Questo protocollo visualizza il deposito di lignina e componenti della parete cellulare pectinici in sezioni trasversali di fusti di alfalfa (Medicago sativa L.). L'obiettivo è identificare tessuti specifici del fusto che potrebbero essere presi di mira per sviluppare nuove linee di alfalfa con caratteristiche desiderabili di digeribilità del fusto.
Articolo metodologico
Incubazione in vitro con Liquido Rumen e Colorazione Istologica di Componenti Selezionati della Parete Cellulare in Fusti di Erba Medica (Medicago sativa L.)
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'accumulo di componenti della parete cellulare durante la crescita delle piante limita la qualità nutrizionale dei foraggi per i ruminanti. In particolare, il deposito di lignina nei tessuti vegetali ostacola la degradazione dei carboidrati della parete cellulare, come cellulosa ed emicellulosa, riducendo così la quantità di energia ottenibile dai foraggi. Il componente pectina della parete cellulare, invece, altamente digeribile, è facilmente disponibile per la degradazione. Informazioni riguardo al deposito di lignina e pectina in diversi tipi cellulari del fusto possono fornire spunti meccanicistici sui fattori alla base della variabilità nella digeribilità del fusto tra diverse linee di alfalfa. L'incubazione in vitro di sezioni trasversali del fusto in fluido rumenale simula i processi che i tessuti del fusto subiscono nel rumine. Abbinata a colorazioni istologiche e microscopia, questa metodica permette di visualizzare nel tempo i cambiamenti nella degradazione dei tessuti e la localizzazione di lignina e pectina nel fusto. Il colorante di Wiesner reagisce con le unità aldeidiche guaiaçil (G) della lignina, tingendole di fucsia. Analogamente, il rosso di rutenio interagisce con i gruppi carbossilici della pectina, colorando la pectina nel fusto con tonalità che vanno dal rosa al marrone. Questo protocollo descrive la digestione di sezioni trasversali del fusto di alfalfa dopo l'esposizione a microrganismi ruminali, seguita da colorazione per visualizzare i modelli di distribuzione di lignina e pectina nelle pareti cellulari. Il metodo può essere utilizzato per identificare i tessuti del fusto in cui lignina e pectina sono presenti o assenti, facilitando confronti tra diverse linee di alfalfa.
Introduzione
Una parete cellulare racchiude ogni cellula vegetale. La cellulosa, l'emiceullulosa, la lignina e la pectina sono componenti della parete cellulare e contribuiscono alla fibra vegetale, un elemento necessario nella dieta dei ruminanti. Mentre le pectine sono polisaccaridi altamente digeribili (solubili)1, la lignina è un polimero indigeribile che limita la degradazione della fibra2. La lignina riduce quindi la digeribilità della pianta e, in ultima analisi, diminuisce l'energia disponibile per il ruminante proveniente dai foraggi. Tuttavia, la lignina svolge importanti funzioni fisiologiche nella pianta, come il trasporto dell'acqua in tutta la pianta attraverso il rinforzo degli elementi dei tracheidi3. Studi precedenti hanno dimostrato che modifiche alla fibra del fusto che riducono la lignina o aumentano la pectina potrebbero migliorare la digeribilità del fusto e il valore nutritivo del foraggio4. Pertanto, questo protocollo si concentra su questi due componenti della parete cellulare. Le concentrazioni totali di lignina e pectina nella parete cellulare del fusto forniscono informazioni insufficienti per spiegare i meccanismi alla base della digeribilità della fibra del fusto5. L'incubazione in vitro con liquido rumenale e la colorazione istologica possono fornire informazioni a livello cellulare, visualizzando le differenze nei componenti della parete cellulare tra piante con diversa digeribilità della fibra del fusto4,6. Nel presente protocollo, la medicaiola (Medicago sativa L.), una comune leguminosa foraggera perenne, funge da specie modello per illustrare i modelli di distribuzione di lignina e pectina nei tessuti del fusto, che contengono più lignina ma meno pectina rispetto alle foglie.
L'incubazione in vitro con liquido rumenale simula la digestione dei foraggi nello stomaco dei ruminanti, permettendo di osservare gli effetti dell'anatomia del foraggio sulla digeribilità. Creando in provetta condizioni simili a quelle presenti nel rumine, sezioni trasversali di fusto aderenti a vetrini possono essere prelevate in diversi momenti al fine di valutare il grado di degradazione dei tessuti dopo l'esposizione al liquido rumenale6. Questo metodo fornisce un approccio relativamente semplice, rapido ed economico per visualizzare le strutture anatomiche dei fusti di erba medica7 ed esaminare come i diversi tipi cellulari contenenti componenti della parete cellulare variano durante la digestione del fusto.
La colorazione istologica di sezioni trasversali di fusto permette la visualizzazione dei componenti della parete cellulare. Il floroglucinolo e l'acido cloridrico (HCl) si combinano per formare la colorazione di Wiesner, che evidenzia i tessuti del fusto contenenti unità ligniniche ricche di guaiacile8 reagendo con i monomeri aldeidici G C6C3 (coniferaleide)9. La lignina è composta da diverse sotto-unità monomeriche; tuttavia, in tutto l'articolo, il termine “lignina” si riferisce esclusivamente al monomero unità G, poiché è il monomero che reagisce con la colorazione di Wiesner10 e quindi viene visualizzato mediante questo protocollo. Alcuni tessuti, come i vasi xilematici, sono sempre lignificati6. In generale, la deposizione della lignina nei tessuti del fusto della medica inizia quando inizia la crescita secondaria (cambiale) e coincide con la cessazione dell'allungamento degli internodi del fusto6. Il rosso di rutenio si lega alle sostanze pectiche, che contengono gruppi carbossilici talvolta esterificati e condividono alcune catene laterali11. I gruppi carbossilici delle pectine presenti nella lamella media e nelle pareti cellulari primarie interagiscono con il rosso di rutenio11. La pectina è coinvolta nell'allungamento cellulare ed è pertanto presente nelle cellule durante la crescita primaria. Nel manoscritto, il termine “pectina” indica in generale l'insieme delle pectine che possono essere presenti. L'accoppiamento della colorazione istologica con l'incubazione in vitro rumenale facilita l'osservazione della localizzazione dei componenti della parete cellulare nel fusto ed evidenzia come i diversi tipi cellulari cambino durante la digestione rumenale. In definitiva, questo protocollo può essere utilizzato per identificare le cellule del fusto contenenti lignina e pectina e per caratterizzare i modelli osservati in diverse linee di medica e in diversi tempi di incubazione.
Protocollo
Questa ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali per i soggetti animali (IACUC 2301-40689B).
1. Etichettatura delle provette del campione
- Preparazione ed etichettatura delle provette campione per incubazione, conservazione e colorazione
- Etichettare preventivamente cinque serie distinte di provette coniche graduate da 50 mL, monouso e con tappo a vite, per ogni campione. Aggiungere l'identificativo del campione e il tempo di incubazione a ciascuna provetta per le finalità descritte di seguito.
- Etichettare le provette di attesa pre-incubazione e aggiungere 35 mL di acqua ultrapura.
- Etichettare le provette per l'incubazione da utilizzare nei paragrafi 3 e 4. Organizzare le provette in rack separati in base al tempo di incubazione (0, 4, 8, 24, 48 o 96 h).
NOTA: Utilizzare un pennarello indelebile di grado industriale per evitare che le etichette si sciolgano nel bagnomaria. - Etichettare le provette per la conservazione post-incubazione e aggiungere 35 mL di una miscela 50:50 di glicerolo al 100% e acqua ultrapura. Utilizzare queste provette per conservare le sezioni trasversali digerite su vetrini fino alla colorazione.
- Etichettare le provette pre-colorazione e aggiungere 35 mL di una miscela 50:50 di etanolo al 200 proof e acqua ultrapura. Utilizzare queste provette per estrarre il glicerolo dalle sezioni trasversali prima della colorazione.
- Etichettare le provette per l'idratazione e aggiungere 35 mL di acqua ultrapura.
2. Sezionamento trasversale del fusto e montaggio su vetrini
- Utilizzando pinzette, selezionare un segmento di fusto alla volta dai fusti campione ed escindere la parte centrale del segmento.
NOTA: Utilizzare quattro fusti per campione come repliche tecniche per ciascuna replica biologica. Selezionare casualmente i quattro fusti tra tutti i fusti disponibili per campione. Utilizzare un ulteriore insieme di fusti standard come controllo in tutte le serie di incubazione. - Tagliare due rettangoli di polistirene espanso rigido isolante, ciascuno di circa 2,5 cm di lunghezza e 0,6 cm di spessore. Praticare una piccola scanalatura lungo la lunghezza di ciascun pezzo in modo che un internodo del fusto si adatti perfettamente tra i due pezzi di schiuma.
- Montare il "panino" di fusto sul portapreparati di un microtomo scorrevole in grado di produrre sezioni spesse 100 μm. Utilizzando un pennello a punta fine, depositare una goccia d'acqua sul fusto e sulla lama del microtomo per facilitare un'incisione pulita.
- Tagliare le sezioni trasversali del fusto con uno spessore di 100 μm. Utilizzare il pennello per trasferire ciascuna sezione trasversale in una piastra di Petri pre-etichettata contenente acqua ultrapura per la conservazione temporanea ed eliminare qualsiasi residuo di schiuma dalla piastra.
NOTA: Sostituire la lama del microtomo se la schiuma si strappa, poiché lo strappo potrebbe indicare una lama smussata. - Etichettare manualmente due vetrini standard da 25 mm × 75 mm per ogni campione a ciascun tempo di incubazione (2 colorazioni × 6 punti temporali = 12 vetrini per campione per ciascuna replica biologica). Riportare su ciascuna etichetta l'identificativo del campione, il tempo di incubazione e la colorazione.
- Tagliare un pezzo di nastro adesivo doppia faccia largo 2 mm e lungo 2,5 cm. Posizionare il lato corto del nastro a 0,5 cm dal fondo del vetrino, con la faccia adesiva rivolta verso il basso, e premere con fermezza sul lato in carta cerata del nastro indossando guanti per assicurare l'adesione.
NOTA: Eseguire questo passaggio su una superficie piana per evitare di rompere i vetrini. - Utilizzare un microscopio stereoscopico per orientare tutte le sezioni trasversali nella stessa direzione. Rimuovere la carta cerata dal nastro adesivo doppia faccia e, mantenendo l'orientamento delle sezioni trasversali, trasferirle sul nastro del vetrino pre-etichettato utilizzando un pennello a punta fine bagnato. Mantenere le sezioni trasversali leggermente umide.
- Posizionare la carta cerata sopra le sezioni trasversali e arrotolare leggermente il pennello per fissarle saldamente al nastro adesivo doppia faccia. Rimuovere la carta cerata e inserire il vetrino montato contenente quattro sezioni trasversali nel tubo portaoggetti pre-etichettato descritto al punto 1.1.2, assicurandosi che l'acqua ultrapura ricopra le sezioni trasversali montate.
- Per la colorazione con rosso di rutenio e con la colorazione di Wiesner, posizionare due vetrini uno di fronte all'altro in ciascun tubo portaoggetti, con il nastro adesivo doppia faccia rivolto verso l'esterno.
NOTA: Dopo aver montato tutti i vetrini e posizionati nei tubi contenenti acqua ultrapura, conservare i vetrini tutta la notte a temperatura ambiente se necessario.
3. Preparazione per l'incubazione in vitro di sezioni trasversali di fusto
- Utilizzare le provette monouso da 50 mL con tappo a vite preparate per l'incubazione (vedere 1.1.3). Riunire tutte le provette campione per ciascun intervallo di incubazione su un'unica rack di plastica.
- Utilizzare una bilancia analitica a quattro cifre decimali per pesare 0,2 g di paglia di mais standard macinata a 1 mm su carta da filtro, quindi trasferire con attenzione il materiale in ciascuna provetta di incubazione, eccetto quelle a 0 h, che fungono da controllo non incubato. Chiudere le provette e metterle da parte fino al momento dell'uso.
NOTA: La paglia di mais standard fornisce energia per sostenere i microrganismi del rumine durante l'incubazione, poiché la biomassa delle sezioni trasversali del fusto non è sufficiente a mantenere l'attività microbica. - Riempire un bagno termostatato a circolazione con acqua sufficiente ed equilibrarlo a 39 °C prima di iniziare l'incubazione. Regolare la profondità dell'acqua in modo da coprire il segno dei 35 mL sulle provette da 50 mL e utilizzare un aeratore, se necessario, per mantenere una circolazione e una temperatura uniformi.
- Preparazione del buffer di McDougall per la soluzione di inoculo
- Preparare il buffer di McDougall non più di 2 giorni prima di iniziare le incubazioni.
NOTA: Mescolare il buffer di McDougall con liquido rumenale in rapporto 4:1 per preparare la soluzione di inoculo. Regolare il volume del buffer in base al numero di campioni e preparare una quantità sufficiente di soluzione di inoculo per fornire 30 mL per provetta. - Misurare 1.600 mL di acqua ultrapura. Trasferirne 1 L in un matraccio Erlenmeyer piano da 3 L e riservare 600 mL per il trasferimento e il risciacquo dei reagenti.
- Posizionare un agitatore magnetico nel matraccio Erlenmeyer e collocare il matraccio su una piastra agitatrice.
- Posizionare un imbuto di plastica nel matraccio Erlenmeyer. Aggiungere 15,7 g di bicarbonato di sodio (NaHCO₃), 5,9 g di fosfato dibasico di sodio anidro (Na₂HPO₄), 0,91 g di cloruro di potassio (KCl), 0,75 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,19 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO₄·7H₂O) e 0,06 g di cloruro di calcio diidrato (CaCl₂), aggiungendo un reagente alla volta e attendendo che ciascuno si sciolga prima di aggiungere il successivo. Utilizzare porzioni dei 600 mL di acqua ultrapura riservati per risciacquare l'imbuto dopo ogni aggiunta.
- Dopo aver aggiunto il cloruro di calcio diidrato, inserire un diffusore di CO₂ per facilitare la dissoluzione e spurgare la soluzione. Una volta che la soluzione diventa limpida, continuare lo spurgo per ulteriori 10–15 min.
- Chiudere ermeticamente il matraccio e fissare il tappo con nastro adesivo, poiché il riscaldamento del buffer potrebbe pressurizzare il contenitore.
- Conservare la soluzione a 20 °C per un massimo di 2 giorni. Immergere la soluzione in un bagno d'acqua a 39 °C il giorno prima dell'uso, oppure posizionarla direttamente nel bagno a 39 °C se verrà utilizzata il giorno successivo.
- Preparare il buffer di McDougall non più di 2 giorni prima di iniziare le incubazioni.
4. Incubazione in vitro di sezioni trasversali del fusto
- Il giorno dell'incubazione, versare 47 mL di acqua e 4 mL di NaOH 1 N in un becher da 100 mL sotto cappa, quindi aggiungere 0,625 g di cisteina-HCl. In un secondo becher da 100 mL, aggiungere 0,625 g di solfuro di sodio a 47 mL di acqua, mantenendo le due soluzioni separate fino alla preparazione della soluzione di inoculo.
- Riempire un thermos isolato con acqua calda per creare un ambiente caldo durante il trasporto dei microrganismi ruminale dalla mucca al laboratorio. Portare un secchio da cinque galloni per trasferire l'acqua calda dal thermos.
- Recarsi nel capannone per raccogliere il liquido ruminale dalla mucca cannullata assegnata all'esperimento dalla gestione del capannone.
NOTA: Raccogliere il liquido ruminale approssimativamente alla stessa ora del giorno e dalla stessa mucca durante tutto l'esperimento per minimizzare le variazioni. Coordinarsi con la gestione del capannone per fornire un preavviso sull'orario di arrivo per il prelievo del liquido ruminale. - Identificare la mucca sperimentale e indossare l'equipaggiamento di protezione personale appropriato, compresi camice da laboratorio, protezione oculare, copriscarpe e guanti lunghi fino alle spalle.
NOTA: Limitare le procedure descritte nei punti 4.4–4.8 al personale autorizzato ai sensi del protocollo IACUC applicabile. - Trasferire l'acqua calda dal thermos al secchio da cinque galloni. Preparare due strati di garza grado 50 (tela di cotone) per filtrare il materiale ruminale.
- Prelievo del liquido ruminale dalla mucca cannullata
- Aprire con attenzione la cannula e posizionare il tappo nel secchio da cinque galloni contenente acqua calda per evitare di contaminare il tappo. Con una mano guantata, rimuovere una quantità sufficiente di materiale dal rumine per accedere all'interfaccia solido-liquido del rumine.
- Una volta raggiunta l'interfaccia solido-liquido, raccogliere diverse manciate di materiale e spremere attraverso due strati di garza grado 50, ciascuno di circa 45 cm di lato, in un thermos con tappo a vite preriscaldato. Scartare il materiale residuo dopo aver spremuto il liquido ruminale attraverso la garza.
- Ripetere il passaggio 4.6.2 fino a ottenere 1 L di liquido ruminale nel thermos per ogni serie di 60 provette di inoculo, regolando il volume in base al numero di campioni da incubare.
NOTA: Le mucche cannullate hanno limiti specifici riguardo alla quantità di liquido ruminale estraibile in una determinata settimana. Comunicare con il responsabile del capannone per assicurarsi che la quantità prelevata non superi il limite consentito per la mucca.
- Dopo aver raccolto una quantità sufficiente di liquido ruminale, chiudere ermeticamente il thermos per mantenerne la temperatura. Riposizionare la cannula e utilizzare l'acqua calda nel secchio da cinque galloni per la pulizia.
- Smaltire copriscarpe, guanti e garza usati nel contenitore di smaltimento appropriato prima di lasciare il capannone. Tornare al laboratorio il più rapidamente possibile per mantenere la temperatura e le condizioni anossiche del liquido ruminale.
- Al ritorno in laboratorio, unire le due soluzioni di agente riducente (vedi punto 4.1) sotto cappa e mescolarle per preparare la soluzione riducente.
- Posizionare un becher di vetro con capacità di almeno 2 L contenente una barretta magnetica su un agitatore riscaldato impostato a <30 °C e posizionare un diffusore di CO₂ sopra il liquido. Aggiungere 1.600 mL di tampone di McDougall e agitare lentamente, evitando che il diffusore di CO₂ entri in contatto con il liquido.
NOTA: Se desiderato, è possibile utilizzare un becher in polipropilene a questa bassa temperatura. Utilizzare CO₂ per dislocare l'O₂ e contribuire al mantenimento delle condizioni anossiche. - Foderare un imbuto grande con due strati di tela di cotone grado 50 e posizionarlo sopra un cilindro graduato da 2 L. Filtrare 400 mL di liquido ruminale e aggiungerli al tampone di McDougall (vedi punto 3.4.7) per preparare la soluzione di inoculo.
- Aggiungere 80 mL della soluzione riducente (vedi punto 4.9) alla soluzione di inoculo e mescolare lentamente. Evitare che il diffusore di CO₂ entri in contatto con il liquido.
- Sotto cappa, rimuovere i tappi dalle provette di incubazione e organizzarle in rack separati in base al tempo di incubazione. Svitare i tappi dalle provette di mantenimento pre-incubazione in preparazione per il trasferimento dei vetrini (vedi punto 1.1.2).
- Selezionare casualmente una provetta di mantenimento pre-incubazione alla volta e utilizzare pinzette per trasferire i vetrini montati nella corrispondente provetta di incubazione (vedi punto 1.1.3). Posizionare ogni provetta di incubazione contenente i vetrini montati in un piccolo rack e mettere da parte la provetta di mantenimento pre-incubazione.
NOTA: Utilizzare due persone per eseguire i passaggi 4.14–4.15. Ove possibile, minimizzare il raffreddamento della miscela liquido ruminale-tampone. - Aspirare 30 mL di soluzione di inoculo in una siringa da 60 mL munita di ago largo e smussato. Dispensare lentamente la soluzione lungo la parete della provetta di incubazione, purgare la provetta con CO₂ per circa 20 s, chiuderla con il tappo e riporla nel rack.
- Posizionare i rack contenenti le provette inoculate in un bagno d'acqua a 39 °C. Agitare delicatamente le provette almeno una volta al giorno e spostare la posizione dei rack quotidianamente per minimizzare riscaldamenti non uniformi.
NOTA: La formazione di bolle di gas nelle provette indica una fermentazione attiva. - Al termine di ogni periodo di incubazione, rimuovere il corrispondente rack dal bagno d'acqua. Aprire una provetta alla volta, rimuovere ogni vetrino e risciacquare delicatamente via i solidi e la soluzione di inoculo residua con acqua ultrapura.
- Posizionare i vetrini risciacquati nelle provette di conservazione post-incubazione contenenti la miscela glicerolo-acqua descritta al punto 1.1.4.
5. Colorazione delle sezioni trasversali per la lignina
- Se i vetrini sono stati conservati in una miscela 50:50 di glicerolo-acqua, trasferire entrambi i vetrini contenenti le sezioni trasversali montate in tubi per il pre-risciacquo contenenti la soluzione di etanolo-acqua ultrapura (vedere 1.1.5). Conservare i tubi tutta la notte in frigorifero per rimuovere il glicerolo prima della colorazione.
- Preparare una soluzione al 3% di floroglucinolo (PG) sciogliendo 0,3 g di PG in 10 mL di etanolo assoluto in un matraccio Erlenmeyer da 25 mL avvolto in carta d'alluminio per proteggere il reagente fotosensibile dalla luce. Tappare e etichettare il matraccio con il nome della soluzione, la data di preparazione e il nome del preparatore, quindi conservarlo a 20 °C.
- Rimuovere i vetrini dai tubi refrigerati e trasferirli temporaneamente nei tubi di idratazione descritti al punto 1.1.6, contenenti acqua ultrapura al 100%.
NOTA: Mantenere le sezioni trasversali idratate durante la manipolazione per ridurre al minimo l'ossidazione, che potrebbe danneggiare le sezioni e compromettere l'analisi successiva mediante imaging. - Preparare la colorazione di Wiesner nella cappa aspirante utilizzando una pipetta, mescolando 50 μL di soluzione al 3% di PG in etanolo (vedere 5.2) con 25 μL di acido cloridrico (HCl) in un becher da 50 mL.
NOTA: Regolare le quantità in base al numero di vetrini, mantenendo un rapporto PG:HCl di 2:1.
ATTENZIONE: Manipolare l'acido cloridrico nella cappa aspirante poiché è corrosivo per i metalli, causa gravi ustioni cutanee e danni agli occhi e può provocare irritazione respiratoria. Evitare di inalare vapori o aerosol, indossare guanti, abbigliamento, protezione oculare e facciale adeguati e lavare accuratamente la pelle esposta dopo l'uso. - Rimuovere un vetrino dal tubo e asciugare delicatamente il vetro intorno al nastro adesivo doppia faccia con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi per evitare che la soluzione di colorazione coli dal nastro. Posizionare il vetrino su un piccolo vassoio di plastica e utilizzare una pipetta per applicare alcune gocce di colorazione di Wiesner sulle sezioni trasversali.
- Impostare un timer per 12 minuti e coprire i vetrini con carta d'alluminio per proteggerli dalla luce. Controllare le sezioni trasversali durante la colorazione e riapplicare la soluzione se necessario per evitare l'essiccazione.
NOTA: Evitare che le sezioni trasversali si secchino poiché l'ossidazione potrebbe danneggiare il tessuto e compromettere l'analisi successiva mediante imaging. - Dopo 12 minuti, rimuovere delicatamente l'eccesso di colorazione di Wiesner con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi. Lavare il tessuto prima del montaggio per ridurre al minimo l'esposizione dell'obiettivo del microscopio ai vapori corrosivi di HCl.
- Applicare 1–2 gocce di soluzione al 50% di glicerolo-acqua ultrapura su ciascuna sezione trasversale e coprire con un coprioggetto di dimensioni 24 mm × 30 mm (spessore No. 1.5). Procedere immediatamente all'analisi microscopica e all'acquisizione delle immagini.
NOTA: Acquisire le immagini entro 6–8 ore poiché la colorazione di Wiesner è sensibile al tempo e potrebbe ingiallire e diffondersi dalla sezione trasversale con il passare del tempo.
6. Colorazione in sezione trasversale per la pectina
- Seguire il punto 5.1 per rimuovere la miscela di glicerolo e acqua ultrapura da vetrini conservati prima della colorazione.
- Preparare una soluzione di rosso di rutenio allo 0,02% sciogliendo 0,02 g di rosso di rutenio in 100 mL di acqua ultrapura in un matraccio Erlenmeyer da 125 mL avvolto in carta d'alluminio per proteggere il reagente fotosensibile dalla luce. Tappare e etichettare il matraccio con il nome della soluzione, la data di preparazione e il nome del preparatore, quindi conservarlo a 20 °C.
- Rimuovere i vetrini dai tubi refrigerati contenenti la miscela etanolo-acqua ultrapura e trasferire i vetrini correttamente etichettati con sezioni montate in tubi contenenti acqua ultrapura al 100% (vedere punto 1.1.6) per il mantenimento temporaneo.
NOTA: Seguire le precauzioni di idratazione descritte al punto 5.3. - Rimuovere un vetrino dall'acqua ultrapura utilizzando pinzette e asciugare delicatamente l'acqua intorno al nastro con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi per evitare che la soluzione di colorazione si spanda sul vetro. Posizionare il vetrino su un piccolo vassoio di plastica.
- Applicare alcune gocce di soluzione di rosso di rutenio (vedere punto 6.2) per coprire uniformemente le sezioni trasversali. Coprire i vetrini con carta d'alluminio per 10 minuti per proteggerli dalla luce, quindi risciacquare delicatamente il colorante dal vetrino con acqua ultrapura per 2 minuti.
- Asciugare l'eccesso di acqua dal vetrino e applicare 1–2 gocce di glicerolo al 50% in acqua ultrapura su ciascuna sezione trasversale. Coprire le sezioni trasversali con un coprioggetto di dimensioni 24 mm × 30 mm (spessore No. 1.5) e procedere all'analisi microscopica e all'acquisizione delle immagini.
NOTA: Eseguire l'analisi microscopica nello stesso giorno per ottenere risultati ottimali.
7. Acquisizione di immagini in campo chiaro
- Osservare le sezioni trasversali in illuminazione in campo chiaro utilizzando un microscopio con ingrandimenti 10×, 20× e 40×. Vedere Tabella 1 per i parametri e le impostazioni di acquisizione delle immagini.
Risultati
L'uso di provette da centrifuga per simulare le condizioni del rumine ha permesso una digestione in vitro relativamente rapida ed economica di sezioni trasversali di fusto di Medicago sativa. Utilizzando un microtomo a slitta, sono state preparate sezioni trasversali di fusto di M. sativa spesse 100 μm (Figura 1A). Le sezioni trasversali dei fusti sono state fissate su vetrini in vetro con nastro adesivo doppiofaccia (Figura 1B) ed immerse in una soluzione di inoculo di liquido rumenale per periodi di incubazione che variavano da 4 h a 96 h (Figura 1C). Per l'incubazione in vitro, sono state utilizzate provette da centrifuga monouso da 50 mL con tappo come contenitori di incubazione, arricchite con 0,2 g di paglia di mais macinata a 1 mm per sostenere i microorganismi ruminali durante tutto il periodo di incubazione. Le provette sono state incubate in un bagnomaria mantenuto a 39 °C (Figura 1D). La fermentazione attiva da parte dei microorganismi ruminali è stata confermata visivamente dalla formazione di bolle di gas nella soluzione di inoculo. I materiali necessari per questo protocollo sono comunemente disponibili nei laboratori di chimica umida. Il nastro adesivo doppiofaccia non ha impedito il degrado del tessuto durante l'esposizione al liquido rumenale, ma ha trattenuto le porzioni di fusto rimaste dopo la digestione, consentendo successivi passaggi di colorazione e la visualizzazione microscopica.
Sezioni trasversali di fusto che non sono state sottoposte a incubazione in vitro (0 h) hanno permesso la visualizzazione dei componenti iniziali della parete cellulare in diversi tessuti del fusto. Le sezioni trasversali colorate con la colorazione di Wiesner hanno identificato tessuti che mostravano una colorazione associata alla lignina (Figura 2A–E), mentre le sezioni colorate con rosso di rutenio hanno evidenziato tessuti con colorazione associata ai pectati (Figura 3A–E). Nelle sezioni colorate con Wiesner, le fibre del floema primario mature hanno mostrato una colorazione fucsia (Figura 2B–E). Anche i vasi xilematici e lo xilema interfascicolare hanno mostrato colorazione fucsia (Figura 2B–D). La colorazione con rosso di rutenio è stata osservata nell'epidermide, nel collenchima, nello clorenchima, nel floema secondario (Figura 3B–E) e nel midollo (Figura 3B–D). Alcuni xilemi interfascicolari e fibre del floema primario sono state anch'esse colorate con rosso di rutenio (Figura 3B–E). Le sezioni trasversali complete del fusto sono state ottenute unendo una griglia di immagini 5 × 5 acquisite a un ingrandimento di 10× (Figura 2A e Figura 3A). Sono state acquisite ulteriori immagini di una regione della sezione trasversale del fusto a 10× (Figura 2B e Figura 3B), 20× (Figura 2C e Figura 3C) e 40× di ingrandimento al di sopra (Figura 2D e Figura 3D) e al di sotto (Figura 2E e Figura 3E) del cambium vascolare.
I tessuti colorati con Wiesner delle sezioni trasversali del fusto di M. sativa erano evidenti in tutti gli incubamenti in vitro da 0 h a 96 h (Figura 4A–F). A 0 h, tutte le cellule presentavano margini ben definiti (Figura 4A). Dopo 8 h, si osservava evidenza di degradazione del tessuto, visibile attraverso lo sfuocamento dei margini delle cellule con pareti sottili e non lignificate (ovvero non colorate) (ad esempio, collenchima) e la scomparsa di alcune cellule (ad esempio, floema secondario). Dopo 24 h, la struttura tridimensionale elicoidale dei vasi xilematici divenne più evidente man mano che i tessuti circostanti si degradavano (Figura 4D). Oltre le 24 h, le cellule non colorate si degradarono progressivamente e scomparvero (Figura 4D–F). Con la degradazione di questi tessuti, la perdita di sostegno anatomico causò il collasso laterale dell'epidermide non colorata, producendo l'aspetto di un nastro di cellule sottili e trasparenti a 24, 48 e 96 h (Figura 4D–F).
L'incubazione in vitro di sezioni trasversali di fusto di M. sativa, seguita dalla colorazione con rosso di rutenio, ha permesso la visualizzazione della colorazione associata alla pectina nei tessuti del fusto dopo 0–96 h di esposizione al liquido rumenale (Figura 5A–F). Tra 0 e 4 h, i margini ben definiti attorno a tutte le cellule indicano che queste erano integre (Figura 5A,B). Con il protrarsi dell'incubazione fino a 8 h, i tessuti con pareti cellulari sottili e non lignificate nel cortice, inclusi collenchima, cloranchima e floema secondario, hanno progressivamente perso integrità strutturale, causando un'indistinzione dei margini cellulari (Figura 5C). A 24, 48 e 96 h, gran parte del tessuto corticale circostante era assente, mentre erano ancora visibili porzioni dell'epidermide, del xilema interfascicolare, del midollo e dei tessuti vascolari (Figura 5D–F). La perdita della struttura anatomica circostante è stata accompagnata da un collasso laterale della regione epidermica. Dopo 96 h, era presente una quantità notevolmente inferiore di tessuto colorato con rosso di rutenio rispetto ai tempi precedenti di incubazione (Figura 5F). Nel complesso, la perdita progressiva del tessuto del fusto durante l'incubazione è stata accompagnata da una riduzione delle cellule che mostravano positività alla colorazione con rosso di rutenio. La degradazione e la scomparsa delle cellule sottili, non lignificate e associate alla pectina erano previste, poiché la pectina si degrada facilmente nel tempo.
Figura 1: in vitro incubazione di sezioni trasversali di fusto di alfalfa (ASegmenti di fusto di alfalfa sono stati inseriti tra due pezzi di polistirene espanso rigido e montati su un portacampioni per microtomo scorrevole per la sezione trasversale.B) Quattro sezioni trasversali, ciascuna 100 μm spesse, sono state fissate su un vetrino con nastro biadesivo per in vitro incubazione e colorazione istologica. (CDue lamelle di vetro sono state posizionate a contatto, con il nastro adesivo doppiofaccia rivolto verso l'esterno, in un tubo da 50 mL contenente 30 mL di soluzione tampone-fluido ruminale e 0,2 g di paglia di mais macinata a 1 mm. Il tubo è stato spurgato con CO₂ e chiuso con tappo per l'incubazione. La presenza di bolle di gas lungo la parete del tubo ha indicato una fermentazione attiva da parte dei microorganismi ruminale durante l'incubazione.D) I rack contenenti le provette da 50 mL sono stati mantenuti in un 39 °C bagno a 37 °C per tutta la durata dell'incubazione. Il livello dell'acqua ricopriva la soluzione di inoculo ma rimaneva al di sotto delle aperture dei tubi, impedendo all'acqua di entrare nei tubi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La colorazione di Wiesner dei tessuti del fusto di alfalfa indica la distribuzione dei componenti della parete cellulare lignificati. (A–E) Sezioni trasversali del fusto di alfalfa non digerite (tempo di incubazione = 0 h) sono state utilizzate come riferimento iniziale per identificare i tessuti del fusto che mostrano la colorazione di Wiesner. I vasi xilematici (XV), lo xilema interfascicolare (ifX) e le fibre del floema primario mature (PP) si sono colorati di fucsia. Ingrandimenti e barre della scala: (A) griglia 5 × 5 di immagini assemblate acquisite a 10×, barra della scala = 500 μm; (B) 10×, barra della scala = 500 μm; (C) 20×, barra della scala = 250 μm; (D, E) 40×, barre della scala = 150 μm. Abbreviazioni: Xy = xilema; Ct = corteccia; Pi = midollo; Ep = epidermide; Co = collenchima; Ch = clorenchima; SP = floema secondario; XV = vasi xilematici; ifX = xilema interfascicolare; PP = fibre del floema primario mature. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: La colorazione con rosso di rutenio dei tessuti del fusto di alfalfa indica la distribuzione dei polisaccaridi pectici nelle pareti cellulari. (A–E) Sezioni trasversali del fusto di alfalfa non digerite (tempo di incubazione = 0 h) sono state utilizzate come riferimento iniziale per identificare i tessuti del fusto che mostrano colorazione con rosso di rutenio. Epidermide (Ep), collenchima (Co), clorochima (Ch), floema secondario (SP) e midollo (Pi) hanno mostrato colorazione rossa. Anche lo xilema secondario (SX) e il floema primario maturo (PP) hanno mostrato colorazione, mentre i vasi xilematici (XV) sono rimasti relativamente non colorati. Ingrandimenti e barre della scala: (A) griglia 5 × 5 di immagini assemblate acquisite a 10×, barra della scala = 500 μm; (B) 10×, barra della scala = 500 μm; (C) 20×, barra della scala = 250 μm; (D, E) 40×, barre della scala = 150 μm. Abbreviazioni: Xy = xilema; Ct = corteccia; Pi = midollo; Ep = epidermide; Co = collenchima; Ch = clorochima; SP = floema secondario; XV = vasi xilematici; SX = xilema secondario; PP = floema primario maturo. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Modifiche nei tessuti del fusto di alfalfa dopo incubazione in vitro e colorazione con Wiesner. Sezioni trasversali del fusto di alfalfa provenienti dagli stessi internodi sono state sottoposte a incubazione in vitro con liquido ruminale per (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h e (F) 96 h. I vasi xilematici (XV), il xilema interfascicolare (ifX) e le fibre mature del floema primario (PP) hanno mantenuto la colorazione di Wiesner durante tutti i periodi di incubazione. Una debole colorazione dell'ifX è stata osservata nei tessuti del fusto immaturi. Con l'aumentare del tempo di incubazione, i tessuti circostanti hanno progressivamente perso integrità strutturale, rendendo sempre più evidenti le strutture vascolari colorate residue. Le barre della scala = 250 μm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Modifiche nei tessuti del fusto della medica dopo incubazione in vitro e colorazione con rosso di rutenio. Sezioni trasversali del fusto di medica provenienti dagli stessi internodi sono state sottoposte a incubazione in vitro con liquido ruminale per (A) 0 h, (B) 4 h, (C) 8 h, (D) 24 h, (E) 48 h e (F) 96 h. La colorazione con rosso di rutenio è stata osservata in diversi tessuti del fusto, mentre i vasi xilematici (XV) sono rimasti relativamente non colorati. All'aumentare del tempo di incubazione, si è osservata una progressiva perdita della struttura dei tessuti e della colorazione con rosso di rutenio. Porzioni dei vasi xilematici, dello xilema interfascicolare (ifX) e della regione epidermica (Ep) sono rimaste visibili anche nei tempi successivi di incubazione. Le barre della scala = 250 μm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Parametro | Impostazione |
| Velocità (Messa a fuoco) | 2000 × 1328 |
| Qualità (Acquisizione) | 2000 × 1328 |
| Modalità colore | Colore RGB |
| Profondità di bit | 8 bit per canale |
| Profondità di colore effettiva | 24 bit RGB (8 bit R + 8 bit G + 8 bit B) |
| Guadagno | 2 |
| Tempo di esposizione a 10x (ms) | 30 |
| Tempo di esposizione a 20x (ms) | 50 |
| Tempo di esposizione a 150x (ms) | 150 |
Tabella 1: Impostazioni del microscopio e della telecamera per l'acquisizione delle immagini. Impostazioni del microscopio, della telecamera e dell'acquisizione delle immagini utilizzate per l'immagine in campo chiaro con un microscopio eretto dotato di telecamera digitale a colori e software di acquisizione.
Discussione
Il materiale di erba medica utilizzato nel presente studio era costituito da cloni di cinque linee di erba medica. Due linee sperimentali sono state selezionate dopo due cicli di selezione divergente per la digeribilità della fibra in detergente neutro in vitro (IVNDFD) da piante madri con IVNDFD a 16 h e IVNDFD a 96 h rispettivamente basse o alte12. Allo studio sono state inoltre incluse tre linee commerciali con background genetici sconosciuti, e le piante madri sono state selezionate sulla base di analisi mediante spettroscopia nel vicino infrarosso per identificare individui con (a) contenuto più elevato di lignina, (b) contenuto più basso di lignina e (c) contenuto più basso di fibra in detergente neutro e fibra in detergente acido. Le cinque linee di erba medica sono state trapiantate da una serra nel maggio 2021 in prove sperimentali replicate in due località del Minnesota, Stati Uniti. Per entrambi i tagli, il primo e il secondo, di ogni stagione di crescita, sono stati raccolti 10 fusti da ciascuna linea di erba medica nelle fasi di maturità vegetativa, inizio formazione del bocciolo, inizio fioritura, fioritura e formazione del baccello verde. Il settimo internodo alla base di ciascun fusto è stato asportato e collocato in un tubo da 50 mL contenente una miscela 50:50 di etanolo al 200 gradi e acqua ultrapura, per lo stoccaggio fino all'incubazione delle sezioni trasversali. Questo metodo è stato sviluppato sulla base di lavori precedentemente condotti dal gruppo di laboratorio negli anni '90, in cui il settimo internodo è stato scelto come unità di studio4,6.
L'incubazione in vitro con liquido rumenale e la colorazione istologica dei fusti di alfalfa sono state utilizzate per comprendere i modelli di deposizione dei componenti della parete cellulare nei tessuti del fusto degradati. Le incubazioni in vitro hanno simulato il grado di degradazione che un fusto di alfalfa subisce nel rumine, e la successiva colorazione istologica ha evidenziato la lignina e le pectine nelle cellule in cui questi componenti della parete cellulare sono rimasti rilevabili dopo una digestione microbica controllata nel tempo. L'uso di un microtomo a slitta ha garantito uno spessore standardizzato delle sezioni trasversali, minimizzando gli artefatti di sezionamento che potrebbero interferire con i risultati13. Sebbene nel presente protocollo siano state analizzate solo lignina e pectina, coloranti alternativi come il blu di toluidina, il blu di Astra e il Rosso Diretto 23 possono essere utilizzati per la colorazione istologica di questi e di altri componenti della parete cellulare14,15,16. Inoltre, la luce polarizzata può essere impiegata per rilevare la cellulosa nelle pareti cellulari, e reagenti fluorescenti come la safranina O possono visualizzare la lignina17 e i polisaccaridi della parete cellulare. Inoltre, gli anticorpi possono essere utilizzati per marcare pectine specifiche18. Oltre all'alfalfa, questo protocollo potrebbe essere applicato ad altre specie. Tuttavia, le risposte alla colorazione possono variare tra specie, genotipi, stadi di sviluppo e condizioni ambientali19.
L'uso di un nastro adesivo bifacciale economico per fissare sezioni trasversali di fusto a vetrini in vetro è stato descritto in precedenza6,20. Prima di avviare questo protocollo di incubazione in vitro, è stato necessario identificare un nastro adesivo bifacciale in grado di resistere all'immersione in liquido per diversi giorni ed essere facilmente reperibile. Sono stati valutati diversi tipi di nastro, diversi per uso industriale indicato e spessore. In breve, pezzi di nastro bifacciale lunghi 1 pollice e sezioni trasversali di fusto sono stati fissati a vetrini in vetro ed immersi in acqua per durate variabili nell'arco di 1 settimana, al fine di determinare se rimanessero attaccati ai vetrini. Alcuni nastri bifacciali si sono staccati dai vetrini in vetro, mentre altri sono diventati opachi dopo un'esposizione prolungata al liquido. La perdita di trasparenza del nastro ha interferito con la microscopia e ha impedito l'acquisizione di immagini di alta qualità delle sezioni trasversali di fusto. Un nastro bifacciale in vinile si è comportato meglio rispetto agli altri adesivi testati. Il nastro utilizzato negli esperimenti originali era stato acquistato negli anni '90 ed era ancora efficace; tuttavia, lo stesso prodotto non è stato reperibile per esperimenti successivi. Pertanto, il nastro selezionato dovrebbe essere testato prima dell'uso per assicurare che sia il nastro sia le sezioni trasversali rimangano fissati per tutta la durata del periodo di incubazione. Il nastro dovrebbe inoltre rimanere trasparente per permettere l'acquisizione di immagini di alta qualità.
La fase di incubazione in vitro del protocollo comprendeva diverse fasi sensibili al tempo che richiedevano un'attenta pianificazione e coordinamento. Il tempo totale necessario per la procedura di incubazione in vitro può variare in base alle dimensioni dell'esperimento. Ad esempio, per generare un dataset robusto di sezioni trasversali di fusto, quattro fusti unici di alfalfa venivano montati su ogni vetrino per ogni campione × intervallo di incubazione in vitro × combinazione di coloranti. Con 16 campioni, sei intervalli di incubazione e due coloranti, erano necessarie complessivamente 768 sezioni trasversali di fusto per ogni esecuzione dell'incubazione in vitro. Erano necessarie circa 8 ore per preparare le 768 sezioni trasversali, che potevano quindi essere conservate durante la notte in piastre di Petri contenenti acqua ultrapura e montate il giorno successivo. Prima del montaggio, era necessario etichettare 192 vetrini e 96 provette centrifuga (50 mL). Il montaggio delle sezioni richiedeva ulteriori 8 ore poiché le sezioni venivano orientate in modo coerente tra gli intervalli di incubazione e i coloranti, per facilitare il confronto tra i tessuti dei fusti. Questo approccio richiedeva più tempo rispetto al montaggio casuale delle sezioni. I vetrini montati venivano conservati durante la notte in acqua ultrapura prima dell'inizio dell'incubazione in vitro il giorno successivo. Mentre le sezioni trasversali di fusto di alfalfa venivano preparate e montate, era inoltre necessario preparare il buffer di McDougall. Il buffer poteva essere preparato non più di 2 giorni prima dell'inizio dell'incubazione in vitro e doveva essere riscaldato a 39 °C prima dell'inoculazione delle sezioni montate. Pertanto, una pianificazione e preparazione accurata erano necessarie per il corretto completamento del protocollo.
La colorazione di Wiesner è comunemente utilizzata per visualizzare le strutture associate alla lignina nei tessuti vegetali. Sebbene questo metodo di colorazione sia relativamente semplice21 e ragionevolmente specifico22, colora i gruppi terminali di cinnamaldeide associati alle unità di lignina guaiaçil (G)13. Negli angiospermi dicotiledoni come la medicagine, le unità G e siringil (S) sono i costituenti principali del polimero di lignina, anche se sono presenti anche sotto-unità con anello H. La colorazione di Wiesner potrebbe quindi sottostimare la quantità totale di lignina nel fusto, poiché non reagisce con la lignina S. Entrambe le unità G e S possono essere presenti nel xilema interfascicolare e nelle fibre del floema primario (cioè nei tessuti sclerenchimatici); pertanto, anche se le unità S potrebbero non reagire con la colorazione di Wiesner, la colorazione delle unità G può indicare la presenza di strutture associate alla lignina in questi tessuti. La colorazione di Mäule potrebbe essere utilizzata per visualizzare le unità S e fornire una rappresentazione più completa delle unità di lignina nel fusto13. Inoltre, possono verificarsi variazioni nell'intensità della colorazione del pectato con rosso di rutenio a seconda dello stato di esterificazione o deesterificazione dell'acido pectico23. La colorazione può variare da una tonalità giallo-arancio a un colore rosso brillante. Poiché il rosso di rutenio può interagire con diversi carboidrati, l'uso di questo colorante potrebbe portare a una sovrastima della quantità di pectina nei tessuti11. Poiché la proporzione di lignina aumenta con la maturazione del fusto della medicagine, la lignina potrebbe interferire anche con la colorazione della pectina nei fusti più vecchi. Le differenze tra le sfumature di un determinato colorante possono risultare difficili da distinguere visivamente; tuttavia, le tecnologie di analisi delle immagini potrebbero aiutare a superare tale limitazione.
Dopo l'incubazione in vitro con liquido ruminale e la colorazione istologica, le sezioni trasversali dei fusti possono essere visualizzate al microscopio e le immagini possono essere acquisite per analisi successive. Poiché la colorazione di Wiesner svanisce entro 24 h9, l'analisi microscopica in campo chiaro dei fusti colorati per la lignina dovrebbe essere completata nello stesso giorno della colorazione, idealmente entro 6–8 h, per garantire una colorazione uniforme tra le immagini. La colorazione con rosso di rutenio mantiene la sua intensità nel tempo; pertanto, l'acquisizione delle immagini nello stesso giorno è meno critica. Tuttavia, anche le immagini colorate con rosso di rutenio sono state acquisite entro 6–8 h per garantire coerenza. Le immagini sono state acquisite utilizzando una telecamera digitale a colori ad alta definizione e ad alta risoluzione, dotata di un sensore d'immagine CMOS di grande formato. Sono stati utilizzati gli stessi tempi di esposizione, guadagno analogico, profondità di bit, qualità dell'immagine e impostazioni di messa a fuoco per garantire la comparabilità tra le immagini e ridurre al minimo le variazioni introdotte da differenze nelle impostazioni di acquisizione. Il tempo di esposizione è stato regolato in base all'ingrandimento (10×, 20× e 40×) per evitare sovraesposizione o sottoesposizione e ottenere immagini di alta qualità. Pertanto, i confronti devono essere effettuati tra immagini acquisite con lo stesso ingrandimento per ridurre al minimo le variazioni associate a diverse impostazioni di esposizione. Le impostazioni di acquisizione delle immagini potrebbero richiedere aggiustamenti a seconda del microscopio e della telecamera utilizzati (Tabella 1). Altre tecniche di microscopia, tra cui la microscopia elettronica a scansione 6,20 e la microscopia a fluorescenza14,15,17, sono state utilizzate anche per visualizzare i componenti della parete cellulare, sebbene nel presente protocollo sia stata impiegata la microscopia in campo chiaro.
Questo protocollo ha generato un ampio insieme di dati composto da immagini di sezioni trasversali di fusto (>15.000), che potrebbe essere sfruttato per estendere le informazioni qualitative ottenute con questo protocollo mediante colorazione istologica verso analisi quantitative basate su tecnologie di apprendimento automatico. Le procedure di analisi delle immagini efficienti possono automatizzare ed accelerare l'estrazione di dati quantitativi dalle immagini. Una collaborazione con informatici può facilitare lo sviluppo di strumenti per preelaborare le immagini, rimuovere il rumore estraneo ed estrarre le caratteristiche di interesse al fine di verificare diverse ipotesi. Gli approcci di apprendimento automatico richiedono set di dati di addestramento e di test adeguati e di dimensioni sufficienti per garantire prestazioni robuste del modello. Dataset più piccoli possono essere analizzati utilizzando approcci di analisi delle immagini più semplici, come la misurazione manuale delle caratteristiche di interesse mediante software di analisi delle immagini come ImageJ24 o con il software di analisi delle immagini associato al microscopio25. Pertanto, considerare l'utilizzo successivo previsto per le immagini può migliorare l'efficienza nella determinazione del tipo e del numero di immagini da acquisire, nonché dell'approccio analitico successivo.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcuna relazione commerciale o finanziaria che possa essere considerata un potenziale conflitto di interessi. La menzione di nomi commerciali o prodotti in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione né approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti è un ente e datore di lavoro che garantisce pari opportunità. Tutti gli esperimenti hanno rispettato le leggi vigenti negli Stati Uniti, il paese in cui sono stati eseguiti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano R. Ted Jeo per i suoi spunti riguardo a precedenti lavori correlati. Un ringraziamento al centro di imaging universitario dell'Università del Minnesota - Twin Cities per aver fornito l'accesso al software di acquisizione e analisi delle immagini al microscopio necessario per preparare le immagini per la pubblicazione. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti – Servizio di Ricerca Agricola [062-21500-001-000D] e dall'accordo di cooperazione senza assistenza (n. 58-5062-2-016).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Foglio di alluminio | Boardwalk | 7106BW | 18 in × 1.000 ft; utilizzato per proteggere le soluzioni coloranti sensibili alla luce |
| Cloruro di calcio diidrato, min. 99% | Sigma Life Science | C7902-500G | CAS n. 10035-04-8; reagente per il buffer di McDougall’s |
| Software per fotocamera | Nikon | NIS-Elements AR 5.42.04 | Software di imaging a 64 bit utilizzato per l'acquisizione e l'analisi delle immagini |
| Gas di anidride carbonica | Matheson | UN1013 | Grado tecnico; utilizzato per mantenere condizioni anossiche durante la preparazione e l'incubazione |
| Bagno termostatato a circolazione d'acqua | Precision | — | Bagno termostatato a circolazione d'acqua utilizzato per mantenere i campioni a 39 °C |
| Standard di stelo di mais | Università del Minnesota | NA | Raccolto nell'autunno 2023 a St. Paul, Minnesota, USA; macinato a 1 mm e utilizzato come substrato microbico |
| Vetrino coprioggetto | Thermo Scientific | 3419 | 24 mm × 30 mm, spessore No. 1,5, 1 oz |
| Fotocamera digitale a colori Digital Sight 10 con sensore d'immagine CMOS di grande formato FX | Nikon | MQA20000 | Fotocamera digitale a colori utilizzata per acquisire immagini microscopiche in campo chiaro |
| Microscopio stereoscopico | Nikon | SMZ18 | Microscopio stereoscopico utilizzato per orientare e posizionare sezioni trasversali di fusto |
| Nastro adesivo doppio | SelloTape Office Vinyl Double Sided Tape | 4270 | 2 mm × 53 m; utilizzato per fissare le sezioni trasversali di fusto ai vetrini |
| Bilancia elettronica | AND | GH-202 | Bilancia analitica con lettura a quattro cifre decimali |
| Beuta Erlenmeyer (125 mL) | Kimax | 25600 | Beuta da 125 mL; compatibile con tappo n. 5 |
| Beuta Erlenmeyer (25 mL) | Pyrex | 4980 | Beuta da 25 mL; compatibile con tappo n. 0 |
| Etilene (200 proof) | Fisher Scientific | 04-355-720 | Etilene assoluto utilizzato per la preparazione delle soluzioni coloranti e dei risciacqui pre-colorazione |
| Isolante rigido in polistirene espanso | Owens Corning | 1407788 | 1 in × 2 ft × 2 ft, R-5, 15 PSI; utilizzato per sostenere gli internodi del fusto durante la sezionatura |
| Pinzette | Fisher Scientific | 10-316A | Pinzette da laboratorio utilizzate per manipolare segmenti di fusto, vetrini e sezioni montate |
| Vetrini in vetro | FisherBrand | 125503 | 25 mm × 75 mm × 1 mm; utilizzati per il montaggio di sezioni trasversali di fusto |
| Beuta sferica (6 L) | Pyrex | CLS43205L-4EA | Beuta in vetro da 6 L utilizzata per la preparazione o la manipolazione di volumi maggiori di soluzione |
| Glicerina, liquido di grado laboratorio | Fisher Science Education | 525342C | CAS n. 56-81-5; glicerolo utilizzato nelle soluzioni di montaggio e conservazione |
| Tela di cotone a doppio strato grado 50 | JINIOHEE Shop | B0FL27KXRN | 100% cotone, sbiancato; utilizzato per filtrare materiale rumenale e fluido rumenale |
| Cilindro graduato (10 mL) | Pyrex | 700024 | Cilindro graduato da 10 mL utilizzato per misurare volumi liquidi |
| Acido cloridrico | Fisher | A1445-500 | CAS n. 7647-01-0; utilizzato con la floroglucina per preparare la colorazione di Wiesner |
| Pennarello industriale super permanente | Sharpie | 13601 | Punta fine; utilizzato per etichettare i tubi di incubazione con marcature resistenti all'acqua |
| Cloridrato di L-cisteina idrato | Sigma-Aldrich | C121800-10G | CAS n. 345909-32-2; agente riducente utilizzato nella preparazione della soluzione di incubazione |
| Tessuto a basso rilascio di lanugine | Kimberly-Clark | 34155 | 4,5 in × 8,5 in; utilizzato per asciugare l'eccesso di liquido dai vetrini senza lasciare fibre |
| Lama per microtomo a profilo ridotto | Leica 819 | 63065-LP | Lama sostitutiva a profilo ridotto utilizzata per preparare sezioni trasversali di fusto uniformi |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Fisher Chemical | M80-500 | CAS n. 10034-99-8; reagente per il buffer di McDougall’s |
| Barra magnetica per agitazione | Fisher Scientific | 03-411-783 | 76 mm × 12 mm; utilizzata per mescolare soluzioni tampone e di inoculo |
| Etichette per indirizzi postali | Avery | 5167 | 1/2 in × 1 3/4 in; utilizzate per l'identificazione di campioni e vetrini |
| Pennello | Loew-Cornell | — | Serie 7000, n. 3 tondo; pennello fine utilizzato per trasferire e manipolare sezioni trasversali di fusto |
| Piastre di Petri con coperchio | Becton Dickinson Labware | 81731119 | 60 mm × 15 mm; utilizzate per la conservazione temporanea di sezioni trasversali di fusto in acqua ultrapura |
| Floroglucina, 1,3,5-triidrossibenzene | Sigma-Aldrich | P3502-25G | CAS n. 108-73-6; reagente utilizzato per preparare la colorazione di Wiesner |
| Pipetta (100 μL) | Gilson | P 1000; 767547M | Pipetta a volume regolabile utilizzata per dispensare soluzioni coloranti |
| Imbuto in plastica per uso generale | Nalgene | 10-437-23E | 150 mm; utilizzato per il trasferimento e la filtrazione dei reagenti |
| Beccherello in polipropilene (4 L) | Nalgene | 1201-4000 | Beccherello da 4 L resistente ai prodotti chimici, utilizzato per la preparazione e il mescolamento delle soluzioni di inoculo |
| Cloruro di potassio | Fisher Chemical | P217-500 | CAS n. 7447-40-7; reagente per il buffer di McDougall’s |
| Lame da barba | Personna | 66-0089 | Spessore 0,009 in; utilizzate per il taglio manuale del materiale di fusto |
| Rosso di rutenio, ossicloruro di rutenio ammoniato | Sigma | R-2751 | CAS n. 11103-72-3; colorante istologico utilizzato per visualizzare le sostanze pectiche |
| Forbici | Fiskars | 1063071 | Forbici per uso generale utilizzate per tagliare nastro, schiuma e altri materiali di consumo |
| Tubi conici per centrifuga con tappo a vite (50 mL) | Corning | 430828 | In polipropilene, non pirogeni; utilizzati per contenere, incubare, risciacquare e conservare i campioni |
| Microtomo a slitta | Leica | 2000R | Microtomo a slitta utilizzato per preparare sezioni trasversali di fusto spesse 100 μm |
| Bicarbonato di sodio, grado ACS | Fisher Chemical | S233-3 | CAS n. 144-55-8; reagente per il buffer di McDougall’s |
| Cloruro di sodio | Fisher Chemical | — | CAS n. 7647-14-5; reagente per il buffer di McDougall’s |
| Idrossido di sodio | Fisher Chemical | S318-500 | CAS n. 1310-73-2; utilizzato nella preparazione della soluzione riducente |
| fosfato dibasico di sodio anidro (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | S-9763 | CAS 7558-79-4 |
| Solfuro di sodio anidro, ACS, min. 98,0% | Oakwood Chemicals | 245960 | CAS n. 1313-84-4; agente riducente utilizzato nella preparazione della soluzione di incubazione |
| Cucchiaio da laboratorio (spatola) | Fisher Scientific | 14-375-10 | Spatola da laboratorio utilizzata per trasferire reagenti in polvere |
| Piastra magnetica per agitazione | Thermolyne by Sybron | 7200 | Piastra magnetica per agitazione utilizzata per mescolare soluzioni tampone e di inoculo |
| Siringa (60 mL) con ago largo | Monoject | 935401028 | Siringa da 60 mL con ago a grande diametro utilizzata per dispensare la soluzione di inoculo |
| Portaprovette | Thermo Scientific | 14-809-44 | Portaprovette utilizzati per organizzare e sostenere i tubi di incubazione da 50 mL |
| Termometro | FisherBrand | 13201663 | Termometro da laboratorio utilizzato per verificare la temperatura delle soluzioni e del bagno d'acqua |
| Microscopio eretto | Nikon | Eclipse Ni | Microscopio eretto in campo chiaro utilizzato per la visualizzazione e l'acquisizione di immagini di sezioni trasversali di fusto colorate |
| Pompa per uso generale | Little Giant Pump Co. | 502203 | Modello 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; utilizzata per far circolare l'acqua e mantenere una temperatura uniforme nel bagno |
| Carta da pesata | VWR Scientific Products | 12578-165 | Carta da pesata monouso utilizzata per pesare e trasferire reagenti solidi e substrato di stelo di mais |
Riferimenti
- Cosgrove DJ. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005;6(11):850-861.
- Moore KJ, Jung H-JG. Lignin and fiber digestion. Journal of Range Management. 2001;54(4):420-430.
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