Un protocollo ottimizzato per la generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Qian Song; Yuqing Zhu; Shoudong Ye

doi:10.3791/73561

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Articolo metodologico

Un protocollo ottimizzato per la generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte umane

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DOI:

10.3791/73561

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3 settembre 2026

Qian Song¹ , Yuqing Zhu¹ , Shoudong Ye¹

¹Center for Stem Cell and Translational Medicine, School of Life Science and Medical Engineering, Anhui University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per la generazione di organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Abstract

Gli organoidi vascolari derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) si sono affermati come modelli tridimensionali potenti per lo studio dello sviluppo vascolare, dei meccanismi delle malattie e delle risposte ai farmaci. Gli attuali protocolli per organoidi vascolari permettono la generazione di reti endoteliali–pericitarie autoriproducentisi; tuttavia, la variabilità tra i diversi lotti, la formazione incoerente degli organoidi e una copertura inadeguata da parte dei periciti possono compromettere la riproducibilità e la scalabilità. Questo studio presenta un protocollo ottimizzato per la generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) con maggiore riproducibilità e coerenza strutturale. Le modifiche principali includono condizioni migliorate per la formazione del corpo embrioide, concentrazioni e tempistiche ottimizzate dei fattori di crescita durante l'induzione mesodermica e la specificazione vascolare, e condizioni di coltura tridimensionale migliorate che favoriscono un efficace reclutamento dei periciti e interazioni endoteliali–pericitarie. Gli organoidi ottimizzati mostrano reti endoteliali altamente ramificate CD31-positive costantemente circondate da periciti PDGFR-β-positivi, con una riduzione significativa della variabilità tra i lotti rispetto al protocollo originale. Vengono fornite procedure dettagliate passo dopo passo per la generazione degli organoidi, la caratterizzazione mediante immunofluorescenza su preparati interi e la valutazione del controllo qualità. Questo metodo ottimizzato consente la produzione scalabile di organoidi vascolari di alta qualità, adatti allo studio delle interazioni tra cellule vascolari, alla modellizzazione delle malattie e allo screening di composti, riducendo così la barriera tecnica per i laboratori che desiderano adottare questo sistema modello.

Introduzione

Gli organoidi tridimensionali (3D) si sono affermati come potenti strumenti per modellare lo sviluppo e le malattie degli organi umani in vitro, offrendo una biomimesi strutturale e una rilevanza fisiopatologica superiori rispetto ai modelli convenzionali di coltura cellulare bidimensionale¹^,². Negli ultimi anni, sono stati sviluppati con successo organoidi derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) per diversi tipi di tessuti, tra cui intestino³, cervello⁴^,⁵, rene⁶, fegato⁷^,⁸ e retina⁹. Tuttavia, una delle principali sfide negli studi basati sugli organoidi è la vascolarizzazione insufficiente durante la coltura a lungo termine, che può causare ipossia e necrosi, ostacolando così l'espansione e la differenziazione degli organoidi¹⁰^,¹¹. Per superare questa limitazione, sono state introdotte diverse strategie di co-coltura, tra cui l'inserimento di cellule endoteliali o cellule staminali mesenchimali per favorire la formazione di reti vascolari¹²^,¹³. Tuttavia, le colture bidimensionali convenzionali e i modelli animali non riproducono pienamente la biologia vascolare umana, mentre gli approcci di co-coltura introducono una maggiore complessità sperimentale¹⁴. Gli organoidi vascolari capaci di vascolarizzazione autonoma rappresentano quindi una promettente alternativa rilevante per l'uomo¹⁵.

La formazione della rete vascolare coinvolge sia la vasculogenesi che l'angiogenesi, processi orchestrati attraverso interazioni tra cellule endoteliali e cellule murali, come periciti e cellule muscolari lisce vascolari, e strettamente regolati da molteplici molecole segnale, tra cui VEGF (fattore di crescita endoteliale vascolare), TGF-β (fattore di crescita trasformante-β), PDGF (fattore di crescita derivato dalle piastrine) e angiopoietine¹⁶. Nel 2019, Wimmer e colleghi hanno sviluppato un metodo per generare direttamente da hPSC organoidi vascolari tridimensionali autorganizzati¹⁷^,¹⁸. Questo sistema genera simultaneamente cellule endoteliali e periciti, portando alla formazione di reti microvascolari con lume e rivestimento della membrana basale. Sulla base di questa piattaforma, gli organoidi vascolari sono stati utilizzati per modellare la vasculopatia diabetica sotto stimolazione da glucosio elevato e citochine pro-infiammatorie (TNF-α e IL-6); tali organoidi riproducono l'ispessimento della membrana basale, un segno distintivo della patologia microvascolare diabetica¹⁷. Inoltre, questo modello è stato impiegato per studiare malattie vascolari ereditarie e come piattaforma per lo screening della tossicità vascolare¹⁹. Più recentemente, diversi studi orientati ai metodi hanno cercato di ottimizzare la generazione di organoidi vascolari. Ad esempio, i progressi nel sequenziamento dell'RNA a singola cellula hanno identificato fattori regolatori chiave, come MECOM e LEF1, fornendo così un quadro molecolare per caratterizzare e ottimizzare la formazione di organoidi vascolari umani. Inoltre, Xu et al. hanno introdotto micropozzetti per facilitare la formazione omogenea di corpi embrionoidi e hanno incorporato il cocktail CEPT per migliorare la vitalità cellulare, riducendo così efficacemente la variabilità tra diversi lotti²⁰.

Per migliorare l'omogeneità, la riproducibilità e la capacità produttiva della generazione di organoidi vascolari, il protocollo originale descritto da Wimmer et al.¹⁷^,¹⁸ è stato sistematicamente ottimizzato per affrontare diverse limitazioni fondamentali. In primo luogo, il protocollo originale utilizza l'aggregazione naturale in piastre a basso attaccamento per la formazione di corpi embrionici, il che può determinare una notevole variabilità da lotto a lotto nella dimensione degli aggregati e, di conseguenza, una differenziazione eterogenea. Nel protocollo ottimizzato, il polivinilalcool (PVA) viene combinato con un'agitazione orbitale durante la formazione degli aggregati per favorire un'aggregazione cellulare uniforme e migliorare la coerenza nella dimensione dei corpi embrionici. In secondo luogo, il protocollo originale prevede la sostituzione completa del mezzo durante la fase di formazione della rete vascolare, il che potrebbe causare notevoli fluttuazioni nelle concentrazioni di fattori di crescita e compromettere la formazione prolungata di nuovi vasi e il reclutamento dei periciti. Al contrario, il protocollo ottimizzato mantiene un terzo del mezzo condizionato ad ogni cambio di mezzo, al fine di preservare i fattori pro-angiogenici endogeni e stabilizzare l'ambiente di coltura. In terzo luogo, il protocollo originale richiede trasferimenti multipli delle piastre durante l'isolamento e la maturazione degli organoidi, aumentando così le operazioni manuali e il rischio di perdita degli organoidi. Il protocollo ottimizzato elimina questi passaggi trasferendo singolarmente gli organoidi isolati in pozzetti di piastre a 96 pozzetti a basso attaccamento, semplificando così la procedura e aumentando la capacità produttiva. Nel complesso, questo protocollo ottimizzato fornisce procedure dettagliate passo dopo passo e punti critici di controllo qualità per ridurre la complessità tecnica nell'adozione di questo sistema modello e facilitare l'uso più ampio degli organoidi vascolari nello studio dello sviluppo vascolare, dei meccanismi delle malattie e della selezione ad alto rendimento di farmaci.

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Protocollo

L'uso di hPSCs in questo studio è stato approvato dal Comitato di Bioetica dell'Università dell'Anhui (BECAHU_2026-010).

1. Mantenimento delle cellule staminali pluripotenti indotte umane

NOTA: Mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) in condizioni senza feeder. Eseguire tutte le procedure all'interno di una cappa biologica di Classe II utilizzando tecniche asettiche.

Preparazione di piastre per coltura rivestite con matrice della membrana basale
1. Prelevare un flaconcino di matrice della membrana basale da −20 °C e scongelarlo a 4 °C durante la notte per circa 12–16 h. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
2. Mescolare accuratamente la matrice della membrana basale scongelata in condizioni sterili e dividerla in aliquote monouso (ad esempio, 1 mL per provetta). Conservare le aliquote a −20 °C fino a 2 anni.
  NOTA: Mantenere fredda la matrice della membrana basale, le pipette, le punte e le provette durante le operazioni per evitare una solidificazione prematura. Evitare di introdurre bolle d'aria.
3. Scongelare l'aliquota richiesta di matrice della membrana basale su ghiaccio. Diluire la matrice della membrana basale 1:200 in DMEM preraffreddato (5 µL di matrice della membrana basale per 1 mL di DMEM; concentrazione finale, circa 5 µg/mL).
4. Mescolare delicatamente la soluzione mediante pipettatura fino a quando non rimangono particelle visibili.
5. Aggiungere 0,5 mL di matrice della membrana basale diluita in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Inclinare e ruotare delicatamente la piastra per ricoprire l'intera superficie del fondo.
6. Incubare la piastra rivestita a 37 °C in un incubatore con 5% di CO₂ per almeno 2 h oppure a 4 °C durante la notte.
  NOTA: Conservare le piastre rivestite sigillate a 4 °C per 1–2 settimane. Portare la piastra a temperatura ambiente e aspirare la soluzione di rivestimento immediatamente prima dell'uso.
Scongelamento di hiPSCs
1. Prelevare un flaconcino di hiPSCs congelate dall'azoto liquido e immergerlo immediatamente in un bagno d'acqua a 37 °C. Agitare delicatamente il flaconcino e rimuoverlo entro 1 minuto, quando rimangono solo pochi piccoli cristalli di ghiaccio.
  NOTA: Evitare un'esposizione prolungata alla dimetilsulfossido (DMSO) a 37 °C e uno scongelamento incompleto, poiché entrambi possono ridurre la vitalità cellulare.
2. Disinfettare l'esterno del flaconcino con etanolo al 70% e aprirlo all'interno della cappa a sicurezza biologica.
3. Trasferire lentamente la sospensione cellulare, goccia a goccia, in una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito preriscaldato, oppure un mezzo di mantenimento chimicamente definito equivalente. Mescolare delicatamente durante il trasferimento per diluire gradualmente il DMSO e minimizzare lo stress osmotico.
4. Centrifugare le cellule a 300 × g per 3 min a temperatura ambiente (22–24 °C) utilizzando un rotore a cestelli oscillanti.
5. Aspirare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito preriscaldato.
  NOTA: Utilizzare una pipetta P1000 e pipettare delicatamente 2–3 volte per minimizzare lo stress meccanico e la formazione di bolle.
Piattamento e coltura di hiPSCs
1. Prelevare la piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita dall'incubatore e aspirare la soluzione di rivestimento. Non lavare i pozzetti.
2. Sezionare circa 1 × 10⁵–2 × 10⁵ cellule vitali per pozzetto per il recupero di routine dopo lo scongelamento. Regolare la densità in base alla linea di hiPSC e alle esigenze sperimentali.
3. Dispensare lentamente la sospensione cellulare lungo la parete di ciascun pozzetto, senza toccare la superficie rivestita con la punta della pipetta.
4. Aggiungere Y-27632 a una concentrazione finale di 5 µM per favorire la sopravvivenza e l'adesione cellulare dopo lo scongelamento.
  NOTA: Utilizzare Y-27632 soltanto nel mezzo di piattamento iniziale. Sostituirlo con mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito privo di Y-27632 il giorno successivo.
5. Incubare le cellule a 37 °C con 5% di CO₂ e umidità satura.
6. Valutare l'adesione cellulare e la morfologia dopo circa 16–24 h. Aspirare il mezzo e sostituirlo con mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito fresco, preriscaldato e privo di Y-27632.
7. Sostituire il mezzo ogni giorno o ogni due giorni fino a quando le cellule raggiungono una confluenza di circa 70%–80% per il passaggio o la differenziazione.
  NOTA: Esaminare le colture quotidianamente. Utilizzare colonie con bordi compatti e ben definiti, alto rapporto nucleo-citoplasma e minima differenziazione spontanea.

2. Generazione e differenziamento di aggregati di iPSC umane

NOTA: Mantenere le hiPSC in condizioni senza feeder in un mezzo di mantenimento hPSC chimicamente definito su piastre rivestite con matrice della membrana basale. Passare le cellule ogni 4–5 giorni utilizzando EDTA 0,02%. Utilizzare colture con densità di semina e dimensioni delle colonie appropriate e con differenziazione spontanea minima per massimizzare l'efficienza di differenziazione vascolare.

Preparazione di una sospensione monocellulare
1. Aspirare il mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito e lavare gli hiPSC con 0,5 mL di DMEM per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
2. Aspirare il DMEM e aggiungere 0,5 mL di EDTA al 0,02% per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 2–4 minuti e monitorare le cellule finché non iniziano ad arrotondarsi.
3. Staccare le cellule utilizzando una pipetta P1000. Pipettare delicatamente 2–3 volte per dissociare gli aggregati in una sospensione monocellulare.
4. Risospendere le cellule in 5 mL di mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito e trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL.
5. Mescolare 10 µL della sospensione cellulare con 10 µL di soluzione di blu di tripano allo 0,1%. Caricare 10 µL della miscela su una camera di conteggio e determinare il numero di cellule vitali.
6. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per ottenere 5 × 10⁵ cellule vitali per pozzetto.
7. Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (22–23 °C). Aspirare il sopranatante.
8. Risospenderle in mezzo di mantenimento per hPSC chimicamente definito fresco contenente 50 µM Y-27632, in un volume di 3 mL per pozzetto.
Formazione degli aggregati
1. Aggiungere 3 mL della sospensione cellulare in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con superficie non aderente. Aggiungere PVA fino a una concentrazione finale dello 0,25%.
2. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 50 rpm e incubare a 37 °C per 1 giorno.
3. Verificare la formazione di aggregati con bordi lisci e un diametro di circa 50–100 µm o superiore prima di procedere.
4. NOTA: Ottimizzare il periodo di aggregazione per ciascuna linea di hiPSC. Prolungare l'incubazione fino a 2–3 giorni, se necessario, per ottenere aggregati della dimensione desiderata.
Induzione del mesoderma
1. Al Giorno 0, trasferire gli aggregati in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta monouso sterile da 10 mL. Conservare la piastra originale con superficie non aderente per il successivo reimpianto.
2. Lasciare sedimentare gli aggregati per gravità per circa 15–20 minuti.
3. NOTA: Manipolare gli aggregati con delicatezza e utilizzare la sedimentazione per gravità invece della centrifugazione per ridurre al minimo i danni meccanici.
4. Aspirare con attenzione il sopranatante dopo che gli aggregati si sono sedimentati.
5. Risospendere gli aggregati in 3 mL per pozzetto di mezzo N2B27 integrato con 12 µM CHIR99021 e 30 ng/mL di BMP-4.
6. Trasferire nuovamente gli aggregati nella piastra con superficie non aderente e incubare a 37 °C.
7. Pipettare gli aggregati delicatamente una volta al giorno con una pipetta P1000 per ridurre al minimo la fusione eccessiva degli aggregati. Continuare l'induzione del mesoderma per 3 giorni.
Induzione della linea vascolare
1. Al Giorno 3, trasferire gli aggregati in un tubo conico da 15 mL e lasciarli sedimentare per gravità. Conservare la piastra a 6 pozzetti originale.
2. Aspirare con attenzione il sopranatante dopo che gli aggregati si sono sedimentati.
3. Risospendere gli aggregati in 3 mL per pozzetto di mezzo N2B27 integrato con 100 ng/mL di VEGF-A e 2 µM forskolina.
4. Trasferire nuovamente gli aggregati nella piastra a 6 pozzetti con superficie non aderente e incubare per ulteriori 2 giorni.

3. Generazione di reti vascolari e organoidi

Preparazione della matrice di collagene I–membrana basale
1. Raccogliere gli aggregati generati in una piastra a 6 pozzetti per l'inclusione in una piastra a 12 pozzetti. Utilizzare circa 40–60 aggregati per pozzetto.
2. Preparare una quantità sufficiente di miscela di collagene I–membrana basale per aggiungere due strati di 0,5 mL a ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti.
3. Preparare 12 mL di matrice per una piastra a 12 pozzetti. Mantenere tutti i componenti sul ghiaccio, preparare la miscela immediatamente prima dell'uso ed evitare di introdurre bolle d'aria.
4. Aggiungere 0,5 mL di matrice in ciascun pozzetto della piastra a 12 pozzetti. Ruotare delicatamente la piastra per distribuire la matrice in modo uniforme.
5. Incubare la piastra a 37 °C per 2 h per consentire al primo strato di matrice di solidificare.
Inclusione degli aggregati
1. Trasferire gli aggregati in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta monouso sterile da 10 mL e lasciarli sedimentare per gravità.
2. Aspirare il soprannatante e lavare gli aggregati due volte con 1 mL di mezzo N2B27. Rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo residuo dopo l'ultimo lavaggio.
3. Preparare una nuova miscela di collagene I–membrana basale e mantenerla sul ghiaccio.
4. Risospendere delicatamente gli aggregati lavati nella matrice appena preparata.
5. Rimuovere la piastra a 12 pozzetti contenente il primo strato solidificato dall'incubatore.
6. Aggiungere 0,5 mL di matrice contenente gli aggregati in ciascun pozzetto.
7. Oscillare delicatamente la piastra per non più di 1 minuto per distribuire gli aggregati in modo uniforme.
8. Incubare immediatamente la piastra a 37 °C per 2 h per consentire al secondo strato di solidificare.
Induzione della formazione di sprouting vascolare
1. Preriscaldare il mezzo N2B27 integrato con 15% di FBS, 100 ng/mL di VEGF-A e 100 ng/mL di FGF-2 a 37 °C.
2. Aggiungere il mezzo preriscaldato e arricchito a ciascun pozzetto per indurre la differenziazione vascolare.
3. Monitorare le colture per la formazione di sprouting vascolare nei successivi 1–3 giorni.
4. NOTA: preriscaldare il mezzo a 37 °C prima di aggiungerlo alle colture per minimizzare la destabilizzazione della matrice gelatinosa.
Cambio del mezzo e mantenimento della coltura
1. Eseguire il primo cambio del mezzo 3 giorni dopo l'inclusione.
2. Sostituire il mezzo ogni due giorni successivamente, utilizzando mezzo N2B27 fresco contenente 15% di FBS, 100 ng/mL di VEGF-A e 100 ng/mL di FGF-2.
3. Mantenere un terzo del mezzo condizionato durante ogni cambio del mezzo e sostituire i rimanenti due terzi con mezzo fresco arricchito.
Procedere con l'isolamento degli organoidi vascolari al Giorno 10.

4. Stabilimento di organoidi vascolari e preparazione per la colorazione

Isolamento di reti vascolari individuali
1. Inserire l'estremità arrotondata di una spatola sterile lungo il bordo della pozzetta e staccare delicatamente la matrice gelatinosa dal fondo.
2. Continuare a spostare la spatola dal bordo della pozzetta verso il centro finché l'intera matrice gelatinosa non galleggia liberamente.
3. Utilizzare due aghi sterili per escindere singole reti vascolari dal gel. Rimuovere la maggior quantità possibile di matrice in eccesso senza danneggiare la rete vascolare.
Coltura di organoidi isolati
1. Trasferire ciascun organoide isolato direttamente in una pozzetta singola di una piastra a 96 pozzette con superficie non aderente, utilizzando una pipetta monouso sterile.
2. Aggiungere 100 µL di mezzo N2B27 integrato con il 15% di FBS, 100 ng/mL di VEGF-A e 100 ng/mL di FGF-2 a ciascuna pozzetta.
3. Incubare gli organoidi per ulteriori 5 giorni e sostituire il mezzo arricchito giornalmente.
4. Verificare che gli organoidi presentino una morfologia arrotondata e completamente incapsulata entro il giorno 5 della maturazione.
Fissazione degli organoidi vascolari
1. Trasferire gli organoidi morfologicamente maturi in provette microcentrifuga da 2 mL. Elaborare non più di circa 60 organoidi per provetta.
2. Aspirare con attenzione il mezzo e aggiungere paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS.
3. Fissare gli organoidi a temperatura ambiente per 1 h.
  ATTENZIONE: La PFA è tossica e sospettata cancerogena. Manipolare la PFA all'interno di una cappa chimica indossando idonei dispositivi di protezione individuale.
4. Aspirare la PFA e sostituirla con PBS.
  PAUSA: conservare gli organoidi vascolari fissati in PBS a 4 °C per un massimo di 1 mese.

5. Colorazione e imaging confocale di organoidi vascolari

Bloccaggio e permeabilizzazione
1. Aggiungere 2 mL di buffer di bloccaggio a ciascun tubo contenente organoidi vascolari fissati.
2. Posizionare i tubi verticalmente su uno shaker orbitale e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 2 h per bloccare e permeabilizzare gli organoidi.
Incubazione con anticorpo primario
1. Aspirare il buffer di bloccaggio e aggiungere 50–100 µL di anticorpo primario diluito 1:100 nel buffer di bloccaggio.
2. Posizionare i tubi in posizione verticale su uno shaker e incubare con agitazione a 4 °C per tutta la notte.
Lavaggio e incubazione con anticorpo secondario
1. Lavare i campioni tre volte con PBST per 10–15 min per ogni lavaggio. Agitare i tubi posizionati verticalmente durante ciascun lavaggio.
2. Aggiungere anticorpo secondario fluorescente diluito 1:300 nel buffer di bloccaggio.
3. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2 h.
Controstaining nucleare e lavaggio finale
1. Lavare i campioni due volte con PBST per 10–15 min per ogni lavaggio.
2. Aggiungere la soluzione di Hoechst diluita 1:5.000 in PBS e incubare a temperatura ambiente per 10–15 min.
3. Lavare i campioni con PBS per 10–15 min.
Acquisizione di immagini confocali
1. Trasferire gli organoidi colorati in piastre per imaging confocale.
2. Acquisire le immagini confocali utilizzando parametri di imaging costanti tra i diversi gruppi sperimentali.
Analisi quantitativa delle immagini di organoidi vascolari
NOTA: Eseguire l'analisi quantitativa delle immagini utilizzando Fiji/ImageJ e AngioTool. Mantenere impostazioni identiche di acquisizione al microscopio per tutti i gruppi sperimentali.
1. Misurazione del diametro degli aggregati
  1. Acquisire immagini in campo chiaro degli aggregati di hiPSC al Giorno 0 utilizzando un microscopio invertito con scala calibrata. Immortalare aggregati ben separati e includere una barra di scala.
  2. Importare ogni immagine in Fiji/ImageJ. Tracciare una linea lungo la barra di scala utilizzando lo strumento Linea Retta e selezionare Analyze > Set Scale.
  3. Inserire la distanza e l'unità conosciute (ad esempio, 100 µm) e selezionare Global per applicare la calibrazione a tutte le immagini della sessione.
  4. Tracciare una linea lungo il diametro più ampio di ciascun aggregato utilizzando lo strumento Linea Retta. Selezionare Analyze > Measure oppure premere Ctrl+M e registrare il diametro in µm.
  5. Misurare almeno 30 aggregati per ogni lotto.
  6. Per aggregati non sferici, delimitare ciascun aggregato utilizzando lo strumento di Selezione Ellittica o Poligonale. Selezionare Analyze > Set Measurements > Feret's diameter e registrare la misurazione.
  7. Esportare le misurazioni dalla tabella dei risultati e raccogliere i dati in un foglio di calcolo.
  8. Calcolare la media, la deviazione standard (SD) e il coefficiente di variazione (CV) secondo la formula CV = SD/media × 100% per ogni lotto.
2. Misurazione del diametro degli organoidi
  1. Acquisire immagini in campo chiaro di organoidi vascolari maturi al Giorno 15 utilizzando un microscopio invertito con scala calibrata. Includere una barra di scala in ogni immagine.
  2. Importare ogni immagine in Fiji/ImageJ e calibrare la scala come descritto al passaggio
  3. Tracciare una linea lungo il diametro più ampio di ciascun organoide utilizzando lo strumento Linea Retta. Selezionare Analyze > Measure oppure premere Ctrl+M e registrare il diametro in µm.
  4. Misurare almeno 30 organoidi per ogni lotto.
  5. Per organoidi di forma irregolare, misurare il diametro più lungo e quello più corto e calcolarne la media, oppure determinare il diametro di Feret come descritto al passaggio 5.6.1.6.
  6. Esportare le misurazioni e calcolare la media, la SD e il CV per ogni lotto.
3. Quantificazione dell'area vascolare positiva per CD31
  1. Acquisire immagini z-stack confocali di organoidi interi al Giorno 15 colorati per CD31. Utilizzare impostazioni identiche di potenza del laser, guadagno, offset e pinhole per tutti i campioni.
  2. Generare proiezioni di massima intensità (MIPs) dagli z-stack utilizzando il software del microscopio o Fiji/ImageJ.
  3. Applicare una soglia di intensità per segmentare la rete vascolare positiva per CD31 escludendo il segnale di fondo.
  4. Selezionare Process > Noise > Remove Outliers e utilizzare un raggio di 2–5 pixel per rimuovere piccoli artefatti. Selezionare Process > Binary > Fill Holes per riempire piccoli vuoti all'interno della rete vascolare.
  5. Selezionare Analyze > Set Measurements e abilitare Area e Area fraction. Selezionare Analyze > Measure per determinare l'area vascolare.
  6. Calcolare l'area vascolare positiva per CD31 come percentuale dell'area totale dell'organoide.
  7. Analizzare almeno tre organoidi per ogni lotto provenienti da tre lotti indipendenti. Esportare le misurazioni per l'analisi statistica.
4. Quantificazione della copertura pericitarica positiva per PDGFR-β
  1. Acquisire immagini z-stack confocali di organoidi interi al Giorno 15 colorati per CD31 e PDGFR-β. Generare MIPs dagli z-stack.
  2. Importare le MIPs di CD31 e PDGFR-β in Fiji/ImageJ e verificare l'allineamento delle immagini.
  3. Sogliare il canale CD31 per generare una maschera binaria che definisca la rete vascolare.
  4. Sogliare il canale PDGFR-β utilizzando lo stesso approccio di segmentazione per generare una maschera binaria del segnale pericitarico.
  5. Selezionare Process > Image Calculator e applicare l'operazione AND alle maschere di CD31 e PDGFR-β per identificare i pixel sovrapposti.
  6. Misurare l'area del segnale sovrapposto.
  7. Calcolare la copertura pericitarica come (area positiva per PDGFR-β all'interno dei vasi positivi per CD31/area vascolare totale positiva per CD31) × 100%.
  8. Analizzare almeno tre organoidi per ogni lotto provenienti da tre lotti indipendenti. Esportare le misurazioni per l'analisi statistica.
5. Analisi dell'indice di ramificazione mediante AngioTool
  1. Acquisire immagini z-stack confocali di organoidi interi al Giorno 15 colorati per CD31. Generare MIPs dagli z-stack.
  2. Avviare AngioTool e caricare l'immagine MIP.
  3. Impostare il diametro dei vasi in base al diametro tipico osservato nelle immagini.
  4. Regolare la soglia di intensità per segmentare la rete vascolare escludendo il segnale di fondo. Impostare la dimensione minima del vaso per escludere piccoli artefatti.
  5. Eseguire l'analisi e registrare area vascolare, densità vascolare, lunghezza totale dei vasi, numero di giunzioni e indice di ramificazione.
  6. Verificare l'immagine risultante confermando che la vascolarizzazione è delineata in giallo, lo scheletro vascolare è visualizzato in rosso e i punti di ramificazione sono contrassegnati con puntini blu.
  7. Esportare i risultati quantitativi da AngioTool.
  8. Analizzare almeno tre campi di vista per ogni lotto provenienti da tre lotti indipendenti e raccogliere i dati per l'analisi statistica.

6. Analisi di PCR quantitativa in tempo reale di organoidi vascolari

NOTA: eseguire tutti i passaggi di isolamento dell'RNA e le procedure successive in condizioni prive di RNasi.

Estrazione dell'RNA
1. Raccogliere 5–10 organoidi vascolari maturi del Giorno 15 in una provetta microcentrifuga RNase-free da 1,5 mL. Rimuovere completamente il mezzo residuo.
  NOTA: Raggruppare più organoidi quando necessario per ottenere una quantità sufficiente di RNA.
2. Aggiungere 350 µL di buffer di lisi integrato con il 1% di β-mercaptoetanolo.
3. Pipettare i campioni da 10 a 15 volte finché gli organoidi non sono completamente lisiati.
4. Trasferire il lisato su una colonna spin per l'eliminazione del DNA genomico posizionata in una provetta di raccolta. Centrifugare a 11.000 × g per 30 s a temperatura ambiente.
5. Scartare la colonna e conservare il flusso passante.
6. Aggiungere un volume equivalente di etanolo al 70%, circa 350 µL, al flusso passante e mescolare accuratamente mediante pipettatura.
7. Trasferire fino a 700 µL della miscela su una colonna spin per RNA posizionata in una provetta di raccolta. Centrifugare a 11.000 × g per 30 s e scartare il flusso passante.
8. Aggiungere 350 µL di buffer di lavaggio 1 sulla colonna. Centrifugare a 11.000 × g per 30 s e scartare il flusso passante.
9. Preparare la miscela di DNasi I combinando 10 µL di DNasi I con 70 µL di buffer per digestione della DNasi per ogni campione.
10. Aggiungere 80 µL della miscela di DNasi I direttamente sulla membrana della colonna e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
11. Aggiungere 350 µL di buffer di lavaggio 1 sulla colonna. Centrifugare a 11.000 × g per 30 s e scartare il flusso passante.
12. Aggiungere 500 µL di buffer di lavaggio 2 sulla colonna. Centrifugare a 11.000 × g per 30 s e scartare il flusso passante.
13. Ripetere il lavaggio con 500 µL di buffer di lavaggio 2.
14. Centrifugare la colonna vuota a 11.000 × g per 2 min per asciugare la membrana.
15. Trasferire la colonna in una nuova provetta microcentrifuga RNase-free da 1,5 mL. Aggiungere 30–50 µL di acqua RNase-free direttamente sulla membrana e incubare a temperatura ambiente per 1 min.
16. Centrifugare a 11.000 × g per 1 min per eluire l'RNA. Conservare l'RNA a −80 °C fino all'uso.
  NOTA: Valutare concentrazione e purezza dell'RNA mediante spettrofotometria. Utilizzare un rapporto A260/A280 compreso tra 1,8 e 2,1 come intervallo accettabile.
Sintesi del cDNA
1. Preparare la miscela di reazione per la trascrizione inversa sul ghiaccio.
2. Combinare 600 ng di RNA totale con 4 µL di mix master RT contenente trascrittasi inversa, buffer, dNTP e primer casuali. Aggiungere acqua RNase-free fino a un volume finale di 20 µL.
3. Incubare la reazione a 37 °C per 15 min, seguito da 85 °C per 5 s.
4. Conservare il cDNA ottenuto a −20 °C fino all'uso.
PCR quantitativa in tempo reale
1. Preparare 9 µL di mix master per qPCR per ogni reazione combinando 5 µL di mix master 2× SYBR Green, 3 µL di acqua RNase-free e 1 µL di primer diretti e inversi premiscelati a 10 µM ciascuno.
2. Distribuire 9 µL di mix master in ogni pozzetto di una piastra qPCR a 96 pozzetti.
3. Aggiungere 1 µL di cDNA in ogni pozzetto per ottenere un volume finale di reazione di 10 µL.
4. Sigillare la piastra con pellicola adesiva ottica e centrifugare a 1.000 × g per 1 min.
5. Eseguire la denaturazione iniziale a 95 °C per 30 s.
6. Eseguire 40 cicli di amplificazione di 95 °C per 5 s seguiti da 60 °C per 30 s.
7. Eseguire l'analisi della curva di denaturazione per confermare la specificità dell'amplicone.
  NOTA: Eseguire ogni campione in duplicato o triplicato.
8. Calcolare l'espressione relativa del gene bersaglio utilizzando il metodo 2^−ΔΔCt. Normalizzare i valori di Ct al gene di controllo (ad esempio, GAPDH) e calibrare l'espressione rispetto ai campioni di hiPSC indifferenziati.

7. Analisi statistica

Presentare i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD) da almeno tre replicati biologici indipendenti (n ≥ 3) per condizione.
Trattare ogni lotto indipendente come un replicato biologico per le misurazioni del diametro degli aggregati e degli organoidi, e calcolare la media dei 30 singoli elementi misurati all'interno di ciascun lotto per ottenere un valore medio unico a livello di lotto.
Misurare l'area vascolare media, il rivestimento da parte dei periciti e l'indice di ramificazione da organoidi multipli o campi all'interno di ogni batch per ottenere un singolo valore a livello di batch, e utilizzare questi valori a livello di batch per i confronti statistici.
Confrontare il protocollo ottimizzato con il protocollo originale di Wimmer utilizzando un test t di Student a due code non appaiato t-test.
Definire il significato statistico come p < 0,05. Indicare i livelli di significatività come p < 0.05, p < 0,01, e p < 0,001, se applicabile.
Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando il software di analisi statistica versione 10.

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Risultati

Il protocollo ottimizzato qui descritto permette la generazione di organoidi vascolari maturi da hiPSCs entro circa 15 giorni, utilizzando una strategia di differenziazione progressiva (Figura 1A). In breve, gli aggregati di hiPSCs sono stati generati in piastre a basso attaccamento, supplementate con PVA al 0,25%, su un agitatore orbitale (Giorno −1). L'induzione del mesoderma è stata avviata al Giorno 0 mediante CHIR99021 (12 µM) e BMP-4 (30 ng/mL) per 3 giorni, seguita dalla specificazion...

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Discussione

Il protocollo ottimizzato descritto in questo articolo introduce diversi miglioramenti chiave al sistema di differenziazione di organoidi vascolari inizialmente sviluppato da Wimmer et al.¹⁸, con l'obiettivo di aumentare l'omogeneità, la riproducibilità e l'integrità strutturale della generazione di organoidi vascolari. Rispetto al protocollo originale, il metodo ottimizzato apporta significativi miglioramenti nei seguenti aspetti. In primo luogo, l'ottimizzazione delle condizioni di formazione de...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in conflitto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (NSFC) attraverso il Young Scientists Fund (C) (n. 32200655) e il General Program (n. 32270847). Gli autori ringraziano inoltre la Anhui University Public Service Platform per il suo supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro a bottiglia da 0,22 μm	Nalgene	FPE204030	Per filtrazione sterile di terreni e tamponi
Tubo conico da 15 mL	SparkJade	GD0001	Sterile
Tubo microcentrifuga da 2 mL	Eppendorf	22363204	Sterile
2-Mercaptoetanolo (1000×)	Gibco	21985023	Da utilizzare in cappa aspirante
Alexa Fluor 488 AffiniPure F₂ Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Lablead	Y1104	Anticorpo secondario; diluire 1:300
Alexa Fluor 594 AffiniPure F(ab′)₂ Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Lablead	Y1007	Anticorpo secondario; diluire 1:300
Anticorpo anti-CD31	Cell Signaling	3528s	Anticorpo primario; diluire 1:100 nel buffer di blocco
Anticorpo anti PDGFR β	Zenbio	347269	Anticorpo primario; diluire 1:100 nel buffer di blocco
Contatore cellulare automatico	Life Technologies	Countess™ II	Inclusi vetrini per camera di conteggio
Integratore B27 (50×)	Gibco	17504044	Per mezzo N2B27; scongelare a 4ºC, aliquotare e conservare a −20ºC, evitare cicli di congelamento-scongelamento
Centrifuga da banco	Zonkia	SC-3610	Con rotore a cestello oscillante
Cappa di sicurezza biologica (Classe II)	Thermo Fisher	NA	NA
BMP4	Proteintech	HZ-1045	Ricostituire in ddH₂O sterile fino a 100 ng/μL, aliquotare e conservare a −20 °C
Albumina sierica bovina (BSA)	Biosharp	9048-46-8	Per buffer di blocco
CHIR99021	MCE	HY-10182	Preparare una soluzione madre da 10 mM in DMSO, conservare a −20ºC per un massimo di 1 anno
Incubatore a CO₂	Fisher Scientific	LS-CO150	37 ºC, 5% CO₂, umidificato
Piatto per imaging confocale	Biosharp	BS-20-GJM	Per imaging dopo colorazione
Microscopio confocale	LEICA	NA	Dotato di obiettivi 10×, 20×, 63× e software ZEN
DMEM	Vivacell	C3113-0500	Per diluizione di Matrigel e soluzione di collagene I
DMEM/F-12, integratore GlutaMAX	Gibco	10565018	Per diluizione di Matrigel e mezzo N2B27
EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Invitrogen	AM9260G	Diluire con PBS fino allo 0,02% per il passaggio
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10270-106	Per mezzo di differenziazione completo N2B27 (15% finale)
FGF-2	Novoprotein	C046	Preparare soluzione madre da 1 mg/mL in PBS sterile, aliquotare e conservare a −20ºC
Forskolina	R&D Systems	1099	Preparare soluzione madre da 10 mM in DMSO, conservare a −20ºC
HEPES (1 M)	Gibco	15630080	Per soluzione di collagene I
Hoechst	Beyotime	C1071S-4	Preparare soluzione madre da 1 mg/mL in acqua deionizzata, aliquotare e conservare a −20ºC
Microscopio invertito	LEICA	DMIL LED	Per osservazione routinaria delle cellule
Matrigel (con fattori di crescita ridotti)	STEEMA	BM05	Conservare a −20ºC dopo l’aliquotatura, evitare cicli di congelamento-scongelamento; manipolare su ghiaccio
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (NEAA, 100×)	Gibco	11140035	Per mezzo N2B27
Integratore N2 (100×)	Gibco	17502048	Per mezzo N2B27; conservare a −20ºC al riparo dalla luce
Mezzo Neurobasal	Gibco	21103049	Per mezzo N2B27
Acqua priva di nucleasi (privi di DNasi/RNasi)	Lablead	Doo55WJ	Per preparazione di RNA/cDNA e qPCR
Agitatore orbitale	Joan Lab	NA	Per fasi di lavaggio
Paraformaldeide (soluzione al 4%)	Servicebio	G1101	Diluire con PBS fino al 4% per fissazione; utilizzare in cappa aspirante
Penicillina-Streptomicina (100×)	Gibco	15140122	Per mezzo N2B27
Mezzo PGM1	Cellapy	A1517001	Mezzo per espansione di hiPSC; conservare a 4ºC al riparo dalla luce, stabile per 2 settimane
Integratore PGM1 (25×)	Cellapy	A1517101	Da usare con il mezzo basale PGM1
Alcool polivinilico (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136	Sciogliere nel PGM1 al 0,25% (p/v) per promuovere l’aggregazione
PureCol (Collagene di tipo I bovino, 3 mg/mL)	Advanced BioMatrix	5005	Per miscela collagene I-Matrigel; testare il lotto per capacità di polimerizzazione
Ciclatore termico per qPCR	Thermo Fisher	StepOnePlus™	Con funzionalità di curva di denaturazione; per rilevamento PCR in tempo reale
Kit per trascrizione inversa	Accurate Biology	AG11706	Per sintesi di cDNA da RNA totale; contiene mix master RT con trascrittasi inversa, buffer, dNTPs e primer casuali
Kit per estrazione di RNA	Yeasen	19221ES50	Per isolamento di RNA totale da organoidi vascolari; include colonne per eliminazione di gDNA e DNasi I priva di RNasi
Bicarbonato di sodio (7,5%)	Gibco	25080094	Per soluzione di collagene I
Deossicolato di sodio	Sigma-Aldrich	D6750	Preparare soluzione al 1% (p/v) in acqua deionizzata per buffer di blocco
Idroxido di sodio (1,0 N)	Sigma-Aldrich	S2770	Per aggiustamento del pH della soluzione di collagene I
Pipette monouso sterili (10 mL)	Bkmamlab	110205007	Confezionate singolarmente, sterili
Punte filtranti sterili per pipetta (1000, 200, 20 μL)	Biozym	VT0270/VT0250/VT0220	Sterili, con filtro
Ago sterile (30 G)	NA	NA	Per dissezione delle reti vascolari
Spatola sterile (a estremità arrotondata)	Fisher Scientific	21-401-5	In acciaio inossidabile
Master mix SYBR Green	Accurate Biology	AG11733	Concentrazione 2× per qPCR; contiene DNA polimerasi hot-start, buffer, dNTPs e colorante SYBR Green
Piastra da coltura cellulare trattata, 12 pozzetti	BD Falcon	353043	Per inclusione in gel e coltura di reti vascolari
Piastra da coltura cellulare trattata, 6 pozzetti	Eppendorf	30720113	Trattata standard per coltura cellulare (TC)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9084	Per buffer di blocco
Blu di tripano (0,4%)	Thermo Fisher	15250061	Per conteggio cellulare
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949	Per soluzione di lavaggio PBS-T allo 0,05%
Piastra da 6 pozzetti con attacamento ultra-basso	Corning	3471	Per formazione di aggregati e differenziazione
Piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo e attacamento ultra-basso	Beyotime	FULA962-6pcs	Per coltura in sospensione di organoidi vascolari
VEGF-A	Proteintech	HZ-1038	Preparare soluzione madre da 1 mg/mL in PBS sterile, aliquotare e conservare a −20ºC
Bagno termostatato	Blue pard	HWS-24	37ºC
Y-27632	MCE	HY-10071	Preparare soluzione madre da 10 mM in PBS sterile o DMSO, conservare a −20ºC; concentrazioni di lavoro: 5 μM (scongelamento), 50 μM (formazione di aggregati)

Riferimenti

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