Questo studio identifica cinque biomarcatori correlati a cuproptosi e ferroptosi nella colite ulcerosa attraverso un approccio integrato basato su apprendimento automatico, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e validazione sperimentale, fornendo nuove prospettive per la diagnosi clinica e l'immunoterapia mirata.
Articolo di ricerca
Targeting della ferroptosi e della cuproptosi nella colite ulcerosa: risultati derivanti da bioinformatica completa e validazione sperimentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La colite ulcerosa (CU) è un disturbo intestinale cronico con una patogenesi non completamente definita e con tassi crescenti di prevalenza e ricoveri nei paesi recentemente industrializzati. Nella CU, la morte eccessiva delle cellule epiteliali intestinali compromette la barriera mucosale e innesca risposte infiammatorie. La ferroptosi e la cuproptosi sono due forme recentemente descritte di morte cellulare regolata. La maggior parte degli studi sulla CU ha esaminato questi processi separatamente; tuttavia, il loro ruolo combinato nella progressione della CU rimane insufficientemente caratterizzato. Per indagare il loro ruolo sinergico nella patogenesi della CU, abbiamo adottato un approccio graduale che include il profilo trascrittomico su larga scala per identificare target candidati, seguito da una validazione in modelli in vitro. I geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati incrociati con geni associati alla ferroptosi (FRG) e geni associati alla cuproptosi (CRG). I target sovrapposti sono stati prioritizzati mediante un consenso di algoritmi di apprendimento automatico e analisi della rete di co-espressione genica pesata (WGCNA). Cinque biomarcatori—LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274—sono risultati significativamente upregolati nella CU. L'analisi a singola cellula ha caratterizzato la loro espressione in diversi tipi cellulari, con LCN2 e NOS2 principalmente arricchiti nelle cellule epiteliali. La rilevanza meccanicistica di questi marcatori è stata ulteriormente valutata mediante saggi in vitro. Il trattamento con inibitori della ferroptosi o della cuproptosi ha attenuato l'infiammazione associata alla CU e modulato l'espressione dei biomarcatori nei modelli cellulari Caco-2. Questi risultati identificano cinque biomarcatori associati alla progressione della CU e forniscono evidenze sperimentali a sostegno del loro potenziale utilizzo nella diagnosi clinica e nell'intervento terapeutico.
Introduzione
La colite ulcerosa (CU) è una malattia infiammatoria intestinale recidivante associata a un crescente onere globale e a costi di trattamento a lungo termine sostanziali1,2. Sebbene gli aminosalicilati, i corticosteroidi, i farmaci biologici e le terapie a base di piccole molecole abbiano ampliato le opzioni terapeutiche, ottenere una remissione duratura rimane difficile per molti pazienti3,4. Questa esigenza clinica insoddisfatta sottolinea l'importanza di identificare marcatori molecolari riproducibili e meccanismi affrontabili che possano favorire una diagnosi precoce e una terapia guidata dai meccanismi5.
La ferroptosi è una forma dipendente dal ferro di morte cellulare regolata, determinata dalla perossidazione lipidica, dalla deplezione di glutathione e dall'alterazione dell'attività della GPX46. L'aumento dei livelli di ferro e di malondialdeide nella colite ulcerosa è coerente con un danno epiteliale di tipo ferroptotico, mentre l'attivazione sperimentale dell'asse SLC7A11–GSH–GPX4 o l'inibizione diretta della ferroptosi possono proteggere la barriera intestinale7,8.
La cuproptosi, descritta nel 2022, è innescata quando il rame si lega alle proteine mitocondriali lipoylate, portando all'aggregazione proteica e allo stress proteotossico9. Poiché l'intestino svolge un ruolo centrale nella gestione del rame, il disturbo di questa via potrebbe amplificare il danno epiteliale ossidativo e infiammatorio nella colite ulcerosa10.
La ferroptosi e la cuproptosi potrebbero convergere attraverso uno squilibrio di ioni metallici, il metabolismo mitocondriale, l'esaurimento del glutatione e lo stress ossidativo11. Tuttavia, non è ancora chiaro se questa interazione produca una firma molecolare riproducibile nella colite ulcerosa e se tale firma risponda all'inibizione specifica del percorso.
L'ipotesi dello studio era che una comunicazione incrociata disregolata tra ferroptosi e cuproptosi nell'UC converga su una firma riproducibile di biomarcatori che può essere individuata in dataset trascrittomici bulk e a singola cellula e attenuata mediante inibizione specifica del percorso in un modello di danno all'epitelio intestinale. Di conseguenza, sono stati integrati bioinformatica multicohorte, apprendimento automatico, analisi a singola cellula ed esperimenti mirati su Caco-2 per identificare e valutare funzionalmente i biomarcatori candidati (Figura 1).
Figura 1: Flusso di lavoro dello studio. Flusso di lavoro integrato per lo screening trascrittomico multicohorte, la priorizzazione dei biomarcatori basata su apprendimento automatico e reti, la localizzazione a singola cellula e la validazione mediante inibitori in cellule Caco-2. UC: colite ulcerosa; GEO: Gene Expression Omnibus; WGCNA: analisi della rete di co-espressione genica pesata; PPI: interazione proteina-proteina; ROC: caratteristica operativa del ricevitore; GSEA: analisi di arricchimento dei set genici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Protocollo
Questo studio ha utilizzato set di dati pubblicamente disponibili e linee cellulari umane reperibili in commercio. Non sono stati coinvolti partecipanti umani, tessuti umani appena raccolti o animali vertebrati; pertanto, non è stata richiesta l'approvazione da parte del comitato etico istituzionale. Gli strumenti di ricerca, il software e le risorse online utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Elaborazione dei dati per l'analisi dell'espressione differenziale
Per definire i cohorti di scoperta e di validazione transcriptomici, è stata effettuata una ricerca nel database Gene Expression Omnibus (GEO) utilizzando il termine „colite ulcerosa“. Quattro dataset — GSE87466, GSE92415, GSE107499 e GSE75214 — sono stati utilizzati come set di addestramento, mentre il dataset GSE47908 è stato riservato per la validazione esterna. I dataset di addestramento sono stati normalizzati e corretti per effetti di batch mediante ComBat in Sangerbox 3.0, mentre il dataset di validazione è stato processato in modo indipendente.
Un totale di 583 geni associati alla ferroptosi (FRGs) è stato ottenuto da FerrDB e integrato con geni riportati in letteratura per ridurre il bias derivante da un'unica fonte12. Un insieme di 96 geni associati alla cuproptosi (CRGs) è stato raccolto da studi pubblicati12,13,14. L'espressione differenziale è stata analizzata utilizzando limma con soglie di |variazione del log₂| > 1 e P corretto con il metodo di Benjamini–Hochberg < 0,05. I grafici diagnostici relativi alla normalizzazione, alla correzione del batch, all'espressione differenziale e al clustering sono forniti nella Figura Supplementare 1. La composizione dei campioni, le piattaforme e le assegnazioni dei cohort sono riportate nella Tabella Supplementare 1.
2. Identificazione di CF-DEG nella UC
È stata eseguita un'analisi della correlazione di Pearson utilizzando soglie di |r| > 0,5 e P < 0,05 per identificare i FRG e i CRG co-espressi. L'insieme genico risultante è stato incrociato con i geni differenzialmente espressi (DEG) per identificare i geni differenzialmente espressi co-espressi in cuproptosi e ferroptosi (CF-DEG).
3. Analisi di arricchimento
Le analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state eseguite utilizzando clusterProfiler e la piattaforma Bioinformatics.com.cn. È stato utilizzato un valore di P corretto con il metodo di Benjamini–Hochberg < 0,05 come soglia di significatività. I grafici di arricchimento sono forniti nella Figura supplementare 2.
Analisi della rete di co-espressione genica pesata (WGCNA)
La struttura modulare sottostante i profili di espressione genica è stata analizzata mediante l'analisi di rete di co-espressione genica pesata (WGCNA). I campioni anomali sono stati identificati ed esclusi attraverso il clustering gerarchico combinato con la funzione goodSamplesGenes. Successivamente è stata determinata una potenza di soglia morbida (β) adeguata per soddisfare il criterio di topologia libera da scala nella costruzione della rete.
I dati di espressione elaborati sono stati utilizzati per costruire una matrice di sovrapposizione topologica (TOM) per l'analisi della co-espressione genica. Mediante l'approccio di taglio dinamico dell'albero, i geni con pattern di espressione altamente coerenti sono stati raggruppati in moduli genici, ciascuno contenente almeno 100 geni. Le associazioni tra eigengeni dei moduli (ME) e fenotipi sono state analizzate per identificare i moduli associati al processo della malattia ed estrarre i corrispondenti insiemi genici. I risultati diagnostici della selezione WGCNA sono riportati nella Figura supplementare 3.
5. Selezione dei biomarcatori
Per stabilire una gerarchia di priorità tra i candidati da sottoporre a ulteriori analisi sperimentali, sono stati applicati in parallelo tre algoritmi di apprendimento automatico¹⁵. È stata utilizzata la regressione con operatore di riduzione e selezione della contrazione assoluta (LASSO) per la selezione delle caratteristiche, la foresta casuale con ntree = 500 per determinare l'ordine di importanza dei geni e la macchina a vettori di supporto con eliminazione ricorsiva delle caratteristiche (SVM-RFE) per identificare il sottoinsieme di caratteristiche con l'errore minore nella validazione incrociata. I risultati completi delle analisi di screening sono riportati nella Figura 5 supplementare.
L'importanza dei geni è stata valutata in base al contributo di ciascun gene all'accuratezza della classificazione, e i geni con rango più elevato sono stati raccolti per generare un insieme preliminare di geni¹⁶. L'algoritmo SVM-RFE ha eseguito la selezione delle caratteristiche e l'ottimizzazione del modello mediante eliminazione iterativa delle caratteristiche, consentendo l'identificazione del sottoinsieme ottimale di caratteristiche per la classificazione¹⁷. I geni comuni ai tre algoritmi sono stati considerati biomarcatori candidati identificati attraverso l'apprendimento automatico.
I CF-DEGs sono stati utilizzati per costruire una rete di interazione proteina-proteina (PPI), e CytoHubba è stato impiegato per classificare i nodi centrali. L'intersezione tra i moduli chiave di WGCNA, i tre risultati dell'apprendimento automatico e il set centrale PPI ha identificato cinque biomarcatori candidati integrati: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274. Questi geni sono stati classificati come candidati diagnostici associati alla colite ulcerosa. Successivi esperimenti con inibitori hanno ulteriormente classificato LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2 come marcatori responsivi all'inibizione della ferroptosi e CD274 come marcatore responsivo all'inibizione della cuproptosi. Tali geni non sono stati considerati regolatori primari dimostrati di nessuno dei due percorsi.
6. Sviluppo del modello predittivo e valutazione multimetodo
Per valutare il potenziale clinico traslazionale della firma genica identificata, è stato costruito un nomogramma utilizzando il pacchetto rms per analizzare le prestazioni diagnostiche. Le prestazioni del modello sono state valutate mediante una curva di calibrazione, il test di Hosmer–Lemeshow (HL) e l'indice di concordanza di Harrell (C-index).
La calibrazione del modello è stata valutata utilizzando il test di Hosmer-Lemeshow (HL) e l'errore assoluto medio (MAE). Sono stati stabiliti come soglie per un adeguato adattamento del modello e per l'accuratezza rispettivamente un valore di P > 0,05 e un MAE < 0,1. Sono state generate curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e calcolata l'area sotto la curva (AUC) per valutare le prestazioni predittive del nomogramma per la colite ulcerosa (UC). Un dataset indipendente è stato utilizzato per valutare la generalizzabilità e la stabilità del modello.
7. Analisi dell'arricchimento di geni (GSEA)
Nel set di addestramento, è stata eseguita un'analisi della correlazione di Spearman tra ciascun biomarcatore e tutti gli altri geni. I risultati della correlazione sono stati ordinati per generare un insieme di geni ordinato. È stata effettuata un'analisi dell'arricchimento degli insiemi genici (GSEA) utilizzando l'insieme genico c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs.symbols del Molecular Signatures Database (MSigDB) come riferimento. I percorsi biologici con P < 0,05 sono stati considerati significativamente arricchiti.
8. Analisi del paesaggio immunitario
Lo strumento CIBERSORT e la matrice di firma LM22 sono stati utilizzati per eseguire l'analisi di deconvoluzione dei dati di espressione e stimare le proporzioni di 22 sottotipi di cellule immunitarie. Successivamente è stata effettuata un'analisi di correlazione di Spearman per valutare le associazioni tra i cinque biomarcatori e i sottotipi di cellule immunitarie.
9. Analisi della rete regolatoria
Le informazioni sulla regolazione genica da parte di fattori di trascrizione (TF) e microRNA (miRNA) sono state ottenute dalle basi di dati integrate ChEA3 e TarBase 9.0 attraverso la piattaforma NetworkAnalyst. I miRNA associati ad almeno due nodi sono stati inclusi nella rete di regolazione.
10. RNA-seq a singola cellula
I dataset di singole cellule UC GSE116222, costituiti da tre campioni sani e tre campioni UC, e GSE214695, costituiti da sei campioni sani e sei campioni UC, sono stati integrati. Le cellule sono state mantenute se contenevano da 200 a 5.000 geni rilevati, >1.000 identificatori molecolari unici, < 30% di trascritti mitocondriali, < 3% di trascritti di emoglobina e < 50% di trascritti ribosomiali. La funzione NormalizeData è stata utilizzata per la normalizzazione e Harmony è stato impiegato per la correzione del batch prima del clustering e dell'annotazione.
Dopo il filtraggio, i dati sono stati normalizzati utilizzando la funzione NormalizeData. Harmony è stato utilizzato per minimizzare gli effetti di batch tra i campioni. L'approximazione uniforme della varietà (UMAP) e l'incorporamento stocastico di vicini distribuiti in t (t-SNE) sono stati impiegati per la riduzione della dimensionalità e il raggruppamento cellulare al fine di caratterizzare le strutture locali e globali all'interno della popolazione cellulare. Un totale di 31.712 cellule di alta qualità è stato mantenuto per ulteriori analisi. I tipi cellulari sono stati annotati in base ai geni marcatore canonici.
L'analisi del pseudotempo è stata eseguita utilizzando Monocle 2 per studiare i cambiamenti negli stati delle cellule epiteliali e mieloidi provenienti da tessuti di colite ulcerosa. Sono state valutate le traiettorie di sviluppo cellulare e le differenze tra gruppi, e i modelli di espressione dei biomarcatori lungo la traiettoria del pseudotempo sono stati visualizzati.
CellChat è stato utilizzato per valutare la comunicazione tra cellule epiteliali e sottopopolazioni di cellule mieloidi. I profili di espressione specifici delle sottopopolazioni sono stati integrati per inferire le probabilità di interazione e le principali vie di segnalazione tra cellule epiteliali e mieloidi e per caratterizzare le potenziali reti di regolazione intercellulare.
11. Esperimenti sulle cellule
Le cellule umane di adenocarcinoma colon-rettale Caco-2 sono state coltivate in terreno di Dulbecco modificato di Eagle contenente il 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina a 37 °C in atmosfera al 5% di CO₂. Le cellule Caco-2 sono state scelte come modello riproducibile di monocapa epiteliale per saggi sulla barriera intestinale e su quelli infiammatori e lesivi; tuttavia, la loro origine maligna limita l'estrapolazione diretta all'epitelio colonnare non maligno. Le informazioni sui passaggi cellulari non erano disponibili nei registri sperimentali archiviati.
Un modello in vitro di infiammazione-danno è stato stabilito esponendo le cellule a 1 µg/mL di lipopolisaccaride (LPS) per 24 h. Le cellule sono state assegnate a un gruppo controllo con dimetilsulfossido come veicolo, a un gruppo con solo LPS, a un gruppo con LPS + 4 µM di ferrostatina-1 o a un gruppo con LPS + 40 µM di tetratiomolibdato, con concentrazioni finali di solvente equivalenti. Il gruppo con solo LPS è stato utilizzato come controllo positivo del danno/modello per i confronti di recupero con inibitori.
- Viabilità cellulare
La viabilità cellulare è stata valutata mediante un saggio di viabilità cellulare secondo le istruzioni del produttore. Dopo un'incubazione a 37 °C per circa 2 h, l'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. - Misurazione dei livelli di MDA e Fe²⁺
I livelli intracellulari di malondialdeide (MDA) e Fe2⁺ sono stati misurati utilizzando i rispettivi kit di saggio secondo le istruzioni dei produttori. Le proteine totali sono state quantificate mediante un saggio con acido bicinconinico e ogni valore ottenuto è stato normalizzato rispetto al contenuto proteico del campione corrispondente. - Saggio con sonda fluorescente per ioni rame
Dopo la rimozione del mezzo di coltura, è stata aggiunta una sonda fluorescente specifica per Cu2⁺ a una concentrazione finale di 1 µM e incubata per 30 min a 37 °C. Le immagini sono state acquisite immediatamente senza lavaggi mediante un microscopio a fluorescenza invertito con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 510 e 578 nm, rispettivamente. Le impostazioni di acquisizione sono state mantenute costanti tra i diversi gruppi e la barra di scala delle immagini è stata calibrata a 50 µm. - RT-qPCR
L'RNA totale è stato isolato utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA basato su fenolo–guanidinio. Il DNA complementare è stato sintetizzato da 1 µg di RNA utilizzando un kit per la sintesi del DNA complementare del primo filamento e reagenti a base di SYBR Green sono stati impiegati per la PCR in tempo reale. Ogni reazione è stata eseguita in triplicato tecnico. Le sequenze dei primer sono riportate nella Tabella Supplementare 2 e l'abbondanza relativa dell'RNA messaggero è stata calcolata con il metodo 2⁻ΔΔCt.
12. Analisi statistica
La normalità e l'omogeneità della varianza sono state valutate utilizzando rispettivamente i test di Shapiro–Wilk e di Levene centrato sulla mediana. I dati che soddisfacevano entrambe le assunzioni sono stati analizzati mediante un test t a due code non appaiato o un'analisi della varianza ad un fattore seguita dal test di Tukey per la differenza significativa onesta. Quando una delle due assunzioni non era soddisfatta, è stato utilizzato il test t di Welch o l'analisi della varianza di Welch seguita dai confronti di Games–Howell.
I risultati sono presentati come media ± deviazione standard. I conteggi effettivi dei replicati biologici, i valori P esatti a due code e i controlli delle assunzioni sono riportati nella Tabella Supplementare 3. Il foglio sorgente dell'Figura 13 archiviato contiene un numero minore di replicati di controllo per i pannelli A (n = 4), C (n = 4) e F (n = 2), mentre tutte le altre combinazioni pannello/gruppo contengono n = 6.
Le analisi computazionali sono state eseguite utilizzando R e i flussi di lavoro limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC, rms, Seurat v4, Harmony, Monocle 2, CellChat e Cytoscape/CytoHubba. Le risorse online incluse sono FerrDB, GEO, STRING, ChEA3, TarBase 9.0, NetworkAnalyst, CIBERSORT/LM22, MSigDB, Bioinformatics.com.cn e Sangerbox 3.0.
Risultati
Identificazione e annotazione funzionale dei geni co-espressi nella cuproptosi e ferroptosi
Sono stati integrati quattro set di dati di addestramento composti da 421 campioni di colite ulcerosa e 97 controlli sani. Sono stati identificati complessivamente 551 geni a espressione differenziale, inclusi 362 geni upregolati e 189 geni downregolati. L'analisi di correlazione ha prodotto 444 geni correlati con la ferroptosi e la cuproptosi, e l'intersezione con i geni a espressione differenziale ha generato 32 geni a espressione differenziale co-espressi nella cuproptosi e ferroptosi (CF-DEGs).
I 32 CF-DEG sono risultati arricchiti nelle risposte a lesioni, ioni rameici, trasporto di acidi grassi, lipopolisaccaride, malattia infiammatoria intestinale, segnalazione NF-κB, segnalazione TNF e ferroptosi (Tabella Supplementare 4).
Individuazione dei biomarcatori principali mediante l'integrazione di apprendimento automatico e analisi WGCNA
L'analisi della rete di co-espressione genica pesata (WGCNA) ha identificato MEpurple, MEbrown e MEblack come i moduli più fortemente associati alla colite ulcerosa (UC). Insieme, i moduli selezionati contenevano 1.426 geni (Supplementary Table 5).
L'operatore di selezione e riduzione del valore assoluto minimo (LASSO), la macchina a vettori di supporto con eliminazione ricorsiva delle caratteristiche (SVM-RFE) e la foresta casuale hanno selezionato rispettivamente 21, 32 e 19 caratteristiche. Tredici geni erano comuni a tutti e tre i modelli. L'integrazione del consenso derivato dall'apprendimento automatico, del nucleo di interazione proteina-proteina classificato tramite CytoHubba e dei moduli WGCNA selezionati ha prodotto cinque biomarcatori candidati associati alla colite ulcerosa: LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274.
Valutazione diagnostica e arricchimento del percorso della firma del biomarcatore
Tutti e cinque i biomarcatori candidati sono risultati positivamente correlati e upregolati nella colite ulcerosa nel gruppo di addestramento (Figura 2A, B). Ogni marcatore ha raggiunto un'area sotto la curva ROC (caratteristica operativa del ricevitore) > 0,80 nel gruppo di addestramento e > 0,75 nel gruppo di validazione indipendente GSE47908 (Figura 2C–E).
Il nomogramma basato su cinque geni ha mostrato una calibrazione favorevole, con un valore P di Hosmer–Lemeshow > 0,05 e un errore medio assoluto < 0,1, nonché una buona capacità discriminatoria nel coorte analizzato, con un'area sotto la curva e un indice di concordanza pari a 0,945 e un intervallo di confidenza al 95% per l'indice di concordanza compreso tra 0,922 e 0,968 (Figura 3).
L'analisi dell'arricchimento di geni ha collegato i cinque candidati alle vie di segnalazione JAK–STAT, interferone–RIPK1/3 e recettore simile a Toll–NF-κB (Figura 4).
Figura 2: Espressione dei biomarcatori candidati e prestazioni diagnostiche. (A) Mappa termica di correlazione. (B, C) Espressione dei biomarcatori e curve caratteristiche operative del ricevitore nella coorte di addestramento. (D, E) Espressione dei biomarcatori e curve caratteristiche operative del ricevitore nella coorte di validazione GSE47908. ROC: caratteristica operativa del ricevitore; AUC: area sotto la curva; UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Sviluppo e valutazione del nomogramma per la colite ulcerosa. (A) Nomogramma basato su cinque geni. (B) Grafico di calibrazione. (C) Curva caratteristica operativa del ricevitore. ROC: curva caratteristica operativa del ricevitore; UC: colite ulcerosa; AUC: area sotto la curva; C-index: indice di concordanza. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi dell'arricchimento di gruppi genici dei cinque biomarcatori candidati. (A–E) Risultati dell'analisi dell'arricchimento di gruppi genici per LCN2, IDO1, CXCL2, NOS2 e CD274, rispettivamente. GSEA: analisi dell'arricchimento di gruppi genici. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Analisi del paesaggio del microambiente immunitario e della rete di regolazione
I campioni di CU hanno mostrato proporzioni aumentate di neutrofili, linfociti T CD4⁺ a memoria attivati, macrofagi M1 e mastociti attivati, con una corrispondente diminuzione di macrofagi M2, mastociti inattivi e cellule dendritiche inattive. Questi schemi sono stati riprodotti nel gruppo di convalida (Figura 5A–E).
I cinque candidati hanno mostrato correlazione positiva con i neutrofili, le cellule T CD4⁺ a memoria attivate e i macrofagi M1, e correlazione inversa con le cellule del mastocito a riposo e i macrofagi M2 (Figura 5F–J). La rete genica miRNA comprendeva 98 nodi e 146 interazioni. hsa-miR-34a-5p e hsa-miR-16-5p mostravano la maggiore connettività come biomarcatori, mentre AR e RELA erano i fattori di trascrizione più connessi (Figura 6).
Figura 5: Analisi dell'infiltrazione immunitaria. (A) Composizione delle cellule immunitarie. (B) Differenze tra i gruppi nelle proporzioni delle cellule immunitarie. (C) Mappa termica di correlazione tra le cellule immunitarie. (D, E) Infiltrazione delle cellule immunitarie nelle coorti di training e di validazione. (F–J) Correlazioni tra biomarcatori candidati e popolazioni di cellule immunitarie. UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Reti predette di miRNA e fattori di trascrizione. (A) Rete gene–miRNA. I cerchi indicano i biomarcatori candidati e i quadrati indicano i miRNA. (B) Rete fattore di trascrizione–gene. I rombi indicano i biomarcatori candidati e i triangoli capovolti indicano i fattori di trascrizione. miRNA: microRNA; TF: fattore di trascrizione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Dinamica dell'espressione spaziotemporale a risoluzione di singola cellula
Dopo il controllo di qualità, 31.712 cellule hanno formato 22 cluster che sono stati annotati come nove popolazioni cellulari principali (Figura 7A–C). Le proporzioni di cellule epiteliali e plasmacellule erano più elevate nella colite ulcerosa (UC). LCN2 e NOS2 erano arricchiti nelle cellule epiteliali, mentre IDO1, CXCL2 e CD274 erano arricchiti nelle cellule mieloidi (Figura 7D–G).
Il sottoclustering delle cellule epiteliali ha identificato 11 sottogruppi, con un'espansione di colonociti infiammatori e un arricchimento di LCN2 e NOS2 in questo sottogruppo (Figura 8). Il sottoclustering delle cellule mieloidi ha identificato sette sottogruppi, con un aumento dei monociti, una riduzione dei macrofagi e un arricchimento di IDO1, CXCL2 e CD274 nei monociti (Figura 9).
I colonociti infiammatori si sono accumulati in una fase tardiva della traiettoria epiteliale, con un'espressione crescente di LCN2 e NOS2 (Figura 10). I monociti hanno mostrato una traiettoria distinta associata alla colite ulcerosa, con un'espressione dinamica di IDO1, CXCL2 e CD274 (Figura 11).
I colonociti infiammatori hanno mostrato il segnale in uscita più intenso e una comunicazione evidente con i monociti. La coppia ligando-recettore APP–CD74 era predominante tra questi sottogruppi (Figura 12).
Figura 7: Espressione dei biomarcatori candidati tra le popolazioni cellulari. (A) Cluster cellulari. (B) Marcatori di annotazione. (C) Nove popolazioni cellulari annotate. (D, E) Distribuzione e proporzioni cellulari in campioni sani e con colite ulcerosa. (F, G) Espressione dei biomarcatori candidati visualizzata mediante UMAP e grafico a bolle. UC: colite ulcerosa; UMAP: uniform manifold approximation and projection. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Sottoraggruppamento delle cellule epiteliali ed espressione dei marcatori candidati. (A) Raggruppamenti iniziali delle cellule epiteliali. (B) Marcatori di annotazione. (C) Sottoinsiemi di cellule epiteliali annotati. (D) Proporzioni dei sottoinsiemi nei campioni sani e nei campioni di colite ulcerosa. (E) Espressione di LCN2 e NOS2 nei sottoinsiemi di cellule epiteliali. t-SNE: embedding stocastico di vicini distribuiti in t; UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Sottoclustering delle cellule mieloidi ed espressione dei candidati. (A) Cluster iniziali di cellule mieloidi. (B) Marcatori di annotazione. (C) Sottoinsiemi di cellule mieloidi annotati. (D) Proporzioni dei sottoinsiemi in campioni sani e con colite ulcerosa. (E) Espressione di IDO1, CXCL2 e CD274 nei sottoinsiemi di cellule mieloidi. t-SNE: t-distributed stochastic neighbor embedding; UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 10: Analisi della pseudotempo delle cellule epiteliali. (A) Traiettoria della pseudotempo e assegnazione degli stati. (B) Distribuzione delle cellule epiteliali sane e delle cellule con colite ulcerosa lungo la traiettoria. (C) Dinamica dell'espressione di LCN2 e NOS2 lungo la pseudotempo. UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 11: Analisi del pseudotempo delle cellule mieloidi. (A) Traiettoria del pseudotempo e assegnazione degli stati. (B) Distribuzione delle cellule mieloidi sane e di quelle con colite ulcerosa lungo la traiettoria. (C) Dinamiche di espressione di IDO1, CXCL2 e CD274 lungo il pseudotempo. UC: colite ulcerosa. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 12: Comunicazione epiteliale-mieloide. (A) Numero e intensità delle interazioni. (B) Intensità del segnale in uscita e in entrata. (C) Interazioni che coinvolgono colonociti infiammatori. (D) Mappa di calore dell'intensità della comunicazione. (E) Coppie ligando-recettore che coinvolgono colonociti infiammatori. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
in vitro validazione sperimentale di interventi sulla ferroptosi e sulla cuproptosi
L'esposizione a lipopolisaccaride (LPS) ha ridotto la vitalità delle cellule Caco-2 e aumentato l'espressione di IL-6 e IL-1β rispetto al controllo con veicolo (Figura 13A–C e Figura Suppletiva 5).
L'LPS ha aumentato Fe2⁺, il malondialdeide e l'abbondanza di RNA messaggero di LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2, mentre il ferrostatina-1 ha invertito ciascuna variazione associata all'LPS (Figura 13D–I). Per i confronti tra LPS e LPS + ferrostatina-1, i valori esatti di P bilaterali sono variati da 9,45 × 10⁻5 a 0,0027 dopo la media delle repliche tecniche all'interno di ciascuna replica biologica.
L'LPS ha ridotto la vitalità e aumentato IL-6, IL-1β, FDX1/DLAT, CD274 e la fluorescenza sensibile al rame, mentre il tetratiomolibdato ha invertito questi effetti (Figura 14 A–E). Per i confronti tra LPS e LPS + tetratiomolibdato, i valori esatti di P a due code sono variati da < 1 × 10⁻15 a 0,0008.
Nel complesso, le analisi hanno identificato cinque potenziali marcatori diagnostici associati alla colite ulcerosa, ne hanno localizzato l'espressione nelle popolazioni epiteliali e mieloidi, e hanno mostrato che LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2 rispondono all'inibizione della ferroptosi, mentre CD274 risponde alla chelazione del rame in cellule Caco-2.
Figura 13: Il ferrostatina-1 attenua le alterazioni infiammatorie e legate alla ferroptosi associate all'LPS nelle cellule Caco-2. (A) Vitalità cellulare. (B, C) Espressione dell'mRNA di IL-6 e IL-1β. (D, E) Livelli intracellulari di malondialdeide e Fe2⁺. (F–I) Espressione dell'mRNA di LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2. Le misurazioni tecniche triplicate sono state mediate all'interno di ciascun replicato biologico indipendente; le barre di errore indicano la deviazione standard. I numeri disponibili di replicati biologici sono: Controllo n = 4 in A e C, Controllo n = 2 in F, e n = 6 per tutte le altre combinazioni di pannello/gruppo. I valori esatti di P a due code e i controlli delle assunzioni sono riportati nel Tavolo Supplementare 5. Fer-1: ferrostatina-1; LPS: lipopolisaccaride; MDA: malondialdeide. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 14: Il tetratiomolibdato attenua le alterazioni infiammatorie e legate alla cuproptosi associate all'LPS nelle cellule Caco-2. (A) Vitalità cellulare. (B, C) Espressione dell'RNA messaggero di IL-6 e IL-1β. (D) Espressione dell'RNA messaggero di FDX1 e DLAT. (E) Espressione dell'RNA messaggero di CD274. (F) Fluorescenza intracellulare di Cu2⁺; barra della scala = 50 µm. Le misurazioni tecniche triplicate sono state mediate all'interno di sei repliche biologiche indipendenti per gruppo; le barre di errore indicano la deviazione standard. I valori esatti di P a due code e i controlli delle assunzioni sono riportati nel Tabulato Supplementare 5. TTM: tetratiomolibdato; LPS: lipopolisaccaride. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I dati grezzi e quelli elaborati, gli script di analisi e i fogli di calcolo sorgente degli esperimenti sulle cellule sono disponibili pubblicamente all'indirizzo https://doi.org/10.5281/zenodo.21202720.
Figura supplementare 1: Diagnostica per la pre-elaborazione dei dati e per l'espressione differenziale. (A–F) Distribuzioni dei campioni prima (A–C) e dopo (D–F) la correzione del batch. (G) Diagramma a vulcano dei geni a espressione differenziale. (H) Mappa termica dei profili di espressione normalizzati. DEGs: geni a espressione differenziale; GEO: Gene Expression Omnibus.Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Analisi di arricchimento dei CF-DEGs. (A) Arricchimento dell'ontologia genica. (B) Arricchimento dell'Enciclopedia di Kyoto di geni e genomi. CF-DEGs: geni differenzialmente espressi co-espressi nella cuproptosi e ferroptosi; GO: Ontologia genica; KEGG: Enciclopedia di Kyoto di geni e genomi.Cliccare qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 3: Diagnostica di screening WGCNA. (A) Selezione della soglia morbida. (B) Raggruppamento degli eigengeni dei moduli. (C) Dendrogramma gene-modulo. (D) Associazioni tra moduli e tratti. (E–G) Relazioni tra significatività del gene e appartenenza al modulo per i moduli viola, marrone e nero. WGCNA: analisi della rete di co-espressione genica pesata; UC: colite ulcerosa.Cliccare qui per scaricare il file.
Figura supplementare 4: Screening biomarker multistadio. (A, B) Selezione delle caratteristiche tramite LASSO. (C, D) Selezione delle caratteristiche tramite SVM-RFE. (E, F) Classificazione delle caratteristiche tramite foresta casuale. (G) Convergenza tra i tre modelli. (H, I) Rete di interazione proteina-proteina (PPI) e nodi centrali identificati con CytoHubba. (J) Integrazione dei risultati ottenuti con apprendimento automatico, WGCNA e PPI. (K) Localizzazione cromosomica dei cinque candidati. LASSO: operatore di riduzione e selezione con norma L1; SVM-RFE: eliminazione ricorsiva delle caratteristiche basata su macchine a vettori di supporto; RF: foresta casuale; PPI: interazione proteina-proteina; WGCNA: analisi della rete di co-espressione genica pesata.Cliccare qui per scaricare il file.
Figura supplementare 5: Validazione del modello LPS in cellule Caco-2. (A) Viabilità cellulare. (B, C) Espressione dell'mRNA di IL-6 e IL-1β. Le replicazioni tecniche triplicate sono state mediate all'interno di sei replicati biologici indipendenti per gruppo; le barre di errore indicano la deviazione standard. LPS: lipopolisaccaride.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 1: Set di dati GEO utilizzati per la scoperta e la validazione. Numeri di accessione dei set di dati, piattaforme, composizione dei campioni e assegnazioni dei cohort per i set di dati GEO inclusi nelle analisi di scoperta e validazione. GEO: Gene Expression Omnibus.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 2: Sequenze dei primer per la PCR quantitativa con trascrizione inversa. Sequenze dei primer utilizzate per l'analisi mediante PCR quantitativa con trascrizione inversa dei geni valutati in questo studio.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 3: Dettagli statistici per le Figure 13, 14 e la Figura supplementare 1. Numeri di repliche biologiche, verifiche delle assunzioni, metodi di analisi statistica e valori P esatti per i confronti sperimentali indicati.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella supplementare 4: Geni differenzialmente espressi co-espressi nella cuproptosi e nella ferroptosi. Elenco dei CF-DEG identificati intersecando i geni correlati a ferroptosi e cuproptosi con i geni differenzialmente espressi.Cliccare qui per scaricare il file.
Tabella Supplementare 5: Geni nei moduli WGCNA selezionati per lo screening dei biomarcatori. Elenco dei geni contenuti nei moduli WGCNA selezionati per lo screening successivo dei biomarcatori. WGCNA: analisi della rete di co-espressione genica pesata.Fare clic qui per scaricare il file.
Discussione
Questo studio ha integrato trascrittomica su larga scala, apprendimento automatico, analisi a singola cellula e esperimenti mirati sulle cellule per esaminare l'interazione tra ferroptosi e cuproptosi nella colite ulcerosa. Cinque candidati diagnostici associati alla colite ulcerosa si sono dimostrati riproducibili in coorti di scoperta e di validazione, localizzandosi principalmente nei compartimenti epiteliali e mieloidi, e hanno mostrato un'espressione modulata da inibizione di pathway nelle cellule Caco-2. Questi risultati supportano un flusso di lavoro articolato in fasi, in cui la priorizzazione computazionale guida una validazione biologica mirata, evitando al contempo l'affermazione più forte secondo cui i cinque geni siano riconosciuti regolatori precoci della ferroptosi o della cuproptosi.
I CF-DEGs erano arricchiti nelle risposte al lipopolisaccaride, alla gestione del rame, al trasporto dei lipidi, alla segnalazione NF-κB/TNF e alla ferroptosi, fornendo un collegamento coerente tra lo stress ossidativo dipendente dai metalli e l'infiammazione della mucosa10,19.
I cinque candidati occupano contesti complementari di infiammazione e stress da metalli. LCN2 collega il sequestro del ferro, la disbiosi microbica e l'asse di ferroptosi LCN2–ALOX1520,21,22,23; IDO1 collega il metabolismo del triptofano, l'infiammazione della mucosa e il malfunzionamento del ferro24,25,26; e CXCL2 collega il segnale IL-17/IL-22, il reclutamento dei neutrofili e la perossidazione lipidica27,28,29,30. NOS2 ha effetti dipendenti dal contesto, ma può amplificare il danno ossidativo e la suscettibilità alla ferroptosi quando è eccessivamente indotto31,32,33,34,35,36. CD274 è un marcatore epiteliale immuno-regolatorio il cui rapporto con FDX1 e la sensibilità agli ionofori del rame suggerisce una risposta alla cuproptosi piuttosto che un controllo consolidato del percorso37,38,39. Gli esperimenti con gli inibitori sono stati coerenti con queste classificazioni: il ferrostatina-1 ha ridotto LCN2, IDO1, CXCL2 e NOS2, mentre il tetratiomolibdato ha ridotto CD274.
L'analisi immunologica ha inoltre collegato la firma candidata ai macrofagi M1, ai neutrofili, alle cellule T CD4⁺ a memoria attivate e ai mastociti attivati, tutti in grado di sostenere il danno epiteliale attraverso citochine, specie reattive dell'ossigeno e segnalazioni che alterano la barriera40,41,42,43,44. RELA, hsa-miR-34a-5p e hsa-miR-16-5p si sono rivelati plausibili regolatori a monte, mentre le evidenze riguardo a un ruolo diretto del recettore per gli androgeni nella colite ulcerosa rimangono limitate45,46,47,48,49,50. Tali risultati devono essere interpretati come ipotesi a livello di rete per futuri esperimenti di perturbazione, piuttosto che come prova di una regolazione diretta.
L'analisi a singola cellula ha localizzato LCN2 e NOS2 in colonociti infiammatori e IDO1, CXCL2 e CD274 in popolazioni ricche di monociti di origine mieloide. Si prevede che i colonociti infiammatori agiscano come centri di comunicazione, con la coppia ligando-recettore APP–CD74 tra le principali interazioni epiteliale-mieloide51,52,53,54,55,56. Questa risoluzione a livello di tipo cellulare restringe il contesto biologico in cui i cinque candidati devono essere testati e supporta l'utilizzo di sistemi di co-coltura o di organoidi con cellule immunitarie come prossimo passo sperimentale.
Diversi limiti ne ostacolano l'interpretazione. Caco-2 è una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale e non riproduce completamente l'epitelio colonico non maligno, l'eterogeneità tra pazienti, le interazioni stromali-immunitarie o la colite ulcerosa cronica; pertanto, sono necessarie conferme mediante cellule epiteliali intestinali primarie, organoidi derivati da pazienti, sistemi di co-coltura e modelli di colite in vivo. Inoltre, il foglio di calcolo sorgente dell'Figura 13 archiviato non includeva alcuni dati di controllo replicati nei pannelli A, C e F, riducendo la precisione di tali confronti; tutti i conteggi dei replicati disponibili e i valori esatti di P sono riportati nella Tabella Supplementare 5. Infine, informazioni su età, sesso, esposizione ai trattamenti e altre covariate cliniche non erano uniformemente disponibili nei cohort pubblici. Per stabilire l'utilità diagnostica e ruoli causali, saranno necessari cohort prospettici multicentrici e una diretta perturbazione dei cinque candidati. Entro questi limiti, lo studio fornisce un insieme trasparente e sperimentalmente fondato di ipotesi che collegano la morte cellulare dipendente dai metalli, la comunicazione epitelio-mieloide e la colite ulcerosa. Ricerche analoghe di farmacologia di rete nel cancro alla prostata illustrano il valore generativo di ipotesi della priorizzazione computazionale dei bersagli, ma non costituiscono una validazione specifica per la colite ulcerosa57. Analogamente, la recente discussione sulla ferroptosi nell'osteoartrite e nella degenerazione ossea riflette un più ampio interesse terapeutico nella modulazione della ferroptosi, sebbene i meccanismi specifici delle singole malattie non possano essere direttamente estesi alla colite ulcerosa58. La validazione su cohort esterni e gli esperimenti con inibitori sono stati quindi utilizzati per rafforzare, ma non esagerare, le associazioni bioinformatiche.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Young Qihuang Scholar dell'Amministrazione Nazionale della Medicina Tradizionale Cinese (Grant No. 2022256). Si ringraziano tutti i membri dei gruppi di ricerca dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Liaoning e del Terzo Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Liaoning per il supporto tecnico e i contributi alla cura dei dati e all'analisi bioinformatica.
OpenAI Codex (OpenAI) è stato utilizzato durante la revisione esclusivamente per assistere con la correzione linguistica in inglese, la formattazione del documento e i controlli sulla qualità delle figure. Tutti i contenuti scientifici, le analisi, le citazioni e la presentazione finale sono stati esaminati e verificati dagli autori, che si assumono piena responsabilità per il manoscritto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per saggio proteico BCA | Beyotime Institute of Biotechnology | P0010 | Quantificazione delle proteine per la normalizzazione. |
| Bioinformatics.com.cn | Bioinformatics.com.cn | Piattaforma online; accesso 2026 | Piattaforma per visualizzazione e analisi GO/KEGG. |
| Linea cellulare Caco-2 | ATCC | HTB-37 | Linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano utilizzata per il modello di danno epiteliale. |
| Cell Counting Kit-8 | GLPBio | GK10001 | Saggio di vitalità cellulare misurato a 450 nm. |
| CIBERSORT con profilo LM22 | Sviluppatori di CIBERSORT | LM22 | Deconvoluzione delle frazioni di 22 cellule immunitarie. |
| ChEA3 | Ma'ayan Laboratory | Piattaforma online; accesso 2026 | Arricchimento dei fattori di trascrizione e previsione di reti regolatorie. |
| Incubatore in atmosfera di CO2 | Non registrato | N/A | Incubatore umidificato utilizzato per la coltura a 37 °C e 5% CO2. |
| Probe fluorescente per Cu2+ | BIOFOUNT | CAS 98907-26-7 | Rilevamento della fluorescenza intracellulare di Cu2+ . |
| Cytoscape con CytoHubba | Consortium Cytoscape | Versione non registrata | Visualizzazione delle interazioni proteina-proteina e classificazione dei nodi principali. |
| Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco | Gibco | 11965092 | Mezzo di coltura per cellule Caco-2. |
| Dietilsolfossido | Non registrato | N/A | Controllo del veicolo. |
| Serum fetale bovino | Non registrato | N/A | Integratore del mezzo al 10%. |
| Kit per saggio del Fe2+ | Abcam | ab83366 | Misurazione del Fe2+ intracellulare. |
| FerrDB | Sviluppatori di FerrDB | Database online; accesso 2026 | Fonte di geni associati alla ferroptosi. |
| Ferrostatina-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | Inibitore della ferroptosi; concentrazione finale 4 µM. |
| Harmony | Broad Institute/comunità | Versione non registrata | Correzione batch per singola cellula. |
| Microscopio a fluorescenza invertito | Olympus | IX71 | Acquisizione di immagini di fluorescenza del Cu2+ con eccitazione/emissione a 510/578 nm. |
| Lipopolisaccaride | Non registrato | N/A | Stimolo di danno infiammatorio a 1 µg/mL per 24 h. |
| Kit per saggio del malondialdeide | Beyotime Institute of Biotechnology | S0131S | Misurazione della perossidazione lipidica. |
| Lettore di micropiastre | Non registrato | N/A | Misurazione dell'assorbanza a 450 nm. |
| Monocle | Bioconductor/comunità | Versione 2 | Analisi del pseudotempo per singola cellula. |
| Molecular Signatures Database | Broad Institute | c2.cp.kegg_medicus.v2025.1.Hs | Set di geni di riferimento per GSEA. |
| NetworkAnalyst | Sviluppatori di NetworkAnalyst | Piattaforma online; accesso 2026 | Integrazione delle reti di fattori di trascrizione e di miRNA. |
| Penicillina–streptomicina | Non registrato | N/A | 100 U/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina. |
| R | R Foundation for Statistical Computing | Versione non registrata | Ambiente di analisi bioinformatica. |
| Set di pacchetti R | CRAN/Bioconductor | Versioni dei pacchetti non registrate | Flussi di lavoro con limma, WGCNA, clusterProfiler, glmnet, randomForest, e1071, pROC e rms. |
| Sistema di PCR in tempo reale | Non registrato | N/A | Strumento per RT-qPCR con SYBR Green. |
| Kit per la sintesi del primo filamento di cDNA RevertAid | Thermo Fisher Scientific | K1622 | Sintesi del primo filamento di cDNA da 1 µg di RNA. |
| Sangerbox | Sviluppatori di Sangerbox | 3.0 | Normalizzazione e correzione batch con ComBat. |
| Seurat | Satija Lab/comunità | Versione 4 | Controllo qualità, normalizzazione, raggruppamento e visualizzazione per singola cellula. |
| Software per analisi statistiche | Non registrato | N/A | Analisi statistica degli esperimenti cellulari originali. |
| STRING | Consortium STRING | Database online; accesso 2026 | Costruzione della rete di interazioni proteina–proteina. |
| Reagenti per PCR in tempo reale con SYBR Green | Takara | RR820A | PCR quantitativa in tempo reale. |
| TarBase | DIANA Tools | 9.0 | Interazioni sperimentali tra miRNA–gene. |
| Tetratiomolibdato | Sigma-Aldrich | 323446 | Chelestrante del rame; concentrazione finale 40 µM. |
| Reagente TRIzol | Takara | 9108 | Estrazione dell'RNA totale. |
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