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Articolo metodologico

Incubazione in vitro con Liquido Rumen e Colorazione Istologica di Componenti Selezionati della Parete Cellulare in Fusti di Erba Medica (Medicago sativa L.)

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DOI:

10.3791/73286

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18 settembre 2026

 , 
1Department of Agronomy and Plant Genetics, University of Minnesota - Twin Cities, 2United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo visualizza il deposito di lignina e componenti della parete cellulare pectinici in sezioni trasversali di fusti di alfalfa (Medicago sativa L.). L'obiettivo è identificare tessuti specifici del fusto che potrebbero essere presi di mira per sviluppare nuove linee di alfalfa con caratteristiche desiderabili di digeribilità del fusto.

Abstract

L'accumulo di componenti della parete cellulare durante la crescita delle piante limita la qualità nutrizionale dei foraggi per i ruminanti. In particolare, il deposito di lignina nei tessuti vegetali ostacola la degradazione dei carboidrati della parete cellulare, come cellulosa ed emicellulosa, riducendo così la quantità di energia ottenibile dai foraggi. Il componente pectina della parete cellulare, invece, altamente digeribile, è facilmente disponibile per la degradazione. Informazioni riguardo al deposito di lignina e pectina in diversi tipi cellulari del fusto possono fornire spunti meccanicistici sui fattori alla base della variabilità nella digeribilità del fusto tra diverse linee di alfalfa. L'incubazione in vitro di sezioni trasversali del fusto in fluido rumenale simula i processi che i tessuti del fusto subiscono nel rumine. Abbinata a colorazioni istologiche e microscopia, questa metodica permette di visualizzare nel tempo i cambiamenti nella degradazione dei tessuti e la localizzazione di lignina e pectina nel fusto. Il colorante di Wiesner reagisce con le unità aldeidiche guaiaçil (G) della lignina, tingendole di fucsia. Analogamente, il rosso di rutenio interagisce con i gruppi carbossilici della pectina, colorando la pectina nel fusto con tonalità che vanno dal rosa al marrone. Questo protocollo descrive la digestione di sezioni trasversali del fusto di alfalfa dopo l'esposizione a microrganismi ruminali, seguita da colorazione per visualizzare i modelli di distribuzione di lignina e pectina nelle pareti cellulari. Il metodo può essere utilizzato per identificare i tessuti del fusto in cui lignina e pectina sono presenti o assenti, facilitando confronti tra diverse linee di alfalfa.

Introduzione

Una parete cellulare racchiude ogni cellula vegetale. La cellulosa, l'emiceullulosa, la lignina e la pectina sono componenti della parete cellulare e contribuiscono alla fibra vegetale, un elemento necessario nella dieta dei ruminanti. Mentre le pectine sono polisaccaridi altamente digeribili (solubili)1, la lignina è un polimero indigeribile che limita la degradazione della fibra2. La lignina riduce quindi la digeribilità della pianta e, in ultima analisi, diminuisce l'energia disponibile per il ruminante proveniente dai foraggi. Tuttavia, la lignina svolge importanti funzioni fisiologiche nella pianta, come il trasporto dell'acqua in tutta la pianta attraverso il rinforzo degli elementi dei tracheidi3. Studi precedenti hanno dimostrato che modifiche alla fibra del fusto che riducono la lignina o aumentano la pectina potrebbero migliorare la digeribilità del fusto e il valore nutritivo del foraggio4. Pertanto, questo protocollo si concentra su questi due componenti della parete cellulare. Le concentrazioni totali di lignina e pectina nella parete cellulare del fusto forniscono informazioni insufficienti per spiegare i meccanismi alla base della digeribilità della fibra del fusto5. L'incubazione in vitro con liquido rumenale e la colorazione istologica possono fornire informazioni a livello cellulare, visualizzando le differenze nei componenti della parete cellulare tra piante con diversa digeribilità della fibra del fusto4,6. Nel presente protocollo, la medicaiola (Medicago sativa L.), una comune leguminosa foraggera perenne, funge da specie modello per illustrare i modelli di distribuzione di lignina e pectina nei tessuti del fusto, che contengono più lignina ma meno pectina rispetto alle foglie.

L'incubazione in vitro con liquido rumenale simula la digestione dei foraggi nello stomaco dei ruminanti, permettendo di osservare gli effetti dell'anatomia del foraggio sulla digeribilità. Creando in provetta condizioni simili a quelle presenti nel rumine, sezioni trasversali di fusto aderenti a vetrini possono essere prelevate in diversi momenti al fine di valutare il grado di degradazione dei tessuti dopo l'esposizione al liquido rumenale6. Questo metodo fornisce un approccio relativamente semplice, rapido ed economico per visualizzare le strutture anatomiche dei fusti di erba medica7 ed esaminare come i diversi tipi cellulari contenenti componenti della parete cellulare variano durante la digestione del fusto.

La colorazione istologica di sezioni trasversali di fusto permette la visualizzazione dei componenti della parete cellulare. Il floroglucinolo e l'acido cloridrico (HCl) si combinano per formare la colorazione di Wiesner, che evidenzia i tessuti del fusto contenenti unità ligniniche ricche di guaiacile8 reagendo con i monomeri aldeidici G C6C3 (coniferaleide)9. La lignina è composta da diverse sotto-unità monomeriche; tuttavia, in tutto l'articolo, il termine “lignina” si riferisce esclusivamente al monomero unità G, poiché è il monomero che reagisce con la colorazione di Wiesner10 e quindi viene visualizzato mediante questo protocollo. Alcuni tessuti, come i vasi xilematici, sono sempre lignificati6. In generale, la deposizione della lignina nei tessuti del fusto della medica inizia quando inizia la crescita secondaria (cambiale) e coincide con la cessazione dell'allungamento degli internodi del fusto6. Il rosso di rutenio si lega alle sostanze pectiche, che contengono gruppi carbossilici talvolta esterificati e condividono alcune catene laterali11. I gruppi carbossilici delle pectine presenti nella lamella media e nelle pareti cellulari primarie interagiscono con il rosso di rutenio11. La pectina è coinvolta nell'allungamento cellulare ed è pertanto presente nelle cellule durante la crescita primaria. Nel manoscritto, il termine “pectina” indica in generale l'insieme delle pectine che possono essere presenti. L'accoppiamento della colorazione istologica con l'incubazione in vitro rumenale facilita l'osservazione della localizzazione dei componenti della parete cellulare nel fusto ed evidenzia come i diversi tipi cellulari cambino durante la digestione rumenale. In definitiva, questo protocollo può essere utilizzato per identificare le cellule del fusto contenenti lignina e pectina e per caratterizzare i modelli osservati in diverse linee di medica e in diversi tempi di incubazione.

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Protocollo

Questa ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali per i soggetti animali (IACUC 2301-40689B).

1. Etichettatura delle provette del campione

  1. Preparazione ed etichettatura delle provette campione per incubazione, conservazione e colorazione
    1. Etichettare preventivamente cinque serie distinte di provette coniche graduate da 50 mL, monouso e con tappo a vite, per ogni campione. Aggiungere l'identificativo del campione e il tempo di incubazione a ciascuna provetta per le finalità descritte di seguito.
    2. Etichettare le provette di attesa pre-incubazione e aggiungere 35 mL di acqua ultrapura.
    3. Etichettare le provette per l'incubazione da utilizzare nei paragrafi 3 e 4. Organizzare le provette in rack separati in base al tempo di incubazione (0, 4, 8, 24, 48 o 96 h).
      NOTA: Utilizzare un pennarello indelebile di grado industriale per evitare che le etichette si sciolgano nel bagnomaria.
    4. Etichettare le provette per la conservazione post-incubazione e aggiungere 35 mL di una miscela 50:50 di glicerolo al 100% e acqua ultrapura. Utilizzare queste provette per conservare le sezioni trasversali digerite su vetrini fino alla colorazione.
    5. Etichettare le provette pre-colorazione e aggiungere 35 mL di una miscela 50:50 di etanolo al 200 proof e acqua ultrapura. Utilizzare queste provette per estrarre il glicerolo dalle sezioni trasversali prima della colorazione.
    6. Etichettare le provette per l'idratazione e aggiungere 35 mL di acqua ultrapura.

2. Sezionamento trasversale del fusto e montaggio su vetrini

  1. Utilizzando pinzette, selezionare un segmento di fusto alla volta dai fusti campione ed escindere la parte centrale del segmento.
    NOTA: Utilizzare quattro fusti per campione come repliche tecniche per ciascuna replica biologica. Selezionare casualmente i quattro fusti tra tutti i fusti disponibili per campione. Utilizzare un ulteriore insieme di fusti standard come controllo in tutte le serie di incubazione.
  2. Tagliare due rettangoli di polistirene espanso rigido isolante, ciascuno di circa 2,5 cm di lunghezza e 0,6 cm di spessore. Praticare una piccola scanalatura lungo la lunghezza di ciascun pezzo in modo che un internodo del fusto si adatti perfettamente tra i due pezzi di schiuma.
  3. Montare il "panino" di fusto sul portapreparati di un microtomo scorrevole in grado di produrre sezioni spesse 100 μm. Utilizzando un pennello a punta fine, depositare una goccia d'acqua sul fusto e sulla lama del microtomo per facilitare un'incisione pulita.
  4. Tagliare le sezioni trasversali del fusto con uno spessore di 100 μm. Utilizzare il pennello per trasferire ciascuna sezione trasversale in una piastra di Petri pre-etichettata contenente acqua ultrapura per la conservazione temporanea ed eliminare qualsiasi residuo di schiuma dalla piastra.
    NOTA: Sostituire la lama del microtomo se la schiuma si strappa, poiché lo strappo potrebbe indicare una lama smussata.
  5. Etichettare manualmente due vetrini standard da 25 mm × 75 mm per ogni campione a ciascun tempo di incubazione (2 colorazioni × 6 punti temporali = 12 vetrini per campione per ciascuna replica biologica). Riportare su ciascuna etichetta l'identificativo del campione, il tempo di incubazione e la colorazione.
  6. Tagliare un pezzo di nastro adesivo doppia faccia largo 2 mm e lungo 2,5 cm. Posizionare il lato corto del nastro a 0,5 cm dal fondo del vetrino, con la faccia adesiva rivolta verso il basso, e premere con fermezza sul lato in carta cerata del nastro indossando guanti per assicurare l'adesione.
    NOTA: Eseguire questo passaggio su una superficie piana per evitare di rompere i vetrini.
  7. Utilizzare un microscopio stereoscopico per orientare tutte le sezioni trasversali nella stessa direzione. Rimuovere la carta cerata dal nastro adesivo doppia faccia e, mantenendo l'orientamento delle sezioni trasversali, trasferirle sul nastro del vetrino pre-etichettato utilizzando un pennello a punta fine bagnato. Mantenere le sezioni trasversali leggermente umide.
  8. Posizionare la carta cerata sopra le sezioni trasversali e arrotolare leggermente il pennello per fissarle saldamente al nastro adesivo doppia faccia. Rimuovere la carta cerata e inserire il vetrino montato contenente quattro sezioni trasversali nel tubo portaoggetti pre-etichettato descritto al punto 1.1.2, assicurandosi che l'acqua ultrapura ricopra le sezioni trasversali montate.
  9. Per la colorazione con rosso di rutenio e con la colorazione di Wiesner, posizionare due vetrini uno di fronte all'altro in ciascun tubo portaoggetti, con il nastro adesivo doppia faccia rivolto verso l'esterno.
    NOTA: Dopo aver montato tutti i vetrini e posizionati nei tubi contenenti acqua ultrapura, conservare i vetrini tutta la notte a temperatura ambiente se necessario.

3. Preparazione per l'incubazione in vitro di sezioni trasversali di fusto

  1. Utilizzare le provette monouso da 50 mL con tappo a vite preparate per l'incubazione (vedere 1.1.3). Riunire tutte le provette campione per ciascun intervallo di incubazione su un'unica rack di plastica.
  2. Utilizzare una bilancia analitica a quattro cifre decimali per pesare 0,2 g di paglia di mais standard macinata a 1 mm su carta da filtro, quindi trasferire con attenzione il materiale in ciascuna provetta di incubazione, eccetto quelle a 0 h, che fungono da controllo non incubato. Chiudere le provette e metterle da parte fino al momento dell'uso.
    NOTA: La paglia di mais standard fornisce energia per sostenere i microrganismi del rumine durante l'incubazione, poiché la biomassa delle sezioni trasversali del fusto non è sufficiente a mantenere l'attività microbica.
  3. Riempire un bagno termostatato a circolazione con acqua sufficiente ed equilibrarlo a 39 °C prima di iniziare l'incubazione. Regolare la profondità dell'acqua in modo da coprire il segno dei 35 mL sulle provette da 50 mL e utilizzare un aeratore, se necessario, per mantenere una circolazione e una temperatura uniformi.
  4. Preparazione del buffer di McDougall per la soluzione di inoculo
    1. Preparare il buffer di McDougall non più di 2 giorni prima di iniziare le incubazioni.
      NOTA: Mescolare il buffer di McDougall con liquido rumenale in rapporto 4:1 per preparare la soluzione di inoculo. Regolare il volume del buffer in base al numero di campioni e preparare una quantità sufficiente di soluzione di inoculo per fornire 30 mL per provetta.
    2. Misurare 1.600 mL di acqua ultrapura. Trasferirne 1 L in un matraccio Erlenmeyer piano da 3 L e riservare 600 mL per il trasferimento e il risciacquo dei reagenti.
    3. Posizionare un agitatore magnetico nel matraccio Erlenmeyer e collocare il matraccio su una piastra agitatrice.
    4. Posizionare un imbuto di plastica nel matraccio Erlenmeyer. Aggiungere 15,7 g di bicarbonato di sodio (NaHCO₃), 5,9 g di fosfato dibasico di sodio anidro (Na₂HPO₄), 0,91 g di cloruro di potassio (KCl), 0,75 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,19 g di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO₄·7H₂O) e 0,06 g di cloruro di calcio diidrato (CaCl₂), aggiungendo un reagente alla volta e attendendo che ciascuno si sciolga prima di aggiungere il successivo. Utilizzare porzioni dei 600 mL di acqua ultrapura riservati per risciacquare l'imbuto dopo ogni aggiunta.
    5. Dopo aver aggiunto il cloruro di calcio diidrato, inserire un diffusore di CO₂ per facilitare la dissoluzione e spurgare la soluzione. Una volta che la soluzione diventa limpida, continuare lo spurgo per ulteriori 10–15 min.
    6. Chiudere ermeticamente il matraccio e fissare il tappo con nastro adesivo, poiché il riscaldamento del buffer potrebbe pressurizzare il contenitore.
    7. Conservare la soluzione a 20 °C per un massimo di 2 giorni. Immergere la soluzione in un bagno d'acqua a 39 °C il giorno prima dell'uso, oppure posizionarla direttamente nel bagno a 39 °C se verrà utilizzata il giorno successivo.

4. Incubazione in vitro di sezioni trasversali del fusto

  1. Il giorno dell'incubazione, versare 47 mL di acqua e 4 mL di NaOH 1 N in un becher da 100 mL sotto cappa, quindi aggiungere 0,625 g di cisteina-HCl. In un secondo becher da 100 mL, aggiungere 0,625 g di solfuro di sodio a 47 mL di acqua, mantenendo le due soluzioni separate fino alla preparazione della soluzione di inoculo.
  2. Riempire un thermos isolato con acqua calda per creare un ambiente caldo durante il trasporto dei microrganismi ruminale dalla mucca al laboratorio. Portare un secchio da cinque galloni per trasferire l'acqua calda dal thermos.
  3. Recarsi nel capannone per raccogliere il liquido ruminale dalla mucca cannullata assegnata all'esperimento dalla gestione del capannone.
    NOTA: Raccogliere il liquido ruminale approssimativamente alla stessa ora del giorno e dalla stessa mucca durante tutto l'esperimento per minimizzare le variazioni. Coordinarsi con la gestione del capannone per fornire un preavviso sull'orario di arrivo per il prelievo del liquido ruminale.
  4. Identificare la mucca sperimentale e indossare l'equipaggiamento di protezione personale appropriato, compresi camice da laboratorio, protezione oculare, copriscarpe e guanti lunghi fino alle spalle.
    NOTA: Limitare le procedure descritte nei punti 4.4–4.8 al personale autorizzato ai sensi del protocollo IACUC applicabile.
  5. Trasferire l'acqua calda dal thermos al secchio da cinque galloni. Preparare due strati di garza grado 50 (tela di cotone) per filtrare il materiale ruminale.
  6. Prelievo del liquido ruminale dalla mucca cannullata
    1. Aprire con attenzione la cannula e posizionare il tappo nel secchio da cinque galloni contenente acqua calda per evitare di contaminare il tappo. Con una mano guantata, rimuovere una quantità sufficiente di materiale dal rumine per accedere all'interfaccia solido-liquido del rumine.
    2. Una volta raggiunta l'interfaccia solido-liquido, raccogliere diverse manciate di materiale e spremere attraverso due strati di garza grado 50, ciascuno di circa 45 cm di lato, in un thermos con tappo a vite preriscaldato. Scartare il materiale residuo dopo aver spremuto il liquido ruminale attraverso la garza.
    3. Ripetere il passaggio 4.6.2 fino a ottenere 1 L di liquido ruminale nel thermos per ogni serie di 60 provette di inoculo, regolando il volume in base al numero di campioni da incubare.
      NOTA: Le mucche cannullate hanno limiti specifici riguardo alla quantità di liquido ruminale estraibile in una determinata settimana. Comunicare con il responsabile del capannone per assicurarsi che la quantità prelevata non superi il limite consentito per la mucca.
  7. Dopo aver raccolto una quantità sufficiente di liquido ruminale, chiudere ermeticamente il thermos per mantenerne la temperatura. Riposizionare la cannula e utilizzare l'acqua calda nel secchio da cinque galloni per la pulizia.
  8. Smaltire copriscarpe, guanti e garza usati nel contenitore di smaltimento appropriato prima di lasciare il capannone. Tornare al laboratorio il più rapidamente possibile per mantenere la temperatura e le condizioni anossiche del liquido ruminale.
  9. Al ritorno in laboratorio, unire le due soluzioni di agente riducente (vedi punto 4.1) sotto cappa e mescolarle per preparare la soluzione riducente.
  10. Posizionare un becher di vetro con capacità di almeno 2 L contenente una barretta magnetica su un agitatore riscaldato impostato a <30 °C e posizionare un diffusore di CO₂ sopra il liquido. Aggiungere 1.600 mL di tampone di McDougall e agitare lentamente, evitando che il diffusore di CO₂ entri in contatto con il liquido.
    NOTA: Se desiderato, è possibile utilizzare un becher in polipropilene a questa bassa temperatura. Utilizzare CO₂ per dislocare l'O₂ e contribuire al mantenimento delle condizioni anossiche.
  11. Foderare un imbuto grande con due strati di tela di cotone grado 50 e posizionarlo sopra un cilindro graduato da 2 L. Filtrare 400 mL di liquido ruminale e aggiungerli al tampone di McDougall (vedi punto 3.4.7) per preparare la soluzione di inoculo.
  12. Aggiungere 80 mL della soluzione riducente (vedi punto 4.9) alla soluzione di inoculo e mescolare lentamente. Evitare che il diffusore di CO₂ entri in contatto con il liquido.
  13. Sotto cappa, rimuovere i tappi dalle provette di incubazione e organizzarle in rack separati in base al tempo di incubazione. Svitare i tappi dalle provette di mantenimento pre-incubazione in preparazione per il trasferimento dei vetrini (vedi punto 1.1.2).
  14. Selezionare casualmente una provetta di mantenimento pre-incubazione alla volta e utilizzare pinzette per trasferire i vetrini montati nella corrispondente provetta di incubazione (vedi punto 1.1.3). Posizionare ogni provetta di incubazione contenente i vetrini montati in un piccolo rack e mettere da parte la provetta di mantenimento pre-incubazione.
    NOTA: Utilizzare due persone per eseguire i passaggi 4.14–4.15. Ove possibile, minimizzare il raffreddamento della miscela liquido ruminale-tampone.
  15. Aspirare 30 mL di soluzione di inoculo in una siringa da 60 mL munita di ago largo e smussato. Dispensare lentamente la soluzione lungo la parete della provetta di incubazione, purgare la provetta con CO₂ per circa 20 s, chiuderla con il tappo e riporla nel rack.
  16. Posizionare i rack contenenti le provette inoculate in un bagno d'acqua a 39 °C. Agitare delicatamente le provette almeno una volta al giorno e spostare la posizione dei rack quotidianamente per minimizzare riscaldamenti non uniformi.
    NOTA: La formazione di bolle di gas nelle provette indica una fermentazione attiva.
  17. Al termine di ogni periodo di incubazione, rimuovere il corrispondente rack dal bagno d'acqua. Aprire una provetta alla volta, rimuovere ogni vetrino e risciacquare delicatamente via i solidi e la soluzione di inoculo residua con acqua ultrapura.
  18. Posizionare i vetrini risciacquati nelle provette di conservazione post-incubazione contenenti la miscela glicerolo-acqua descritta al punto 1.1.4.

5. Colorazione delle sezioni trasversali per la lignina

  1. Se i vetrini sono stati conservati in una miscela 50:50 di glicerolo-acqua, trasferire entrambi i vetrini contenenti le sezioni trasversali montate in tubi per il pre-risciacquo contenenti la soluzione di etanolo-acqua ultrapura (vedere 1.1.5). Conservare i tubi tutta la notte in frigorifero per rimuovere il glicerolo prima della colorazione.
  2. Preparare una soluzione al 3% di floroglucinolo (PG) sciogliendo 0,3 g di PG in 10 mL di etanolo assoluto in un matraccio Erlenmeyer da 25 mL avvolto in carta d'alluminio per proteggere il reagente fotosensibile dalla luce. Tappare e etichettare il matraccio con il nome della soluzione, la data di preparazione e il nome del preparatore, quindi conservarlo a 20 °C.
  3. Rimuovere i vetrini dai tubi refrigerati e trasferirli temporaneamente nei tubi di idratazione descritti al punto 1.1.6, contenenti acqua ultrapura al 100%.
    NOTA: Mantenere le sezioni trasversali idratate durante la manipolazione per ridurre al minimo l'ossidazione, che potrebbe danneggiare le sezioni e compromettere l'analisi successiva mediante imaging.
  4. Preparare la colorazione di Wiesner nella cappa aspirante utilizzando una pipetta, mescolando 50 μL di soluzione al 3% di PG in etanolo (vedere 5.2) con 25 μL di acido cloridrico (HCl) in un becher da 50 mL.
    NOTA: Regolare le quantità in base al numero di vetrini, mantenendo un rapporto PG:HCl di 2:1.
    ATTENZIONE: Manipolare l'acido cloridrico nella cappa aspirante poiché è corrosivo per i metalli, causa gravi ustioni cutanee e danni agli occhi e può provocare irritazione respiratoria. Evitare di inalare vapori o aerosol, indossare guanti, abbigliamento, protezione oculare e facciale adeguati e lavare accuratamente la pelle esposta dopo l'uso.
  5. Rimuovere un vetrino dal tubo e asciugare delicatamente il vetro intorno al nastro adesivo doppia faccia con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi per evitare che la soluzione di colorazione coli dal nastro. Posizionare il vetrino su un piccolo vassoio di plastica e utilizzare una pipetta per applicare alcune gocce di colorazione di Wiesner sulle sezioni trasversali. 
  6. Impostare un timer per 12 minuti e coprire i vetrini con carta d'alluminio per proteggerli dalla luce. Controllare le sezioni trasversali durante la colorazione e riapplicare la soluzione se necessario per evitare l'essiccazione.
    NOTA: Evitare che le sezioni trasversali si secchino poiché l'ossidazione potrebbe danneggiare il tessuto e compromettere l'analisi successiva mediante imaging.
  7. Dopo 12 minuti, rimuovere delicatamente l'eccesso di colorazione di Wiesner con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi. Lavare il tessuto prima del montaggio per ridurre al minimo l'esposizione dell'obiettivo del microscopio ai vapori corrosivi di HCl.
  8. Applicare 1–2 gocce di soluzione al 50% di glicerolo-acqua ultrapura su ciascuna sezione trasversale e coprire con un coprioggetto di dimensioni 24 mm × 30 mm (spessore No. 1.5). Procedere immediatamente all'analisi microscopica e all'acquisizione delle immagini.
    NOTA: Acquisire le immagini entro 6–8 ore poiché la colorazione di Wiesner è sensibile al tempo e potrebbe ingiallire e diffondersi dalla sezione trasversale con il passare del tempo.

6. Colorazione in sezione trasversale per la pectina

  1. Seguire il punto 5.1 per rimuovere la miscela di glicerolo e acqua ultrapura da vetrini conservati prima della colorazione.
  2. Preparare una soluzione di rosso di rutenio allo 0,02% sciogliendo 0,02 g di rosso di rutenio in 100 mL di acqua ultrapura in un matraccio Erlenmeyer da 125 mL avvolto in carta d'alluminio per proteggere il reagente fotosensibile dalla luce. Tappare e etichettare il matraccio con il nome della soluzione, la data di preparazione e il nome del preparatore, quindi conservarlo a 20 °C.
  3. Rimuovere i vetrini dai tubi refrigerati contenenti la miscela etanolo-acqua ultrapura e trasferire i vetrini correttamente etichettati con sezioni montate in tubi contenenti acqua ultrapura al 100% (vedere punto 1.1.6) per il mantenimento temporaneo.
    NOTA: Seguire le precauzioni di idratazione descritte al punto 5.3.
  4. Rimuovere un vetrino dall'acqua ultrapura utilizzando pinzette e asciugare delicatamente l'acqua intorno al nastro con un fazzoletto a basso rilascio di pelucchi per evitare che la soluzione di colorazione si spanda sul vetro. Posizionare il vetrino su un piccolo vassoio di plastica.
  5. Applicare alcune gocce di soluzione di rosso di rutenio (vedere punto 6.2) per coprire uniformemente le sezioni trasversali. Coprire i vetrini con carta d'alluminio per 10 minuti per proteggerli dalla luce, quindi risciacquare delicatamente il colorante dal vetrino con acqua ultrapura per 2 minuti.
  6. Asciugare l'eccesso di acqua dal vetrino e applicare 1–2 gocce di glicerolo al 50% in acqua ultrapura su ciascuna sezione trasversale. Coprire le sezioni trasversali con un coprioggetto di dimensioni 24 mm × 30 mm (spessore No. 1.5) e procedere all'analisi microscopica e all'acquisizione delle immagini.
    NOTA: Eseguire l'analisi microscopica nello stesso giorno per ottenere risultati ottimali.

7. Acquisizione di immagini in campo chiaro

  1. Osservare le sezioni trasversali in illuminazione in campo chiaro utilizzando un microscopio con ingrandimenti 10×, 20× e 40×. Vedere Tabella 1 per i parametri e le impostazioni di acquisizione delle immagini.

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Risultati

L'uso di provette da centrifuga per simulare le condizioni del rumine ha permesso una digestione in vitro relativamente rapida ed economica di sezioni trasversali di fusto di Medicago sativa. Utilizzando un microtomo a slitta, sono state preparate sezioni trasversali di fusto di M. sativa spesse 100 μm (Figura 1A). Le sezioni trasversali dei fusti sono state fissate su vetrini in vetro con nastro adesivo doppiofaccia (Figura 1B) ed imm...

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Discussione

Il materiale di erba medica utilizzato nel presente studio era costituito da cloni di cinque linee di erba medica. Due linee sperimentali sono state selezionate dopo due cicli di selezione divergente per la digeribilità della fibra in detergente neutro in vitro (IVNDFD) da piante madri con IVNDFD a 16 h e IVNDFD a 96 h rispettivamente basse o alte12. Allo studio sono state inoltre incluse tre linee commerciali con background genetici sconosciuti, e le piante madri sono state selezion...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcuna relazione commerciale o finanziaria che possa essere considerata un potenziale conflitto di interessi. La menzione di nomi commerciali o prodotti in questa pubblicazione ha lo scopo esclusivo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione né approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti è un ente e datore di lavoro che garantisce pari opportunità. Tutti gli esperimenti hanno rispettato le leggi vigenti negli Stati Uniti, il paese in cui sono stati eseguiti.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano R. Ted Jeo per i suoi spunti riguardo a precedenti lavori correlati. Un ringraziamento al centro di imaging universitario dell'Università del Minnesota - Twin Cities per aver fornito l'accesso al software di acquisizione e analisi delle immagini al microscopio necessario per preparare le immagini per la pubblicazione. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti – Servizio di Ricerca Agricola [062-21500-001-000D] e dall'accordo di cooperazione senza assistenza (n. 58-5062-2-016).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio di alluminioBoardwalk7106BW18 in × 1.000 ft; utilizzato per proteggere le soluzioni coloranti sensibili alla luce
Cloruro di calcio diidrato, min. 99%Sigma Life ScienceC7902-500GCAS n. 10035-04-8; reagente per il buffer di McDougall’s
Software per fotocameraNikonNIS-Elements AR 5.42.04Software di imaging a 64 bit utilizzato per l'acquisizione e l'analisi delle immagini
Gas di anidride carbonicaMathesonUN1013Grado tecnico; utilizzato per mantenere condizioni anossiche durante la preparazione e l'incubazione
Bagno termostatato a circolazione d'acquaPrecision—Bagno termostatato a circolazione d'acqua utilizzato per mantenere i campioni a 39 °C
Standard di stelo di maisUniversità del MinnesotaNARaccolto nell'autunno 2023 a St. Paul, Minnesota, USA; macinato a 1 mm e utilizzato come substrato microbico
Vetrino coprioggettoThermo Scientific341924 mm × 30 mm, spessore No. 1,5, 1 oz
Fotocamera digitale a colori Digital Sight 10 con sensore d'immagine CMOS di grande formato FXNikonMQA20000Fotocamera digitale a colori utilizzata per acquisire immagini microscopiche in campo chiaro
Microscopio stereoscopicoNikonSMZ18Microscopio stereoscopico utilizzato per orientare e posizionare sezioni trasversali di fusto
Nastro adesivo doppioSelloTape Office Vinyl Double Sided Tape42702 mm × 53 m; utilizzato per fissare le sezioni trasversali di fusto ai vetrini
Bilancia elettronicaANDGH-202Bilancia analitica con lettura a quattro cifre decimali
Beuta Erlenmeyer (125 mL)Kimax25600Beuta da 125 mL; compatibile con tappo n. 5
Beuta Erlenmeyer (25 mL)Pyrex4980Beuta da 25 mL; compatibile con tappo n. 0
Etilene (200 proof)Fisher Scientific04-355-720Etilene assoluto utilizzato per la preparazione delle soluzioni coloranti e dei risciacqui pre-colorazione
Isolante rigido in polistirene espansoOwens Corning14077881 in × 2 ft × 2 ft, R-5, 15 PSI; utilizzato per sostenere gli internodi del fusto durante la sezionatura
PinzetteFisher Scientific10-316APinzette da laboratorio utilizzate per manipolare segmenti di fusto, vetrini e sezioni montate
Vetrini in vetroFisherBrand12550325 mm × 75 mm × 1 mm; utilizzati per il montaggio di sezioni trasversali di fusto
Beuta sferica (6 L)PyrexCLS43205L-4EABeuta in vetro da 6 L utilizzata per la preparazione o la manipolazione di volumi maggiori di soluzione
Glicerina, liquido di grado laboratorioFisher Science Education525342CCAS n. 56-81-5; glicerolo utilizzato nelle soluzioni di montaggio e conservazione
Tela di cotone a doppio strato grado 50JINIOHEE ShopB0FL27KXRN100% cotone, sbiancato; utilizzato per filtrare materiale rumenale e fluido rumenale
Cilindro graduato (10 mL)Pyrex700024Cilindro graduato da 10 mL utilizzato per misurare volumi liquidi
Acido cloridricoFisherA1445-500CAS n. 7647-01-0; utilizzato con la floroglucina per preparare la colorazione di Wiesner
Pennarello industriale super permanenteSharpie13601Punta fine; utilizzato per etichettare i tubi di incubazione con marcature resistenti all'acqua
Cloridrato di L-cisteina idratoSigma-AldrichC121800-10GCAS n. 345909-32-2; agente riducente utilizzato nella preparazione della soluzione di incubazione
Tessuto a basso rilascio di lanugineKimberly-Clark341554,5 in × 8,5 in; utilizzato per asciugare l'eccesso di liquido dai vetrini senza lasciare fibre
Lama per microtomo a profilo ridottoLeica 81963065-LPLama sostitutiva a profilo ridotto utilizzata per preparare sezioni trasversali di fusto uniformi
Solfato di magnesio eptaidratoFisher ChemicalM80-500CAS n. 10034-99-8; reagente per il buffer di McDougall’s
Barra magnetica per agitazioneFisher Scientific03-411-78376 mm × 12 mm; utilizzata per mescolare soluzioni tampone e di inoculo
Etichette per indirizzi postaliAvery51671/2 in × 1 3/4 in; utilizzate per l'identificazione di campioni e vetrini
PennelloLoew-Cornell—Serie 7000, n. 3 tondo; pennello fine utilizzato per trasferire e manipolare sezioni trasversali di fusto
Piastre di Petri con coperchioBecton Dickinson Labware8173111960 mm × 15 mm; utilizzate per la conservazione temporanea di sezioni trasversali di fusto in acqua ultrapura
Floroglucina, 1,3,5-triidrossibenzeneSigma-AldrichP3502-25GCAS n. 108-73-6; reagente utilizzato per preparare la colorazione di Wiesner
Pipetta (100 μL)GilsonP 1000; 767547MPipetta a volume regolabile utilizzata per dispensare soluzioni coloranti
Imbuto in plastica per uso generaleNalgene10-437-23E150 mm; utilizzato per il trasferimento e la filtrazione dei reagenti
Beccherello in polipropilene (4 L)Nalgene1201-4000Beccherello da 4 L resistente ai prodotti chimici, utilizzato per la preparazione e il mescolamento delle soluzioni di inoculo
Cloruro di potassioFisher ChemicalP217-500CAS n. 7447-40-7; reagente per il buffer di McDougall’s
Lame da barbaPersonna66-0089Spessore 0,009 in; utilizzate per il taglio manuale del materiale di fusto
Rosso di rutenio, ossicloruro di rutenio ammoniatoSigmaR-2751CAS n. 11103-72-3; colorante istologico utilizzato per visualizzare le sostanze pectiche
ForbiciFiskars1063071Forbici per uso generale utilizzate per tagliare nastro, schiuma e altri materiali di consumo
Tubi conici per centrifuga con tappo a vite (50 mL)Corning430828In polipropilene, non pirogeni; utilizzati per contenere, incubare, risciacquare e conservare i campioni
Microtomo a slittaLeica2000RMicrotomo a slitta utilizzato per preparare sezioni trasversali di fusto spesse 100 μm
Bicarbonato di sodio, grado ACSFisher ChemicalS233-3CAS n. 144-55-8; reagente per il buffer di McDougall’s
Cloruro di sodioFisher Chemical—CAS n. 7647-14-5; reagente per il buffer di McDougall’s
Idrossido di sodioFisher ChemicalS318-500CAS n. 1310-73-2; utilizzato nella preparazione della soluzione riducente
fosfato dibasico di sodio anidro (Na2HPO4)Sigma AldrichS-9763CAS 7558-79-4
Solfuro di sodio anidro, ACS, min. 98,0%Oakwood Chemicals245960CAS n. 1313-84-4; agente riducente utilizzato nella preparazione della soluzione di incubazione
Cucchiaio da laboratorio (spatola)Fisher Scientific14-375-10Spatola da laboratorio utilizzata per trasferire reagenti in polvere
Piastra magnetica per agitazioneThermolyne by Sybron7200Piastra magnetica per agitazione utilizzata per mescolare soluzioni tampone e di inoculo
Siringa (60 mL) con ago largoMonoject935401028Siringa da 60 mL con ago a grande diametro utilizzata per dispensare la soluzione di inoculo
PortaprovetteThermo Scientific14-809-44Portaprovette utilizzati per organizzare e sostenere i tubi di incubazione da 50 mL
TermometroFisherBrand13201663Termometro da laboratorio utilizzato per verificare la temperatura delle soluzioni e del bagno d'acqua
Microscopio erettoNikonEclipse NiMicroscopio eretto in campo chiaro utilizzato per la visualizzazione e l'acquisizione di immagini di sezioni trasversali di fusto colorate
Pompa per uso generaleLittle Giant Pump Co.502203Modello 2E-38N; 115 VAC, 60 Hz, 1,7 A; utilizzata per far circolare l'acqua e mantenere una temperatura uniforme nel bagno
Carta da pesataVWR Scientific Products12578-165Carta da pesata monouso utilizzata per pesare e trasferire reagenti solidi e substrato di stelo di mais

Riferimenti

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