, l'insufficienza renale acuta (AKI) è stata associata a un'acidosi metabolica più grave, insufficienza respiratoria, insufficienza multiorgano, ventilazione meccanica, trattamento extracorporeo, ricovero più lungo e maggiore mortalità intraospedaliera; sono stati inoltre identificati il depletamento del volume, la sepsi, la rabdomiolisi e la pancreatite acuta come fattori associati allo sviluppo di AKI^8,10. Nella coorte riportata da Chang et al., l'AKI è rimasta indipendentemente associata alla mortalità intraospedaliera in un'analisi multivariata; tuttavia, il disegno osservazionale retrospettivo non dimostra che l'AKI stessa abbia causato la mortalità⁸. Pertanto, l'AKI dovrebbe essere interpretata come un marcatore di maggiore gravità della malattia e di prognosi peggiore nell'intossicazione da metanolo. Al contrario, la revisione sistematica di Wang et al. ha valutato gli esiti renali dopo avvelenamento da alcoli tossici in senso più ampio, principalmente metanolo e glicole etilenico; per questo motivo, le sue conclusioni non sono esclusivamente specifiche per il metanolo⁹. Tale revisione ha individuato una mortalità a breve termine significativa e importanti lacune conoscitive riguardo al recupero renale a lungo termine, alla dialisi in corso e alla segnalazione standardizzata degli esiti renali⁹.

La relazione tra tossicità del metanolo e insufficienza renale acuta (AKI) è probabilmente multifattoriale. L'accumulo di metaboliti tossici può contribuire attraverso inibizione mitocondriale, ipossia cellulare, grave acidosi metabolica e squilibrio redox, mentre fattori sistemici documentati in coorti cliniche — tra cui deplezione volumetrica, compromissione emodinamica, rabdomiolisi, sepsi, insufficienza respiratoria e disfunzione multiorgano — possono aggiungere ulteriori danni renali^1,2,3,8,10. Questi percorsi forniscono collegamenti biologicamente e clinicamente plausibili tra avvelenamento da metanolo e danno renale. Le alterazioni metaboliche renali possono derivare dall'esposizione al formiato circolante, dall'inibizione mitocondriale, dall'acidosi metabolica e dallo stress emodinamico sistemico. Tuttavia, il contributo specifico del metabolismo dell'alcol e dell'aldeide nei tessuti renali rimane incerto, poiché nel presente studio non sono state valutate direttamente le concentrazioni di metanolo, formaldeide e formiato, l'attività renale dell'ADH e la funzione mitocondriale.

Una sfida metodologica fondamentale negli studi sperimentali sulla tossicità del metanolo è che i ratti metabolizzano l'acido formico più rapidamente rispetto agli esseri umani. Sebbene l'accumulo di acido formico sia un determinante principale della tossicità del metanolo nell'uomo, ottenere un accumulo comparabile e il conseguente danno d'organo nei ratti è più difficile a causa del loro metabolismo della formiata altamente efficiente e dipendente dal folato. Pertanto, agenti che inibiscono il metabolismo del folato sono spesso utilizzati nei modelli sperimentali di tossicità da metanolo^11,12. Il trattamento precoce con metotressato (MTX) è stato impiegato per ridurre l'eliminazione della formiata dipendente dal folato nei ratti, aumentando così la suscettibilità alla tossicità del metanolo^11,12. Il metotressato non induce di per sé tossicità da metanolo, e il modello risultante non riproduce tutti gli aspetti dell'avvelenamento umano da metanolo. Poiché il metotressato può influenzare in modo indipendente gli esiti renali, ossidativi e infiammatori, è stato incluso un gruppo con solo MTX per caratterizzare le alterazioni associate al trattamento preventivo. Entro questi limiti, il modello fornisce una piattaforma preclinica controllata per confrontare i profili di esito renale tra gruppi sperimentali sottoposti allo stesso protocollo di pretrattamento con metotressato e di esposizione al metanolo, e per valutare tali esiti a livello biochimico, infiammatorio, ossidativo e istopatologico.

L'inibizione dell'alcol deidrogenasi costituisce il cardine del trattamento antidotico nell'intossicazione da metanolo. I due agenti più comunemente utilizzati a questo scopo nella pratica clinica sono l'etanolo e la fomepizolo (4-metilpirazolo). L'etanolo sopprime in modo competitivo la formazione di metaboliti tossici grazie alla sua maggiore affinità per l'ADH rispetto al metanolo, mentre il fomepizolo, un inibitore potente e selettivo dell'ADH, impedisce direttamente la conversione del metanolo in formaldeide e acido formico^5,6. Tuttavia, non esiste un consenso completo riguardo all'efficacia clinica comparativa, alla sicurezza, alla facilità di somministrazione e agli effetti protettivi sugli organi di questi due antidoti. Il fomepizolo è considerato vantaggioso in molti centri per via del suo regime posologico standardizzato, della mancanza di necessità di monitoraggio dei livelli sierici, dell'assenza di depressione del sistema nervoso centrale e delle proprietà farmacocinetiche più prevedibili, mentre la terapia con etanolo è associata a potenziali svantaggi, tra cui ipoglicemia, epatotossicità, alterazioni dello stato mentale e alla necessità di un monitoraggio intensivo^6,7. Al contrario, confronti clinici su larga scala hanno suggerito che gli effetti dei due antidoti sulla mortalità e sugli esiti clinici potrebbero essere simili. Nello studio di Zakharov et al., che ha valutato casi di intossicazione di massa, non è stata osservata alcuna differenza significativa nella sopravvivenza tra fomepizolo ed etanolo⁵.

Nonostante l'importanza prognostica dell'AKI nel caso di avvelenamento da metanolo^8,9,10, il danno renale ha ricevuto notevolmente meno attenzione rispetto alla tossicità oculare e neurologica, e gli effetti renali comparativi dell'etanolo e della fomepizolo rimangono insufficientemente caratterizzati. È pertanto necessaria una valutazione mirata al rene che includa test convenzionali di funzionalità renale, biomarcatori precoci di danno tubulare, citochine infiammatorie, parametri legati al redox e istopatologia, al fine di determinare se le due strategie antidotiche siano associate a differenti profili di esito renale. Inoltre, questo modello controllato di ratto pretrattato con metotrexato potrebbe facilitare la valutazione preclinica di potenziali antidoti, interventi diretti al rene e terapie di supporto in condizioni sperimentali definite. Il valore scientifico di questo modello risiede nella valutazione comparativa in un contesto sperimentale acuto, piuttosto che nella diretta riproduzione della complessità clinica e metabolica dell'avvelenamento umano da metanolo.

Le differenze nel metabolismo del metanolo tra roditori ed esseri umani, insieme all'uso di un trattamento farmacologico preventivo per ridurre l'eliminazione del formiato dipendente dal folato, rimangono importanti limitazioni metodologiche. Inoltre, la tossicità acuta indotta in condizioni sperimentali potrebbe non riflettere pienamente le diverse durate di esposizione e le condizioni comorbide riscontrate nella pratica clinica. Di conseguenza, i risultati ottenuti da questo modello animale devono essere considerati come evidenze precliniche preliminari e non devono essere utilizzati direttamente per sostenere decisioni terapeutiche nell'uomo. È necessaria una conferma mediante studi clinici adeguatamente progettati prima di poter trarre conclusioni applicabili alla clinica. In questo contesto, la principale lacuna conoscitiva riguarda se etanolo e fomepizolo siano associati a diversi profili di esiti renali rispetto a misure convenzionali della funzionalità renale, biomarcatori di danno tubulare, citochine infiammatorie, parametri legati allo stato redox e istopatologia in un modello di ratto pretrattato con metotressato. L'ipotesi dello studio era che l'inibizione dell'alcol deidrogenasi mediante etanolo o fomepizolo sarebbe stata associata a una riduzione del danno renale, con possibili differenze tra i trattamenti nei diversi domini di esito valutati. La nefroprotezione è stata definita operativamente come un profilo di esiti renali più favorevole rispetto al gruppo MTX + Metanolo. Tale profilo comprendeva concentrazioni più basse di urea e creatinina nel siero; livelli renali inferiori di molecola di danno renale-1 (KIM-1), cistatina C, fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), interleuchina-6 (IL-6) e interleuchina-1 beta (IL-1β); concentrazioni sieriche più basse di malondialdeide (MDA); maggiore attività della superossido dismutasi (SOD) nel siero, livelli ematici più elevati di glutatione ridotto (GSH) e maggiore attività della catalasi (CAT) nel sangue; e punteggi istopatologici più bassi per degenerazione tubulare, necrosi tubulare, danno glomerulare, congestione vascolare, infiammazione interstiziale e fibrosi. La nefroprotezione non è stata calcolata come un singolo punteggio composito; invece, i singoli esiti sono stati valutati collettivamente attraverso questi domini complementari. Pertanto, lo studio si proponeva di confrontare gli effetti dell'etanolo e del fomepizolo sulla funzionalità renale, sul danno tubulare, sull'infiammazione, sullo stato redox e sull'istopatologia renale in questo modello.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico Locale per gli Esperimenti sugli Animali dell'Università di Kırşehir Ahi Evran (decisione di approvazione n. 1, riunione n. 12, data di approvazione: 12 giugno 2025) e sono state condotte in conformità con le linee guida nazionali e internazionali per la cura e l'utilizzo degli animali da laboratorio. Durante tutto lo studio sono state adottate misure per minimizzare il dolore e lo stress e per utilizzare il minor numero possibile di animali.

Preparazione dei reagenti chimici
Il metotrexato è stato utilizzato come agente di pretrattamento per facilitare l'instaurazione del modello sperimentale di tossicità da metanolo. Poiché l'ossidazione del formiato dipendente dal folato è più efficiente nei ratti rispetto agli esseri umani, il pretrattamento con metotrexato è stato impiegato per ridurre l'eliminazione del formiato e aumentare la suscettibilità alla tossicità da metanolo; esso è stato usato come intervento di sensibilizzazione del modello piuttosto che come surrogato dell'esposizione al metanolo^11,12. Il metotrexato era disponibile in una formulazione da 500 mg/5 mL, corrispondente a una concentrazione madre di 100 mg/mL. La formulazione è stata diluita con soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% per ottenere una concentrazione lavorativa finale di 0,06 mg/mL. La soluzione lavorativa è stata somministrata per gavaggio orale a un volume di 5 mL/kg, corrispondente a una dose di MTX di 0,3 mg/kg. Per ratti del peso di 200–220 g all'inizio dello studio, il volume giornaliero somministrato è variato da 1,00 a 1,10 mL per animale ed è stato calcolato singolarmente in base al peso corporeo registrato all'inizio dello studio. Il peso corporeo non è stato rilevato nuovamente durante il periodo di pretrattamento di 7 giorni con MTX. Il metotrexato è stato somministrato una volta al giorno per 7 giorni consecutivi (giorni dello studio 1–7), mentre il metanolo è stato somministrato al giorno 8 dello studio, al termine del protocollo di pretrattamento con MTX. Questo regime è stato conforme ai modelli di pretrattamento orale con MTX precedentemente pubblicati¹³.

Il metanolo (purezza ≥99,8%) è stato appena preparato nel giorno della somministrazione come soluzione acquosa lavorativa al 20% (v/v) mediante diluizione con acqua distillata sterile. La soluzione lavorativa è stata preparata mescolando 1 volume di metanolo con 4 volumi di acqua distillata sterile. In conformità ai modelli di ratti pretrattati con metotressato precedentemente descritti per l'intossicazione da metanolo, una singola dose di metanolo è stata somministrata ai gruppi 3–5 al giorno 8 dello studio a 3 g/kg per gavaggio orale. Non sono state imposte restrizioni di cibo o acqua prima della somministrazione del metanolo. Il volume richiesto per la somministrazione è stato calcolato singolarmente in base al peso corporeo di ciascun animale ed era di circa 18,9 mL/kg per la soluzione di metanolo al 20%. Per un ratto del peso di circa 220 g, questa dose corrispondeva a 0,66 g di metanolo e a un volume finale di gavaggio di circa 4,2 mL. Questo regime di esposizione al metanolo è stato scelto per mantenere la comparabilità con i modelli di ratti pretrattati con metotressato precedentemente pubblicati per la tossicità acuta da metanolo^13,14,15.

La soluzione lavorativa di fomepizolo è stata preparata in soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9%, con una concentrazione finale di 10 mg/mL. È stata somministrata una dose di carico intraperitoneale di 15 mg/kg, 4 ore dopo l'amministrazione del metanolo, seguita da dosi di mantenimento intraperitoneali di 10 mg/kg a 12, 24 e 36 ore. Alla concentrazione lavorativa di 10 mg/mL, i volumi di somministrazione erano di 1,5 mL/kg per la dose di carico e di 1,0 mL/kg per ciascuna dose di mantenimento. Per un ratto con un peso corporeo iniziale dello studio di circa 220 g, queste dosi corrispondevano approssimativamente a 0,33 mL per la dose di carico e a 0,22 mL per ciascuna dose di mantenimento. Tutti i volumi di somministrazione sono stati calcolati utilizzando il peso corporeo registrato all'inizio dello studio. Le dosi di carico e di mantenimento di fomepizolo sono state scelte in riferimento alle raccomandazioni stabilite per il trattamento dell'avvelenamento da metanolo^1,6.

L'etanolo è stato utilizzato come trattamento comparatore antidotico. L'etanolo assoluto (purezza ≥99,8%) è stato diluito con acqua distillata sterile mescolando 1 volume di etanolo assoluto con 4 volumi di acqua distillata sterile per ottenere una soluzione acquosa di lavoro al 20% (v/v). Una singola dose di etanolo è stata somministrata per gavaggio orale a 0,5 g/kg, 4 ore dopo la somministrazione di metanolo; non sono state somministrate dosi di mantenimento di etanolo. Il volume di somministrazione è stato di circa 3,2 mL/kg. Per un ratto con un peso corporeo iniziale dello studio di circa 220 g, ciò corrispondeva a un volume finale di gavaggio di circa 0,70 mL. Il volume di somministrazione è stato calcolato utilizzando il peso corporeo registrato all'inizio dello studio. La concentrazione di etanolo, la dose, la via e il momento della somministrazione sono stati scelti sulla base di modelli di ratti precedentemente pubblicati, pretrattati con metotressato e con utilizzo di etanolo come comparatore antidotico^13,14.

Tutte le soluzioni sono state preparate fresche nel giorno della somministrazione ed esaminate per verificare l'aspetto omogeneo e l'assenza di materiale particolato visibile. Le somministrazioni per via orale sono state effettuate utilizzando una cannula in acciaio inossidabile per gavaggio. Durante il gavaggio, la cannula è stata inserita con attenzione dalla cavità orale nell'esofago, evitando rigurgito, fuoriuscita orale, aspirazione e distress respiratorio. Le iniezioni intraperitoneali sono state eseguite in condizioni asettiche utilizzando siringhe e aghi sterili monouso. Tutte le procedure relative alla preparazione e alla somministrazione dei composti chimici sono state condotte in conformità con le normative istituzionali di sicurezza di laboratorio.

Animali sperimentali, condizioni di allevamento e randomizzazione
Un totale di 30 ratti albini Wistar maschi adulti, di età compresa tra 8 e 12 settimane e del peso di 220 ± 20 g, sono stati ottenuti dal Laboratorio di Ricerca sugli Animali Sperimentali dell'Università di Ahi Evran, Kırşehir, Turchia. I ratti Wistar sono stati scelti in quanto ampiamente utilizzati in studi sperimentali di tossicità e nefroprotezione, consentendo un confronto con studi precedentemente pubblicati. Gli animali sono stati allevati a 24 ± 2 °C in un ciclo luce/buio di 12 ore. Durante il periodo sperimentale di 10 giorni, è stato fornito loro cibo in pellet standard e acqua di rubinetto ad libitum. Prima delle procedure sperimentali, tutti gli animali hanno trascorso un periodo di ambientamento della durata di 7 giorni.

Trenta ratti sono stati assegnati a cinque gruppi sperimentali mediante un procedimento di assegnazione casuale assistito da computer, con un obiettivo di sei animali per gruppo. Per ogni ratto è stato generato un numero intero casuale compreso tra 1 e 5, e l'animale è stato assegnato al gruppo sperimentale corrispondente. Una volta che un gruppo raggiungeva sei animali, ogni estrazione successiva che indicava quel gruppo veniva scartata, e un nuovo numero casuale veniva generato finché non veniva selezionato un gruppo con una posizione disponibile. Questa procedura è proseguita fino a quando tutti e 30 i ratti non sono stati assegnati, ottenendo così 6 animali per gruppo. Lo stesso ricercatore ha generato le assegnazioni casuali e ha effettuato l'assegnamento; non è stato utilizzato un operatore di assegnamento separato. Il gruppo 1 (Controllo) non ha ricevuto alcun trattamento sperimentale con farmaci, e gli animali sono stati sottoposti allo stesso prelievo programmato all'endpoint degli altri gruppi. Il gruppo 2 (MTX) ha ricevuto metotressato per via orale alla dose di 0,3 mg/kg per 7 giorni. Il gruppo 3 (MTX + Metanolo) ha ricevuto metotressato per 7 giorni, seguito da metanolo alla dose di 3 g/kg all'ottavo giorno dello studio. Il gruppo 4 (MTX + Metanolo + Fomepizolo) ha ricevuto un pretrattamento con metotressato seguito da metanolo, con l'inizio del trattamento con 4-metilpirazolo 4 ore dopo. Il gruppo 5 (MTX + Metanolo + Etanolo) ha ricevuto un pretrattamento con metotressato seguito da metanolo, con somministrazione di etanolo 4 ore dopo.

Tutti e tre i gruppi esposti al metanolo hanno ricevuto lo stesso pretrattamento con MTX e lo stesso protocollo di somministrazione del metanolo, differendo soltanto per il trattamento antidotico post-esposizione. L'assegnazione sperimentale dei gruppi, il protocollo di somministrazione, i tempi del trattamento antidotico e il processo di raccolta dei campioni sono riassunti in Figura 1. È stata effettuata un’analisi a priori della potenza statistica per un’ANOVA a effetti fissi ad una via con cinque gruppi indipendenti. Assumendo una dimensione dell’effetto standardizzata elevata (f di Cohen = 0,70), un livello di significatività dello 0,05 e una potenza statistica dell’80%, la dimensione minima totale del campione richiesta è stata calcolata in 30 animali, corrispondenti a sei animali per gruppo. La potenza calcolata per una dimensione totale del campione di 30 animali era approssimativamente dell’80,9%. La dimensione dell’effetto assunta (f di Cohen = 0,70) è stata specificata prima dell’esperimento sulla base dell’aspettativa da parte dei ricercatori di un effetto complessivo elevato tra i gruppi in questo modello di tossicità acuta. Tale assunzione si basava sul giudizio dei ricercatori piuttosto che su una stima derivata da dati pilota o da uno studio precedente specifico. Nessun singolo risultato primario è stato designato a priori per questo studio; il calcolo della dimensione del campione si è basato sull’ipotesi di un effetto complessivo elevato in un confronto omnibus tra i cinque gruppi sperimentali. Un risultato primario non può essere designato retrospettivamente come endpoint specificato a priori. Di conseguenza, il calcolo della dimensione del campione non garantisce una potenza adeguata per ciascun singolo risultato né per i confronti a coppie.

Protocollo di intossicazione da metanolo e trattamento antidotico
Al termine del periodo di acclimatazione, gli animali dei gruppi 2–5 hanno ricevuto metotressato una volta al giorno per 7 giorni consecutivi (giorni dello studio 1–7). Al giorno 8 dello studio, gli animali dei gruppi 3–5 hanno ricevuto una singola dose di soluzione di metanolo al 20% pari a 3 g/kg per gavaggio orale. Non è stato previsto digiuno né altre restrizioni di cibo o acqua prima della somministrazione del metanolo.

Nel gruppo MTX + Metanolo + Fomepizolo, è stata somministrata una dose di carico intraperitoneale di 15 mg/kg 4 ore dopo l'amministrazione del metanolo, seguita da dosi di mantenimento intraperitoneali di 10 mg/kg a 12, 24 e 36 ore dall'amministrazione del metanolo. Nel gruppo MTX + Metanolo + Etanolo, è stata somministrata una singola dose di etanolo per gavaggio orale a 0,5 g/kg 4 ore dopo l'amministrazione del metanolo; non sono state somministrate dosi di mantenimento di etanolo. I due regimi antidotici sono stati scelti per rispecchiare le raccomandazioni consolidate per la dose di fomepizolo e protocolli comparativi con etanolo precedentemente pubblicati^1,6,13,14. I regimi non sono stati progettati per fornire un trattamento bilanciato per dose, via o esposizione. Pertanto, il regime ripetuto di fomepizolo per via intraperitoneale e la singola dose orale di etanolo costituivano un confronto farmacologico non equivalente. L'avvenuta somministrazione per gavaggio è stata confermata dall'assenza di rigurgito, perdite orali o distress respiratorio durante la procedura. L'avvenuta somministrazione intraperitoneale è stata confermata dall'assenza di perdite, emorragie o gonfiore marcato nel sito di iniezione.

Dopo la somministrazione, gli animali sono stati monitorati regolarmente per quanto riguarda lo stato di salute generale, mobilità, assunzione di cibo, postura, aspetto del pelo e segni di tossicità. Il programma di trattamento è stato progettato per consentire l'inizio della formazione di metaboliti tossici a partire dal metanolo, permettendo al contempo la valutazione degli effetti protettivi e terapeutici degli agenti antidotici.

Eutanasia, endpoint umani e raccolta dei campioni
Durante tutto l'esperimento, tutti gli animali sono stati valutati quotidianamente per quanto riguarda lo stato di salute generale, l'assunzione di cibo e acqua, la mobilità e i cambiamenti comportamentali. I criteri per l'endpoint umano erano predefiniti come letargia evidente, incapacità di assumere cibo o acqua, perdita di peso grave, mobilità ridotta, postura anomala, piloerezione persistente o segni evidenti di sofferenza. Gli animali che avessero soddisfatto uno qualsiasi di questi criteri sarebbero stati sottoposti a eutanasia umana. Tuttavia, nessun animale ha raggiunto i criteri predefiniti per l'endpoint umano durante lo studio.

Tutti gli animali nei cinque gruppi sperimentali sono stati soppressi al decimo giorno dello studio. Per i gruppi MTX + Metanolo, MTX + Metanolo + Fomepizolo e MTX + Metanolo + Etanolo, questo punto terminale corrispondeva a 48 h dopo la singola somministrazione di metanolo avvenuta all'ottavo giorno dello studio. Il gruppo di controllo è rimasto non trattato fino al decimo giorno dello studio, mentre il gruppo solo MTX è stato monitorato fino al decimo giorno successivamente al completamento del protocollo di somministrazione di MTX della durata di 7 giorni. Pertanto, tutti e cinque i gruppi hanno avuto la stessa durata totale dello studio e sono stati sottoposti a soppressione e raccolta dei campioni nello stesso giorno dello studio.

Ketamina e xilazina sono state utilizzate per indurre un’anestesia profonda. La profondità dell’anestesia è stata confermata dalla perdita del riflesso di ritrazione plantare. Dopo aver raggiunto l’anestesia profonda, sono stati prelevati campioni di sangue mediante puntura intracardiaca. Sono stati ottenuti circa 3–5 mL di sangue utilizzando una siringa e un ago adeguati. Il sangue raccolto per la misurazione delle concentrazioni sieriche di urea e creatinina, dell’attività della SOD sierica e della concentrazione di MDA sierica è stato trasferito in provette senza anticoagulante e lasciato coagulare completamente. Il sangue destinato alla misurazione del livello di GSH e dell’attività della CAT è stato raccolto separatamente in provette contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) ed elaborato senza fase di coagulazione. Dopo la completa formazione del coagulo, i campioni sierici sono stati centrifugati a 3.000 × g per 10–15 min a 4 °C. Il siero separato è stato conservato a −80 °C fino all’analisi. La corretta separazione del siero è stata confermata da un aspetto limpido e non emolizzato. Dopo il prelievo del sangue, l’eutanasia è stata completata mediante esanguinazione sotto anestesia profonda. È stata quindi eseguita una laparotomia mediana e entrambi i reni sono stati rimossi con attenzione. Dopo aver rimosso il tessuto adiposo e i tessuti connettivi circostanti, i reni sono stati risciacquati con soluzione fisiologica fredda. I campioni tissutali sono stati suddivisi per analisi istopatologiche e biochimiche. I campioni destinati all’esame istopatologico sono stati posti in formaldeide neutra tamponata al 10%. I campioni destinati alle analisi biochimiche sono stati opportunamente etichettati e conservati a −80 °C.

La raccolta dei campioni, le analisi biochimiche e le valutazioni degli esiti sono state effettuate da ricercatori ciechi rispetto ai gruppi sperimentali. Nessun animale è stato escluso dalle analisi.

Analisi biochimiche
La concentrazione di urea nel siero è stata misurata mediante un saggio cinetico enzimatico ureasi–glutammato deidrogenasi su un analizzatore biochimico automatico. L'urea è stata idrolizzata dall'ureasi per produrre ammoniaca, che successivamente ha reagito con il 2-ossoglutarato e la forma ridotta del nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) in presenza di glutammato deidrogenasi. La diminuzione dell'assorbanza risultante dal consumo di NADH è stata misurata in modo cinetico. La concentrazione di creatinina nel siero è stata determinata mediante metodo colorimetrico utilizzando lo stesso analizzatore biochimico automatico.

L'attività della superossido dismutasi (SOD) nel siero è stata determinata mediante un saggio colorimetrico basato sulla generazione di radicali superossido tramite il sistema xantina–xantina ossidasi e sulla loro reazione con il cloruro di 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolo per formare un prodotto colorato di formazano. L'assorbanza finale è stata misurata a 505 nm. La concentrazione di malondialdeide (MDA) nel siero è stata determinata utilizzando la reazione con l'acido tiobarbiturico. I campioni di siero sono stati mescolati con acido tricloroacetico freddo per precipitare le proteine ed è stata effettuata una centrifugazione a 7.500 × g per 5 min a 4 °C. Il soprannatante ottenuto è stato mescolato con un volume uguale di acido tiobarbiturico ed incubato a 90 °C per 60 min. I tubi della reazione sono stati quindi raffreddati in un bagno di acqua fredda per 10 min e l'assorbanza è stata misurata a 532 nm. Le concentrazioni di MDA sono state calcolate sulla base della curva di taratura corrispondente. Il glutatione ridotto (GSH) è stato misurato nel sangue anticoagulato con EDTA utilizzando un metodo di Ellman modificato. Dopo la precipitazione proteica con acido tricloroacetico, i campioni desproteinizzati sono stati fatti reagire con il 5,5′-ditiobis(2-nitrobenzoico) in tampone Tris 500 mM a pH 8,2 e l'assorbanza è stata misurata a 412 nm. L'attività della catalasi (CAT) è stata misurata nel sangue anticoagulato con EDTA mediante un saggio colorimetrico in due passaggi. I campioni sono stati incubati con una quantità nota di perossido di idrogeno e, dopo l'interruzione della reazione enzimatica, il perossido di idrogeno residuo è stato misurato utilizzando un reagente cromogeno a 405 nm.

Poiché l'attività della SOD e la concentrazione di MDA sono state misurate nel siero, mentre il livello di GSH e l'attività della CAT sono state misurate nel sangue anticoagulato con EDTA anziché negli omogenati di tessuto renale, la normalizzazione di questi parametri legati al redox rispetto alla concentrazione totale di proteine tissutali non era applicabile. Per l'interpretazione del profilo dei biomarcatori legati al redox, concentrazioni più elevate di MDA nel siero sono state considerate indicative di una maggiore perossidazione lipidica, mentre un'attività più bassa della SOD nel siero, livelli ridotti di GSH nel sangue e attività più bassa della CAT nel sangue sono stati considerati indicativi di una ridotta capacità antiossidante; variazioni in direzione opposta sono state interpretate come un profilo più favorevole dal punto di vista redox.

Per le misurazioni enzimatiche del tessuto renale mediante saggio immunoenzimatico (ELISA), circa 50 mg di tessuto renale conservato a −80 °C sono stati omogeneizzati sul ghiaccio in 500 µL di tampone di omogeneizzazione contenente un cocktail di inibitori delle proteasi, corrispondente a un rapporto fisso tessuto/tampone di 1:10 (p/v). È stato preparato un omogeneato specifico del tessuto renale per ciascun ratto. I campioni provenienti da animali diversi sono stati trattati separatamente e non sono stati mai raggruppati in alcuna fase. Gli omogeneati sono stati centrifugati a 14.000 × g per 10 minuti a 4 °C e il soprannatante ottenuto da ciascun animale è stato raccolto separatamente e suddiviso in aliquote per le analisi pianificate sul tessuto renale. La concentrazione totale di proteine non è stata misurata separatamente; pertanto, i risultati dell'ELISA su tessuto non sono stati normalizzati rispetto a questa. Le concentrazioni finali, calcolate a partire dalle curve standard specifiche per ciascun saggio, sono state espresse in ng/L per TNF-α e IL-6 e in ng/mL per IL-1β, KIM-1 e cistatina C.

La molecola-1 di danno renale (KIM-1) e la cistatina C sono state valutate come biomarcatori di danno renale, mentre il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l'interleuchina-6 (IL-6) e l'interleuchina-1β (IL-1β) sono stati valutati come marcatori infiammatori renali. Tutti e cinque gli analiti sono stati misurati in omogeneati di tessuto renale utilizzando kit ELISA specifici per ratto, seguendo i protocolli dei produttori. Per i rispettivi saggi, le sensibilità analitiche e i range di misurazione erano di 2,51 ng/L e 5–1.000 ng/L per TNF-α, 0,052 ng/L e 0,1–40 ng/L per IL-6, 0,08 ng/mL e 0,2–60 ng/mL per IL-1β, 0,01 ng/mL e 0,05–10 ng/mL per KIM-1, e 0,25 ng/mL e 0,5–100 ng/mL per cistatina C, rispettivamente. Prima dell'analisi, tutti i reagenti, i campioni standard e i supernatanti del tessuto renale sono stati portati a temperatura ambiente. Per ogni esecuzione del saggio, sono state generate curve standard separate seguendo le raccomandazioni del produttore. Standard e supernatanti del tessuto renale sono stati aggiunti a pozzetti rivestiti con anticorpi, seguiti dall'anticorpo di rilevamento biotinilato corrispondente e dal coniugato streptavidina-perossidasi. Campioni e reagenti ELISA sono stati incubati per 1 ora a 37 °C. Dopo cinque cicli di lavaggio effettuati con un lavatore automatizzato di micropiastre, sono state aggiunte le soluzioni di substrato A e B, che sono state incubate per 10 minuti a 37 °C. La reazione cromogenica è stata arrestata mediante una soluzione acida di arresto, e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm. Per ciascun analita, i valori di assorbanza corretti per il bianco sono stati convertiti in concentrazioni utilizzando la curva standard specifica per il saggio corrispondente.

Tutte le analisi biochimiche sono state eseguite in condizioni standardizzate e tutti i campioni sono stati processati utilizzando le stesse procedure. Le misurazioni ELISA su tessuto renale sono state effettuate in duplicato. Per ogni analita, la media dei due pozzetti replicati tecnici è stata calcolata per ottenere un singolo valore a livello di animale. I pozzetti replicati tecnici e gli aliquote separati ottenuti dallo stesso omogeneato specifico per animale non sono stati considerati osservazioni indipendenti. L'animale singolo è stato considerato l'unità sperimentale e un risultato per animale per ciascun parametro è stato incluso nell'analisi statistica.

Elaborazione istopatologica e valutazione del danno renale
I campioni di tessuto sono stati preparati per l'analisi microscopica seguendo procedure istopatologiche standard. I tessuti renali sono stati fissati in formaldeide al 10% neutra tamponata a temperatura ambiente per 72 h. Dopo la fissazione, i tessuti sono stati disidratati mediante concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 80%, 96% e 100%), mantenendo ciascuna concentrazione per 1 h. Successivamente, i tessuti sono stati chiarificati mediante un procedimento in due fasi con xilolo ed inclusi in blocchi di paraffina. Sezioni di spessore pari a 5 µm sono state ottenute dai blocchi di paraffina utilizzando un microtomo rotativo.

Per la colorazione con ematossilina ed eosina, i campioni sono stati disparaffinati e reidratati, quindi colorati con ematossilina per 5 min e lavati sotto acqua corrente per 5 min. La differenziazione è stata eseguita utilizzando alcol acido, dopodiché i campioni sono stati mantenuti in acqua ammoniacale per 1 min. Successivamente, i campioni sono stati controcolorati con eosina per 2 min. In seguito, i campioni sono stati disidratati mediante una serie crescente di alcoli, chiarificati nello xilene e montati con un adeguato mezzo di montaggio.

Per la colorazione tricromatica di Masson, le sezioni sono state disparaffinate e reidratate, quindi incubate in una soluzione mordente a 56 °C per 60 minuti e lavate sotto acqua corrente per 10 minuti. Le sezioni sono state quindi trattate in sequenza con ematossilina ferrea di Weigert per 10 minuti, scarlatto Biebrich-fucsina acida per 15 minuti, acido fosfotungstico per 10 minuti e blu di anilina per 10 minuti. Infine, le sezioni sono state mantenute in acido acetico al 1% per 5 minuti, disidratate, chiarificate in xilene e montate.

La corretta colorazione è stata confermata da una marcata colorazione nucleare, un contrasto citoplasmatico preservato, il mantenimento dell'architettura renale e una chiara visualizzazione delle strutture del tessuto connettivo. Tutti i vetrini colorati sono stati valutati in condizioni standardizzate mediante microscopio ottico dotato di sistema di acquisizione digitale delle immagini.

Le valutazioni istopatologiche sono state effettuate da un singolo patologo esperto, in cecità rispetto ai gruppi sperimentali. Il punteggio istopatologico è stato assegnato a un ingrandimento di 200×. Per ogni animale e per ciascun parametro istopatologico, sono stati esaminati 10 campi microscopici selezionati casualmente. Il campo che mostrava l'alterazione più grave per il parametro in esame è stato utilizzato per assegnare al singolo animale un punteggio intero compreso nella scala da 0 a 4. Il danno tubulare è stato valutato in base alla dilatazione tubulare, all'accumulo di materiale proteico nella lume tubulare, alla degenerazione dell'epitelio tubulare e alla necrosi tubulare. Il danno glomerulare è stato valutato in base alla degenerazione o atrofia glomerulare, all'ingrandimento dello spazio di Bowman e alla congestione vascolare. Il danno interstiziale è stato valutato sulla base dell'infiammazione e della fibrosi interstiziale. Per la valutazione istopatologica sono state utilizzate sezioni renali di cinque micrometri di spessore, colorate con ematossilina-eosina e con la tricromia di Masson, prelevate da ciascun animale. Fotomicrografie rappresentative sono state ottenute a un ingrandimento di 200×, con barre della scala che indicano 100 µm. Il numero di sezioni istologiche distinte esaminate per ciascun animale non è stato possibile recuperarlo dai documenti dello studio e pertanto non può essere riportato.

I risultati della colorazione tricromica di Masson sono stati interpretati in modo istomorfologico, considerando la localizzazione e il modello morfologico del deposito di collagene piuttosto che l'intensità della colorazione blu da sola. Il punteggio semiquantitativo della fibrosi interstiziale si basava su questa valutazione istomorfologica, e la percentuale di area positiva al collagene non è stata quantificata. La valutazione istopatologica è stata effettuata in modo semiquantitativo utilizzando criteri di valutazione del danno renale precedentemente descritti^16,17. A ciascun animale è stato assegnato un punteggio intero per ciascun parametro istopatologico su una scala da 0 a 4, dove 0 = assente, 1 = minimo, 2 = lieve, 3 = moderato e 4 = grave. Le categorie di valutazione rappresentavano la valutazione complessiva, in cieco, del patologo riguardo alla gravità morfologica di ciascuna lesione piuttosto che una misurazione morfometrica continua.

Precauzioni di sicurezza e gestione dei rifiuti
È stato utilizzato un idoneo equipaggiamento di protezione individuale durante la manipolazione di metanolo, formaldeide, xilene, campioni biologici e tessuti animali. Sono stati indossati camici da laboratorio, guanti e protezioni per gli occhi. A causa della tossicità sistemica e della volatilità del metanolo, tutte le operazioni sono state eseguite con cautela. Le procedure che coinvolgono formaldeide e xilene sono state effettuate sotto cappa chimica ogni volta che possibile. Gli oggetti taglienti sono stati raccolti in appositi contenitori per rifiuti taglienti. I rifiuti chimici e i materiali biologici sono stati smaltiti in conformità alle procedure istituzionali di sicurezza biologica e di gestione dei rifiuti pericolosi.

Analisi statistica
Le variabili continue relative a parametri biochimici, biomarcatori del danno renale, infiammazione, funzione renale e redox sono state espresse come media ± deviazione standard (media ± DS). La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata mediante il test di Shapiro–Wilk, mentre l'omogeneità delle varianze è stata verificata con il test di Levene. I confronti tra i gruppi per gli esiti biochimici sono stati effettuati utilizzando l'analisi della varianza ad un fattore (ANOVA). I controlli delle assunzioni hanno evidenziato scostamenti dalla normalità in un gruppo per la creatinina sierica e eterogeneità della varianza per diversi esiti biochimici. L'approccio ANOVA originale è stato mantenuto; tuttavia, tali scostamenti potrebbero aver influenzato l'affidabilità dei valori p- ottenuti, pertanto i risultati sono stati interpretati con cautela.

Quando un'analisì della varianza (ANOVA) ha rivelato una differenza statisticamente significativa, sono stati effettuati confronti a coppie tra i gruppi mediante il test post hoc di Duncan per il confronto multiplo. I valori che presentano la stessa lettera apice all'interno di ogni riga non differiscono in modo significativo secondo il test post hoc di Duncan. Non è stata applicata alcuna ulteriore correzione per la molteplicità dei risultati biochimici. La procedura di Duncan non garantisce un controllo rigoroso del tasso di errore di tipo I per famiglia, e il test di più risultati aumenta ulteriormente il rischio di risultati falsamente positivi. Pertanto, i singoli confronti significativi sono stati interpretati con cautela.

Le dimensioni dell'effetto complessive per gli esiti biochimici sono state stimate utilizzando l'eta-quadrato (η²), calcolato come (F × df_between)/(F × df_between + df_error), con df_between = 4 e df_error = 25. Gli intervalli di confidenza bilaterali al 95% sono stati calcolati invertendo la distribuzione F non centrale e trasformando i limiti di non centralità (λ) mediante λ/(λ + N), dove N = 30. Questi calcoli supplementari sono stati eseguiti utilizzando un ambiente di calcolo scientifico. Le stime sono state derivate dalle statistiche F arrotondate ottenute dall'analisi statistica primaria e pertanto sono approssimative. Gli intervalli di confidenza si basavano sulle assunzioni di normalità e di varianza uguale del modello ANOVA e non sono stati corretti per multipli esiti.

I punteggi istopatologici erano osservazioni ordinali e semiquantitative, riassunti descrittivamente come media ± DS per mostrare il carico medio delle lesioni a livello di gruppo e la variabilità tra gli animali. Non sono stati effettuati test inferenziali di ipotesi né confronti a coppie post hoc per i punteggi istopatologici. Pertanto, l'ANOVA, il test post hoc di Duncan e la segnalazione del valore p sono stati applicati soltanto ai risultati relativi a biomarcatori biochimici di danno renale, infiammazione, funzione renale e parametri legati allo stato redox. Un valore p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

All 30 animals were included in the analyses, with six animals in each of the five experimental groups. All animals in the five groups were euthanized and sampled on study day 10. For the three methanol-exposed groups, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Therefore, the total study duration and sample collection time were consistent across all experimental groups. Renal injury and inflammatory biomarkers, renal function and redox-related parameters, and histopathological findings were evaluated as described below.

Biochemical findings: renal injury and inflammatory biomarkers
The findings for renal injury and inflammatory biomarkers measured in kidney tissue homogenates are presented in Table 1. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in cystatin C [F(4,25) = 5.329, p = 0.003], IL-6 [F(4,25) = 3.907, p = 0.013], KIM-1 [F(4,25) = 3.673, p = 0.017], TNF-α [F(4,25) = 7.660, p < 0.001], and IL-1β [F(4,25) = 11.584, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 1. Kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, and KIM-1 were highest in the MTX + Methanol group, whereas no significant differences were observed among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups for these variables. Kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β were also highest in the MTX + Methanol group. The MTX-only group showed higher levels of TNF-α and IL-1β in kidney tissue homogenates than the Control group, whereas the antidote-treated groups showed intermediate values (Table 1).

Renal function and redox-related parameters
Serum renal function indices and blood-derived redox-related parameters were presented in Table 2. One-way ANOVA indicated significant overall differences among the five groups in serum urea [F(4,25) = 3.694, p = 0.017], serum creatinine [F(4,25) = 12.988, p < 0.001], serum SOD activity [F(4,25) = 11.621, p < 0.001], blood GSH level [F(4,25) = 10.164, p < 0.001], blood CAT activity [F(4,25) = 10.631, p < 0.001], and serum MDA concentration [F(4,25) = 8.814, p < 0.001]. Post hoc group comparisons were performed using Duncan’s multiple range test, with group assignments indicated by superscript letters in Table 2.

Serum urea, serum creatinine, and serum MDA concentrations were highest in the MTX + Methanol group. Serum urea and serum MDA concentrations did not differ significantly among the Control, MTX-only, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups, whereas serum creatinine was lowest in the Control group (Table 2).

The MTX + Methanol group also showed the lowest serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity. Compared with the MTX + Methanol group, the fomepizole-treated group showed significantly higher serum SOD and blood CAT activities, whereas the corresponding increases in the ethanol-treated group were not statistically significant. Blood GSH levels did not differ significantly among the MTX-only, MTX + Methanol, and two antidote-treated groups (Table 2).

Compared with the Control group, the MTX-only group showed higher kidney tissue homogenate levels of TNF-α and IL-1β and lower serum SOD activity, blood GSH level, and blood CAT activity but did not differ significantly in kidney tissue homogenate levels of cystatin C, IL-6, or KIM-1 or in serum urea, serum creatinine, or serum MDA concentration.

Histopathological findings and renal injury scores
The results of the histopathological evaluation of renal tissues were presented in Table 3. Descriptive variation among the groups was observed in tubular dilatation, accumulation of proteinaceous material, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

In the Control group, renal tissue preserved normal histological architecture, with no evident pathological alterations in the glomerular or tubular structures. In the MTX group, mild tubular degeneration, vascular congestion, and interstitial inflammation were observed.

The MTX + Methanol group showed the highest observed injury scores across the evaluated tubular, glomerular, vascular, and interstitial parameters. Both antidote-treated groups showed descriptively lower observed scores than the MTX + Methanol group. In descriptive comparisons, the fomepizole-treated group showed lower observed scores than the ethanol-treated group for most parameters, particularly tubular dilatation, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, and interstitial fibrosis (Table 3). These comparisons were descriptive, and no inferential statistical tests were performed on the histopathological scores. Representative renal histopathological images obtained using hematoxylin and eosin and Masson’s trichrome staining are shown in Figure 2.

Overall, the MTX + Methanol group showed the highest renal injury and inflammatory biomarker values, the least favorable renal function and redox profiles, and the highest histopathological injury scores. Both antidote-treated groups showed more favorable renal outcome patterns than the MTX + Methanol group, with the fomepizole-treated group showing a more consistently favorable pattern across the evaluated domains. The MTX-only group also showed changes in selected inflammatory and redox-related parameters relative to the Control group.

DATA AVAILABILITY:
The animal-level raw data supporting the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, renal function, and redox-related analyses are provided in Supplementary File 1.

Figure 1: Experimental design and treatment timeline. Schematic representation of the experimental rat model of methanol intoxication. Adult male Wistar albino rats were assigned to five groups: Control, methotrexate (MTX) only, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol (n = 6/group). Standard pellet chow and tap water were available ad libitum throughout the 10-day study, and no fasting or other food or water restrictions were imposed before or after methanol administration. The Control group received no experimental treatment. Animals in Groups 2–5 received MTX by oral gavage at 0.3 mg/kg once daily for seven consecutive days (study days 1–7). Animals in Groups 3–5 received a single dose of methanol at 3 g/kg by oral gavage on study day 8. In the MTX + Methanol + Fomepizole group, an intraperitoneal loading dose of fomepizole at 15 mg/kg was administered 4 h after methanol administration, followed by maintenance doses of 10 mg/kg at 12, 24, and 36 h. In the MTX + Methanol + Ethanol group, ethanol was administered as a single dose of 0.5 g/kg by oral gavage 4 h after methanol administration. All animals were euthanized on study day 10. For Groups 3–5, this endpoint corresponded to 48 h after methanol administration. Blood and kidney samples were collected for analyses of renal function, renal injury biomarkers, inflammatory cytokines, redox-related biomarkers, and renal histopathology. Abbreviations: MTX = methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2: Representative histopathological findings in renal tissue from experimental groups. Representative kidney sections from the Control, MTX, MTX + Methanol, MTX + Methanol + Fomepizole, and MTX + Methanol + Ethanol groups are shown. The upper row presents hematoxylin and eosin (H&E) staining, whereas the lower row presents Masson’s trichrome staining. The Control group exhibited preserved renal architecture with normal glomerular and tubular morphology. The blue-stained collagen observed in the glomerular and tubular basement membranes, vascular walls, and interstitial connective tissue of the Control group was considered physiological collagen rather than evidence of pathological fibrosis. The MTX group showed mild tubular degeneration, vascular congestion, and inflammatory changes. The MTX + Methanol group exhibited more pronounced renal injury, characterized by tubular degeneration (*), vascular congestion (+), widening of Bowman’s space (x), tubular necrosis (↑), interstitial inflammation (↕), and periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change (‡), as observed in the Masson’s trichrome-stained section. The Fomepizole-treated group showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group, with relatively preserved tubular and glomerular structures and less extensive necrosis, inflammation, vascular congestion, and collagen-associated changes. The Ethanol-treated group also showed lower histopathological injury scores than the MTX + Methanol group; however, residual tubular, glomerular, and vascular alterations were more apparent than in the Fomepizole-treated group. Photomicrographs were obtained at 200× magnification, and scale bars represent 100 µm. Masson’s trichrome staining was evaluated as supportive histomorphological evidence; differences in the intensity of blue staining among the panels were not used as a quantitative measure for intergroup comparison of fibrosis. Symbols: * tubular degeneration; + vascular congestion; x widening of Bowman’s space; ↑ tubular necrosis; ↕ interstitial inflammation; ‡ periglomerular collagen accumulation consistent with a histomorphological fibrotic change. MTX, methotrexate. Please click here to view a larger version of this figure.

Variable	Control (n = 6)	MTX (n = 6)	MTX + Methanol (n = 6)	MTX + Methanol + Fomepizole (n = 6)	MTX + Methanol + Ethanol (n = 6)	p	η² (95% CI)
Cystatin C (ng/mL)	26.07 ± 12.05a	32.01 ± 1.86a	45.23 ± 10.51b	32.49 ± 1.60a	31.27 ± 4.60a	0.003	0.460 (0.084 – 0.597)
IL-6 (ng/L)	7.66 ± 1.38a	8.72 ± 2.45a	11.02 ± 0.83b	7.96 ± 1.54a	8.12 ± 1.77a	0.013	0.385 (0.023 – 0.535)
KIM-1 (ng/mL)	2.21 ± 1.00a	2.47 ± 0.24a	3.45 ± 0.81b	2.28 ± 0.58a	2.32 ± 0.37a	0.017	0.370 (0.013 – 0.522)
TNF-α (ng/L)	118.66 ± 22.95a	190.51 ± 5.84b	238.29 ± 34.68c	147.10 ± 24.31ab	168.41 ± 75.41ab	<0.001	0.551 (0.181 – 0.668)
IL-1β (ng/mL)	8.43 ± 0.59a	12.53 ± 1.05c	15.26 ± 1.46d	10.05 ± 2.86ab	11.17 ± 2.37bc	<0.001	0.650 (0.316 – 0.743)

Table 1: Renal injury and inflammatory biomarkers in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. All biomarkers were measured in kidney tissue homogenates. Cystatin C, KIM-1, and IL-1β concentrations are expressed in ng/mL; IL-6 and TNF-α concentrations are expressed in ng/L. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified among some biomarkers; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted with caution. Abbreviations: MTX = methotrexate; KIM-1 = kidney injury molecule-1; IL-6 = interleukin-6; TNF-α = tumor necrosis factor-alpha; IL-1β = interleukin-1 beta; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol	p	η² (95% CI)
Serum urea (mg/dL)	39.64 ± 13.69a	46.88 ± 9.49a	98.75 ± 59.24b	48.03 ± 19.64a	60.44 ± 18.53a	0.017	0.371 (0.014–0.523)
Serum creatinine (mg/dL)	0.50 ± 0.10a	0.54 ± 0.05ab	0.72 ± 0.03c	0.54 ± 0.03ab	0.60 ± 0.05b	<0.001	0.675 (0.356–0.762)
Serum SOD activity (U/mL)	470.40 ± 40.49d	371.16 ± 17.64c	219.29 ± 85.06a	319.38 ± 107.20bc	256.22 ± 67.89ab	<0.001	0.650 (0.317–0.743)
Blood GSH (mmol/L)	58.74 ± 31.90b	26.36 ± 5.92a	11.10 ± 3.73a	19.56 ± 1.66a	13.66 ± 5.32a	<0.001	0.619 (0.272–0.720)
Blood CAT activity (U/mL)	220.82 ± 74.08c	160.88 ± 55.18b	68.90 ± 13.41a	129.45 ± 7.49b	110.14 ± 20.18ab	<0.001	0.630 (0.287–0.728)
Serum MDA (nmol/mL)	13.17 ± 2.03a	17.29 ± 6.36a	31.83 ± 9.94b	17.93 ± 2.04a	19.34 ± 4.65a	<0.001	0.585 (0.225–0.694)

Table 2: Renal function and redox-related parameters in experimental groups. Data are presented as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Serum urea, serum creatinine, superoxide dismutase (SOD) activity, and malondialdehyde (MDA) concentration were measured in serum, whereas reduced glutathione (GSH) level and catalase (CAT) activity were measured in blood anticoagulated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). Serum urea and creatinine concentrations are expressed in mg/dL, SOD and CAT activities in U/mL, GSH levels in mmol/L, and MDA concentrations in nmol/mL. Reported p values are from omnibus one-way analysis of variance (ANOVA) across the five groups. Following a significant omnibus test, post hoc comparisons were performed using Duncan’s multiple range test. Within each row, groups sharing at least one superscript letter do not differ significantly, whereas groups with no letter in common differ significantly at the 0.05 level. No additional multiplicity adjustment was applied across biomarkers. Variance heterogeneity was identified for some outcomes; therefore, the ANOVA and Duncan results should be interpreted cautiously. The redox-related biomarkers are indirect indicators and do not constitute direct measurements of mitochondrial function or molecular mechanisms of injury. η² represents the overall effect size across the five groups. The two-sided 95% confidence intervals are model-based, assume normally distributed errors with equal variances, and are not adjusted for multiple outcomes. Therefore, the confidence intervals should be interpreted cautiously where these assumptions are violated. Abbreviations: MTX = methotrexate; SOD = superoxide dismutase; GSH = reduced glutathione; CAT = catalase; MDA = malondialdehyde; EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid; SD = standard deviation; ANOVA = analysis of variance; CI = confidence interval.

Variable	Control	MTX	MTX + Methanol	MTX + Methanol  + Fomepizole	MTX + Methanol + Ethanol
Tubular dilatation	0.16 ± 0.40	1.50 ± 0.54	3.50 ± 0.54	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Proteinaceous material accumulation	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.33 ± 0.51
Tubular epithelial degeneration	0.16 ± 0.40	1.83 ± 0.40	3.83 ± 0.40	1.00 ± 0.00	2.00 ± 0.00
Tubular necrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.33 ± 0.51	0.83 ± 0.40	1.33 ± 0.51
Glomerular degeneration	0.16 ± 0.40	1.33 ± 0.51	3.33 ± 0.51	1.00 ± 0.00	1.66 ± 0.51
Bowman's space enlargement	0.00 ± 0.00	1.16 ± 0.40	3.00 ± 0.00	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Vascular congestion	0.00 ± 0.00	1.33 ± 0.51	3.16 ± 0.40	0.83 ± 0.40	1.66 ± 0.51
Interstitial inflammation	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	3.00 ± 0.63	0.83 ± 0.40	1.16 ± 0.40
Interstitial fibrosis	0.00 ± 0.00	1.00 ± 0.00	2.83 ± 0.40	0.66 ± 0.51	1.16 ± 0.40

Table 3: Descriptive histopathological scores in experimental groups. Data are presented descriptively as mean ± standard deviation (SD), with six animals per group. Histopathological scores were obtained from kidney sections stained with hematoxylin and eosin (H&E) and Masson’s trichrome; the scores are dimensionless. Each animal was assigned one integer score for each histopathological parameter on a scale of 0–4, where 0 = absent, 1 = minimal, 2 = mild, 3 = moderate, and 4 = severe. The decimal values presented in the table represent the arithmetic means of the individual integer scores obtained from the six animals in each experimental group and do not represent scores assigned to individual animals or a continuous scoring system. The standard deviations represent between-animal variability within each group. No inferential statistical testing or post hoc pairwise comparisons were performed on the histopathological scores; therefore, the observed between-group patterns should be interpreted descriptively rather than as statistically significant differences. Histopathological evaluation included tubular dilatation, proteinaceous material accumulation, tubular epithelial degeneration, tubular necrosis, glomerular degeneration, enlargement of Bowman’s space, vascular congestion, interstitial inflammation, and interstitial fibrosis.

Supplementary File 1: Raw data supporting the biochemical analyses. This spreadsheet contains the animal-level raw values used for the biochemical, renal injury biomarker, inflammatory, and redox-related analyses reported in the manuscript. Please click here to download this file.

Discussione

Il risultato principale di questo studio è stato che il gruppo MTX + Metanolo ha mostrato il profilo di danno renale più sfavorevole in termini funzionali, infiammatori, legati allo stato redox e istopatologici. Questo gruppo ha presentato i valori più elevati di urea sierica, creatinina sierica, cistatina C renale, KIM-1, TNF-α, IL-6, IL-1β e MDA, nonché i livelli più bassi di attività della SOD, livelli di GSH e attività della CAT, insieme ai punteggi di danno istopatologico più alti osservati. Entrambi i gruppi trattati con antidoti hanno mostrato un andamento renale più favorevole rispetto al gruppo MTX + Metanolo, con il gruppo trattato con fomepizolo che ha evidenziato un profilo più costantemente positivo nei diversi parametri valutati. Tuttavia, questi risultati sono stati ottenuti in un modello acuto di ratto pretrattato con MTX, utilizzando regimi di antidoto non equivalenti: somministrazione intraperitoneale ripetuta di fomepizolo rispetto a una singola dose orale di etanolo. Queste differenze nella via di somministrazione e nella frequenza del dosaggio limitano il confronto diretto dell'efficacia nefroprotettiva, e gli andamenti osservati non dimostrano la superiorità del fomepizolo rispetto all'etanolo. Il gruppo MTX-only ha mostrato livelli più elevati di TNF-α e IL-1β e attività della SOD, livelli di GSH e attività della CAT più bassi rispetto al gruppo Controllo, mentre i livelli renali di cistatina C, IL-6, KIM-1, urea sierica, creatinina sierica e MDA sono rimasti statisticamente comparabili tra i gruppi. Questo andamento ha indicato che il pretrattamento con MTX ha contribuito al profilo infiammatorio e redox di base. Di conseguenza, le ulteriori alterazioni osservate nel gruppo MTX + Metanolo si sono verificate su un background pretrattato con MTX e non possono essere attribuite esclusivamente al metanolo. Poiché non è stato incluso un gruppo con solo metanolo, il contributo indipendente del metanolo e le potenziali interazioni tra MTX e metanolo non sono potuti essere completamente distinti.

Sulla base della tossicologia consolidata del metanolo, l'accumulo di metaboliti tossici rappresentava un fattore plausibile che contribuiva al danno renale. Il metanolo viene metabolizzato principalmente nel fegato dall'ADH in formaldeide e successivamente in acido formico^1,3,18,19,20. Il rene potrebbe quindi essere stato interessato principalmente dal formiato circolante e dalle conseguenti alterazioni metaboliche sistemiche, piuttosto che da un intenso metabolismo locale del metanolo. Tuttavia, non si poteva escludere un contributo del metabolismo dell'alcol o dell'aldeide nei tessuti renali, poiché non sono state misurate le concentrazioni di metanolo, formaldeide e formiato, né l'attività renale dell'ADH. L'acido formico inibisce la citocromo c ossidasi mitocondriale, compromettendo così la fosforilazione ossidativa, riducendo la produzione di ATP e inducendo un'ipossia istotossica; questo processo può portare ad acidosi lattica, aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno e danni alla membrana^1,2,3,19,20. Rispetto al fegato, principale sede del metabolismo del metanolo, il rene potrebbe essere particolarmente suscettibile agli effetti tardivi del formiato e delle alterazioni metaboliche sistemiche. Le cellule epiteliali dei tubuli contorti prossimali hanno elevati fabbisogni energetici e sono particolarmente vulnerabili alla disfunzione mitocondriale, allo stress ossidativo e al danno microcircolatorio. Di conseguenza, l'ipossia mediata dal formiato, l'acidosi metabolica e l'infiammazione potrebbero contribuire al danno renale^{2,8,9,21,22,23}. Studi clinici che hanno evidenziato associazioni tra danno renale acuto e acidosi metabolica, insufficienza respiratoria, rabdomiolisi, sepsi e disfunzione multiorgano hanno suggerito che il danno renale potrebbe riflettere il carico tossico sistemico^8,9,10,21. La più rapida ossidazione del formiato dipendente dal folato nei ratti rispetto agli esseri umani rappresentava una limitazione importante dei modelli sperimentali^1,11,12. Pertanto, il pretrattamento con metotressato è stato utilizzato per ridurre l'eliminazione del formiato e aumentare la suscettibilità alla tossicità del metanolo, piuttosto che riprodurre completamente le caratteristiche cliniche e metaboliche dell'avvelenamento da metanolo nell'uomo.

La disfunzione renale è stata dimostrata attraverso la valutazione combinata di parametri biochimici convenzionali e biomarcatori di danno renale. L'aumento delle concentrazioni sieriche di urea e creatinina nel gruppo MTX + Methanol ha indicato un'alterata capacità di filtrazione ed escrezione renale. L'aumento dei livelli renali di cistatina C e KIM-1 ha suggerito che al danno funzionale si accompagnasse un danno tubulare. Considerata l'associazione tra KIM-1 e danno tubulare prossimale, tale incremento era coerente con degenerazione, dilatazione e necrosi dell'epitelio tubulare^24,25. L'aumento dei livelli di cistatina C ha ulteriormente confermato la presenza di una funzionalità renale compromessa^26,27. I livelli più bassi di questi biomarcatori nei gruppi trattati con fomepizolo ed etanolo hanno indicato un'attenuazione del danno renale, con un andamento più costantemente favorevole osservato nel gruppo trattato con fomepizolo. Il profilo dei biomarcatori legati al redox era compatibile con lo stress ossidativo come possibile fattore contributivo al danno renale, piuttosto che con prove di un meccanismo confermato. L'MDA è comunemente utilizzato come indice di perossidazione lipidica, mentre il GSH contribuisce al mantenimento dell'omeostasi redox cellulare^28,29. In modelli sperimentali di intossicazione da metanolo e di neuropatia ottica associata al metanolo, lo stress ossidativo, la perossidazione lipidica e la ridotta capacità antiossidante sono stati anch'essi associati a danno tissutale^10,15,20. L'attività sierica ridotta della SOD, concentrazioni sieriche elevate di MDA e livelli ematici più bassi di GSH e attività della CAT nel gruppo MTX + Methanol erano coerenti con una ridotta capacità antiossidante e un aumento della perossidazione lipidica; tuttavia, queste misurazioni non hanno stabilito un meccanismo mitocondriale o molecolare sottostante. Concentrazioni sieriche più basse di MDA e un parziale recupero dell'attività sierica della SOD e della CAT ematica nei gruppi trattati con antidoto erano compatibili con un profilo più favorevole dei biomarcatori legati al redox, con un andamento più costantemente positivo osservato nel gruppo trattato con fomepizolo.

Valori più elevati di TNF-α, IL-6 e IL-1β nel gruppo MTX + Metanolo erano coerenti con un profilo renale proinfiammatorio. Poiché queste citochine non erano specifiche per un particolare percorso metabolico e lo stesso MTX era associato a modifiche di alcuni marcatori infiammatori selezionati, i risultati supportavano l'infiammazione come un possibile fattore contribuente piuttosto che un meccanismo confermato di danno renale. La disfunzione mitocondriale mediata dall'acido formico, l'ipossia cellulare e lo stress ossidativo potrebbero costituire la base per l'attivazione di percorsi infiammatori; pertanto, lo stress ossidativo e l'infiammazione potrebbero progredire come processi reciprocamente rinforzanti nella tossicità da metanolo^1,2,3,15. Modelli sperimentali di intossicazione da metanolo hanno riportato associazioni tra l'esposizione al metanolo e l'infiltrazione di cellule infiammatorie, danni istopatologici e livelli aumentati di marcatori proinfiammatori come IL-1β e TNF-α^13,15. Questi risultati erano coerenti con i livelli aumentati di citochine proinfiammatorie e con punteggi più elevati per l'infiammazione interstiziale, la degenerazione tubulare e la necrosi tubulare osservati nel gruppo MTX + Metanolo. Nel complesso, i risultati erano compatibili con un processo multifattoriale che coinvolge gli effetti dei metaboliti tossici, lo stress ossidativo, l'infiammazione, il danno alla microcircolazione e il carico tossico sistemico; tuttavia, questi percorsi non sono stati valutati direttamente. Livelli più bassi di TNF-α, IL-6 e IL-1β nei gruppi trattati con antidoto suggerivano che l'inibizione della formazione di metaboliti tossici potesse aver limitato anche la risposta infiammatoria. I reperti istopatologici hanno fornito correlati tissutali del danno renale, con il gruppo MTX + Metanolo che mostrava i punteggi di danno più elevati osservati per i parametri tubulari, glomerulari, vascolari e interstiziali. Entrambi i gruppi trattati con antidoto mostravano punteggi di danno istopatologico descrittivamente più bassi, e il gruppo trattato con fomepizolo mostrava punteggi descrittivamente inferiori rispetto al gruppo trattato con etanolo per la maggior parte dei parametri. Tuttavia, poiché non è stato effettuato alcun test statistico inferenziale sui punteggi istopatologici, queste osservazioni non hanno dimostrato una protezione istopatologica statisticamente significativa né la superiorità di uno dei due antidoti^16,17.

Gli effetti antidotici dell'etanolo e della fomepizolo nell'intossicazione da metanolo si basano sull'inibizione del metabolismo mediato dal deidrogenasi alcolico, riducendo così la formazione di formaldeide e acido formico. L'etanolo agisce come substrato competitivo, mentre la fomepizolo funziona come inibitore diretto e potente del deidrogenasi alcolico^{1,3,4,6,7,30,31,32}. I modelli di esito renale più favorevoli osservati in entrambi i gruppi trattati con antidoti erano compatibili con gli effetti attesi dell'inibizione del deidrogenasi alcolico. Tuttavia, la letteratura attuale non dimostra una superiorità clinica definitiva della fomepizolo rispetto all'etanolo. Sebbene la fomepizolo sia spesso preferita per la maggiore semplicità di somministrazione, la farmacocinetica prevedibile e un profilo di effetti avversi più basso, l'etanolo rimane un'alternativa efficace^{1,3,4,6,7,30,32}. Nei dati relativi a intossicazioni massive da metanolo riportati da Zakharov et al., non è stata osservata una differenza chiara tra i due antidoti in termini di mortalità, durata della terapia intensiva o necessità di dialisi; pertanto, interpretazioni riguardo a una superiorità clinica devono essere formulate con cautela⁵. Nessuna differenza diretta statisticamente significativa tra i gruppi trattati con fomepizolo ed etanolo è stata identificata per gli esiti biochimici mediante il test post hoc di Duncan. Inoltre, la fomepizolo è stata somministrata in dosi ripetute, mentre l'etanolo è stato somministrato in un'unica dose. I regimi non erano equivalenti per via di somministrazione, frequenza di dosaggio o esposizione sistemica. Di conseguenza, il modello descrittivamente più favorevole associato alla fomepizolo potrebbe riflettere differenze nel programma di somministrazione, nella via di somministrazione o nell'esposizione al farmaco, oltre alle differenze tra i due agenti antidotici, e non dimostra una maggiore efficacia biochimica, una superiorità clinica o una preferenza terapeutica clinica^5,6,30,32. Un punto di forza importante dello studio è stata la valutazione integrata dell'urea e della creatinina sierica, della cistatina C, della KIM-1, delle citochine proinfiammatorie, dei biomarcatori legati allo stato redox e dei punteggi istopatologici attraverso domini funzionali, tubulari, infiammatori, legati allo stato redox e strutturali complementari. Questo modello focalizzato sul danno renale potrebbe fornire un quadro preclinico utile per valutare regimi antidotici, interventi renoprotettivi aggiuntivi e biomarcatori di danno renale in condizioni di ridotta eliminazione del formiato dipendente dal folato^8,9,10,21.

Diverse limitazioni hanno influenzato l'interpretazione. La generalizzabilità diretta all'intossicazione clinica da metanolo è stata limitata dal modello animale sperimentale e dalle differenze metaboliche interspecifiche. Il metotressato può influenzare in modo indipendente gli esiti renali, infiammatori e ossidativi³³, e l'assenza di un gruppo con solo metanolo ha impedito una completa separazione degli effetti del metanolo dalle potenziali interazioni tra MTX e metanolo. Non sono state misurate le concentrazioni sieriche o tissutali di metanolo, formaldeide, formiato, etanolo e fomepizolo, e l'attività dell'alcol deidrogenasi (ADH) nella frazione citosolica renale grezza non è stata valutata; pertanto, non è stato possibile verificare direttamente la sensibilizzazione metabolica, la formazione di metaboliti tossici, l'esposizione all'antidoto e l'inibizione del metabolismo del metanolo, né sono state eseguite analisi di correlazione con gli esiti biochimici renali. Non sono state misurate le variabili dell'equilibrio acido-base, inclusi pH, bicarbonato, eccesso di basi e gap anionico. Il follow-up di 48 ore ha permesso di valutare soltanto esiti renali acuti, senza stabilire il recupero renale, la persistenza o la reversibilità del danno, né le modifiche strutturali croniche. La colorazione con tricromio di Masson è stata valutata mediante analisi istomorfologica, senza misurazione quantitativa dell'area positiva al collagene, e non sono stati valutati marcatori molecolari o biochimici della fibrosi, tra cui l'espressione di α-actina del muscolo liscio, il contenuto di collagene e la concentrazione di 4-idrossiprolina. La valutazione istopatologica effettuata da un singolo patologo in cieco ha escluso la possibilità di valutare l'accordo tra osservatori, e la classificazione semiquantitativa delle lesioni è rimasta potenzialmente soggetta a classificazione dipendente dall'osservatore. I regimi antidotici erano farmacologicamente non equivalenti; le concentrazioni renali di fomepizolo misurate con ELISA non sono state normalizzate rispetto alla concentrazione totale di proteine; non sono state eseguite analisi molecolari della funzione mitocondriale e delle vie di morte cellulare; la dimensione del campione era limitata; ed è stato incluso soltanto ratto maschio. Studi futuri dovrebbero includere gruppi con solo metanolo e solo MTX, regimi antidotici comparabili, misurazioni seriali delle concentrazioni di metanolo, formiato e antidoto, valutazione dell'attività renale di ADH, misurazioni dell'equilibrio acido-base, valutazione quantitativa della fibrosi, un follow-up più lungo e una validazione clinica adeguatamente progettata. In conclusione, nell'esposizione al metanolo in questo modello di ratto pretrattato con metotressato si è osservata una compromissione della funzione renale, un aumento dei biomarcatori di danno renale e infiammazione, un profilo sfavorevole correlato al redox e un danno istopatologico. Entrambi i gruppi trattati con antidoti hanno mostrato un andamento renale più favorevole rispetto al gruppo MTX + Metanolo. Il fomepizolo ha mostrato un andamento descrittivo più costantemente favorevole nei diversi domini valutati; tuttavia, l'assenza di differenze biochimiche dirette significative tra i gruppi antidotici, la natura descrittiva dei confronti istopatologici, i regimi antidotici non equivalenti e l'assenza di misurazioni tossicocinetiche hanno impedito di trarre conclusioni sulla superiorità rispetto all'etanolo. Questi risultati sono limitati al modello di ratto pretrattato con metotressato e non stabiliscono gli effetti renali di nessuno dei due antidoti in seguito all'esposizione al metanolo in assenza di pretrattamento con metotressato o nell'intossicazione umana da metanolo. Sono necessari ulteriori studi che includano misurazioni tossicocinetiche dirette, valutazioni meccanicistiche, regimi di dosaggio antidotico comparabili e un follow-up più lungo per valutare la riproducibilità e l'applicabilità più ampia di questi risultati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fissativo neutro tamponato al 10%	Merck	Non registrato	Fissazione dei tessuti per la procedura istopatologica.
Etilene assoluto (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	Non registrato	Diluito con acqua distillata sterile per ottenere una soluzione finale al 20% (v/v); somministrato in un'unica dose per gavaggio orale di 0,5 g/kg, 4 ore dopo la somministrazione di metanolo.
Centrifuga da banco	Nüve	NF048	Preparazione e centrifugazione dei campioni.
Anticorpo coniugato con biotina	Componenti del kit ELISA BT Lab	Incluso nel kit	Anticorpo di rilevamento
Kit CAT (Catalasi)	Otto Scientific	Otto3051	Misurazione colorimetrica dell'attività della catalasi (CAT) nel sangue anticoagulato con EDTA.
cOmplete Mini Cocktail Inibitore di Proteasi senza EDTA	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	Aggiunto al buffer di omogeneizzazione durante la preparazione degli omogenati di tessuto renale per le analisi ELISA.
Kit della creatinina	Otto Scientific	OttoBC139	Valutazione dei livelli sierici di creatinina.
Omogeneizzatore digitale	Daihan Scientific	HG-15D	Omogeneizzazione del tessuto
Lavatrice automatica per strisce ELx50	Bio-Tek Instruments, USA	ELx50	Lavaggio per ELISA
Lettore di microplacche ELx800	Bio-Tek Instruments, USA	ELx800	Misurazione dell'assorbanza per ELISA e saggi colorimetrici; l'assorbanza per ELISA è stata letta a 450 nm.
Eosina Y (giallastra)	Merck	1.15935.0025	Colorazione istopatologica
Fomepizolo (4-Metilpirazolo)	Hüsnü Arsan A.., Ankara, Türkiye	Non registrato	Preparato in soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% a una concentrazione finale di 10 mg/mL; somministrato per via intraperitoneale come dose di carico di 15 mg/kg, 4 ore dopo la somministrazione di metanolo, seguito da dosi di mantenimento di 10 mg/kg a 12, 24 e 36 ore dopo la somministrazione di metanolo.
Kit GSH (Glutatione)	Otto Scientific	Otto3053	Misurazione colorimetrica dei livelli di glutatione ridotto (GSH) nel sangue anticoagulato con EDTA.
Soluzione di ematossilina di Harris	BSLAB	BS-002	Colorazione istopatologica
Acido cloridrico (HCl)	Merck	7647-01-0	Regolazione del pH
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	IBM SPSS Statistics Versione 29.0	Analisi statistica; RRID:SCR_016479.
Cloridrato di chetamina (Ketalar)	Pfizer, USA	Non registrato	Anestesia generale prima del prelievo di sangue e tessuto renale.
Microscopio ottico	Nikon Eclipse	Ni-U	Esame istopatologico
Kit di colorazione con tricromia di Masson	MOSLAB (Medical Olympus Sanayi Tic. Ltd. ti., Türkiye)	BKMTO001	Colorazione istopatologica
Kit MDA (Malondialdeide)	Otto Scientific	Otto1001	Misurazione colorimetrica dei livelli di malondialdeide (MDA) nel siero come indice di perossidazione lipidica.
Metanolo (≥99,8%)	Sigma-Aldrich, USA	322415	Somministrato per via orale (3 g/kg) per indurre intossicazione sperimentale da metanolo.
Metotrexato (Emthexate 500 mg/5 mL)	Teva Pharma Belgium	Non registrato	Formulazione commerciale da 100 mg/mL diluita con soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 0,06 mg/mL; somministrato per gavaggio orale a 5 mL/kg, corrispondente a 0,3 mg/kg, una volta al giorno per 7 giorni consecutivi.
Analizzatore chimico Mindray	Mindray	BS-400	Misurazione dell'urea e della creatinina sieriche.
Paraffina, grado istologico	Non registrato	Non registrato	Inclusione dei tessuti.
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)	Merck	P4417	Lavaggio/risciacquo dei tessuti
Kit ELISA per Cistatina-C del ratto	BT Lab, Cina	E0145Ra	Quantificazione dei livelli di cistatina C negli omogenati di tessuto renale; sensibilità analitica, 0,25 ng/mL; intervallo di rilevamento, 0,5–100 ng/mL.
Kit ELISA per IL-1β del ratto	BT Lab, Cina	E0119Ra	Quantificazione dei livelli di IL-1β negli omogenati di tessuto renale; sensibilità analitica, 0,08 ng/mL; intervallo di rilevamento, 0,2–60 ng/mL.
Kit ELISA per IL-6 del ratto	BT Lab, Cina	E0135Ra	Quantificazione dei livelli di IL-6 negli omogenati di tessuto renale; sensibilità analitica, 0,052 ng/L; intervallo di rilevamento, 0,1–40 ng/L.
Kit ELISA per KIM-1 del ratto	BT Lab, Cina	E0549Ra	Quantificazione dei livelli di KIM-1 negli omogenati di tessuto renale; sensibilità analitica, 0,01 ng/mL; intervallo di rilevamento, 0,05–10 ng/mL.
Kit ELISA per TNF-α del ratto	BT Lab, Cina	E0764Ra	Quantificazione dei livelli di TNF-α negli omogenati di tessuto renale; sensibilità analitica, 2,51 ng/L; intervallo di rilevamento, 5–1.000 ng/L.
Buffer di lisi ed estrazione RIPA	Thermo Scientific	89900	Omogeneizzazione e lisi del tessuto renale per le analisi ELISA.
Kit SOD (Superoxide Dismutasi)	Otto Scientific	Otto3047	Misurazione colorimetrica dell'attività della superossido dismutasi (SOD) nel siero.
Citrato di sodio	Merck	03-04-6132	Preparazione del buffer
Idrossido di sodio (NaOH)	Merck	1310-73-2	Regolazione del pH
Ago in acciaio inossidabile (cannula per gavaggio orale 22 G)	Instech Laboratories, USA	Non registrato	Cannula riutilizzabile in acciaio inossidabile utilizzata per la somministrazione per gavaggio orale nei ratti.
Soluzione di arresto	Componenti del kit ELISA BT Lab	Incluso nel kit	Terminazione della reazione ELISA
Streptavidina perossidasi	Thermo Scientific	SHRP248-B	Sistema di rilevamento ELISA
Soluzione cromogenica TMB	Componenti del kit ELISA BT Lab	Incluso nel kit	Substrato cromogenico
Tris-HCl	Thermo Scientific	1185-53-1	Preparazione del buffer
Kit dell'urea	Otto Scientific	OttoBC157	Misurazione dei livelli sierici di urea.
Concentrato del buffer di lavaggio	Componenti del kit ELISA BT Lab	Incluso nel kit	Lavaggio delle piastre
Ratti albinos Wistar	Laboratorio di ricerca sugli animali sperimentali dell'Università Ahi Evran, , Türkiye	Numero di licenza per allevamento/produzione 184	Maschi; età 8–12 settimane; peso corporeo, 220 ± 20 g
Cloridrato di xilazina (Rompun)	Bayer, Germania	Non registrato	Anestesia generale prima del prelievo di sangue e tessuto renale.
Xilene, grado istologico	Non registrato	Non registrato	Processamento e chiarificazione dei tessuti istologici.