Fabbricazione e utilizzo di una microplacca a 32 pozzetti con LED integrati per il controllo optogenetico dinamico

Sommario

Questo protocollo descrive come fabbricare, programmare e utilizzare una micropiastra da 32 pozzetti con diodo a emissione luminosa (LED) integrato per studi optogenetici (LEMOS 2.0) all'interno di un lettore di micropiastre, al fine di consentire stimolazioni optogenetiche ad alto rendimento e misurazioni quantitative dell'espressione genica in colture microbiche.

Abstract

Il controllo optogenetico consente la regolazione attivata dalla luce dell'espressione genica e fornisce un'interfaccia programmabile tra cellule viventi e sistemi elettronici. Tuttavia, la prototipazione routinaria di costrutti optogenetici rimane limitata dall'infrastruttura. Le piattaforme esistenti in ciclo chiuso richiedono spesso chemostati, microfluidica, manipolazione robotica o sensori ottici personalizzati, elementi che possono aumentare i costi, ridurre l'accessibilità o limitare le prestazioni delle misurazioni.

In questo studio viene presentato LEMOS 2.0, una piastra microtitolatrice aggiornata con diodi a emissione luminosa (LED) integrati per studi di optogenetica, un dispositivo a basso costo per la stimolazione optogenetica e la caratterizzazione di circuiti genetici all'interno di lettori di micropiastre standard. LEMOS 2.0 migliora la piattaforma originale LEMOS aumentando la capacità da 16 a 32 micropozzetti e riducendo la dispersione della luce tra micropozzetti adiacenti, consentendo condizioni di buio come ulteriore stato di illuminazione. Il dispositivo è composto da una struttura stampata in tre dimensioni (3D), LED indirizzabili singolarmente posizionati accanto a ciascun micropozzetto, una batteria ricaricabile e un microcontrollore integrato per la comunicazione wireless basata su Bluetooth. Micropozzetti in polidimetilsilossano (PDMS) biocompatibile sono realizzati direttamente all'interno del dispositivo mediante stampaggio per replica, permettendo la stimolazione di colture batteriche attraverso lo stampo trasparente. Il dispositivo si adatta ai lettori di piastre standard, consentendo la misurazione della densità ottica e della fluorescenza.

Questo protocollo descrive l'intero flusso di lavoro di LEMOS 2.0, inclusa la fabbricazione del dispositivo, il montaggio del circuito, la programmazione di Arduino, la realizzazione di micropozzetti in PDMS, la configurazione del lettore di piastre, la preparazione di ceppi e colture, l'esecuzione automatizzata dell'esperimento, la pulizia del dispositivo e l'analisi dei dati di fluorescenza e OD₆₀₀. A titolo dimostrativo, il protocollo utilizza il sistema optogenetico CcaSR, in cui l'espressione di sfGFP è attivata dalla luce verde e repressa dalla luce rossa. LEMOS 2.0 è stato progettato per rendere le perturbazioni optogenetiche e la caratterizzazione dell'espressione genica più accessibili agli utenti del laboratorio, consentendo cicli di progettazione-costruzione-test-apprendimento più rapidi senza richiedere infrastrutture specializzate come bioreattori o sistemi microfluidici.

Introduzione

L'optogenetica fornisce un'interfaccia programmabile tra cellule viventi e sistemi di controllo elettronici. Utilizzando la luce per regolare l'espressione genica, il comportamento cellulare può essere attuato con precisione temporale, reversibilità e minima perturbazione del mezzo di coltura¹. Quando abbinata a reporter fluorescenti o luminescenti, l'optogenetica consente di misurare elettronicamente gli stati biologici e di regolarli mediante retroazione¹. Questa interfaccia ottica bidirezionale ha permesso il controllo cibernetico di processi cellulari, inclusi l'espressione genica, la crescita cellulare e la composizione della popolazione^2,3,4. Tuttavia, molti sistemi optogenetici ad anello chiuso di successo richiedono chemostati specializzati⁵, dispositivi microfluidici^4,6,7 o campionamento robotico^2,3,8, il che può limitare l'accessibilità e ostacolare i cicli ripetuti di progettazione-costruzione-test-apprendimento.

I lettori di micropiastre sono tra gli strumenti più utilizzati per misurare la crescita microbica e la dinamica dell'espressione genica. Forniscono misurazioni affidabili della densità ottica e della fluorescenza su numerose provette, supportano il controllo ambientale ed sono già integrati nei comuni flussi di lavoro della biologia sintetica⁹. Tuttavia, i percorsi di illuminazione nei lettori di piastre commerciali standard sono progettati per misurazioni ottiche, non per attuazioni ottogenetiche programmabili e specifiche per pozzetto durante la crescita delle colture. Di conseguenza, gli esperimenti ottogenetici richiedono spesso dispositivi di illuminazione separati^{10,11,12,13,14}, trasferimenti robotici tra piattaforme di stimolazione e misurazione^8,15 o hardware personalizzato per l'acquisizione dei dati^5,16,17. Questi passaggi aggiuntivi riducono la risoluzione temporale, introducono variabilità nelle manipolazioni e complicano il controllo in ciclo chiuso.

La piastra microtitolata con LED incorporati per studi di optogenetica, o LEMOS, è stata sviluppata in precedenza per colmare questa lacuna¹⁸. LEMOS è un dispositivo compatibile con lettori di micropiastre che contiene LED indirizzabili singolarmente posizionati attorno a micropozzetti di coltura. Il dispositivo rimane all'interno di un lettore di micropiastre commerciale per tutta la durata dell'esperimento, consentendo allo stesso tempo stimolazione ottica e misurazione della fluorescenza o della densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀). Nell'implementazione originale, LEMOS supportava 16 micropozzetti di coltura ed è stato utilizzato per dimostrare stimolazione optogenetica in anello aperto e controllo in retroazione in anello chiuso dell'espressione genica in coltura batch¹⁸. Il dispositivo è stato sincronizzato con un computer esterno in modo che l'illuminazione dei LED potesse essere spenta durante le finestre di misurazione, riducendo al minimo l'interferenza diretta con le letture di fluorescenza e densità ottica.

Questo protocollo descrive una versione aggiornata del dispositivo, LEMOS 2.0, e il suo utilizzo per esperimenti optogenetici in colture microbiche. LEMOS 2.0 è stato riprogettato per aumentare il numero di micropozzetti di coltura indirizzabili in modo indipendente da 16 a 32, migliorando la produttività sperimentale e consentendo di testare più condizioni, repliche o progetti di controllo in un'unica esecuzione. Il design del dispositivo è stato inoltre modificato per ridurre la dispersione della luce tra i micropozzetti illuminati e quelli bui adiacenti, aumentando l'affidabilità dei controlli in condizioni di buio e degli esperimenti di stimolazione con modelli spaziali. Queste modifiche rendono la piattaforma più adatta per la caratterizzazione optogenetica comparativa, i test di controllo in più condizioni e l'adozione routinaria del protocollo da parte di laboratori che utilizzano già lettori di micropiastre.

LEMOS 2.0 è progettato per esperimenti di coltura microbica in batch che richiedono misurazioni ripetute di OD₆₀₀ e fluorescenza con illuminazione programmabile nei canali rosso, verde, blu o in condizioni di buio. Il lettore di piastre deve supportare misurazioni cinetiche di OD₆₀₀ e fluorescenza, controllo della temperatura, agitazione, definizione personalizzata del layout della piastra per le 32 micropozzette di LEMOS e esportazione automatica dei file di misurazione in una cartella monitorata dallo script di controllo Python. L'attuale implementazione è stata convalidata utilizzando un lettore di micropiastre BioTek Synergy H1 con BioTek Gen5 v3.14; l'implementazione con altri software per lettori di piastre richiede modifiche adeguate al formato di esportazione, al parser di file e ai passaggi di automazione dello schermo. Poiché il dispositivo utilizza LED con picchi di emissione a 620–630 nm, 515–525 nm e 465–475 nm, gli utenti devono selezionare attuatori optogenetici e reporter fluorescenti i cui spettri di attivazione e rilevamento siano compatibili con questi canali^19,20. Nuovi ceppi ospiti, reporter, sistemi optogenetici, mezzi di coltura, temperature di crescita, intervalli di campionamento o progetti di controllore richiederanno probabilmente una ricalibrazione dell'intensità dei LED, dell'intervallo del duty cycle, della correzione del bianco, della normalizzazione della fluorescenza e dei parametri del controllore.

Il protocollo copre l'intero flusso di lavoro di LEMOS 2.0: fabbricazione del dispositivo, assemblaggio del circuito, programmazione di Arduino, realizzazione di micropozzetti in polidimetilsilossano (PDMS), configurazione del lettore di piastre, preparazione di ceppi e colture, esecuzione automatica dell'esperimento, pulizia del dispositivo e analisi dei dati di fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀). Sebbene il flusso di lavoro illustrato si concentri sul controllo ottogenetico dell'espressione genica in batteri, lo stesso approccio può essere adattato ad altri ceppi microbici, reporter fluorescenti, sistemi attuatori ottogenetici e algoritmi di controllo. Combinando un'illuminazione programmabile con misurazioni standard effettuate tramite lettore di piastre, la piattaforma aggiornata LEMOS 2.0 offre un metodo accessibile per esperimenti ad alto rendimento basati su perturbazioni ottogenetiche e su sistemi di controllo in retroazione in colture batch.

Protocollo

All experimental procedures involving Escherichia coli strain MG1655  were performed in designated Biosafety Level 2 (BSL-2) laboratories at Texas A&M University. Bacterial cultures and manipulations were carried out in certified Class II Biosafety Cabinets in accordance with standard containment guidelines. Procedures were performed under designated containment conditions reviewed and approved by the Texas A&M Institutional Biosafety Committee (IBC) under permit number IBC2023-044.

1. Fabrication of the LEMOS 2.0 Frame and LED Array

NOTE: Begin fabricating LEMOS 2.0 by 3D-printing the LEMOS 2.0 frame and placing the LED strips into the device body. The goal is to generate a mechanically stable frame in which each LED is positioned next to the corresponding microwell. Correct LED placement at this stage is important because misalignment can reduce stimulation uniformity and increase optical crosstalk between microwells.

1. 3D-print the LEMOS 2.0 inner frame and the casting mold for the PDMS microwells using the provided STL files in the GitHub repository (github.com/synbiosystems/LEMOS-2.0). Remove all support material after printing.
   NOTE: It is recommended to use polylactic acid (PLA) filament and a fused deposition modelling (FDM) printer with the following printing parameters: 0.2 mm layer height, 20% infill for the LEMOS 2.0 frame, and 40% infill for the casting mold.
2. Cut the LED strips across the center of the soldering pads into 2 sets of 16 LEDs. Ensure each strip end has three soldering pads available for soldering, as discussed further in Section 2.
3. Fold each LED strip in half, with the LEDs facing outward (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1).
4. Manually conform the LED strip to the device geometry and insert it between the microwells, with the +5 V soldering pads oriented downward, noting the arrow on the LED strip (Supplementary Figure 1A, Supplementary Video 1). Adjust the strip position iteratively until each LED is correctly seated in its slot before continuing.

2. Assembly and Validation of the Electrical Circuit

NOTE: Assemble the power, charging, microcontroller, switch, and LED connections required for wireless device operation. After assembly, the LEMOS 2.0 device should operate from the onboard battery, recharge through the charging module, and receive LED commands from the peripheral Arduino board. Verify each power connection before connecting the LED strips, as incorrect voltage routing can damage the microcontroller or LEDs.

CAUTION: The protocol requires prior proficiency in soldering, including appropriate safety practices (e.g., use of a smoke absorber, protective eyewear, and burn-prevention methods), soldering iron maintenance, and basic through-hole/wire-soldering techniques. Users without this experience should obtain training before attempting the steps in this section.

1. Gather all electronic components listed in the Table of Materials and inspect for visible physical damage. Review the wiring diagram (Supplementary File 1).
2. Configure the step-up voltage converter to output 5 V, instead of the default 12 V. Following the configuration key on the back of the board, disconnect pads A and B by applying heat from a soldering iron to remove the connection.
3. Solder the Arduino Nano BLE Rev2 (referred to hereafter as BLE Nano) VIN pin to the step-up converter OUT+ pin and the BLE Nano GND pin to the step-up converter OUT- pin (Supplementary Figure 1B).
4. Solder the step-up converter IN– pin to the battery charging module negative (-) pin.
5. Separate the two wires of the 'JST PH 2-Pin Cable – Female Connector, 100 mm' by pulling the battery-connection ends from the white housing. Trim each to ~70 mm to better fit in the device by trimming from the non-battery-connection ends (Supplementary Figure 1C).
6. Modify the switch. First, remove the mounting pins in each corner. Second, trim all pins to 30% of their length. Then, remove completely T1, T3, and B3 (Notation: T = top, B = bottom, numbered left to right from 1 to 4 when looking directly at the pins with the switch on top) (Supplementary Figure 1D).
7. Solder the red JST cable to B2, leaving the battery-connection end exposed for connecting to the battery’s male connector later (Supplementary Figure 1D).
8. Solder a connecting wire between B1 and B4.
9. Solder the battery charging module B+ pin to B1, being careful to leave the connecting wire from the previous step also soldered to B1 (Supplementary Figure 1E).
10. Solder the step-up converter IN+ pin to T4.
11. Solder the battery charging module positive (+) pin to T2.
12. Solder the black JST cable to the battery charging module B– pin. Leave the battery-connection end loose for later connection to the battery’s male connector.
13. Verify connections under normal device operation mode. Connect the Li-ion battery to the circuit via battery connecting wires left loose in soldering steps, with the switch in the center/off position (Supplementary Figure 1E).
14. Flip the switch to the left/on position (the side with only 2 occupied pins).
15. Verify power to the BLE Nano via the onboard power LED (labeled ‘ON’, next to the USB port), which should turn green (Supplementary Figure 1E, Supplementary Video 1).
16. Verify power to the step-up converter via its on-board LED, which should turn blue.
    NOTE: If LED indicators do not illuminate, verify all connections with a multimeter before proceeding.
17. Remove the first LED strip (inserted in step 1.4) and solder wires to both sets of VIN, DIN, and GND pads. Reinsert the LED strip, feeding the wires through the port on the side of the frame (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1).
18. Repeat with the second LED strip, according to Supplementary Video 1.
19. Solder the first LED strip to the BLE Nano GND pin, BLE Nano D13 pin, and BLE Nano VIN pin.
    NOTE: Soldering to the VIN pin requires soldering two wires to the same Arduino pin. Solder one wire inside the pin hole, and the other to the outside of the pin hole, at the indentation in the Nano board.
20. Solder the two LED strips together.
21. Verify connections with a multimeter in continuity mode by touching the VIN pin on the BLE Nano and the +5 V pad on the last unsoldered LED pad. Repeat for GND.
22. Secure the LED strips in place using a hot glue gun (Supplementary Figure 1F, Supplementary Video 1). Move slowly, gluing only one or two LED pairs at a time, allowing the glue to cool between applications. Use tweezers as needed to hold the LEDs in place.

3. Programming the Central and Peripheral Arduino Boards

NOTE: Program the two Arduino boards used for wireless communication and LED control. The central Arduino (Arduino Nano IOT 33) is connected to the computer during an experiment, and it relays commands from the Python script. The peripheral Arduino (Arduino Nano 33 BLE Rev 2) is stationed in the LEMOS 2.0 device and controls the LED array. Both boards must be loaded with the appropriate sketches before starting an experiment. Visual indicators of successful connection to the other device are available by uncommenting the listed lines in the Arduino scripts: Central – Lines 34–37, Yellow LED flashes; Peripheral – Lines 99–106, Green LED flashes. Re-comment these lines after observing successful connections between devices. Otherwise, flashing LEDs may turn on while the device is inside the plate reader, potentially compromising the measurements.

1. Download the Arduino files from the GitHub repository: LEMOS_Central.ino, LEMOS_Peripheral.ino. Download and install the latest version of the Arduino integrated development environment (IDE) from http://www.arduino.cc/en/software.
2. Install the latest version of the board package from the Boards Manager (Tools > Board > Boards Manager) (Supplementary Figure 2A).
   Central: Arduino SAMD Boards
   Peripheral: Arduino Mbed OS Nano Boards
3. Install the following Arduino libraries in the Library Manager (Tools > Manage Libraries) (Supplementary Figure 2B): 'ArduinoBLE’ for Bluetooth Low Energy communication between both peripheral and central devices, and ‘Adafruit_NeoPixel’ for LED programming.
4. Open the LEMOS_Central.ino Arduino file in the Arduino IDE.
5. Connect the corresponding device to the computer via universal serial bus (USB) data cable.
6. Select the correct COM port for the connected device (Tools > Port). If the COM port is unclear, observe which port appears and disappears when connecting and disconnecting the device.
7. Select the Arduino Nano 33 IoT board from the board menu (Tools > Board).
8. Upload the script to the device.
9. Repeat for the LEMOS_Peripheral.ino file and peripheral device (Arduino Nano 33 BLE Rev 2).

4. Casting PDMS Microwells by Replica Molding

NOTE: Cast optically clear PDMS microwells directly inside the LEMOS 2.0 frame using replica molding²¹. The PDMS microwells hold the bacterial cultures during plate-reader experiments and must have clear, bubble-free bottoms for reliable OD₆₀₀ and fluorescence measurements. Dust, bubbles, or incomplete curing can introduce well-to-well variation and should be avoided during casting. Ensure the fume hood surface is clean before casting, as any dust or debris in the PDMS will compromise its optical transparency and result in inconsistent OD₆₀₀ readings across microwells.

CAUTION: Work in a fume hood when handling uncured PDMS. Avoid skin contact with the curing agent.

1. Sanitize the interior of the LEMOS 2.0 frame where the microwells are cast by spraying 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs. Allow the LEMOS 2.0 frame to dry completely before casting PDMS microwells.
   NOTE: Ethanol exposure to the LEDs is safe, but will damage all other electrical components.
2. Spray the casting mold for the PDMS microwells with a release agent, and wait 10 min for the spray to settle on the plastic surface. A second application after an additional 10 min can improve mold release, but it is optional.
   NOTE: The release agent (e.g., Ease Release 200) will make the casting mold hydrophobic, allowing for easy removal of the casting mold from the cured PDMS microwells.
3. Weigh and mix the curing agent and base of 184 silicone elastomer to a 10:1 mass ratio of base to curing agent in a disposable plastic cup.
   NOTE: It is recommended to use 2.5 g of curing agent + 25 g of base for a total of 27.5 g mixture for one LEMOS 2.0 device; scale up proportionally if casting multiple devices simultaneously.
4. Mix vigorously for at least 5 min using a disposable spatula or wooden stick, scraping the sides and bottom of the cup to ensure complete mixing.
   NOTE: Thorough mixing is critical. Undermixed PDMS will not cure uniformly and will yield inconsistent baseline OD₆₀₀ readings across microwells.
5. Place the cup containing the PDMS mixture in a vacuum desiccator. Apply vacuum (at least 65 cmHg /25 inHg) for 45–60 min, until all visible air bubbles have been removed from the mixture. The PDMS will expand as air bubbles rise to the surface and may overflow its cup. Use a container with at least 3× the volume of the mixture.
   NOTE: Residual air bubbles in the cured PDMS will alter the optical transmission of the microwell bottoms, leading to inconsistent baseline OD₆₀₀ measurements.
6. Secure the LEMOS 2.0 frame to the outer shell using binder clips of appropriate sizes on all four sides.
   NOTE: The binder clips minimize the amount of PDMS that seeps into the gap between the outer shell and the LEMOS 2.0 frame. Excess PDMS in this gap can increase the overall device height and prevent the LEMOS 2.0 frame from sitting level within the outer shell. Placing Kapton tape along the bottom perimeter of the LEMOS 2.0 frame, adjacent to the microwells, can further reduce seepage.
7. Pour the degassed PDMS carefully into the LEMOS 2.0 frame. Use a syringe to add PDMS into each microwell in the frame to ensure they are filled with minimal bubbles.
   NOTE: Formation of small bubbles is unavoidable; they will eventually rise to the surface and disappear. Pour the degassed PDMS immediately after degassing to minimize the reintroduction of bubbles during handling.
8. Insert the 3D-printed casting mold into the PDMS-filled frame. Press the mold gently and evenly, ensuring the circular protrusions in the casting mold sit in the holes of the LEMOS 2.0 frame. The mold defines square microwells aligned next to the LEDs. Wipe away excess PDMS that overflows from the edges with a clean lint-free wipe.
9. Allow the PDMS to cure at room temperature (25 °C) on a level surface for a minimum of 30 h. If needed, accelerate curing by placing the device at 37 °C for 4 h, but only once all visible air bubbles have been removed from the PDMS.
   CAUTION: Do not expose the LEMOS device to temperatures above 37 °C, as this may cause the onboard Li-ion battery to overheat and rupture.
10. Remove the casting mold after the PDMS microwells are cured by gripping it at the edges and pulling it up with a steady force. Ensure the PDMS microwells remain in the frame.
11. Inspect each microwell to ensure that the walls are optically clear and the bottom is free of bubbles. The LEMOS 2.0 device with fresh PDMS microwells is now ready for use.

5. Configuring the Microplate Reader and Data Export Workflow

NOTE: Configure the microplate reader to obtain LEMOS 2.0-compatible kinetic measurements and automation of data export. The reader must recognize the custom LEMOS 2.0 microwell layout, acquire OD₆₀₀ and fluorescence measurements at defined intervals, and export data files to the folder monitored by the Python control script. Perform a baseline measurement with sterile medium before biological experiments to confirm that the PDMS microwells and plate-reader settings produce consistent readings. This protocol uses a BioTek Synergy H1 microplate reader operated via BioTek Gen5 software v3.14.

1. Launch Gen5.
2. Go to Plate Types and import LEMOS 2.0.xml from GitHub, or alternatively set up the custom plate layout for LEMOS 2.0 in Gen5 by referring to Supplementary File 2 (Section 1)  and Supplementary File 3.
3. Perform a baseline measurement with the LEMOS 2.0 device (microwells filled with 200 µL of sterile M9CA media, covered with a medical-grade sealing film [e.g., Breathe-Easy film]). Record the OD₆₀₀ and fluorescence baseline values for all 32 microwells and compare these values to those obtained from a standard 96-well microplate. If a large discrepancy is observed, re-cast the PDMS microwells, as bubbles or debris in the cured PDMS are the most likely cause.
   NOTE: Breathe-Easy film is gas-permeable, maintaining aerobic conditions for cell growth, while remaining optically transparent to avoid interference with fluorescence and OD₆₀₀ measurements.
4. Open the experiment protocol closed_loop_protocol.prt from the GitHub repository in Gen5.
   NOTE: A pre-configured experiment file template.xpt is available in the GitHub repository for convenience. However, the settings are described in detail in Supplementary File 2 (Section 2) and Supplementary File 3 to provide a reference for troubleshooting for users with different versions of Gen5.

6. Preparation of Bacterial Cultures for LEMOS 2.0 Experiments

NOTE: Prepare bacterial cultures for a LEMOS 2.0 optogenetic time-course experiment. A cautious approach to culture preparation is important because starting density and pre-experiment light exposure can affect the measured gene-expression dynamics. The demonstration strain is Escherichia coli (E. coli) MG1655 carrying pSR58.6 and pNO286-3²². pSR58.6 contains superfolder green fluorescent protein (sfgfp) under P_cpcG2 and constitutive CcaR, chloramphenicol resistance, and a pColE1 origin. pNO286-3 contains constitutive CcaS, spectinomycin resistance, and a p15A origin. Together, these plasmids reconstitute a green-light-inducible, red-light-repressible gene expression system. pSR58.6 and pNO286-3 were transformed into chemically competent E. coli MG1655 using standard heat-shock transformation²³. Plates were kept in a box to protect cells from ambient light to avoid premature activation of the optogenetic circuit.

1. Inoculate a single colony of the CcaSR optogenetic strain and a fluorescence-negative control strain into separate 14 mL round-bottom culture tubes, each containing 2 mL of M9CA broth supplemented with 50 µg/mL spectinomycin and 25 µg/mL chloramphenicol. Use this media formulation for all subsequent culture steps throughout the experiment.
2. Cover each tube with aluminum foil and incubate overnight (14–16 h) at 37 °C with shaking at 220 rpm.
   NOTE: Foil wrapping maintains dark conditions and prevents unintended activation of the CcaSR system. Alternatively, cultures can be incubated under constant red light by housing the tubes in an LED enclosure wired with the same electrical setup described in section 2, which more closely mimics the repressed state of the system prior to the experiment.
3. Transfer 100 µL of each overnight culture into 2 mL of fresh media in a new foil-wrapped culture tube. Incubate for 4 h at 37 °C with shaking at 220 rpm.
4. Measure the OD₆₀₀ of each sub-culture after 4 h using the microplate reader.
   NOTE: Cultures should have reached an OD₆₀₀ of 0.4–0.6.
5. Dilute each culture to OD₆₀₀ = 0.1 in fresh media, pipette 200 µL into each microwell of the LEMOS 2.0 device, taking care while pipetting to avoid the formation of air bubbles, and seal the device with a medical-grade sealing film.

7. Initiation of a LEMOS 2.0 Optogenetic Time-Course Experiment

NOTE: Start the automated LEMOS 2.0 experiment by coordinating the microplate reader, the central Arduino, and the Python control script. During the run, the computer coordinates plate-reader measurements, data export, Bluetooth communication, and LED actuation. It is critical that the Gen5 window remains visible, as the Python script uses screen-based automation to interact with the plate-reader software. A successful start is indicated by exported data files appearing in the expected folder, terminal output confirming Bluetooth communication, and LED commands updating at each control interval.

1. Slide the switch to the left to power on the LEMOS 2.0 device. The first LED on the LED strip in LEMOS 2.0 will illuminate green.
2. Connect the central Arduino to the computer via USB and select it in the Arduino IDE from the drop-down menu (Tools > Board).
3. Open the Serial Monitor and connect the peripheral Arduino staged in LEMOS 2.0 to the central Arduino.
4. Turn off the indicator LED on the LED strip by entering the letter 'o' into the serial monitor.
5. Open the experiment file LEMOS-start-data.xpt in Gen5 and take a baseline reading of the cultures in the device, ensuring that the OD₆₀₀ and fluorescence values are consistent with expectations. Close the experiment file.
6. Open the protocol file saved in step 5.4 in Gen5 and save it as an experiment by referring to the Supplementary File 2 (Section 3) and Supplementary File 3.
7. Ensure that Python 3.10 or newer is installed on the system, and install the required packages using the provided requirements.txt file.
8. Open control_duty_cyle.py (for duty cycle experiments) or control_pid.py (for PID experiments) in any suitable IDE, such as Visual Studio Code or Spyder.
   NOTE: Ensure the working directory is set to the folder containing all the Python scripts so they can be imported during script execution. The choice of IDE is not critical.
9. In the Main section of the python script, modify the file variable to match the filename chosen for the Gen5 experiment file in step 7.6.
10. Set up the experiment file and Python script side by side (Figure 1).
11. Click Run on the Gen5 experiment, then abort it once the kinetic step begins.
    NOTE: The Python script looks for a Continue button after clicking Run. However, in a fresh experiment file, this button is not displayed until the second reading is taken or the kinetic run is aborted.
12. Run the Python script. Do not minimize or cover the Gen5 window during the run.
    NOTE: The Python script uses screen-based automation and must be able to locate the Gen5 window approximately every 20 min to handle data export after each kinetic cycle. Obscuring or minimizing the window during this time may disrupt the experiment.

8. Device Cleaning, PDMS Removal, and Battery Recharging

NOTE: Clean and reset the LEMOS 2.0 device after the experiment. Remove the bacterial cultures and the used PDMS microwells, sanitize the reusable frame and shell, and recharge the battery for the next run. Avoid exposing the non-LED electronic components to ethanol or excessive mechanical force during cleaning.

1. Gently peel the medical-grade sealing film from the top of the LEMOS 2.0 device and discard.
2. Aspirate and discard all cell suspension fluid from each microwell using a pipette according to biological waste disposal procedures.
3. Separate the outer shell from the LEMOS 2.0 frame by applying a steady, even force. Avoid excessive bending or twisting of the PLA frame, as this may cause cracking or permanent deformation.
4. Peel away the bulk PDMS layer from the exterior of the frame and use tweezers to carefully remove PDMS microwells from the LEMOS 2.0 frame.
5. Sanitize the LEMOS 2.0 frame and outer shell with 70% ethanol, avoiding direct contact with any electrical components other than the LEDs, as described in step 4.1.
6. Recharge the Li-ion battery for the next experiment:
   1. Slide switch to the right/charging position.
   2. Connect USB to charging module.
   3. Confirm charging via the onboard LED, which will flash while charging (Supplementary Figure 1E).

9. Analyzing Fluorescence and Growth Dynamics

NOTE: Process the fluorescence and OD₆₀₀ data generated during the LEMOS 2.0 experiment. The analysis notebook imports the exported plate-reader data, applies blank and negative-control corrections, calculates normalized fluorescence, and generates time-course plots. Before running the notebook, confirm that the microwell assignments and condition labels match the experimental layout.

1. Open either FL_OD_Data_Analysis_Duty_Cycle.ipynb or FL_OD_Data_Analysis_PID.ipynb.
   NOTE: This uses fluorescence (FL) and optical density (OD) data, which are stored in these files, generated during the run: Datafile/fl.csv and Datafile/od.csv. The PID analysis sheet also uses the errors of expression from the set point that are stored in Datafile/errors.csv.
2. Set the conditions variable with condition names and wells.
3. Set neg_wells equal to a bracketed list of negative control microwell names.
4. Set od_blank and fl_blank to averages across blank wells, or to known values if no blank was run.
5. Set colors_4_figures to desired colors (full list of named colors available at https://matplotlib.org/stable/gallery/color/named_colors.html).
6. Set figsize to the desired width and height of resultant figures in inches.
7. Confirm filenames listed under Constants.
8. Run the notebook, figures will be generated as .png files.

10. Troubleshooting

1. During LED wiring, if the LED soldering pads break off, consider the following:
   1. Bend the corner of the LED strip to more easily fit the wires through the wiring port.
   2. If a stiffer (solid) wire was used, switch to a more flexible (stranded) wire.
2. If the switch is turned on and the BLE Nano's power LED does not illuminate, consider the following:
   1. First, confirm whether the battery is charged. Set the switch to charging mode and connect the charging module to power. If charged, the indicator LED should stop flashing and turn solid green after a few minutes. If the battery was drained, allow it to charge fully before retrying.
   2. If the battery is charged and the LED still does not illuminate, use a multimeter to measure the voltage across the BLE Nano's VIN and GND pins.
      1. 0 V: A wiring connection is broken. Inspect each solder joint along the battery > switch > step-up converter > Nano path and re-flow any joint that looks cold or incomplete.
      2. 5 V: Power is reaching the Nano correctly, so the board itself may be damaged. Attempt to power the Nano via cable to confirm this. If the power LED still does not illuminate, solder a new Nano to replace the faulty Nano.
      3. Greater than 5 V: The step-up converter has not been configured to output 5 V. Confirm pads A and B have been disconnected on the step-up converter, as described in the device assembly section.
3. If the Python script fails to run, consider the following:
   1. Confirm whether the Python script is opened from within its full project folder rather than as a standalone file; both control_duty_cycle.py and control_pid.py depend on other local modules and will fail if opened independently.
   2. Confirm that Arduino IDE is closed, since the Arduino can only have one active connection at a time. The operating system grants access to whichever program opens the port first.
   3. Confirm that the Gen5 protocol is set up correctly, especially if using different software. Refer to Supplementary File 2 (Section 2).
   4. Ensure the required packages are installed. Create a virtual environment and install the packages as listed in the requirements.txt file.
4. If the experiment stops unexpectedly, consider the following:
   1. Stops after the first cycle: The Gen5 data export path is likely misconfigured. Confirm the export destination matches the folder the Python script expects to read from the file variable.
   2. Stops after several cycles: PyAutoGUI occasionally fails to recognize on-screen elements, often after a change in screen resolution, display scaling, or window size. Re-capture the reference screenshots used by the script and keep the Gen5 window active and in the foreground throughout the run; the Python IDE window can be minimized.
   3. In the event that Gen5 reports that the chamber temperature is outside the target range, allow the reader to equilibrate before continuing. Do not override the temperature warning, because doing so can trigger an audit report window that must be closed manually and may interrupt automation.
5. If unusually high or inconsistent OD₆₀₀/fluorescence baseline values across microwells are observed, consider the following:
   1. Inspect the PDMS microwells for trapped dust or debris, which scatters light and inflates readings.
   2. Avoid leaving PDMS uncovered and exposed to ambient air for extended periods before casting or use.
6. If cells show no detectable response to light despite running the experiment, consider the following:
   1. Confirm LED "on" commands are being issued by checking both the IDE terminal output and the BLE communication log.
   2. If commands are being sent but no light is visible, check the LED soldering connections with a multimeter.

Risultati

LEMOS 2.0 è una piattaforma compatibile con lettori di micropiastre a 32 pozzetti²⁴ per la stimolazione optogenetica programmabile e la misurazione quantitativa dell'espressione genica (Figura 2A,B). Ogni micropozzetto è abbinato a un diodo a emissione luminosa (LED) WS2812B indirizzabile singolarmente, controllato da un Arduino Nano 33 BLE Sense Rev2 tramite la libreria Adafruit_NeoPixel. Il dispositivo comunica con un computer esterno tramite Bluetooth, consentendo l'aggiornamento dei comandi di illuminazione durante l'esperimento. Prima dell'uso, nuovi micropozzetti in PDMS vengono realizzati nel dispositivo mediante stampaggio per replica (Figura 2C,D). Colture di E. coli coltivate in LEMOS 2.0 a 30 °C sotto illuminazione costante del LED hanno mostrato una crescita riproducibile tra i micropozzetti, indicando che il dispositivo supporta la coltura batterica e le misurazioni con lettore di piastre durante l'intero periodo sperimentale¹⁸ (Figura 2E). Inoltre, le curve di crescita sono risultate simili in diverse condizioni di illuminazione, indicando che l'esposizione al LED non ha influenzato in modo misurabile la crescita cellulare in queste condizioni.

Per dimostrare il controllo dell'espressione genica mediante optogenetica, è stato adottato il sistema CcaSR v3.0²², un sistema a due componenti attivato dalla luce verde e represso dalla luce rossa, che regola l'espressione di sfGFP (Figura 3A). In presenza di luce verde, CcaS si autofosforila e trasferisce il fosfato al regolatore di risposta CcaR, che si dimerizza attivando l'espressione di sfGFP dipendente dal promotore P_cpcG2. In presenza di luce rossa, CcaS defosforila, riducendo così l'attività di P_cpcG2 e reprimendo l'espressione di sfGFP. I plasmidi CcaSR sono stati trasformati in E. coli MG1655 e utilizzati per gli esperimenti descritti in questo protocollo (Figura 3B). Durante l'esperimento, il lettore di micropiastre ha misurato OD₆₀₀ e fluorescenza ogni 10 minuti. Per evitare che l'illuminazione a LED interferisse con le misurazioni ottiche, i LED sono stati programmati per spegnersi durante le finestre di misurazione all'inizio e alla fine di ogni intervallo di 10 minuti (Figura 3C).

Il crosstalk tra pozzetti è stato inizialmente valutato posizionando pozzetti in condizioni di buio verticalmente od orizzontalmente adiacenti a pozzetti sottoposti a un'illuminazione costante con luce verde (Figura 3D). I pozzetti al buio adiacenti a quelli illuminati con luce verde non hanno mostrato un aumento significativo dell'espressione rispetto ai pozzetti al buio senza pozzetti vicini illuminati, indicando una minima fuoriuscita di luce tra i pozzetti. Sulla base di questi risultati, per esperimenti successivi è stato utilizzato un valore di modulazione della larghezza dell'impulso (PWM) pari a 1 su 255, al fine di garantire una stimolazione ottica sufficiente riducendo al minimo il crosstalk tra pozzetti.

Successivamente, è stata utilizzata una stimolazione ad anello aperto per definire il parametro di attuazione per il controllo optogenetico basato su LEMOS. Il parametro di attuazione era il ciclo di lavoro della luce verde, definito come la frazione di ogni finestra di illuminazione attiva assegnata alla luce verde, con il tempo rimanente di illuminazione assegnato alla luce rossa. Ogni intervallo di controllo durava 10 minuti, con i LED attivi per 8 minuti e spenti per i restanti 2 minuti al fine di evitare interferenze con le misurazioni del lettore di piastre. Cicli di lavoro della luce verde compresi tra il 5% e l'80% hanno prodotto un'espressione graduale di sfGFP, dimostrando che il ciclo di lavoro può essere utilizzato come ingresso regolabile per la regolazione optogenetica (Figura 3E). La velocità di espressione è aumentata all'aumentare del ciclo di lavoro dal 5% al 40%, senza ulteriori aumenti significativi a cicli di lavoro più elevati (Figura 3F), suggerendo che il sistema tende a saturarsi con stimolazioni prolungate alla luce verde.

Infine, è stato implementato un controllo in retroazione a ciclo chiuso per verificare se LEMOS 2.0 fosse in grado di regolare dinamicamente l'espressione genica verso un valore prefissato²⁵ (Figura 4A). I componenti del sistema di controllo sono stati assegnati come segue: attuatore — LED, controllore — computer esterno che esegue lo script PID, e uscita misurata — fluorescenza di sfGFP normalizzata rispetto all'OD₆₀₀. Il controllore ha confrontato il valore misurato di FL/OD₆₀₀ con il valore di riferimento assegnato e ha aggiornato il ciclo di lavoro della luce verde per il successivo intervallo di 10 minuti. È stato implementato un controllo proporzionale-integrale-derivativo (PID), in cui la durata dell'esposizione alla luce verde in ogni ciclo, t_green, è stata calcolata come:

In questo caso, e(t) rappresenta l'errore tra il segnale FL/OD₆₀₀ misurato e il valore di riferimento al tempo t. K è il guadagno proporzionale, τ_I  è la costante di tempo integrale e τ_D è la costante di tempo derivativa. I parametri di controllo in retroazione sono stati selezionati utilizzando il modello di espressione genica attraverso le fasi di crescita (GEAGS), precedentemente descritto²⁶. Utilizzando questi parametri, il segnale misurato si è avvicinato e ha mantenuto il valore di riferimento FL/OD₆₀₀ obiettivo (Figura 4B).

I comandi corrispondenti al ciclo di lavoro sono mostrati in Figura 4C. L'altezza delle barre rappresenta la frazione di luce verde erogata durante ciascuna finestra di illuminazione di 8 minuti. Il comando del ciclo di lavoro è cambiato a passi discreti poiché il controllore aggiornava l'ingresso una volta ogni 10 minuti. Mentre l'espressione di sfGFP si avvicinava al valore di riferimento, l'esposizione alla luce verde diminuiva e quella alla luce rossa aumentava. Dopo che il segnale misurato aveva raggiunto il valore di riferimento, si osservava comunque un basso livello di ingresso di luce verde. Questo ingresso di controllo residuo riflette probabilmente il termine derivativo che risponde al brusco cambiamento del tasso di espressione in prossimità del valore di riferimento. Questi risultati dimostrano che LEMOS 2.0 può implementare un controllo retroattivo PID guidato da modello per l'espressione genica optogenetica in coltura batch.

Figura 1: Configurazione del software LEMOS 2.0 durante un esperimento. Screenshot di esempio che mostra lo script di controllo Python in esecuzione in VS Code (a sinistra), con i comandi per i LED che compaiono nel terminale man mano che vengono inviati al microcontrollore Arduino. Nella finestra dell'esplora file è visibile la directory del progetto contenente lo script principale e i moduli di funzione associati. A destra, il software del lettore di piastre mostra un ciclo di misura cinetica in corso; al termine di ogni ciclo, lo script Python attiva automaticamente l'esecuzione successiva tramite l'interfaccia Gen5 e aggiorna di conseguenza i comandi del duty cycle dei LED. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Costruzione del dispositivo LEMOS e caratterizzazione della crescita cellulare. (A) Schema esploso del dispositivo LEMOS che mostra micropozzetti in PDMS, LED di stimolazione, batteria, interruttore, microcontrollore, modulo di ricarica, telaio del dispositivo e involucro esterno. (B) Dispositivo assemblato con micropozzetti in PDMS riempiti con acqua deionizzata. (C) Pozzetto in PDMS stampato all'interno del dispositivo LEMOS. Riprodotto da Namboothiri et al. (2026)¹⁸, concesso in licenza secondo CC BY 4.0. (D) Stampo stampato in 3D per la realizzazione dei micropozzetti. (E) Curve di crescita di E. coli nel dispositivo LEMOS a 30 °C (N = 3 replicati tecnici per ciascun pozzetto illuminato continuamente con luce verde o rossa, nonché mantenuto al buio). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Caratterizzazione del sistema optogenetico in LEMOS e dinamiche di controllo ad anello aperto. (A) Mappa del plasmide del sistema optogenetico a due componenti CcaSR: la luce verde (522 nm) attiva CcaS/CcaR per aumentare l'espressione di sfGFP, mentre la luce rossa (620 nm) riduce l'espressione. (B) Protocollo per eseguire esperimenti optogenetici con il sistema optogenetico CcaSR. (C) Schema di funzionamento di LEMOS. Durante il corso temporale di 12 h, il dispositivo rimane nel lettore di micropiastre. Il lettore misura la fluorescenza di sfGFP e l'OD₆₀₀, quindi trasmette i dati a un computer, che gestisce la temporizzazione e controlla gli sketch di Arduino. Gli sketch di Arduino comandano il microcontrollore integrato a disattivare temporaneamente l'illuminazione a LED durante ogni misurazione. Adattato da Namboothiri et al. (2026)¹⁸, concesso in licenza secondo CC BY 4.0. (D) Effetto dell'interferenza della luce verde su cellule non stimolate in condizioni di buio. Nel layout della piastra, le caselle verdi indicano micropozzetti illuminati con luce verde (N = 9), le caselle grigie indicano micropozzetti in condizioni di buio senza interferenza luminosa dai micropozzetti circostanti (N = 6), le caselle viola indicano micropozzetti al buio (N = 3) adiacenti verticalmente a micropozzetti illuminati con luce verde, le caselle gialle indicano micropozzetti al buio (N = 3) adiacenti orizzontalmente a micropozzetti illuminati con luce verde, e le caselle blu indicano micropozzetti illuminati con luce verde (N = 2) con una ceppa controllo per misurare l'autofluorescenza. (E) Risposte ad anello aperto in LEMOS a cicli di lavoro della luce verde variabili (5–80%, N = 3) come parametro di attuazione. Le linee continue indicano i valori medi; le fasce ombreggiate indicano le deviazioni standard. (F) Tasso medio di espressione durante la fase esponenziale di crescita in funzione del ciclo di lavoro. N indica il numero di replicati tecnici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Controllo con retroazione in ciclo chiuso in LEMOS 2.0. (A) Schema del funzionamento in ciclo chiuso: il lettore di micropiastre svolge la funzione di sensore che misura FL/OD₆₀₀, il computer funge da controllore e il dispositivo LEMOS 2.0 attiva i LED per regolare l'espressione genica. Il processo è l'espressione genica in cellule batteriche vive. Adattato da Namboothiri et al. (2026)¹⁸, concesso in licenza secondo CC BY 4.0. (B) Controllo proporzionale integrale derivativo (PID) per il raggiungimento del valore di riferimento di FL/OD₆₀₀ (SP = 18,5 × 10⁵ u.a.). I riferimenti con luce costante sono in verde e rosso (N = 3). Le prove di inseguimento del valore di riferimento sono rappresentate da linee arancioni (N = 3). Le linee continue indicano la media di FL/OD₆₀₀; le fasce ombreggiate indicano le deviazioni standard. La linea tratteggiata indica il valore di riferimento. (C) Comandi rappresentativi del duty cycle generati dal controllore PID durante l'inseguimento del valore di riferimento in ciclo chiuso. L'altezza delle barre indica la frazione di luce verde erogata durante ciascun intervallo di illuminazione. N indica il numero di replicati tecnici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Piattaforma	Formato di coltura	Lettura	Controllo con retroazione dimostrato	Formato di crescita	Vincolo affrontato da LEMOS 2.0
LEMOS 2.0	32 micropozzetti in PDMS su lettore di piastre	Lettore di piastre commerciale	Tracciamento del set-point PID guidato da modello	Coltura batch agitata	Questo studio	Questo studio
LEMOS 1.0	16 micropozzetti in PDMS su lettore di piastre	Lettore di piastre commerciale	Tracciamento del set-point PI e PID guidato da modello	Coltura batch agitata	Bassa produttività; compatibilità limitata con condizioni di buio	18
Turbidostato automatizzato + campionamento robotico	Turbidostato	Citometria a flusso + sensore di OD	Tracciamento del set-point PI, PID, MPC	Coltura continua	Necessita di campionamento robotico; ritardo tra misurazione e attuazione	2, 3
Microscopia Mother-machine	Microfluidica a singola cellula	Microscopia in tempo reale su cellule vive	Retroazione a livello di singola cellula / MPC	Perfusione continua	Necessita di microfluidica e microscopia specializzate	4, 6, 7
Chi.Bio	Turbidostato miniaturizzato	Sensori integrati di OD/FL	Tracciamento del set-point PI	Coltura continua	L'intervallo dinamico del sensore integrato limita le prestazioni del controllo basato su fluorescenza	5
Light Tube Array	Tubi di coltura	OD/ citometria a flusso esterni	Solo in ciclo aperto	Coltura batch agitata	Campionamento manuale; lettura della crescita online limitata	10
LAVA / LITOS / RainbowCap / Diya	Dispositivi di illuminazione per piastre multipozzetto	Lettore di piastre commerciale	Solo in ciclo aperto	Coltura batch	Stimolazione e lettura separate; automazione limitata	12, 13, 14, 15
Lustro	Illuminazione di piastre a 96 pozzetti	Lettore di piastre commerciale	Solo in ciclo aperto	Coltura batch	Necessita di trasferimento robotico tra stimolazione e lettura	8
RT-OGENE	Stadio compatibile con multipozzetto/microfluidica	OD/FL basati su telecamera	Chiusura del ciclo tentata; limitata dalla lettura	Coltura batch statica	La lettura basata su telecamera e la coltura statica limitano le prestazioni di controllo	16
optoPlateReader	Lettore/stimolatore personalizzato a 96 pozzetti	Fotodiodi integrati	Tracciamento del set-point bang-bang	Coltura batch agitata	La dipendenza dal reporter/filtro e la sensibilità ridotta alla fluorescenza limitano la flessibilità della lettura	11,17

Tabella 1: Confronto tra LEMOS 2.0 e le piattaforme optogenetiche esistenti^{2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18}.

Figura supplementare 1: Immagini del montaggio. (A) Striscia LED piegata e striscia modellata all'interno del dispositivo. (B) Nano BLE Sense Rev 2 saldato al convertitore boost, che a sua volta è saldato al modulo di ricarica della batteria. (C) Versioni originale e modificata del cavo ‘JST PH 2-Pin Cable – Female Connector 100mm’. (D) Interruttore originale, interruttore modificato, cavo JST PH rosso saldato e ponticello corto saldato tra due pin su lati opposti della fila inferiore. (E) Inserimento dell'interruttore nell'assemblaggio del circuito e alimentazione del circuito. (F) Vista laterale dei LED e delle strisce LED posizionate con colla a caldo. Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 2: Schermate della configurazione di Arduino IDE. (A) Schermata del Gestore schede, che mostra una ricerca per una delle schede richieste. (B) Schermata del Gestore librerie, che mostra due delle librerie richieste. Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 1. Schema di Cablaggio di LEMOS. Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 2: Protocollo per la configurazione di un layout personalizzato di piastra per LEMOS 2.0 in Gen5. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: Screenshot dei passaggi del software descritti nel File supplementare 2. Cliccare qui per scaricare il file.

Video supplementare 1: Video di montaggio con i seguenti passaggi. Manipolazione della striscia LED all'interno della cornice, fissaggio della striscia LED con colla a caldo, disposizione dei fili sia verso che tra le strisce LED, e assemblaggio finale con la circuitazione elettronica. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Questo protocollo descrive la fabbricazione e l'uso di LEMOS 2.0, una micropiastra da 32 pozzetti con LED integrati per stimolazioni optogenetiche e esperimenti con controllo retroattivo all'interno di un lettore di micropiastre standard. Esperimenti rappresentativi dimostrano che LEMOS 2.0 consente la crescita microbica (Figura 2E) senza evidenza di fototossicità significativa sotto illuminazione. Inoltre, LEMOS 2.0 riduce la fuoriuscita di luce nei pozzetti adiacenti mantenuti al buio (Figura 3D), migliorando così l'affidabilità dei controlli in condizioni di buio e degli esperimenti di stimolazione con modelli spaziali. Inoltre, LEMOS 2.0 permette l'attuazione optogenetica basata sul duty cycle (Figura 3E) e implementa un controllo retroazionato PID in tempo reale dell'espressione genica in colture batch (Figura 4B).

Il fotoblecamento è un aspetto importante da considerare negli esperimenti di optogenetica, poiché lo stesso percorso ottico viene utilizzato sia per l'attuazione che per la lettura della fluorescenza²⁷. LEMOS 2.0 utilizza LED RGB commerciali contenenti tre diodi con picchi di emissione a 620–630 nm (rosso), 515–525 nm (verde) e 465–475 nm (blu)¹⁹. Pertanto, la scelta del reporter e l'intensità operativa dei LED devono essere selezionate per minimizzare l'overlap spettrale tra le lunghezze d'onda di attuazione e lo spettro di eccitazione del reporter fluorescente, mantenendo al contempo un'illuminazione sufficiente per la regolazione optogenetica. In questo protocollo, è stato utilizzato il sistema CcaSR, le cui risposte alla luce verde e rossa rientrano nelle ampie bande di attivazione e disattivazione riportate per questo sistema²², e la fluorescenza di sfGFP è stata misurata utilizzando un'eccitazione a 485 nm. Poiché le lunghezze d'onda di attuazione verdi e rosse utilizzate per il controllo di CcaSR sono distinte dalla lunghezza d'onda di eccitazione di sfGFP, e poiché l'output del LED è stato ridotto al minimo a un'intensità PWM di 1 su 255 pur producendo una regolazione optogenetica robusta, ci si aspetta che il fotoblecamento causato dall'attuazione con LED sia limitato. Tuttavia, un certo grado di fotoblecamento potrebbe comunque verificarsi durante esperimenti a lungo termine; nelle condizioni utilizzate in questo caso, non è stato tuttavia sufficientemente elevato da oscurare l'induzione optogenetica misurata, la risposta al duty cycle o la dinamica di tracciamento in ciclo chiuso²⁰.

Diversi passaggi sono fondamentali per un funzionamento affidabile. Durante la fabbricazione, ogni LED deve essere allineato al micropozzo corrispondente per mantenere l'uniformità della stimolazione e ridurre il crosstalk ottico. Durante il montaggio del circuito, il convertitore elevatore deve essere configurato a 5 V prima di collegare il microcontrollore e le strisce di LED. Anche la stampatura del PDMS richiede particolare attenzione, poiché bolle, polvere, detriti o una reticolazione incompleta possono alterare la trasmissione ottica attraverso i fondi dei micropozzi e produrre letture di densità ottica (OD) non uniformi.₆₀₀ o basi di fluorescenza²⁸. Una misurazione di base con mezzo sterile deve pertanto essere eseguita prima degli esperimenti biologici. Se si osservano grandi discrepanze nell'OD₆₀₀ Se si osservano letture anomale nei pozzetti rispetto al resto della piastra, i pozzetti interessati devono essere ispezionati per verificare la presenza di difetti di fabbricazione menzionati in precedenza. A seconda della gravità, tali micropozzetti devono essere esclusi dall'analisi oppure la piastra deve essere rifatta completamente.

La configurazione del software è un'altra causa comune di esperimenti falliti. Il flusso di lavoro attuale dipende dal funzionamento coordinato del metodo del lettore di piastre, dell'esportazione dei dati da Gen5, dello script di controllo in Python e della comunicazione Bluetooth tra le schede Arduino centrale e periferica. Il percorso di esportazione e il formato del file devono corrispondere alla struttura prevista dallo script Python, e la finestra di Gen5 deve rimanere visibile durante l'esecuzione poiché l'automazione utilizza interazioni basate sullo schermo. Prima di avviare un esperimento, il dispositivo LEMOS deve essere collegato all'Arduino centrale ed è necessario eseguire una procedura di prova per verificare che tutti i LED si accendano correttamente; tutti i LED non reattivi devono essere identificati e risolti prima del caricamento delle colture batteriche, poiché guasti non rilevati comporterebbero condizioni di illuminazione non controllate durante l'esperimento. Gli utenti che adattano il flusso di lavoro a un modello diverso di lettore di piastre o a un diverso pacchetto software dovrebbero mantenere la stessa tempistica, logica di misurazione, esportazione e analisi, modificando il livello di automazione secondo necessità.

LEMOS chiude il ciclo permettendo un'attuazione automatizzata sincronizzata con gli intervalli di misurazione¹⁸. In questo caso, il dispositivo LEMOS iniziale viene aggiornato raddoppiando il numero di pozzetti per aumentare la produttività. Inoltre, una geometria rivista dei micropozzetti riduce al minimo la dispersione della luce tra pozzetti adiacenti, consentendo di testare circuiti optogenetici in condizioni di buio insieme a condizioni illuminate nello stesso esperimento. Attualmente, LEMOS 2.0 supporta esperimenti in coltura batch. Poiché la velocità di crescita, la disponibilità di risorse e la dinamica dell'espressione genica cambiano durante la coltura batch, potrebbe essere necessario ricalibrare parametri come intensità del LED, intervallo del duty cycle, intervallo di campionamento e parametri del controllore per altri ceppi, reporter, sistemi optogenetici o condizioni di crescita²⁰. Un confronto dettagliato tra LEMOS 2.0 e le piattaforme precedentemente sviluppate per condurre studi optogenetici è riportato nella Tabella 1. Versioni future potrebbero incorporare canali o serbatoi integrati nella piastra per uno scambio e un'accurata diluizione del mezzo, consentendo esperimenti più lunghi mantenendo condizioni di crescita più costanti. Altri design potrebbero inoltre supportare lunghezze d'onda alternative dei LED o ridurre la dipendenza dall'automazione software basata su schermo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filo intrecciato da 22 AWG	Amazon	ASIN: B089CQ2N69	Filo economico per collegare il circuito elettrico. Sono accettabili fili rigidi o intrecciati.
Interruttore a scorrimento 8 pin 3 posizioni 2P3T DP3T con manopola laterale	Amazon	ASIN: B007Q9Y8YC	L'interruttore e i pin devono trovarsi su lati adiacenti, non opposti, come invece è più comune.
Arduino Nano 33 BLE Rev 2	Arduino	ABX00071	Microcontrollore – Profilo piatto e funzionalità BLE adatte alle esigenze del dispositivo periferico.
Arduino Nano 33 IoT	Arduino	ABX00027	Microcontrollore – Utilizzato come dispositivo centrale.
Lettore di micropiastre BioTek Synergy H1	Agilent (BioTek)	—	Oppure lettore di piastre compatibile con modalità cinetica
Film sigillante Breathe-Easy	USA Scientific	9123-6100	Film sigillante di grado medico; sigillo per micropiastre permeabile ai gas
Cloramfenicolo (soluzione madre 25 mg/mL in etanolo)	Varie	—	Concentrazione di lavoro 25 µg/mL
E. coli MG1655
Ease Release 200	Mann Release Technologies		Agente distaccante
Nastro Kapton	Amazon	ASIN: B07F8TZZ4N
Piastre di agar LB e antibiotici appropriati	In sede	—	Si presuppone che questi siano già disponibili.
Batteria Li-ion 3,7 V, 3000 mAh (11,1 Wh), formato 104060	Ufine	UFX0391-03	Dovrebbe essere fornita con cavo JST PH a 2 pin maschio. Prodotta da Liter Energy, venduta da diversi rivenditori.
Modulo di carica e scarica per batteria Li-ion con USB di tipo C (5 V 1 A)	Amazon	ASIN: B0CTMJMRKZ	Cercare su Amazon "Sostituisce TP4056". Scorrere oltre i moduli TP4056 standard. Fermarsi a qualsiasi prodotto che mostri i moduli più piccoli e neri con la dicitura "Sostituisce TP4056" nel titolo.
Cavo JST PH Li-ion a 2 pin – Connettore femmina da 100 mm	Varie	ASIN: B07NWNPB77	Deve essere compatibile con il connettore JST della batteria’.
Mini modulo boost 3,7 V a 5 V/8 V/9 V/12 V, scheda step-up con indicatore LED	Amazon (Teyleten Robot)	ASIN: B0B4TB9QNY	[https://a.co/d/03ASKZPq](https://a.co/d/03ASKZPq)
Piastra Nunc OmniTray a pozzetto singolo	Thermo Scientific	242811	Guscio esterno
pNO286-3	Addgene	Plasmide n. 107746	Codifica per l'espressione costitutiva di CcaS
pSR58.6	Addgene	Plasmide n. 63176	Codifica per l'espressione costitutiva di CcaR e sfGFP sotto il promotore PcpcG2
Stagno e saldatore	Varie	—	Raccomandazioni: punta fine, saldatura con anima a flussante o resina.
Spettinomicina (soluzione madre 50 mg/mL)	Varie	—	Concentrazione di lavoro 50 µg/mL
Provette sterili (14 mL, fondo rotondo)	Varie	—
Elastomero siliconico SYLGARD 184 (base + agente indurente)		SYLGARD 184	Rapporto di indurimento:base 1:10 in massa
Cavo USB-A a Micro USB	Varie	—	Per collegare le schede Arduino al PC. Deve essere un cavo per il trasferimento dati, non semplicemente un cavo di ricarica.
Cavo di ricarica USB-A a USB-C	Varie	—	Si collega al modulo di ricarica della batteria
Desiccante a vuoto e pompa	Varie	—	Per la degasificazione del PDMS
Striscia LED RGB a pixel controllati WS2812B IC SPI, 100 LED/m, CC5V, IP30, nera	Amazon (BTF-LIGHTING)	ASIN: B088B8G8LD ; Numero prodotto BTF-LIGHTING: WS2812B1M100LB30	Striscia LED con pixel singolarmente accessibili. 100 LED/m. Tensione: 5 V. IP30 indica la resistenza all'acqua. Il colore nero è preferibile al bianco per riflettere meno luce.