Flusso di lavoro standardizzato per la raccolta di campioni fecali umani e l'estrazione automatizzata dell'acido desossiribonucleico mediante un processore a particelle magnetiche

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è standardizzare la raccolta di campioni fecali umani e l'estrazione automatizzata dell'acido deossiribonucleico mediante un processore a particelle magnetiche.

Abstract

Il sequenziamento del microbioma intestinale è diventato un approccio importante per lo studio della dinamica delle comunità microbiche in condizioni di salute e di malattia. Alterazioni nella composizione microbica sono state associate a diverse patologie legate allo stile di vita e all'età, tra cui diabete, leucemia e malattie neurodegenerative. Poiché diversi microrganismi presentano caratteristiche fisiologiche e requisiti ambientali distinti, la raccolta, il trasporto e la lavorazione standardizzati di campioni fecali sono essenziali per preservare l'integrità del campione e ridurre al minimo la variabilità tecnica. Le variazioni introdotte durante la manipolazione pre-analitica e l'estrazione dell'acido desossiribonucleico (DNA) possono influenzare le analisi successive del microbioma e compromettere l'interpretazione dei dati. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro standardizzato per la raccolta di campioni fecali umani e l'estrazione automatizzata del DNA mediante l'utilizzo del MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit (kit per l'estrazione di acidi nucleici) e del KingFisher Flex System (sistema automatizzato per il trattamento di particelle magnetiche). Il flusso di lavoro integra una manipolazione controllata dei campioni con l'estrazione automatizzata di acidi nucleici, riducendo la variabilità manuale e migliorando la coerenza procedurale. Il protocollo comprende la raccolta, la conservazione, la preparazione, l'estrazione automatizzata e il recupero di acidi nucleici da matrici fecali complesse. I risultati rappresentativi dimostrano un efficace recupero di DNA idoneo per applicazioni successive, tra cui il sequenziamento del gene dell'acido ribonucleico ribosomiale 16S (rRNA) e il sequenziamento metagenomico shotgun. Il flusso di lavoro standardizzato consente una lavorazione riproducibile dei campioni, facilita la scalabilità per studi sul microbioma e promuove una maggiore coerenza tra esperimenti. La dimostrazione visiva fornisce indicazioni pratiche per l'implementazione della lavorazione standardizzata di campioni fecali e dell'estrazione automatizzata di acidi nucleici nella ricerca sul microbioma intestinale.

Introduzione

Il microbioma intestinale è un ecosistema microbico complesso che influenza il metabolismo dell'ospite, l'immunità e la funzione neurologica ed è sempre più associato a diverse malattie, tra cui disturbi metabolici, morbo di Parkinson, cancro e neurodegenerazione^1,2. Svolge un ruolo importante nel mantenimento della fisiologia dell'ospite influenzando il metabolismo, la funzione immunitaria, l'assorbimento dei nutrienti e la resistenza ai microrganismi patogeni^3,4. Misure del microbioma robuste e riproducibili sono essenziali per tradurre queste associazioni in approfondimenti meccanicistici e applicazioni cliniche. I progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno rivoluzionato la nostra comprensione delle complesse comunità microbiche che risiedono nel tratto gastrointestinale. Tuttavia, variabili pre-analitiche, come le procedure di raccolta dei campioni fecali, le condizioni di conservazione, la manipolazione, il trasporto e i metodi di estrazione dell'acido desossiribonucleico (DNA), possono alterare selettivamente la struttura della comunità microbica, il rendimento del DNA e i risultati del sequenziamento^5,6. Tali incoerenze metodologiche complicano spesso il confronto tra studi.

Tra i passaggi pre-analitici critici, l'estrazione del DNA rappresenta uno dei fattori determinanti più influenti sulla qualità dei dati del microbioma^7,8. Un protocollo di estrazione ideale dovrebbe produrre in modo costante DNA di alta qualità e ad alto peso molecolare, con contaminazione minima, su un elevato numero di campioni. Le piattaforme automatizzate per l'estrazione di acidi nucleici possono migliorare la riproducibilità, ridurre gli errori legati alla manipolazione manuale, diminuire il rischio di contaminazione e aumentare la produttività. Le prestazioni di queste piattaforme di estrazione automatizzata dipendono in larga misura dai parametri del protocollo, inclusi l'omogeneizzazione del campione, le condizioni di bead-beating, la chimica della lisi, le condizioni di incubazione e la manipolazione delle perle magnetiche^9,10. Pertanto, è essenziale stabilire un flusso di lavoro standardizzato che integri una raccolta uniforme dei campioni fecali con l'estrazione automatizzata del DNA per generare dataset del microbioma affidabili e riproducibili.

In questo studio, presentiamo un flusso di lavoro standardizzato per la raccolta, la manipolazione e l'estrazione automatizzata del DNA da campioni fecali umani, utilizzando il kit di estrazione degli acidi nucleici e il processore automatico di particelle magnetiche descritti in precedenza. Il protocollo pone l'accento su una manipolazione controllata dei campioni, una lisi meccanica e chimica efficace, la rimozione di inibitori e misure di controllo qualità adeguate per applicazioni successive, tra cui il sequenziamento degli ampliconi del gene dell'acido ribonucleico ribosomiale 16S (rRNA), il sequenziamento dell'intero genoma, la reazione a catena della polimerasi (PCR) quantitativa e il sequenziamento metagenomico shotgun. La dimostrazione visiva fornisce indicazioni pratiche per la lavorazione standardizzata dei campioni fecali e l'estrazione automatizzata degli acidi nucleici, al fine di sostenere ricerche riproducibili e scalabili sul microbioma intestinale.

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del Comitato Etico Istituzionale della SKAN Research Trust ed è stato approvato dal comitato (Numero di approvazione: SKAN/IEC/2025/04). A tutti i partecipanti è stato richiesto un consenso informato scritto prima della raccolta dei campioni.

NOTA: Tutti i reagenti, i materiali di consumo e l'equipaggiamento sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Assemblare il kit per la raccolta del campione fecale

1. Assemblare un kit per la raccolta di campioni fecali contenente un raccoglitore fecale sterile, un tubo di raccolta sterile con tappo a vite (capacità 30–50 mL) dotato di spatola integrata, un tubo di raccolta pre-riempito con tampone di stabilizzazione, guanti monouso, materiale assorbente, un sacchetto per il trasporto richiudibile etichettato con simbolo di rischio biologico e un foglio di istruzioni (Figura 1).
2. Etichettare ogni tubo di raccolta con un identificativo univoco del campione, la data e l’ora della raccolta, utilizzando un pennarello indelebile o un’etichetta prestampata.
3. Includere un foglio di istruzioni che descriva la procedura di raccolta del campione, le precauzioni per la manipolazione, le condizioni di conservazione e i requisiti per il trasporto.
   ​NOTA: Il tampone di stabilizzazione viene fornito già pre-riempito nel tubo per la raccolta fecale come parte integrante del kit. Il produttore non rivela la composizione né il volume del tampone di stabilizzazione. Raccogliere circa 2–5 g di materiale fecale direttamente nel tubo di raccolta pre-riempito seguendo le istruzioni del produttore.

Figura 1. Componenti del kit per la raccolta di campioni fecali. 
Il kit per la raccolta di campioni fecali comprende guanti monouso, un contenitore sterile per feci, una provetta sterile con tappo a vite per la raccolta di feci dotata di spatola integrata, un sacchetto sigillabile per il trasporto con etichetta di materiale biologico e un opuscolo illustrativo fornito ai partecipanti con istruzioni per la raccolta, la manipolazione, la conservazione e il trasporto del campione fecale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Preparare il partecipante al prelievo del campione

1. Chiedere al partecipante di lavarsi le mani prima del prelievo del campione.
2. Chiedere al partecipante di svuotare la vescica prima dell'evacuazione per evitare contaminazione urinaria del campione fecale.

3. Raccogliere il campione fecale utilizzando un raccoglitore fecale

1. Posizionare un raccoglitore fecale sterile sul bordo della tazza del water per evitare il contatto tra il campione fecale e l'acqua del water.
2. Per i raccoglitori fecali adesivi, aprire con attenzione il dispositivo lungo i bordi indicati senza strapparlo. Seguire le istruzioni del produttore fornite insieme al raccoglitore fecale e fissare saldamente il dispositivo alla parte posteriore della tazza del water per creare una superficie stabile di raccolta.
3. Per i raccoglitori fecali non adesivi, posizionare il dispositivo attraverso la vaschetta del water secondo le istruzioni del produttore, in modo da garantire un supporto stabile.
4. Assicurarsi che il raccoglitore fecale non entri in contatto con l'acqua del water durante la raccolta del campione.
5. Chiedere al partecipante di effettuare l'evacuazione direttamente sul raccoglitore fecale.
6. Indossare i guanti monouso forniti nel kit di raccolta prima di manipolare il campione.
7. Aprire il tubo sterile per la raccolta e utilizzare la spatola allegata per prelevare materiale fecale da almeno quattro a cinque aree distinte delle feci, inclusa la superficie esterna e il nucleo interno. Questo approccio fornisce tipicamente circa 2–5 g di materiale fecale, quantità sufficiente per l'estrazione del DNA.
8. Evitare di raccogliere materiale fecale che ha toccato i bordi del raccoglitore fecale o altre superfici esterne.
9. Chiudere accuratamente il tubo di raccolta immediatamente dopo il prelievo del campione.
10. Mescolare accuratamente il campione fecale con il tampone di stabilizzazione agitando vigorosamente a mano il tubo chiuso fino a quando il campione risulta uniformemente sospeso e non sono presenti grumi di grandi dimensioni.
11. Inserire il tubo di raccolta sigillato nel sacchetto di trasporto impermeabile etichettato come materiale biologico contenente materiale assorbente.
12. Rimuovere con attenzione il raccoglitore fecale e gettarlo nel water insieme alle feci, assicurandosi che il contenuto non si rovesci. Sciacquare il water per smaltire contemporaneamente il raccoglitore fecale e le feci.

4. Conservare e trasportare i campioni fecali

1. Conservare i campioni in base alle specifiche del tampone di stabilizzazione utilizzato.
2. Conservare i campioni a temperatura ambiente se il tampone di stabilizzazione permette la conservazione in condizioni ambientali. In alternativa, conservare i campioni a 4°C per la conservazione a breve termine (≤24–48 h) o a −20°C fino a −80°C per la conservazione a lungo termine.
3. Conservare i campioni seguendo le raccomandazioni del produttore. I campioni raccolti utilizzando il tampone di stabilizzazione impiegato in questo studio sono stabili fino a 2 anni a temperatura ambiente.
4. Trasportare i campioni in sacchetti biologici impermeabili contenenti materiale assorbente per prevenire fuoriuscite e contaminazioni.
5. Mantenere i campioni nelle condizioni di temperatura raccomandate durante il trasporto. Utilizzare contenitori isolati ed elementi refrigeranti quando necessario.
6. Assicurare il rispetto delle linee guida istituzionali sulla biosicurezza e delle normative locali applicabili per il trasporto di campioni biologici.

5. Ricezione e registrazione dei campioni

1. Ispezionare ogni campione al ricevimento in laboratorio per verificare l'etichettatura corretta, l'integrità del tubo e la presenza di segni di fuoriuscita.
2. Assegnare un identificatore specifico del laboratorio, se richiesto, e registrare la data e l'ora del prelievo, le condizioni di conservazione e la durata del trasporto.
3. Escludere i campioni che presentano fuoriuscita, etichettatura errata o integrità compromessa.

6. Preparare le piastre

NOTA: preparare tutte le piastre prima di iniziare il flusso di lavoro di estrazione. Eseguire tutti i passaggi che coinvolgono reagenti e campioni biologici in un ambiente pulito indossando dispositivi di protezione personale adeguati, tra cui camice da laboratorio, guanti e protezione oculare. Figura 2 mostra il processore automatizzato di particelle magnetiche (Figura 2A), le posizioni di caricamento delle piastre (Figura 2B), l'adattatore per piastre deep-well (Figura 2C), la centrifuga compatibile con piastre (Figura 2D), lo strumento per bead-beating (Figura 2E), il supporto ammortizzante (Figura 2F), il porta-piastra (Figura 2G), la piastra a 96 pozzetti con perline (Figura 2H), la piastra deep-well (Figura 2I), e la piastra di eluizione (Figura 2J).

Figura 2. Attrezzature e materiali di consumo utilizzati per l'estrazione automatizzata dell'acido desossiribonucleico (DNA) fecale. 
(A) Processore automatizzato di particelle magnetiche. (B) Posizione di caricamento della piastra all'interno del processore automatizzato di particelle magnetiche. (C) Adattatore per piastra a pozzetti profondi per la centrifugazione. (D) Centrifuga compatibile con piastre. (E) Omogeneizzatore a sferette. (F) Supporto ammortizzante utilizzato durante la rottura mediante sferette. (G) Portapiastra a pozzetti profondi (adattatore) per la rottura mediante sferette. (H) Piastra a 96 pozzetti con sferette fornita con il kit di estrazione degli acidi nucleici. (I) Piastra a 96 pozzetti profondi. (J) Piastra di eluizione a 96 pozzetti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Rimuovere la piastra pettinata dei puntali dall'imballaggio e tenerla pronta per il caricamento nello strumento.
2. Preparare la Piastra di Eluizione (Figura 2J) aggiungendo 200 µL del tampone di eluizione fornito con il kit di estrazione degli acidi nucleici in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con un film adesivo trasparente per prevenire contaminazioni. Mantenere la piastra sigillata fino al momento del caricamento nel processore automatico di particelle magnetiche. Etichettare la piastra come Piastra di Eluizione.
3. Preparare la Piastra di Lavaggio 4 aggiungendo 1 mL di etanolo al 80% in ogni pozzetto di una piastra con pozzetti profondi. Sigillare la piastra con un film adesivo per prevenire evaporazione e contaminazioni.
4. Preparare la Piastra di Lavaggio 3 aggiungendo 1 mL di etanolo al 80% appena preparato in ogni pozzetto di una piastra con pozzetti profondi separata. Sigillare la piastra con un film adesivo.
5. Preparare la Piastra di Lavaggio 2 aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio in ogni pozzetto di una piastra con pozzetti profondi. Sigillare la piastra con un film adesivo.
6. Preparare la Piastra di Lavaggio 1 aggiungendo 1 mL di tampone di lavaggio in ogni pozzetto di una piastra con pozzetti profondi. Sigillare la piastra con un film adesivo.

7. Configurare il processore automatico di particelle magnetiche

1. Accendere il processore automatico di particelle magnetiche. Verificare che siano installate la testa magnetica 96 pozzetti profondi e la piastra riscaldante 96 pozzetti profondi corrette.
2. Eseguire il protocollo di controllo dello strumento appropriato (ad esempio, il protocollo Check_96dw_tip) utilizzando un pettine di punte pulito e una piastra vuota compatibile prima dell'elaborazione dei campioni.
3. Confermare che il programma di estrazione richiesto sia disponibile sul processore automatico di particelle magnetiche.
   NOTA: L'uso di una testa magnetica o di una piastra riscaldante errata può ridurre il rendimento degli acidi nucleici e danneggiare lo strumento.

8. Eseguire la lisi del campione

1. Preparare una mappa della piastra per registrare la posizione di ogni campione nella piastra a 96 pozzetti.
2. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti contenente le perle (Figura 2H) a 2.750 × g per 10 s utilizzando una centrifuga compatibile con piastre (Figura 2D) e un adattatore (Figura 2C) per raccogliere le perle sul fondo di ogni pozzetto.
   NOTA: Questo passaggio evita la perdita di perle durante la rimozione della pellicola sigillante.
3. Rimuovere con attenzione la pellicola sigillante senza disturbare le perle.
4. Aggiungere 800 µL di buffer di lisi in ogni pozzetto della piastra contenente le perle.
5. Evitare di aspirare le perle durante la pipettatura.
6. Scongelare i campioni fecali congelati a temperatura ambiente fino a completo scongelamento. Mescolare delicatamente i campioni per renderli omogenei ed eseguire immediatamente l'estrazione del DNA. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento poiché possono ridurre la qualità e il rendimento del DNA.
   NOTA: Per i campioni freschi, vortexare ogni provetta di campione fecale contenente la soluzione di stabilizzazione per 5–10 s per garantire l'omogeneizzazione del campione.
7. Trasferire 200 µL di ogni campione omogeneizzato nel pozzetto corrispondente della piastra contenente le perle.
8. Utilizzare una pipetta monocanale dotata di punte sterili filtrate a largo diametro (tagliate) per trasferire i campioni. Evitare pipettature ripetute per minimizzare la perdita di perle e la conseguente riduzione del rendimento del DNA.
9. Sigillare accuratamente la piastra con una pellicola adesiva, assicurandosi che tutti i pozzetti e i bordi della piastra siano completamente sigillati.

9. Eseguire la lisi meccanica (bead beating)

1. Fissare la piastra sigillata nell'apparecchio per la disgregazione con perle (Figura 2E) utilizzando il portapiastra appropriato (Figura 2G) e il supporto ammortizzante (Figura 2F).
2. Bilanciare l'apparecchio posizionando una piastra di peso equivalente opposta alla piastra del campione.
3. Impostare l'apparecchio a 30 Hz per 2 min e avviare il ciclo.
4. Lasciare procedere il ciclo senza interruzioni.
5. Rimuovere con attenzione la piastra al termine del ciclo senza alterare il sigillo.
   NOTA: Utilizzare il supporto ammortizzante per evitare danni alla piastra durante la disgregazione con perle.

10. Eseguire l'elaborazione post-lisi

1. Centrifugare la piastra a 2.750 × g per 5 min a temperatura ambiente utilizzando una configurazione bilanciata.
2. Trasferire con attenzione 400 µL del soprannatante da ogni pozzetto a una nuova piastra a pozzetti profondi designata come Piastra del Campione.
3. Evitare di trasferire alcuna perlina durante questo passaggio.
   NOTA: La Piastra del Campione non contiene perline e non richiede una pre-centrifugazione.
4. Sigillare la Piastra del Campione se non si prosegue immediatamente.
   NOTA: Conservare la piastra dei lisati sigillata a 4°C durante la notte, se necessario. In alternativa, conservare la Piastra del Campione sigillata a −20°C per un massimo di 3 mesi. Scongelare i campioni a temperatura ambiente prima di ulteriori lavorazioni.

11. Preparare la miscela di perle di legame

1. Preparare la miscela di perle di legame immediatamente prima dell'uso combinando 500 µL di tampone di legame per acidi nucleici con 20 µL di perle magnetiche per campione. Mescolare accuratamente per ottenere una sospensione omogenea.
2. Calcolare il volume totale di miscela di perle di legame necessario in base al numero di campioni.
3. Per una piastra completa a 96 pozzetti, preparare la miscela di perle di legame aggiungendo 48,00 mL di tampone di legame per acidi nucleici e 1,92 mL di perle magnetiche in un tubo conico sterile. Mescolare accuratamente per ottenere un volume finale di 49,92 mL (520 µL per pozzetto).
   NOTA: Preparare un volume sufficiente per uno o due pozzetti aggiuntivi per compensare le variabilità nella pipettaggio.
4. Mescolare delicatamente la sospensione di perle di legame capovolgendo il contenitore fino a ottenere una sospensione omogenea.
5. Trasferire la miscela di perle di legame in un serbatoio reagente pulito.
6. Immediatamente prima della dispensazione, risospendere le perle magnetiche aspirando e dispensando la sospensione su e giù da tre a quattro volte per evitare il deposito delle perle.
7. Dispensare 520 µL della miscela di perle di legame in ciascun pozzetto della piastra campione preparata, utilizzando una pipetta multicanale.
8. Pipettare lentamente a causa della viscosità della soluzione ed evitare la formazione di bolle. Risospendere delicatamente la miscela di perle di legame nel serbatoio reagente prima di ogni passaggio di dispensazione per mantenere una distribuzione uniforme delle perle in tutti i pozzetti.

12. Modificare il programma dello strumento MagMAX_Microbiome_Stool_Flex (programma di estrazione modificato)

1. Scaricare e installare il software BindIt (software per la modifica dei protocolli) seguendo le istruzioni del produttore.
2. Scaricare il programma dello strumento dal sito web del produttore.
3. Avviare il software per la modifica dei protocolli e consentirne l'inizializzazione.
4. Fare clic su Apri e selezionare il programma dello strumento scaricato.
5. Modificare i parametri del protocollo come descritto nella Tabella 1.
6. Salvare il protocollo modificato e chiudere il software.
7. Collegare il computer al processore automatico di particelle magnetiche utilizzando un cavo seriale USB o RS-232C.
   NOTA: Assicurarsi che il processore automatico di particelle magnetiche sia spento prima di collegare il computer.
8. Accendere il processore automatico di particelle magnetiche e attendere il completamento dell'inizializzazione.
9. Avviare il software per la modifica dei protocolli e verificare che rilevi il processore automatico di particelle magnetiche.
10. Trasferire il programma di estrazione modificato al processore automatico di particelle magnetiche.
11. Confermare il trasferimento corretto del programma di estrazione modificato, quindi spegnere il processore automatico di particelle magnetiche.

Passaggio	Azione	Parametri
1	Legame	Mescolare; 5 cicli di raccolta; 37°C
2	Raccogliere le perle	5 cicli magnetici di raccolta
3	Lavaggio 1	Mescolare per 20 s × 3 cicli; 37°C
4	Lavaggio 2	Mescolare per 20 s × 3 cicli; 37°C
5	Lavaggio 3	Mescolare per 20 s × 2 cicli; 37°C
6	Lavaggio 4	Mescolare; 1 ciclo; 37°C
7	Asciugare	Asciugare all'aria per 2 min
8	Eluizione	75°C; 6 cicli di mescolamento; preriscaldamento attivato
9	Raccogliere le perle	3 cicli magnetici di raccolta
10	Trasferire l'eluato	Trasferire l'acido nucleico purificato nella piastra di eluizione

Tabella 1: Programma automatizzato di estrazione per il processore di particelle magnetiche.
Riepilogo del programma automatizzato eseguito dal processore automatico di particelle magnetiche durante l'estrazione dell'acido desossiribonucleico (DNA). Il programma comprende il legame degli acidi nucleici, la raccolta delle microsfere magnetiche, i passaggi di lavaggio sequenziali, l'essiccazione all'aria, l'eluzione e il trasferimento del DNA purificato nella piastra di eluizione. Sono indicati i parametri operativi per ciascun passaggio automatizzato.

13. Eseguire l'estrazione automatizzata degli acidi nucleici

1. Accendere il processore automatizzato di particelle magnetiche (Figura 2A) attivando prima l'alimentazione principale e poi il pulsante di accensione dello strumento. Attendere il completamento dell'inizializzazione del sistema.
2. Utilizzando il pannello di controllo dello strumento, selezionare il programma di estrazione modificato e avviare l'esecuzione.
3. Quando richiesto, inserire la piastra con i puntali nella posizione 7 e premere Avvia per procedere. Fare riferimento alla Tabella 2 per le posizioni di carico delle piastre (Figura 2B).
4. Rimuovere il film sigillante dalla Piastra di Eluizione e inserire la piastra nella posizione 6, assicurandosi dell'orientamento corretto (il pozzetto A1 allineato con la posizione indicata). Premere Avvia per procedere.
5. Rimuovere il film sigillante dalla Piastra di Lavaggio 4 contenente etanolo al 80%, caricare la piastra nella posizione 5 con l'orientamento corretto e premere Avvia.
6. Rimuovere il film sigillante dalla Piastra di Lavaggio 3 contenente etanolo al 80%, caricare la piastra nella posizione 4 e premere Avvia.
7. Rimuovere il film sigillante dalla Piastra di Lavaggio 2, caricare la piastra nella posizione 3 e premere Avvia.
8. Rimuovere il film sigillante dalla Piastra di Lavaggio 1, caricare la piastra nella posizione 2 e premere Avvia.
9. Quando richiesto, caricare la Piastra dei Campioni nella posizione 1, assicurandosi dell'orientamento corretto.
10. Chiudere il coperchio dello strumento e premere Avvia per avviare l'esecuzione automatizzata dell'estrazione.
11. Lasciare che il programma prosegua senza interruzioni fino al completamento (circa 35–40 min).
    NOTA: la Tabella 1 riassume il programma di estrazione automatizzata eseguito dallo strumento.

Piastra	Posizione	Tipo di piastra	Reagente	Volume per pozzetto
Piastra del campione	1	Piastra a 96 pozzetti profondi	Miscela di lisato del campione e perle di legame	920 µL
Piastra di lavaggio 1	2	Piastra a 96 pozzetti profondi	Tampone di lavaggio	1.000 µL
Piastra di lavaggio 2	3	Piastra a 96 pozzetti profondi	Tampone di lavaggio	1.000 µL
Piastra di lavaggio 3	4	Piastra a 96 pozzetti profondi	Etanolo al 80%	1.000 µL
Piastra di lavaggio 4	5	Piastra a 96 pozzetti profondi	Etanolo al 80%	1.000 µL
Piastra di eluizione	6	Piastra a 96 pozzetti	Tampone di eluizione	200 µL
Piastra del pettine per punte	7	Piastra profonda standard	Pettine per punte a 96 pozzetti profondi	N/D

Tabella 2: Configurazione del caricamento delle piastre per l'estrazione automatizzata di acidi nucleici.
Posizioni di caricamento delle piastre, tipi di piastre, reagenti e volumi di reagente utilizzati per l'estrazione automatizzata del DNA con il processore di particelle magnetiche. La piastra campione contiene il lisato campione e la miscela di perle di legame. N/A indica che nessun reagente liquido è stato aggiunto alla piastra dei pettini per punte.

​14. Eluire e conservare gli acidi nucleici

1. Al termine della corsa, aprire lo strumento e rimuovere con attenzione la piastra di eluizione per evitare di rovesciare gli eluati.
   NOTA: Se nella piastra di eluizione è presente un trasferimento visibile di microsferette magnetiche, trasferire gli eluati in una piastra standard da 96 pozzetti e posizionare la piastra su un supporto magnetico per 5–10 minuti. Trasferire il sopranatante chiarificato in una nuova piastra da 96 pozzetti o in provette opportunamente etichettate, utilizzando una pipetta multicanale.
2. Trasferire il DNA eluito in provette o piastre per lo stoccaggio opportunamente etichettate.
3. Conservare il DNA eluito a 4°C per un uso a breve termine, a −20°C per una conservazione fino a 6 mesi o a −80°C per una conservazione a lungo termine.

15. Eseguire la pulizia dopo l'esecuzione

1. Rimuovere tutte le piastre e i pettini di punte utilizzati dal processore automatico di particelle magnetiche.
2. Smaltire tutti i materiali monouso secondo le linee guida istituzionali per la sicurezza biologica e lo smaltimento dei rifiuti chimici.
3. Pulire eventuali versamenti utilizzando un disinfettante da laboratorio appropriato.
4. Spegnere il processore automatico di particelle magnetiche e successivamente l'alimentazione elettrica principale.

Risultati

Campioni fecali di sette partecipanti sono stati raccolti con successo utilizzando il flusso di lavoro descritto, ottenendo campioni con massa sufficiente e consistenza adeguata per le analisi successive. I campioni sono stati conservati a temperatura ambiente dopo la raccolta. La maggior parte dei campioni ha mostrato una texture e un colore uniformi, coerenti con adeguate condizioni di raccolta e conservazione, mentre un piccolo sottoinsieme ha presentato una leggera variabilità nella consistenza, che potrebbe riflettere la variabilità biologica tra i partecipanti. Non è stata osservata contaminazione visibile né fuoriuscita durante il trasporto, e tutti i campioni sono stati processati entro la finestra di stabilità validata del kit di raccolta (fino a 2 anni a temperatura ambiente), dimostrando l'affidabilità e la robustezza del flusso di lavoro di raccolta (Figura 1).

Il protocollo automatizzato di estrazione del DNA è stato eseguito utilizzando il processore automatico di particelle magnetiche (Figura 2A), la configurazione di caricamento delle piastre (Figura 2B), l'adattatore per piastre deep-well (Figura 2C), la centrifuga compatibile con piastre (Figura 2D), lo strumento per bead-beating (Figura 2E), il supporto ammortizzante (Figura 2F), il porta-piastra (Figura 2G), la piastra con perle (Figura 2H), la piastra deep-well (Figura 2I) e la piastra di eluizione (Figura 2J), seguendo il programma di estrazione automatizzato riassunto nella Tabella 1 e la configurazione di caricamento delle piastre presentata nella Tabella 2. La concentrazione e la purezza del DNA sono state valutate su campioni fecali rappresentativi, e i risultati sono riportati nella Tabella 3. La concentrazione del DNA è stata misurata mediante il saggio Qubit per DNA a doppio filamento ad alta sensibilità (saggio fluorometrico di quantificazione del DNA) su un fluorimetro Qubit (strumento fluorometrico per la quantificazione del DNA), seguendo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati mescolati con la soluzione di lavoro, incubati per 2 min a temperatura ambiente e misurati insieme ai due standard del saggio. I rapporti di assorbanza A₂₆₀/A₂₈₀ e A₂₆₀/A₂₃₀ sono stati determinati utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (spettrofotometro a microvolume). Le concentrazioni di DNA sono risultate comprese tra 36 e 87 ng/µL, con tutti i campioni eluiti in un volume costante di 200 µL, consentendo un confronto diretto del recupero totale di DNA tra le diverse preparazioni (Tabella 3).

Campione	Concentrazione di DNA (ng/µL)	A260/A280	A260/A230	Volume di eluizione (µL)	Rendimento totale di DNA (ng)
Campione A	62	1.83	1.71	200	12.400
Campione B	36	1.89	1.51	200	7.200
Campione C	87	1.92	1.85	200	17.400
Campione D	50	2.03	1.87	200	10.000
Campione E	55	1.97	1.81	200	11.000
Campione F	85	1.99	1.88	200	17.000
Campione G	44	2.01	1.51	200	8.800
Controllo di estrazione	0	—	—	200	0

Tabella 3: Recupero e purezza rappresentativi del DNA dopo l'estrazione automatizzata da campioni fecali umani.
Concentrazione rappresentativa del DNA, purezza (rapporti di assorbanza A₂₆₀/A₂₈₀ e A₂₆₀/A₂₃₀), volume di eluizione e resa totale di DNA misurati dopo l'estrazione automatizzata del DNA da campioni fecali umani. La concentrazione del DNA è stata determinata mediante saggio fluorometrico. Il bianco di estrazione è servito come controllo negativo e non ha prodotto DNA rilevabile.

I risultati rappresentativi hanno dimostrato una variabilità nel recupero del DNA tra i campioni. Sono state ottenute concentrazioni maggiori di DNA per il Campione A (62 ng/µL), il Campione F (85 ng/µL) e il Campione C (87 ng/µL), mentre concentrazioni intermedie sono state osservate per il Campione D (50 ng/µL) e il Campione E (55 ng/µL). Il Campione B e il Campione G hanno prodotto le concentrazioni più basse di DNA (36 ng/µL e 44 ng/µL, rispettivamente). I rapporti di assorbanza A₂₆₀/A₂₈₀ sono variati da 1,83 a 2,03, mentre i rapporti di assorbanza A₂₆₀/A₂₃₀ sono compresi tra 1,51 e 1,88 (Tabella 3). Questa variabilità è attesa nei campioni fecali e può riflettere differenze nella composizione del campione e nella variabilità biologica, oltre alla variabilità tecnica associata all'elaborazione dei campioni. Il controllo negativo di estrazione non ha prodotto DNA rilevabile, indicando l'assenza di contaminazione rilevabile durante la procedura di estrazione. L'amplificazione rappresentativa del gene batterico 16S rRNA quasi completo ha generato l'amplicone PCR previsto di circa 1,5 kb nei campioni di DNA fecale, mentre il controllo senza stampo non ha mostrato alcuna amplificazione (Figura 3).

Figura 3. Elettroforesi su gel di agarosio degli ampliconi della reazione a catena della polimerasi (PCR) del gene dell'acido ribonucleico ribosomiale (rRNA) 16S batterico. 
Gel di agarosio rappresentativo che mostra l'amplificazione del gene batterico dell'rRNA 16S quasi completo (~1,5 kb) mediante l'uso dei primer universali 27F e 1525R, dopo l'estrazione del DNA da campioni fecali umani. Corsia M: scala del DNA di 100 paia di basi (bp); Corsia 1: controllo senza stampo (bianco); Corsie 2–8: campioni rappresentativi di DNA fecale che mostrano l'amplicone PCR previsto di ~1,5 kb. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L'implementazione corretta di questo protocollo è dimostrata dal recupero di DNA misurabile, adatto ad applicazioni molecolari successive, tra cui saggi basati sulla PCR, sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S, sequenziamento metagenomico shotgun e preparazione di librerie. Nel complesso, questi risultati rappresentativi dimostrano che il protocollo consente un recupero costante di DNA da campioni fecali umani, illustrando al contempo la variabilità che può verificarsi tra diversi campioni biologici.

Discussione

Il protocollo descritto in questo articolo fornisce un flusso di lavoro standardizzato per la raccolta di campioni fecali umani e l'estrazione automatizzata del DNA per studi sul microbioma. I passaggi critici includono il prelievo rappresentativo di campioni fecali da diverse regioni delle feci, un'accurata omogeneizzazione con il tampone di stabilizzazione, un corretto stoccaggio e trasporto nelle condizioni raccomandate, una lisi meccanica efficiente e un'attenta manipolazione durante l'estrazione automatizzata. L'adesione costante a questi passaggi riduce al minimo la variabilità tecnica e favorisce un recupero riproducibile del DNA. Studi precedenti hanno identificato in modo analogo la raccolta dei campioni, le condizioni di conservazione, l'omogeneizzazione e l'estrazione del DNA come principali fonti di variabilità nelle analisi del microbioma, sottolineando l'importanza di flussi di lavoro standardizzati per ottenere risultati riproducibili^5,6,7,8. I risultati rappresentativi dimostrano una raccolta di campioni avvenuta con successo, senza contaminazione o fuoriuscita visibile, e un recupero misurabile di DNA in tutti i campioni testati.

Diversi fattori procedurali possono influenzare il recupero del DNA e devono essere considerati durante l'implementazione. Una lisi meccanica o chimica inadeguata, un'omogeneizzazione incompleta, un legame inefficiente degli acidi nucleici o una perdita del campione durante i passaggi di trasferimento e lavaggio possono ridurre il rendimento del DNA. Anche le variazioni nella composizione delle feci, nella biomassa microbica e nella consistenza del campione possono contribuire a differenze nel recupero del DNA tra i diversi campioni. Pertanto, un'esecuzione accurata del protocollo, in particolare durante l'omogeneizzazione del campione, la bead beating e l'estrazione automatizzata, è fondamentale per ottenere risultati costanti. La risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sulla verifica della preparazione dei reagenti, dell'allestimento dello strumento, del caricamento della piastra e dell'esecuzione del programma di estrazione automatizzato prima dell'elaborazione dei campioni. Raccomandazioni simili sono state riportate in studi che valutano i flussi analitici del microbioma e le metodologie di estrazione del DNA^5,6,7,8,11.

Il limite principale di questo metodo è la variabilità osservata nel rendimento del DNA tra i diversi campioni biologici. Come dimostrato dai risultati rappresentativi, le differenze nella concentrazione del DNA possono riflettere sia variazioni biologiche intrinseche tra i campioni fecali sia variazioni tecniche introdotte durante l'elaborazione dei campioni. Di conseguenza, la concentrazione del DNA non dovrebbe essere considerata l'unico indicatore dell'efficacia dell'estrazione. Potrebbero essere necessarie ulteriori misure della qualità e idoneità del DNA a seconda dell'applicazione successiva prevista. Per valutare ulteriormente la qualità e l'idoneità del DNA per analisi molecolari successive, il gene batterico dell'rRNA 16S è stato amplificato mediante PCR utilizzando i primer universali 27F e 1525R. L'avvenuta amplificazione del frammento del gene dell'rRNA 16S di circa 1,5 kb è stata confermata mediante elettroforesi su gel di agarosio (Figura 3), dimostrando che il DNA estratto era di qualità sufficiente per applicazioni successive, inclusi il sequenziamento e altri saggi molecolari. Precedenti studi di confronto hanno analogamente mostrato che il rendimento del DNA non correla necessariamente con le prestazioni del sequenziamento successivo o con l'accuratezza del profilo del microbioma^8,11.

Rispetto ai protocolli di estrazione manuale, i processori automatizzati di particelle magnetiche riducono l'intervento manuale, standardizzano le condizioni di estrazione e consentono l'elaborazione di un elevato numero di campioni, minimizzando al contempo la variabilità dipendente dall'operatore^9,10. Tuttavia, le variazioni nella consistenza delle feci e nella biomassa microbica possono influenzare l'efficienza della lisi e il rendimento del DNA. Inoltre, i microorganismi con pareti cellulari particolarmente resistenti potrebbero non essere completamente lisiati, con possibili effetti sulla rappresentatività di alcuni taxa. Nonostante questi limiti, l'estrazione automatizzata rappresenta un approccio solido ed efficiente per studi su larga scala del microbioma intestinale^5,6,7,8,9,10. Il presente protocollo combina la raccolta standardizzata di campioni fecali con un flusso di lavoro automatizzato per l'estrazione del DNA, fornendo un approccio pratico e riproducibile per studi del microbioma che richiedono un'elaborazione uniforme di un elevato numero di campioni. Metodologie standardizzate come questa favoriscono la riproducibilità tra diversi studi e si adattano bene ad applicazioni molecolari successive, tra cui il profilo del microbioma, il sequenziamento metagenomico e altre analisi basate sul sequenziamento^5,6,7,8,9,10.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo al 80% (preparato da etanolo assoluto)	Merck	ET00161000	Preparare al momento usando etanolo assoluto come descritto nel protocollo.
Materiale assorbente	Kimtech	34256	Incluso nel sacchetto di trasporto.
Film adesivo per sigillare piastre	Applied Biosystems	4306311	Film adesivo trasparente MicroAmp.
Processore automatizzato per particelle magnetiche (sistema di purificazione KingFisher Flex con testina a 96 pozzetti profondi)	Thermo Fisher Scientific	5400630	Sistema automatizzato per l'estrazione di acidi nucleici.
Sacchetto di trasporto sigillabile con etichetta per materiale biologico pericoloso	Zymo Research	R1180	Sacchetto di trasporto impermeabile per il trasporto di campioni.
Software BindIt	Thermo Fisher Scientific	5189009	Software utilizzato per modificare e trasferire il protocollo di estrazione automatizzato.
Tubo di raccolta con spatola integrata (30–50 mL)	Zymo Research	R1180	Tubo sterile con tappo a vite.
Supporto ammortizzante	QIAGEN	69984	Set adattatore TissueLyser (utilizzato come supporto ammortizzante durante la lisi meccanica con perle).
Piastra a pozzetti profondi (96 pozzetti)	Thermo Fisher Scientific	95040460	Piastra KingFisher Deepwell 96.
Guanti monouso	Zymo Research	R1180	Si consigliano senza polvere.
Tampone di eluizione	Applied Biosystems	A42357	Fornito insieme al kit MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Dispositivo per la raccolta di feci	Zymo Research	R1180	Dispositivo sterile per la raccolta.
Blocco riscaldante (96 pozzetti profondi)	Thermo Fisher Scientific	Supplied with instrument	Componente del sistema KingFisher Flex Purification System.
Camice da laboratorio	Fornitore locale	N/A	Equipaggiamento di protezione individuale.
Tampone di lisi	Applied Biosystems	A42357	Fornito insieme al kit MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Perle magnetiche	Applied Biosystems	A42357	Fornite insieme al kit MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Testina magnetica (96 pozzetti profondi)	Thermo Fisher Scientific	Included with 5400630	Testina magnetica a 96 pozzetti profondi fornita con il sistema KingFisher Flex.
Supporto magnetico (96 pozzetti)	Thermo Fisher Scientific	12332D	Necessario solo se si osserva trascinamento delle perle magnetiche.
Pipetta multicanale	Eppendorf	3125000052	Compatibile con piastre a 96 pozzetti.
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Utilizzato per determinare i rapporti A260/280 e A260/230.
Tampone di legame per acidi nucleici	Applied Biosystems	A42357	Fornito insieme al kit MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.
Pennarello indelebile	Sharpie	3002	In alternativa, utilizzare etichette prestampate.
Punte per pipetta, sterili filtrate (10 µL)	Tarsons	528100	Punte graduate sterili con filtro.
Punte per pipetta, sterili filtrate (200 µL)	Tarsons	528104	Punte graduate sterili con filtro.
Punte per pipetta, sterili filtrate (1.000 µL)	Tarsons	529106	Punte sterili con filtro; tagliare per preparare punte larghe quando indicato nel protocollo.
Adattatore per piastra per centrifuga	Eppendorf	5820710004	Adattatore per piastra profonda Rotor A-2-DWP-AT.
Centrifuga compatibile con piastre	Eppendorf	5810	Compatibile con l'adattatore Rotor A-2-DWP-AT.
Portapiastra per lisi meccanica con perle	QIAGEN	69984	TissueLyser Adapter Set 2 × 96.
Etichette prestampate (opzionale)	Brady	BBP12	Alternativa al pennarello indelebile.
Test Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher Scientific	Q33231	Test fluorometrico utilizzato per la quantificazione del DNA.
Fluorimetro Qubit	Thermo Fisher Scientific	Q33327	Strumento utilizzato per la quantificazione fluorometrica del DNA.
Reservoir per reagenti	Thermo Fisher Scientific	8093	Matrix Reservoir per reagenti.
Tampone di stabilizzazione del campione	Zymo Research	R1180	Kit di raccolta feci DNA/RNA Shield.
Tubo conico sterile	HiMedia	TCP106H	Utilizzato per la preparazione della miscela di perle di legame.
Omogeneizzatore a perle TissueLyser III	QIAGEN	9003240	Strumento per la lisi meccanica.
Piastra pettine per punte	Thermo Fisher Scientific	97002534	Pettine KingFisher 96 per magneti a pozzetti profondi.
Tampone di lavaggio	Applied Biosystems	A42357	Fornito insieme al kit MagMAX Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit.