Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per isolare e coltivare cellule muscolari lisce aortiche primarie di origine murina provenienti dalle regioni toracica e addominale. Il metodo consente di ottenere cellule vitali adatte a studi in vitro sul rimodellamento vascolare e sulla biologia correlata agli aneurismi.
Articolo metodologico
Isolamento e Coltura di Cellule Primarie di Muscolo Liscio Aortico Murino per Studi In vitro Relativi alla Rimodellazione Vascolare e alla Biologia dell'Aneurisma Aortico
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'isolamento e la coltivazione di cellule muscolari lisce (SMC) aortiche primarie rappresentano un approccio prezioso per lo studio dei meccanismi cellulari alla base delle malattie vascolari, tra cui le aneurismi aortiche. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e ottimizzato per l'isolamento e la coltivazione di SMC aortiche murine provenienti da segmenti aortici toracici e addominali. La procedura attuale comprende un'accurata dissezione aortica, la rimozione dei tessuti circostanti e una digestione enzimatica in due fasi mediante collagenasi, elastasi e inibitore della tripsina della soia, seguita da dissociazione meccanica ed espansione cellulare in condizioni di coltura definite. Particolare enfasi è posta su quei passaggi che migliorano il rendimento cellulare, la purezza e la riproducibilità, tra cui la rimozione dell'avventizia e il controllo dei tempi di digestione. Utilizzando questo approccio, le SMC primarie possono essere isolate ed espanse con successo, mostrando una morfologia e modelli di crescita caratteristici. Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile e adattabile per ottenere SMC aortiche primarie e costituisce una piattaforma per studi in vitro rilevanti per il rimodellamento vascolare e la biologia dell'aneurisma aortico.
Introduzione
I cellule muscolari lisce aortiche (SMC) sono componenti essenziali della parete vascolare, contribuendo sia all'integrità strutturale che alla regolazione funzionale dell'aorta. Nei vasi sani, le SMC mantengono un fenotipo contrattile caratterizzato dall'espressione di proteine contrattili come l'actina muscolare liscia α (α-SMA) e la catena pesante della miosina muscolare liscia (MYH11)1,2,3. Questo fenotipo sostiene il tono vascolare e preserva l'organizzazione della matrice extracellulare. Tuttavia, in condizioni patologiche come l'aneurisma dell'aorta addominale (AAA), le SMC subiscono una modulazione fenotipica verso uno stato sintetico e pro-infiammatorio1,2,3. Questa transizione è associata a un aumento della proliferazione, della secrezione di citochine e della produzione di enzimi degradanti la matrice, contribuendo infine all'indebolimento della parete aortica4,5.
I modelli animali, inclusa la formazione di aneurismi aortici indotta dall'angiotensina II (Ang II), hanno notevolmente approfondito la comprensione della patogenesi dell'AAA1,6,7,8,9,10,11. Tuttavia, questi modelli non permettono una manipolazione precisa dei percorsi cellulari né un'osservazione diretta dei meccanismi specifici delle cellule muscolari lisce (SMC). I sistemi in vitro che utilizzano SMC primarie offrono un approccio complementare, consentendo un'analisi dettagliata dei percorsi di segnalazione, della regolazione genica e delle risposte cellulari in condizioni controllate12.
Nonostante la loro utilità, l'isolamento di SMC aortici murini primari è tecnicamente complesso. Le piccole dimensioni dell'aorta murina, la presenza di tessuto adiposo e connettivo circostante e il rischio di contaminazione da fibroblasti avventiziali possono compromettere la purezza cellulare. Inoltre, la digestione enzimatica deve essere attentamente controllata per bilanciare la dissociazione del tessuto con il mantenimento della vitalità cellulare. La variabilità in questi passaggi spesso porta a risultati incoerenti tra esperimenti e laboratori.
Sono stati pubblicati diversi protocolli che descrivono l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche primarie di origine murina, la maggior parte dei quali si basa sulla rimozione completa della tonaca avventizia prima della digestione enzimatica e si concentra principalmente sull'aorta intera o su segmenti dell'aorta toracica13,14. Il presente protocollo si basa su questi metodi introducendo diverse migliorie tecniche, tra cui un breve passaggio di pre-digestione enzimatica per facilitare la separazione tra i livelli avventiziale e mediale prima della completa dissociazione del tessuto, condizioni standardizzate di digestione con ripetute dissociazioni meccaniche delicate e un flusso di lavoro per l'isolamento e la coltura separati delle cellule muscolari lisce provenienti dall'aorta toracica (THX) e da quella addominale (ABD). Nel complesso, queste migliorie sono state progettate per migliorare la coerenza e la riproducibilità dell'elaborazione dei tessuti, facilitando al contempo studi specifici per regione sul rimodellamento vascolare e sulla biologia degli aneurismi. Le colture di SMC ottenute sono adatte per una vasta gamma di applicazioni successive, tra cui silenziamento genico, studi farmacologici e indagini meccanicistiche relative al rimodellamento vascolare e alla biologia degli aneurismi. Sebbene le SMC primarie isolate da aorte non malate non riproducano in modo intrinseco i fenotipi aneurismatici, esse forniscono un sistema in vitro controllato per lo studio di vie cellulari coinvolte nello sviluppo degli aneurismi a seguito di manipolazioni sperimentali mirate.
Protocollo
Sono state utilizzate topoline adulte C57BL/6J femmine di 8-10 settimane di età, del peso di 18–20 g, per la procedura descritta di seguito. Per ogni isolamento sono state utilizzate due topoline. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) presso l'Università del Kentucky ed sono state approvate secondo il protocollo n. 2022-4153. I dettagli di tutti i reagenti e dell'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali. Una panoramica schematica dell'intero processo di isolamento e coltura è mostrata in Figura 1.
AVVERTENZA: La chetamina e la xilazina sono sostanze controllate e devono essere manipolate, conservate e smaltite in conformità con le politiche istituzionali e le normative applicabili. La collagenasi di tipo II e l'elastasi sono enzimi proteolitici che possono causare irritazione cutanea, oculare e delle vie respiratorie. Il blu di tripano è un colorante pericoloso e deve essere manipolato indossando idonei dispositivi di protezione individuale, evitando il contatto con la pelle e con gli occhi. Tutti i reagenti pericolosi devono essere manipolati e smaltiti in conformità alle linee guida per la sicurezza dell'istituto e alle istruzioni dei produttori.
1. Preparazione dei reagenti e dei terreni di coltura
- Preparare 10 mL di soluzione enzimatica di digestione fresca nel giorno dell'isolamento in un tubo conico sterile da 15 mL:
- Aggiungere 10 mg di collagenasi di tipo II (concentrazione finale di 1 mg/mL) (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 10 mg di inibitore della tripsina da soia (concentrazione finale di 1 mg/mL) (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 71 µL di sospensione di elastasi (concentrazione finale di 0,744 U/mL) (vedere Tabella dei Materiali).
- Preparare la soluzione in HBSS contenente calcio e magnesio senza rosso fenolo (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 100 µL di penicillina/streptomicina (1% del volume finale) (vedere Tabella dei Materiali).
- Mescolare accuratamente la soluzione e filtrare sterilizzando con un filtro per siringa in nylon da 0,2 µm (vedere Tabella dei Materiali).
- Preparare il mezzo completo per coltura di cellule muscolari lisce (SMC) (500 mL)
- Aggiungere 385 mL di Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) senza rosso fenolo (vedere Tabella dei Materiali) come mezzo base.
- Integrare con 100 mL di siero fetale bovino trattato con carbone/dextrano (20% del volume finale) (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 10 mL di penicillina/streptomicina (2% del volume finale) (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere 5 mL di anfotericina B (1% del volume finale) (vedere Tabella dei Materiali)
- Filtrare sterilizzando il mezzo e conservarlo a 4 °C.
- Riscaldare in anticipo tutti i reagenti a 37 °C prima dell'uso.
2. Preparazione per l'elaborazione dei tessuti
- Aliquotare in anticipo la soluzione per la digestione enzimatica in 4 pozzetti (2,5 mL ciascuno) di una piastra da coltura a 6 pozzetti e preriscaldare in incubatore a 37 °C con 5% di CO₂ prima dell'elaborazione del tessuto. Due pozzetti devono essere contrassegnati come 'THX' e due come 'ABD' per i segmenti aortici. Più segmenti provenienti dalla stessa regione anatomica possono essere elaborati in un singolo pozzetto.
- Preparare due piastre da coltura separate (vedere Tabella dei Materiali) contenenti mezzo completo per colture di SMC ed etichettarle rispettivamente THX e ABD.
- Preriscaldare le piastre da coltura contenenti il mezzo in un incubatore umidificato.
- Preparare in anticipo 20 mL di HBSS sterile per la perfusione vascolare e la manipolazione del tessuto.
- Preparare altre due piastre da coltura contenenti ciascuna 3 mL di HBSS per la pulizia sequenziale delle aorte isolate.
- Preparare provette coniche graduate da 15 mL etichettate (vedere Tabella dei Materiali) contenenti ciascuna 5 mL di HBSS per la conservazione temporanea e la separazione dei segmenti aortici THX e ABD.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra un animale e l'altro applicando un detergente, risciacquando con acqua distillata, disinfettando con etanolo al 70% e sterilizzando mediante sterilizzatore a perle (vedere Tabella dei Materiali).
3. Preparazione dell'animale e dissezione dell'aorta
- Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale (IP) di chetamina (300 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg) (vedere Tabella dei Materiali), come approvato secondo il protocollo IACUC dell'Università del Kentucky 2022-4153 per procedure terminali.
- Verificare la profondità adeguata dell'anestesia attraverso l'assenza di risposta riflessa alla compressione delle dita dei piedi.
- Sterilizzare il campo chirurgico utilizzando etanolo al 70%.
- Quando si è in profonda anestesia chirurgica, eutanasia i topi mediante esanguinazione tramite punzione cardiaca seguita da perfusione transcardiaca con HBSS, in conformità con le linee guida istituzionali e AVMA.
- Aprire la cavità toracica ed eseguire una punzione cardiaca per raccogliere il sangue.
- Perfondere il sistema vascolare attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 10 mL dotata di un ago da 25 gauge, iniettando lentamente 10 mL di HBSS sterile. Si raccomanda una velocità di perfusione di circa 0,5 mL/s per garantire un'efficace rimozione del sangue residuo.
- Rimuovere con attenzione gli organi circostanti (fegato, polmoni, milza, tratto gastrointestinale, reni). Lasciare un frammento del diaframma collegato all'aorta.
- Isolare l'aorta dalla radice aortica fino alla biforcazione iliaca, mantenendo intatto il diaframma. Il diaframma funge da limite anatomico tra le regioni THX e ABD (Figura 2B).
- Trasferire immediatamente l'aorta in HBSS sterile (Figura 2A).
4. Pulizia e segmentazione dell'aorta
- Posizionare la piastra sterile per colture contenente l'aorta sotto un microscopio stereoscopico (vedere Tabella dei Materiali).
- Rimuovere con attenzione il tessuto adiposo e il tessuto connettivo utilizzando pinzette fini (vedere Tabella dei Materiali).
- Separare l'aorta in segmenti THX e ABD.
NOTA: Il segmento THX si estende dalla regione dell'aorta appena al di sopra del diaframma fino alla radice aortica, mentre il segmento ABD si estende dalla regione dell'aorta appena al di sotto del diaframma fino alla biforcazione iliaca (Figura 2B). - Trasferire i segmenti puliti in provette coniche separate da 15 mL contenenti HBSS fresco per ulteriori lavorazioni.
5. Digestione enzimatica e isolamento delle cellule
- Incubare i segmenti aortici in soluzione enzimatica a 37 °C per 8–10 min.
- Rimuovere i segmenti aortici dalla soluzione enzimatica.
- Trasferire i segmenti in piatti di coltura separati contenenti mezzo completo per cellule muscolari lisce, designato per campioni THX e ABD.
- Rimuovere il layer avventiziale dall'aorta utilizzando pinzette fini e grossolane. La rimozione completa dell'avventizia è confermata quando la superficie esterna dell'aorta appare liscia e traslucida, senza tessuto connettivo residuo o tessuto adiposo visibile (Figura 2C).
- Trasferire i segmenti aortici in una nuova soluzione enzimatica e trinciare il layer mediale in piccoli frammenti direttamente all'interno della soluzione (Figura 3A).
- Incubare i frammenti di tessuto a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% CO₂ per 1 h.
- Eseguire una dissociazione meccanica delicata aspirando e dispensando circa 10–15 volte per favorire il rilascio delle cellule (Figura 3B).
- Ripetere il passaggio di dissociazione meccanica a intervalli di 30–60 min durante l'incubazione continua, per un tempo totale di digestione di 2–3 h o fino al raggiungimento di una sospensione cellulare omogenea.
6. Raccolta, lavaggio, semina e coltura iniziale delle cellule
- Trasferire la soluzione enzimatica di digestione contenente le cellule dissociate in diverse provette coniche da 15 mL (vedere la Tabella dei Materiali), designate per i campioni THX e ABD.
- Risciacquare ogni pozzetto di digestione con 5 mL di mezzo di coltura e unire il liquido alle provette corrispondenti.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Ripetere la centrifugazione se la formazione del pellet non è sufficiente.
- Rimuovere il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare (Figura 3C).
- Risospendere le cellule con 5 mL di mezzo di coltura fresco ed eseguire un ulteriore passaggio di lavaggio seguito da centrifugazione nelle stesse condizioni.
- Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare finale in un volume appropriato (tipicamente 6 mL) di mezzo completo per colture di SMC.
- Piastrellare l'intera sospensione cellulare ottenuta dal segmento aortico toracico o addominale in due pozzetti di una piastra per colture da 6 pozzetti (3 mL di mezzo sospeso per pozzetto) e incubare a 37 °C con 5,0% di CO₂. Le cellule vengono piastrellate immediatamente dopo l'isolamento, senza conteggio cellulare preliminare; pertanto, in questa fase non si utilizza una densità di semina target.
- Mantenere le colture indisturbate per 5–7 giorni per consentire l'attacco cellulare e l'espansione iniziale.
PUNTO DI PAUSA: Dopo la piastrellatura, le colture possono essere mantenute nell'incubatore per 5–7 giorni prima di procedere ai passaggi di mantenimento ed espansione cellulare descritti nella Sezione 7.
7. Mantenimento ed espansione delle cellule
- Sostituire il mezzo di coltura ogni 3–4 giorni.
- Monitorare regolarmente la morfologia e la confluenza delle cellule.
- Passare le cellule quando raggiungono una confluenza di circa l'80–90%.
- Aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) preriscaldata (vedere Tabella dei Materiali).
- Aggiungere tripsina-EDTA 0,05% e incubare a 37 °C per 5–10 min.
- Procedere quando l'80%–90% delle cellule si è staccato.
- Battere leggermente la piastra di coltura per favorire il distacco.
- Aggiungere un volume uguale di mezzo di coltura completo per neutralizzare la tripsina.
- Pipettare delicatamente per staccare le cellule rimanenti.
- Trasferire la sospensione cellulare in provette coniche e centrifugare a 400 × g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di coltura fresco.
- Piastrellare le cellule in un rapporto di suddivisione 1:2 (o alla densità sperimentale desiderata) e incubare a 37 °C con 5% di CO₂. Lasciare attaccare le cellule indisturbate per 24–48 h.
NOTA: Per esperimenti successivi, utilizzare cellule comprese tra i passaggi 3 e 7 (P3–P7) per ridurre al minimo la deriva fenotipica indotta dalla coltura. Le cellule oltre il passaggio 7 sono più soggette a deriva fenotipica e possono presentare morfologia e funzionalità alterate.
8. Convalida mediante colorazione immunofluorescente per α-SMA
- Coltivare le cellule su un materiale idoneo alla microscopia fluorescente.
- Piastrare le cellule in una piastra ottica a 96 pozzetti con 15.000 cellule per pozzetto. Lasciare crescere le cellule fino alla confluenza desiderata.
- Preparare le cellule per la fissazione
- Aspirare il mezzo di coltura dalle cellule aderenti. Lavare 3 volte con 200 µL per pozzetto di soluzione salina tamponata al Tris con lo 0,1% di Tween 20 (TBS-T) per 5 minuti a ogni lavaggio, quindi aspirare con il vuoto della cappa biologica.
- Fissare le cellule
- Aggiungere 200 µL per pozzetto di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS 1x. Incubare per 10–20 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare.
- Permeabilizzazione
- Aggiungere 200 µL per pozzetto di Triton X-100 allo 0,1% in PBS 1x. Incubare per 10–15 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare.
- Blocco del legame non specifico
- Lavare le cellule 3 volte con 200 µL per pozzetto di TBS-T per 5 minuti a ogni lavaggio. Aggiungere 200 µL per pozzetto di albumina sierica bovina (BSA) al 5% in TBS-T.
- Posizionare la piastra su un agitatore orbitale a circa 200 rpm per 1 ora a temperatura ambiente.
- Colorazione con anticorpo primario
- Preparare l'anticorpo primario α-SMA in un rapporto di diluizione 1:1.000 in BSA al 5% in TBS-T.
- Rimuovere la piastra dall'agitatore orbitale e aspirare la soluzione di blocco dai pozzetti destinati alla colorazione con α-SMA. Per il controllo con solo anticorpo secondario, omettere l'anticorpo primario e mantenere il pozzetto di controllo in BSA al 5% in TBS-T.
- Aggiungere 200 µL per pozzetto dell'anticorpo primario α-SMA diluito nei pozzetti sperimentali. Incubare i pozzetti sperimentali e quelli di controllo con solo anticorpo secondario per tutta la notte a 4 °C su un agitatore orbitale delicato.
- Colorazione con anticorpo secondario
- Preparare l'anticorpo secondario fluorescente in un rapporto di diluizione 1:2.500 in TBS-T contenente lo 0,1% di Tween 20.
- Rimuovere la piastra dall'agitatore orbitale e aspirare tutti i pozzetti.
- Lavare tutti i pozzetti 3 volte con 200 µL per pozzetto di TBS-T per 5 minuti a ogni lavaggio, quindi aspirare.
- Aggiungere 200 µL per pozzetto dell'anticorpo secondario fluorescente diluito in tutti i pozzetti, inclusi quelli di controllo con solo anticorpo secondario.
- Proteggere la piastra dalla luce e incubare su un agitatore orbitale a circa 200 rpm per 1 ora a temperatura ambiente.
- Colorazione nucleare e acquisizione delle immagini fluorescenti
- Preparare una soluzione di Hoechst 33342 a 2 µg/mL.
- Lavare le cellule 3 volte con 200 µL per pozzetto di TBS-T per 5 minuti a ogni lavaggio. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di colorazione con Hoechst 33342 per coprire le cellule e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce.
- Acquisire le immagini fluorescenti utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito con un ingrandimento di 20x per le colture THX e ABD colorate per α-SMA e di 10x per i controlli con solo anticorpo secondario, usando un'illuminazione a 385 nm per Hoechst 33342 e a 475 nm per l'anticorpo secondario coniugato a fluoroforo. I controlli con solo anticorpo secondario sono stati acquisiti a 10x per includere un numero sufficiente di nuclei nel campo visivo.
- Quantificazione delle cellule positive per α-SMA.
- Valutare la positività per α-SMA contando i nuclei positivi per Hoechst associati a cellule che mostrano una chiara colorazione citoplasmatica a forma di fuso positiva per α-SMA. Assegnare un punteggio conservativo alle cellule con segnale fluorescente ambiguo o non definito, classificandole come negative per α-SMA.
- Calcolare la percentuale di positività per α-SMA come il numero di cellule positive per α-SMA diviso per il numero totale di nuclei positivi per Hoechst contati nei campi microscopici valutati, moltiplicato per 100.
Risultati
Entro 24–48 h dal isolamento, un sottoinsieme di cellule inizia ad aderire alla superficie della coltura e a espandersi, mostrando inizialmente una morfologia arrotondata. L'adesione cellulare può risultare variabile nei primi momenti, e le colture possono apparire scarsamente popolate a causa del numero limitato di cellule vitali ottenute durante l'isolamento iniziale. Tra i giorni 3 e 5, le cellule aderenti assumono progressivamente una caratteristica morfologia allungata a forma di fuso, tipica delle cellule muscolari lisce vascolari (SMCs), e iniziano a proliferare formando piccoli aggregati. Una panoramica schematica del flusso di lavoro sperimentale, comprensivo di isolamento aortico, segmentazione, digestione enzimatica, dissociazione meccanica e semina cellulare, è illustrata nella Figura 1.
Immagini rappresentative di isolamento aortico, suddivisione anatomica nelle regioni TOR (THX) e ADD (ABD) e rimozione dello strato avventizio sono mostrate nella Figura 2. Le regioni aortiche TOR e ADD sono state distinte in base alla posizione anatomica rispetto al diaframma, come indicato nella Figura 2B. Immagini rappresentative di digestione enzimatica, dissociazione meccanica e formazione di un pellet cellulare visibile dopo centrifugazione sono mostrate nella Figura 3.
Il conteggio cellulare e la vitalità sono stati valutati al passaggio 3 mediante esclusione del blu di tripano (1:1) e un contatore cellulare automatico Countess. I dati sono stati ottenuti da 3 isolamenti indipendenti utilizzando complessivamente 6 topi (2 topi per isolamento). Le colture THX hanno mostrato un conteggio cellulare medio di 5,10 × 105 ± 7,81 × 104 cellule (intervallo, 4,20 × 105–5,60 × 105) e una vitalità del 66,33 ± 18,18% (intervallo, 46–81%). Le colture ABD hanno presentato un conteggio cellulare medio di 4,63 × 105 ± 2,31 × 104 cellule (intervallo, 4,50 × 105–4,90 × 105) e una vitalità del 61,66 ± 12,01% (intervallo, 50–74%) (Tabella 1).
Tra i giorni 5 e 7, le colture raggiungono tipicamente una confluenza di circa il 70%–90%, formando un monostrato denso e relativamente uniforme. Le cellule si allineano comunemente in orientamenti paralleli, riflettendo la loro linea contrattile. Possono essere osservate differenze nel tasso di proliferazione e nella densità cellulare tra le SMC di origine THX e quelle di origine ABD, in accordo con l'eterogeneità regionale nota dell'aorta. Nella Figura 4 sono mostrate immagini rappresentative al microscopio a contrasto di fase della morfologia delle SMC primarie provenienti dai segmenti aortici THX e ABD, a ingrandimento basso (10x) e maggiore (20x).
I MLC mostravano una morfologia allungata a forma di fuso, un allineamento organizzato in parallelo a confluenza e un modello di crescita uniforme, mentre le cellule di tipo fibroblastico presentano tipicamente una morfologia più appiattita e irregolare, con un orientamento meno organizzato e una distribuzione eterogenea. Queste caratteristiche morfologiche e di crescita offrono un approccio pratico e riproducibile per identificare le popolazioni di MLC in colture primarie in assenza di validazione molecolare. Un isolamento riuscito è indicato dall'adesione precoce delle cellule entro 24–48 h, dall'acquisizione progressiva di una morfologia a forma di fuso e dalla formazione di un monostrato confluenziale entro i giorni 5–7. Le cellule si allineano tipicamente in file parallele a maggiore confluenza, caratteristica compatibile con il fenotipo muscolare liscio. Risultati subottimali possono includere scarsa adesione cellulare, resa cellulare bassa o la presenza di cellule appiattite e dalla forma irregolare, che potrebbero indicare una digestione incompleta, un'esposizione eccessiva agli enzimi o una contaminazione da popolazioni cellulari non appartenenti ai muscoli lisci.
Una viabilità cellulare costante e una contaminazione minima da cellule simili a fibroblasti supportano ulteriormente il successo dell'isolamento. Per validare ulteriormente l'identità delle cellule muscolari lisce (SMC), colture primarie rappresentative sono state sottoposte a immunomarcatura per l'α-SMA (Figura 5) seguendo la procedura descritta nella Sezione 8. Sia le colture provenienti da THX che da ABD hanno mostrato il tipico pattern di marcatura filamentoso per l'α-SMA, caratteristico delle SMC vascolari. La quantificazione effettuata su quattro campi microscopici ha rilevato 69 cellule positive per l'α-SMA su un totale di 72 cellule positive all'Hoechst analizzate, corrispondente a una positività complessiva per l'α-SMA del 95,8% (IC 95%, 88,5%–98,9%). In particolare, 20 su 20 cellule THX e 49 su 52 cellule ABD erano positive per l'α-SMA. Figura 5 mostra campi rappresentativi tra quelli valutati.
Durante i primi passaggi, le cellule mantengono una morfologia stabile e una capacità proliferativa costante. Tuttavia, con una coltura prolungata, le cellule possono gradualmente mostrare segni di modulazione fenotipica, tra cui un aumento dello spreading, una ridotta allineamento e modifiche nei pattern di crescita.
In queste condizioni, le colture primarie di SMC sono adatte per applicazioni successive, tra cui l'abbattimento genico, trattamenti farmacologici e studi meccanicistici di vie coinvolte nel rimodellamento vascolare e nello sviluppo dell'aneurisma aortico.
Figura 1: Panoramica dello schema del flusso di lavoro. Una rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'isolamento primario di cellule muscolari lisce aortiche murine. Pannello 1 mostra l'eutanasia e l'isolamento dell'aorta. Pannello 2 mostra la separazione dei segmenti aortici toracici (THX) e addominali (ABD) nella soluzione enzimatica per la digestione. Pannello 3 mostra la rimozione dell'avventizia e l'isolamento del foglio mediale. Pannello 4 mostra il trasferimento dei segmenti di tessuto in una soluzione enzimatica fresca e il trinciamento. Pannello 5 mostra la dissociazione meccanica mediante pipettaggio ogni 30 min per 2–3 h. Pannello 6 mostra il recupero e il semina delle cellule, inclusi 6a la centrifugazione, 6b la rimozione del sopranatante e 6c la risospensione del pellet e la semina. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Isolamento e preparazione di segmenti di aorta murina. (A) Aorta intera isolata e posizionata in una piastra di coltura. (B) Aorta pulita con punti di riferimento anatomici che indicano le regioni toracica (THX) e addominale (ABD), inclusi il diaframma e la biforcazione iliaca. (C) Immagini rappresentative della rimozione dell'avventizia dai segmenti THX (in alto) e ABD (in basso) mediante pinze fini e grossolane, che evidenziano il tessuto mediale sottostante, fondamentale per l'isolamento dei cellule muscolari lisce. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Digestione enzimatica e dissociazione meccanica del tessuto aortico. (A) Dopo la rimozione dello strato avventiziale, lo strato mediale viene trasferito in una soluzione enzimatica fresca e tritato utilizzando piccole forbici. (B) Esempio di dissociazione meccanica di frammenti aortici mediante pipettaggio delicato. (C) Dopo la digestione enzimatica e la centrifugazione, si osserva un pellet cellulare visibile. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Morfologia rappresentativa di cellule muscolari lisce (SMC) aortiche murine primarie. Le SMC primarie isolate da segmenti aortici toracici e addominali sono state coltivate in condizioni standard e analizzate al passaggio 4. Sono mostrate immagini rappresentative in contrasto di fase a ingrandimento basso (10x) e maggiore (20x). Le cellule mostrano una tipica morfologia allungata e a forma di fuso, con allineamento compatibile con un fenotipo contrattile delle SMC. Possono essere osservate differenze nella densità cellulare e nell'organizzazione tra le SMC derivate dalla regione toracica (THX) e da quella addominale (ABD), riflettendo un'eterogeneità regionale. Le barre della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Convalida mediante immunofluorescenza di SMC aortiche murine primarie. (A) Immagini rappresentative di immunofluorescenza di SMC primarie isolate dall'aorta toracica (sinistra) e addominale (destra), colorate per α-SMA (verde). I nuclei sono stati colorati in controcolorazione con Hoechst 33342 (blu). Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento di 20x. (B) Immagini di controllo rappresentative con solo l'anticorpo secondario di SMC primarie toraciche (sinistra) e addominali (destra), processate senza l'anticorpo primario anti-α-SMA e colorate in controcolorazione con Hoechst 33342 (blu). Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento di 10x. La quantificazione effettuata su quattro campi microscopici ha identificato 69/72 cellule positive per α-SMA (95,8%). Le barre della scala = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Numero di cellule e vitalità delle colture primarie di cellule muscolari lisce aortiche murine | |||
| Segmento aortico | Isolamenti indipendenti, n | Numero di cellule (Media ± DS)* | Vitalità cellulare (Media ± DS)† |
| THX | 3 | 5.10 x 105 ± 7.81 x 104 cells | 66.33 ± 18.18 % |
| ABD | 3 | 4.63 x 105 ± 2.31 x 104 cells | 61.66 ± 12.01 % |
| *Il numero di cellule è stato ottenuto al passaggio 3 da 3 isolamenti indipendenti. | |||
| †Il numero e la vitalità delle cellule sono stati determinati mediante esclusione del blu di tripano 1:1 utilizzando un Countess Automated Cell Counter. | |||
Tabella 1: Numero di cellule e vitalità delle colture primarie di cellule muscolari lisce aortiche murine
| Passaggio | Problema | Causa possibile | Soluzione consigliata |
| Dissezione aortica | Basso rendimento cellulare | Recupero incompleto dell’aorta o danno tissutale durante la dissezione | Assicurarsi di isolare completamente dall’origine aortica fino alla biforcazione iliaca; manipolare il tessuto con delicatezza per evitare danni |
| Pulizia dell’aorta | Contaminazione da fibroblasti | Rimozione incompleta del tessuto avventiziale | Rimuovere con attenzione l’avventizia dopo la digestione iniziale; questo passaggio è fondamentale per la purezza dei miociti lisci (SMC) |
| Digestione iniziale | Difficoltà nella rimozione dell’avventizia | Insufficiente distacco enzimatico | Assicurarsi un’adeguata incubazione (8-10 min) prima di procedere alla rimozione meccanica |
| Digestione enzimatica | Basso rendimento cellulare | Sottodigestione del tessuto | Protrarre leggermente il tempo di digestione o aumentare la frequenza della dissociazione meccanica |
| Digestione enzimatica | Scarso vitale cellulare | Superdigestione o eccessiva esposizione all’enzima | Ridurre il tempo di digestione ed evitare incubazioni prolungate |
| Dissociazione meccanica | Scarso rilascio cellulare | Pipettaggio inadeguato | Eseguire un pipettaggio delicato ma ripetuto ogni 30-60 min |
| Adesione cellulare | Scarso attaccamento alla piastra | Danno cellulare o mezzo freddo | Utilizzare mezzo preriscaldato e ridurre al minimo lo stress da manipolazione |
| Coltura iniziale | Assenza di crescita cellulare | Scarso vitale o contaminazione | Verificare le condizioni di digestione e l’assenza di contaminazioni; ripetere l’isolamento se necessario |
| Morfologia cellulare | Forma non fusiforme (persistenza di cellule arrotondate/piatte) | Contaminazione o deriva fenotipica | Verificare l’asportazione dell’avventizia; evitare sovraconfluenza e colture prolungate |
| Crescita cellulare | Proliferazione lenta | Concentrazione subottimale di siero | Utilizzare il 20% di FBS durante la fase iniziale di espansione |
| Confluenza | Cellule sovraconfluenti difficili da passaggiare | Passaggio ritardato | Passaggiare le cellule all’80-90% di confluenza |
| Passaggio | Scarso distacco | Cellule troppo confluenti o insufficiente trattamento con tripsina | Aumentare leggermente il tempo di esposizione alla tripsina e assistere meccanicamente il distacco |
| Coltura a lungo termine | Perdita del fenotipo SMC | Alto numero di passaggi o coltura prolungata | Utilizzare cellule comprese tra i passaggi 3-7 |
| Riproducibilità | Variabilità tra isolamenti | Differenze di tecnica o variabilità biologica | Standardizzare la preparazione degli enzimi, i tempi e la manipolazione tra esperimenti |
Tabella 2: Guida alla risoluzione dei problemi per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche murine primarie. Sintesi dei comuni problemi tecnici riscontrati durante l'isolamento, la digestione e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche murine primarie, comprese le possibili cause e le soluzioni raccomandate per migliorare la riproducibilità.
Discussione
Questo protocollo fornisce un metodo solido e riproducibile per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce aortiche primarie di origine murina (SMCs) per in vitro studi. Oltre all'utilità tecnica, questo approccio è particolarmente rilevante per lo studio dei meccanismi alla base del rimodellamento vascolare e dello sviluppo dell'aneurisma aortico. Considerato il ruolo consolidato del sistema renina-angiotensina (RAS) e dell'Ang II nell'infiammazione vascolare e nella formazione di aneurismi15,16l'isolamento di SMC aortici primari rappresenta un approccio utile per analizzare questi percorsi a livello cellulare.
Un fattore chiave del successo è la rimozione accurata del tessuto avventizio. L'avventizia contiene fibroblasti e altre popolazioni non-SMC che possono superare in crescita le SMC in coltura se non vengono rimossi adeguatamente. Il breve passaggio iniziale di digestione enzimatica facilita la separazione meccanica dell'avventizia dallo strato mediale, consentendo una dissezione più precisa. Il mancato svolgimento efficace di questo passaggio è una delle cause più comuni di contaminazione e variabilità nei protocolli di isolamento delle SMC.
Anche le condizioni di digestione enzimatica devono essere attentamente ottimizzate. La combinazione di collaghenasi di tipo II, elastasi e inibitore della tripsina da soia consente una degradazione efficace dei componenti della matrice extracellulare preservando al contempo la vitalità cellulare. Tuttavia, la digestione deve essere monitorata attentamente. Una digestione insufficiente porta a una dissociazione incompleta del tessuto e a un ridotto rendimento cellulare, mentre una digestione eccessiva può danneggiare le cellule, comprometterne l'adesione e ridurre la vitalità. La dissociazione meccanica, eseguita mediante pipettaggio delicato e ripetuto, rappresenta quindi un passaggio complementare essenziale, in grado di favorire il rilascio cellulare minimizzando l’esposizione eccessiva agli enzimi. Nel complesso, questi passaggi evidenziano l'importanza di bilanciare la lavorazione enzimatica e quella meccanica al fine di ottimizzare sia il rendimento cellulare che la vitalità. Mantenere costanti i tempi di digestione, la manipolazione del tessuto e la dissociazione meccanica durante tutta la procedura è altrettanto importante per migliorare la riproducibilità tra le diverse isolazioni.
Le condizioni di coltura rivestono un ruolo centrale nel mantenimento del fenotipo e della funzione delle cellule muscolari lisce (SMC). Un mezzo ricco di siero (20% di siero fetale bovino) favorisce l'adesione iniziale e l'espansione delle cellule primarie dopo l'isolamento. È stato utilizzato siero trattato con carbone/destrano per ridurre la variabilità derivante da ormoni e componenti lipidici presenti nelle preparazioni standard di siero. Tuttavia, un'esposizione prolungata a siero ricco o una durata eccessiva della coltura può indurre una deriva fenotipica verso uno stato sintetico o simile a quello dei fibroblasti. Per minimizzare questi effetti, si raccomanda di utilizzare le cellule entro le prime e le fasi intermedie di passaggio (P3–P7) e di evitare condizioni di sovra-confluenza, che possono alterare la morfologia e ridurre la capacità proliferativa.
La morfologia delle cellule isolate fornisce un importante indicatore iniziale della qualità della coltura. Le cellule muscolari lisce sane presentano una tipica forma a fuso, allungata, e si allineano in file parallele a maggiore confluenza. Deviazioni rispetto a questa morfologia, come cellule appiattite o con forma irregolare, possono indicare contaminazione, condizioni di coltura subottimali o deriva fenotipica. Caratteristiche morfologiche indicative di un passaggio fenotipico da uno stato contrattile a uno stato sintetico includono un aumento della distensione cellulare, una riduzione della morfologia a fuso, la perdita dell'allineamento parallelo e schemi di crescita più eterogenei.
Sebbene la valutazione morfologica sia informativa, essa non è sufficiente per determinare in modo definitivo il fenotipo delle cellule muscolari lisce (SMC) e dovrebbe essere integrata da una validazione molecolare mediante l'uso di marcatori come α-SMA e MYH11, a seconda dell'applicazione. Nel presente studio, α- L'immunofluorescenza per SMA ha confermato l'identità delle cellule isolate e ha dimostrato una elevata proporzione di α-Celle positive per SMA nelle colture di THX e ABDFigura 5). Un vantaggio fondamentale di questo protocollo è la possibilità di isolare cellule muscolari lisce (SMCs) da diverse regioni dell’aorta, compresi i segmenti toracico (THX) e addominale (ABD). Queste regioni presentano differenze biologiche intrinseche, tra cui variazioni nella composizione della matrice extracellulare, nell’origine embriologica e nella suscettibilità alle malattie. L’isolamento di SMCs specifiche per regione consente di studiare l’eterogeneità spaziale nella biologia vascolare e potrebbe fornire informazioni sulle diverse vulnerabilità regionali alla formazione di aneurismi.16,17,18. I metodi esistenti di isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari aortiche murine utilizzano una digestione con collaghenasi eseguita durante la notte13 o 4–6 h di digestione enzimatica, con un recupero migliore riportato per 5–6 h14, rispetto alla digestione di 2–3 h successiva a una pre-digestione di 8–10 min utilizzata nel presente protocollo, con un tempo totale di lavorazione di circa 4 h dall'eutanasia al seeding cellulare. Adhikari et al. hanno riportato 25–35 × 103 cellule vitali/mL dopo 5 giorni di coltura e positività al 97%–99% per sm22α e Acta2, mentre il presente protocollo ha prodotto conteggi di cellule al passaggio-3 di 5,10 × 105 ± 7.81 × 104 cellule per THX e 4,63 × 105 ± 2.31 × 104 cellule per ABD, con un complesso generale αpositività per SMA del 95,8%. Hubert et al. hanno utilizzato una digestione notturna ma non hanno riportato una resa cellulare quantitativa né una percentuale di purezza13,14. Al contrario, il metodo basato su espianti di McMurray et al. richiedeva un periodo di latenza medio di circa 7,6 giorni prima dell'espansione cellulare di SMC da espianti aortici normali, con >90% di espianti che mostrano una migrazione cellulare entro il giorno 10 e >95% entro il giorno 12, mentre il presente metodo enzimatico consente la semina diretta delle cellule isolate nel giorno stesso dell'isolamento18. Il presente protocollo combina un breve passaggio di pre-digestione che facilita la rimozione dell'avventizia con condizioni standardizzate di digestione e dissociazione meccanica, al fine di promuovere una lavorazione del tessuto e un recupero cellulare costanti. Insieme all'isolamento specifico per regione delle cellule muscolari lisce (SMCs) di THX e ABD, il tempo ridotto di lavorazione e la caratterizzazione quantitativa del recupero cellulare e αLa positività per SMA offre vantaggi pratici per la riproducibilità in vitro studi.
Questo metodo è particolarmente adatto per studi meccanicistici che prevedono manipolazioni genetiche e farmacologiche. Le colture primarie di SMC possono essere utilizzate per approcci di silenziamento genico, inclusa l'eliminazione mediata da siRNA, nonché per studi di sovraespressione e trattamenti farmacologici. Questi approcci permettono un'analisi diretta delle vie di segnalazione coinvolte nel passaggio fenotipico dei SMC, nell'infiammazione e nel rimodellamento della matrice extracellulare, processi centrali nello sviluppo e nella progressione dell'aneurisma aortico1,5.
È importante considerare i limiti di questo protocollo nel contesto della modellizzazione delle malattie. Le cellule muscolari lisce in questo protocollo sono isolate da aorte murine non malate e quindi non presentano inerentemente fenotipi associati all'aneurisma. Per questo motivo, sono necessari approcci sperimentali aggiuntivi, tra cui stimolazione farmacologica, manipolazione genetica o integrazione con modelli in vivo, per riprodurre processi rilevanti per la malattia come l'attivazione infiammatoria, il rimodellamento della matrice extracellulare e il passaggio fenotipico. Oltre alle considerazioni sopra descritte, questo protocollo presenta diversi limiti. Possono verificarsi variabilità nel rendimento cellulare e nella cinetica di crescita tra diverse isolazioni, a causa di differenze biologiche tra gli animali o di piccole variazioni nella tecnica. Inoltre, l'isolamento basato sulla digestione enzimatica potrebbe influenzare l'espressione dei recettori sulla superficie cellulare o le vie di segnalazione, aspetto da tenere in considerazione nell'interpretazione degli studi funzionali successivi. Le cellule SMC primarie inoltre perdono gradualmente il loro fenotipo contrattile all'aumentare del numero di passaggi, il che potrebbe influire sui risultati sperimentali. Una rigorosa standardizzazione delle procedure e l'uso di cellule a basso numero di passaggio possono contribuire a ridurre tali limitazioni. Le sfide tecniche più comuni e le soluzioni raccomandate per questo protocollo sono riassunte nella Tabella 2.
In sintesi, questo protocollo fornisce un quadro affidabile e adattabile per l'isolamento e la coltura di SMC aortici murini primari. Quando combinato con modelli in vivo, questo approccio consente un'indagine esaustiva dei meccanismi cellulari e molecolari alla base del rimodellamento vascolare e della patogenesi dell'aneurisma aortico.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto. Grammarly è stato utilizzato per la revisione linguistica e la correzione grammaticale; tutti i contenuti scientifici e le interpretazioni sono stati prodotti dagli autori.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario è stato fornito, in parte, dal College of Medicine dell'Università del Kentucky. L'abstract grafico (Figura 1) è stato creato utilizzando BioRender.com in base a una licenza per pubblicazioni accademiche, con il numero di accordo di pubblicazione GI2A3W9TY8.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtri per siringa in nylon da 0,2 μm | VWR | 76439-080 | Filtrazione sterile |
| Provette coniche da 15 mL | VWR | — | Per il trasferimento dell'aorta dopo la pulizia e per la raccolta delle cellule |
| Piastre per colture (6 pozzetti / 12 pozzetti), non trattate | Corning | — | Coltura cellulare |
| Provette coniche da 50 mL | VWR | — | Raccolta delle cellule |
| Piastre micrometriche a 96 pozzetti con fondo ottico | Thermo Fisher Scientific | 165305 | Per la validazione delle SMC |
| Anticorpo α-actina muscolare liscia (monoclonale) | Cell Signaling Technology | 19245S | Per la validazione delle SMC; diluizione di lavoro 1:1000 |
| Anticorpo secondario IgG Alexa Fluor 488 (policlonale) | Invitrogen | A-11008 | Per la validazione delle SMC; diluizione di lavoro 1:2500 |
| Amfotericina B | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Antifungino |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A7906 | Per la validazione delle SMC |
| Incubatore a CO2 (37 °C) | Varie | — | Condizioni di coltura cellulare |
| Collagenasi di tipo II | Worthington Biochemical | LS004174 | Per digestione enzimatica; utilizzata a 260 U/mg |
| Contatore cellulare automatico Countess | Invitrogen | C10281 | Per il conteggio delle cellule |
| Microscopio stereoscopico | Varie | — | Pulizia dei tessuti |
| Mezzo DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Mezzo di base per colture |
| Elastasi | Worthington Biochemical | LS002279 | Per la degradazione della matrice; utilizzata a 4,17 U/mg di proteina |
| Siero fetale bovino (trattato con carbone/destrano) | Cytiva (Hyclone) | SH30068.03 | Utilizzato al 20% per la coltura |
| HBSS con Ca2+ e Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | Utilizzato come tampone di digestione |
| Soluzione Hoechst 33342 | BD Pharmingen | 561908 | Per la validazione delle SMC |
| Sterilizzatore a perle calde | Fine Science Tools | 18000-45 | Per l'estrazione dell'aorta |
| Ketamina | Dechra | — | Per l'anestesia del topo |
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotico |
| Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012-027 | Tampone di lavaggio |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BDH9286 | Per la validazione delle SMC; concentrazione di lavoro 150 mM (8,8 g per 1 L) |
| Inibitore della tripsina da soia | Worthington Biochemical | LS003570 | Impedisce la sovradigestione |
| Base di Tris | Fisher Scientific | BP152 | Per la validazione delle SMC; concentrazione di lavoro 20 mM (2,4 g per 1 L) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | Per la validazione delle SMC; concentrazione di lavoro 0,1% |
| Colorante blu di tripano | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Per il conteggio delle cellule |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Per il passaggio delle colture |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | Per la validazione delle SMC; concentrazione di lavoro 0,1% |
| Xilazina | Covetrus | 61035 | Per l'anestesia del topo |
| Materiali opzionali (se utilizzati) | |||
| Flaconi per colture (T25/T75) | Corning | — | Amplificazione cellulare |
Riferimenti
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