Articolo metodologico

Un Protocollo Basato su Inserti per Coltura Cellulare per la Costruzione di un Modello In Vitro Multicellulare Semplificato della Barriera Emato-Neoplasmatica nel Metastasi Cerebrale del Carcinoma della Mammella

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DOI:

10.3791/73693

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21 ottobre 2026

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1Department of Breast Oncology and Surgery, The Second Hospital of Dalian Medical University, 2State Key Laboratory of Medical Proteomics, Dalian Institute of Chemical Physics, 3Department of Pathology, The Second Hospital of Dalian Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio stabilisce un modello semplificato in vitro multicellulare della barriera emato-encefalica tumorale (BTB) che combina colture cellulari in co-coltura Transwell e sferoidi tumorali 3D, fornendo una piattaforma fisiologicamente rilevante per lo studio delle metastasi cerebrali del carcinoma mammario e per la selezione di terapie mirate.

Abstract

I trattamenti efficaci per le metastasi cerebrali del carcinoma mammario (BCBM) rimangono limitati, principalmente perché la barriera emato-tumorale (BTB) ostacola l'ingresso di numerosi agenti chemioterapici e mirati nelle lesioni metastatiche all'interno del sistema nervoso centrale. Per modellare in vitro alcune caratteristiche di questo complesso microambiente, questo studio presenta un protocollo standardizzato per la costruzione di un modello semplificato tridimensionale e multicellulare della BTB. Il metodo comprende tre passaggi fondamentali. Innanzitutto, viene costruito un compartimento della barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando inserti per colture cellulari con un diametro di poro di 0,4 μm. Cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HBMEC) vengono seminate sul lato basale della membrana porosa e, un giorno dopo, astrociti umani (HA) e cellule microgliali umane HMC3 (HMC3) vengono seminate sul lato apicale. Utilizzando le cellule SK-BR-3 come esempio, le cellule tumorali del carcinoma mammario vengono coltivate con il metodo della goccia sospesa per formare sferoidi tumorali tridimensionali uniformi e dalla forma regolare dopo 3 giorni di coltura. Gli sferoidi vengono quindi trasferiti sul lato apicale di una membrana porosa rivestita con matrice della membrana basale, la quale garantisce una separazione fisica pur permettendo la comunicazione chimica tra le cellule della barriera e gli sferoidi tumorali durante la co-coltura. Questa piattaforma consente un controllo preciso della tempistica sperimentale e produce modifiche morfologiche e nei marcatori astrocitari coerenti con una risposta reattiva peritumorale, permettendo al contempo la valutazione dell'integrità della barriera endoteliale e della permeabilità paracellulare.

Introduzione

La metastasi cerebrale è una complicanza comune negli stadi avanzati di vari tumori solidi maligni, tra cui il cancro al seno e il cancro del polmone1,2. La sua prognosi è estremamente sfavorevole e le opzioni terapeutiche sono limitate1,2. Nel sistema nervoso centrale sano, la barriera emato-encefalica (BBB) è un'interfaccia altamente specializzata e dinamica formata principalmente da cellule endoteliali microvascolari cerebrali strettamente connesse, mentre l'integrità e la funzione di questa barriera sono sostenute dalla membrana basale vascolare e da interazioni coordinate con periciti, astrociti, neuroni, microglia, cellule della linea degli oligodendrociti e altre componenti dell'unità neurovascolare3. Grazie alle giunzioni strette tra le cellule endoteliali e al supporto delle cellule gliali periferiche, essa limita severamente l'ingresso di sostanze esogene nel sistema nervoso centrale4. Una volta che le cellule del carcinoma mammario si sono diffuse e stabilite nel cervello, le lesioni metastatiche cerebrali si espandono, l'ipossia locale aumenta, i segnali infiammatori si intensificano e l'unità neurovascolare (NVU) si rimodella, ricostruendo gradualmente la barriera emato-tumorale (BTB)5. Sebbene la permeabilità locale della BTB sia maggiore rispetto a quella della BBB, le differenze nella permeabilità a molecole di dimensioni diverse, unite a una perfusione sanguigna irregolare, portano ad un accumulo insufficiente dei farmaci nei tumori cerebrali6. Pertanto, comprendere la biologia della BTB e sviluppare strategie di somministrazione in grado di superare questa barriera sono diventati obiettivi fondamentali nella neuro-oncologia.

Ad oggi, le caratteristiche e i meccanismi di trasformazione della barriera emato-encefalica tumorale (BTB) sono state descritte solo parzialmente, e le opzioni terapeutiche efficaci per le metastasi cerebrali da carcinoma mammario (BCBM) rimangono limitate nella pratica clinica. Una delle sfide principali è la scarsa disponibilità di campioni clinici derivati da metastasi cerebrali, unita alla limitata accessibilità e alla caratterizzazione funzionale incompleta dei modelli BTB esistenti. I modelli animali in vivo, in particolare i modelli murini7,8, continuano ad essere ampiamente utilizzati nella ricerca sulla BTB. Tuttavia, questi modelli presentano delle limitazioni, tra cui le differenze tra le specie, la bassa produttività, e le difficoltà nella standardizzazione e nella riproducibilità, che possono ostacolare gli studi meccanicistici e lo sviluppo di farmaci9,10. Inoltre, i modelli BTB in vitro attualmente disponibili utilizzano comunemente colture cellulari miste di cellule tumorali e cellule associate alla barriera, impiegando sistemi con inserti per colture cellulari o chip microfluidici.

Questi modelli esistenti spesso mancano della struttura tridimensionale dei tumori e sono quindi limitati nella riproduzione di caratteristiche spaziali rilevanti per le metastasi cerebrali, tra cui gradienti di densità cellulare, regioni ipossiche/necrotiche, diffusione molecolare limitata e distribuzione cellulare eterogenea11,12. Per introdurre un componente tumorale tridimensionale definito, abbiamo utilizzato un modello di sferoidi semplice, riproducibile e compatibile con applicazioni di screening. Sulla base di questo approccio, abbiamo sviluppato un compartimento BBB umano multiculturale in vitro semplificato e lo abbiamo integrato con sferoidi tumorali per costruire un modello BTB semplificato (Figura 1A) che riproduce alcune caratteristiche strutturali e cellulari del microambiente metastatico cerebrale. Il modello è facile da utilizzare, consente misurazioni quantitative della barriera e permette la visualizzazione dei cambiamenti spaziali nelle popolazioni di astrociti e microglia associate al tumore.

Questo protocollo descrive dettagliatamente i passaggi fondamentali dalla preparazione e semina delle cellule alla generazione di sferoidi tumorali, dall'aggiunta del matrix della membrana basale alla preparazione di controlli abbinati e al trasferimento dei sferoidi, fornendo un flusso di lavoro standardizzato per la costruzione di questo modello semplificato della barriera emato-encefalica (BTB).

Protocollo

Lo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dal Comitato Etico del Secondo Ospedale dell'Università Medica di Dalian (Numero di approvazione: JW2026-019-01). Tutti i dati relativi ai pazienti sono stati resi anonimi prima dell'analisi. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione del modello di barriera ematoencefalica (BBB)

  1. Requisiti generali
    1. Eseguire tutte le operazioni all'interno di una cappa a flusso laminare sterile e seguire rigorosamente le tecniche asettiche.
    2. Utilizzare inserti per colture cellulari in piastre da 12 pozzetti con membrane in PET aventi una dimensione dei pori di 0,4 µm e un'area membranosa efficace di 1,12 cm2.
  2. Rivestimento con collagene di tipo I
    1. Aggiungere da 1 a 2 mL di soluzione di rivestimento con collagene di tipo I a ciascun fiasco o piastra per colture cellulari e distribuirla uniformemente sulla superficie inferiore.
    2. Aggiungere 200 µL e 800 µL di soluzione di rivestimento rispettivamente sui lati apicale e basale di ciascun inserto per coltura cellulare. Agitare delicatamente la piastra per assicurare un contatto completo della membrana, evitando la formazione di bolle al di sotto della membrana.
    3. Incubare i contenitori e gli inserti rivestiti a 37 °C con 5% di CO₂ per 1 h. Rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare due volte con PBS.
    4. Mantenere i fiaschi, le piastre e gli inserti per colture cellulari rivestiti a 37 °C con 5% di CO₂ e utilizzarli entro 3 giorni. Sciacquare una volta con PBS immediatamente prima dell'uso.
    5. Rivestire i contenitori per coltura di HBMEC e HA con collagene di tipo I prima della coltura cellulare. Le cellule HMC3-RFP non richiedono il rivestimento con collagene di tipo I.
  3. Preparazione della soluzione di rivestimento con collagene di tipo I
    1. Sciogliere 60 µL di acido acetico glaciale in 50 mL di acqua ultrapura e raffreddare la soluzione a 4 °C.
      ATTENZIONE: L'acido acetico glaciale è corrosivo. Manipolarlo all'interno di una cappa chimica indossando dispositivi di protezione personale adeguati, inclusi guanti, camice da laboratorio e protezione oculare. Smaltire i rifiuti di acido acetico secondo le procedure istituzionali per i rifiuti chimici.
    2. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da siringa da 0,22 µm, aggiungere 500 µL di collagene di tipo I (9,45 mg/mL), mescolare accuratamente e conservare a 4 °C fino all'uso.
  4. Preparazione delle cellule
    1. Coltivare le cellule HBMEC, HA e HMC3-RFP fino al raggiungimento di una confluenza compresa tra l'80% e il 90% prima dell'uso.
      ATTENZIONE: Le linee cellulari di origine umana e i materiali associati a tessuti umani devono essere manipolati come potenzialmente bio-pericolosi. Seguire le procedure istituzionali di biosicurezza e indossare dispositivi di protezione personale adeguati. Smaltire i materiali di coltura contaminati come rifiuti bio-pericolosi.
  5. Seeding delle HBMEC al Giorno 0
    1. Staccare le HBMEC utilizzando una proteasi ricombinante simile alla tripsina (1×), centrifugare le cellule e risospendere il pellet per ottenere una sospensione monocellulare.
    2. Determinare la densità cellulare e regolare la sospensione in modo che 120 µL contengano 1,5 × 105 HBMEC per ciascun inserto per coltura cellulare.
    3. Rovesciare la piastra e dispensare 120 µL della sospensione di HBMEC sul lato basale della membrana porosa. Evitare la formazione di bolle d'aria durante il seeding (Figura 1B).
    4. Coprire i pozzetti, mantenere la piastra da 12 pozzetti capovolta e incubare per 6 h.
    5. Riportare la piastra nella posizione eretta, aggiungere 200 µL e 800 µL di mezzo di coltura completo ECM rispettivamente nelle camere superiore e inferiore e proseguire l'incubazione.
  6. Seeding delle cellule HA e HMC3-RFP al Giorno 1
    1. Staccare le cellule HA con proteasi ricombinante simile alla tripsina (1×) e le cellule HMC3-RFP con tripsina-EDTA allo 0,25%. Centrifugare e risospendere separatamente i due tipi cellulari.
    2. Determinare le densità cellulari e combinare 2,0 × 105 cellule HA con 4,0 × 103 cellule HMC3-RFP per ciascun inserto per coltura cellulare.
    3. Centrifugare le cellule miste, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 µL di mezzo completo misto (mezzo completo AM : mezzo completo MEM = 5:1). Aggiungere la sospensione da 200 µL uniformemente nella camera superiore evitando bolle d'aria (Figura 1B). 
    4. Aggiungere 800 µL di mezzo di coltura completo ECM nella camera inferiore, mantenere la piastra in posizione eretta nell'incubatore e cambiare il mezzo ogni giorno.

2. Preparazione di sferoidi tumorali tridimensionali

  1. Preparazione delle cellule SK-BR-3
    1. Coltivare le cellule SK-BR-3 fino al raggiungimento di una confluenza dell'80%–90% prima di procedere alla formazione degli sferoidi.
    2. Staccare le cellule SK-BR-3 con tripsina-EDTA allo 0,25%, centrifugare le cellule e risospendere il pellet per ottenere una sospensione monocellulare.
    3. Determinare la densità cellulare e regolare la sospensione in modo che ogni goccia di 30 µL contenga 2 × 104 cellule.
  2. Formazione delle gocce sospese
    1. Capovolgere una piastra da coltura cellulare da 10 cm e distribuire gocce da 30 µL di sospensione cellulare sul coperchio della piastra. Posizionare circa 20 gocce per coperchio.
    2. Rimettere il fondo della piastra e capovolgere rapidamente la piastra assemblata (Figura 1B). Ripetere la preparazione delle gocce se queste gocciolano dal coperchio o perdono la loro forma.
  3. Coltura degli sferoidi
    1. Aggiungere 5 mL di PBS nella piastra e posizionarla nell'incubatore. Non disturbare la piastra durante i primi 2 giorni di coltura.
    2. Per colture a lungo termine, aggiungere 10 µL di mezzo di coltura completo a ciascuna goccia ogni 2 giorni.
    3. Aggiungere il mezzo partendo dal bordo di ogni goccia utilizzando la punta della pipetta ed evitare di toccare gli sferoidi tumorali.

3. Preparazione del modello semplificato di barriera emato-encefalica tumorale (BTB)

  1. Preparazione dei materiali
    1. Rivestire i contenitori per colture cellulari e le inserti per colture cellulari (membrana in PET, dimensione dei pori 0,4 µm) con collagene di tipo I e mantenerli nell'incubatrice fino all'uso.
    2. Tagliare le estremità dei puntali di pipetta da 200 µL con le forbici e sterilizzare i puntali modificati mediante autoclave.
  2. Stabilimento del modello
    1. Giorno 0–1: Costruire il modello di BBB e preparare gli sferoidi tumorali come descritto in precedenza.
    2. Giorno 2: Scongelare la matrice della membrana basale in ghiaccio. Rimuovere il mezzo di coltura da entrambe le camere e lavare entrambe le camere con PBS.
    3. Aggiungere 800 µL di mezzo completo ECM nella camera inferiore e 30 µL di matrice della membrana basale scongelata nella camera superiore. Distribuire uniformemente la matrice della membrana basale sulla membrana porosa.
    4. Incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti, quindi aggiungere lentamente 200 µL di mezzo completo misto (AM:MEM = 5:1) lungo la parete laterale della camera superiore. Riposizionare la piastra nell'incubatrice (Figura 1B).
    5. Mantenere la matrice della membrana basale in ghiaccio e lavorare rapidamente. Utilizzare un puntale di pipetta preraffreddato quando si aspira la matrice della membrana basale.
  3. Controllo abbinato senza sferoidi/matrice della membrana basale
    1. Preparare inserti di controllo utilizzando lo stesso volume di matrice della membrana basale (30 µL), composizione del mezzo, passaggi di lavaggio, tempi di incubazione e programma di cambio giornaliero del mezzo della condizione BTB, ma omettere il trasferimento degli sferoidi tumorali al giorno 3. Pertanto, il controllo abbinato differisce dalla condizione BTB soltanto per la presenza o assenza degli sferoidi tumorali, e non per l'esposizione o la manipolazione della matrice della membrana basale.
  4. Trasferimento degli sferoidi tumorali al giorno 3
    1. Esaminare gli sferoidi tumorali al microscopio invertito e confermare che abbiano una forma regolare e che abbiano formato sferoidi compatti.
    2. Aspirare gli sferoidi tumorali in provette microcentrifughe da 1,5 mL utilizzando un puntale tagliato e lavarli due volte con PBS. Manipolare gli sferoidi delicatamente per evitare danni.
    3. Sostituire il mezzo nella camera inferiore e rimuovere il mezzo di coltura dalla camera superiore.
    4. Trasferire cinque sferoidi tumorali in ciascuna camera superiore utilizzando un puntale tagliato.
    5. Aggiungere 200 µL di mezzo di coltura completo misto (AM:MEM = 5:1) nella camera superiore e agitare delicatamente la piastra per evitare che gli sferoidi entrino in contatto o si fondano (Figura 1B).
    6. Mantenere la piastra nell'incubatrice e cambiare il mezzo giornalmente.
  5. Raccolta dei campioni
    1. Raccogliere i campioni al giorno 7 per esperimenti successivi, oppure regolare il tempo di raccolta in base ai requisiti sperimentali.

4. Misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER)

  1. Preparazione dell'elettrodo
    1. Caricare completamente il misuratore di TEER e immergere gli elettrodi a bastoncino nel 75% di etanolo per 15 min.
      ATTENZIONE: L'etanolo è infiammabile. Tenere l'etanolo al 75% lontano da fiamme libere, scintille e altre fonti di accensione, e maneggiarlo in conformità alle procedure di sicurezza chimica istituzionali.
    2. Esposizione della cappa a flusso laminare alla luce ultravioletta per 30 min per sterilizzazione. Non esporre direttamente gli elettrodi all'irraggiamento ultravioletto.
    3. Rimuovere gli elettrodi dall'etanolo, equilibrarli in PBS per 15 min e asciugarli in condizioni sterili.
  2. Equilibrazione degli inserti per coltura cellulare
    1. Rimuovere la piastra a 12 pozzetti contenente gli inserti per coltura cellulare dall'incubatore e lasciarla a temperatura ambiente per 15 min prima della misurazione.
  3. Misurazione della resistenza
    1. Preparare un inserto per coltura cellulare privo di cellule con 200 µL e 800 µL dello stesso mezzo di coltura completo rispettivamente nella camera superiore e in quella inferiore.
    2. Inserire delicatamente gli elettrodi a bastoncino lungo il bordo dell'inserto per coltura cellulare senza toccare la membrana porosa o il fondo del pozzetto.
    3. Risciacquare gli elettrodi con PBS e asciugarli. Misurare ogni inserto contenente cellule utilizzando la stessa procedura e registrare la resistenza come R₍measured₎.
  4. Calcolo del TEER
    1. Calcolare il valore della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) utilizzando la seguente formula13:
      TEER (Ω·cm²) = (R(measured) − R(blank) × S    (1.1)
    2. R(measured) è la resistenza attraverso la membrana porosa contenente lo strato cellulare (Ω); R(blank) è la resistenza attraverso una membrana porosa priva di cellule (Ω); e S è l'area efficace della membrana (cm2). L'area efficace della membrana utilizzata in questo studio è 1.12 cm2.

5. Saggio di permeabilità paracellulare con FITC-dextrano (direzione apicale-basale)

  1. Preparazione del dextrano marcato con FITC
    1. Preparare una soluzione lavorativa di dextrano marcato con FITC (4 kDa) a 2 mg/mL prima dell'esperimento e proteggerla dalla luce.
  2. Interpretazione del verso del saggio
    1. Interpretare il presente saggio come una misura dell'integrità della barriera paracellulari da apicale a basolaterale, poiché le HBMEC sono attaccate alla faccia basale della membrana, mentre astrociti, microglia e sferoidi tumorali occupano il compartimento apicale.
      NOTA: Per studi volti a simulare un'esposizione sistemica, introdurre il dextrano marcato con FITC o un composto in esame nel compartimento inferiore/basale rivolto verso l'endotelio e raccogliere i campioni dal compartimento superiore/apicale utilizzando uno schema di campionamento separatamente validato e il calcolo di Papp.
  3. Lavaggio ed equilibrazione
    1. Rimuovere tutto il mezzo di coltura da entrambe le camere. Aggiungere 400 µL e 1 mL di mezzo basale DMEM senza glucosio preriscaldato rispettivamente nella camera superiore e in quella inferiore, lavare delicatamente una volta e quindi scartare il mezzo.
    2. Aggiungere 400 µL e 1 mL di fresco mezzo basale DMEM senza glucosio preriscaldato rispettivamente nella camera superiore e in quella inferiore. Equilibrare a 37 °C con 5% CO₂ per 15 minuti, quindi aspirare tutto il liquido.
  4. Misurazione della permeabilità
    1. Aggiungere 200 µL di soluzione lavorativa di dextrano marcato con FITC a 2 mg/mL nel lato apicale e 800 µL di mezzo basale DMEM senza glucosio nella camera inferiore. Incubare a 37 °C con 5% CO₂ per 30 minuti al buio.
    2. Dopo 30 minuti, raccogliere 100 µL di mezzo dalla camera inferiore di ogni inserto sperimentale. Trasferire tre aliquote da ciascun inserto in una piastra nera a 96 pozzetti e proteggere la piastra dalla luce.
  5. Preparazione della curva standard del dextrano marcato con FITC
    1. Preparare standard di dextrano marcato con FITC a 0, 0,5, 1,0 e 1,5 mg/mL. Aggiungere 100 µL di ciascuno standard in una piastra nera a 96 pozzetti in triplice replicazione e proteggere la piastra dalla luce.
  6. Misurazione della fluorescenza e calcolo di Papp
    1. Misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando un lettore multifunzione per piastre a microvolume con una lunghezza d'onda di eccitazione di 492 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 520 nm. Registrare i dati e calcolare il coefficiente di permeabilità apparente (Papp) utilizzando le seguenti equazioni14.
    2. Per prima cosa, effettuare un'interpolazione lineare tra le concentrazioni delle soluzioni standard di dextrano marcato con FITC (C) e le corrispondenti intensità di fluorescenza (A) per ottenere una curva standard:
       A = kC + b    (1.2)
    3. Qui, k rappresenta la pendenza della curva standard e b rappresenta l'intercetta.
    4. Successivamente, sostituire l'intensità di fluorescenza del campione (At) misurata al tempo t nell'equazione della curva standard per ottenere la concentrazione di dextrano marcato con FITC (Ca) nel lato basolaterale al tempo t. Quindi sostituire Ca nella seguente formula per calcolare Papp (cm/s):
    5. Papp = (Ca × Va)/(t × S × C0)  (1.3)
    6. Qui, Va è il volume totale basolaterale (mL); t è il tempo di permeazione (s); S è l'area efficace della membrana porosa (cm2); e C₀ è la concentrazione iniziale nel lato apicale.

6. Colorazione mediante immunofluorescenza

  1. Fissazione, lavaggio e permeabilizzazione
    1. Rimuovere tutto il mezzo di coltura dagli inserti per coltura cellulare, lavare due volte con PBS ed aspirare tutto il liquido residuo.
    2. Aggiungere 200 µL e 800 µL di paraformaldeide al 4% rispettivamente nelle camere superiore e inferiore e fissare le cellule per tutta la notte a 4 °C.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è pericolosa e deve essere manipolata in una cappa chimica certificata indossando guanti, camice da laboratorio e protezione oculare. Raccogliere separatamente i rifiuti di paraformaldeide e smaltirli secondo le procedure istituzionali per i rifiuti pericolosi.
    3. Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 200 µL e 800 µL di PBS rispettivamente nelle camere superiore e inferiore. Lavare su agitatore per tre volte, 5 minuti ciascuna.
    4. Aggiungere 200 µL e 800 µL di surfattante non ionico allo 0,5% rispettivamente nelle camere superiore e inferiore e permeabilizzare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere la soluzione di surfattante non ionico e lavare con PBS per tre volte, 5 minuti ciascuna.
  2. Escissione della membrana e bloccaggio
    1. Rovesciare gli inserti per coltura cellulare sul coperchio di una piastra per colture cellulari, escindere con attenzione le membrane porose lungo il bordo con un bisturi e trasferirle in una piastra a 24 pozzetti.
    2. Aggiungere 200 µL di BSA al 3% in PBS per coprire ciascuna membrana e bloccare per 90 minuti a temperatura ambiente. Se necessario, tagliare le membrane in pezzi più piccoli per una colorazione separata.
  3. Incubazione con anticorpo primario
    1. Diluire gli anticorpi primari con un diluente standard per anticorpi e aggiungere una quantità sufficiente di soluzione per coprire completamente ciascuna membrana.
    2. Aggiungere acqua ultrapura nei pozzetti vuoti circostanti per ridurre l'evaporazione e incubare i campioni per tutta la notte a 4 °C. Utilizzare i campioni senza anticorpo primario specifico come controlli negativi.
    3. Rimuovere la soluzione di anticorpo primario il giorno successivo e lavare le membrane con 1 mL di PBS su agitatore per tre volte, 10 minuti ciascuna.
  4. Colorazione con anticorpo secondario e DAPI
    1. Diluire gli anticorpi secondari con un diluente per anticorpi fluorescenti in condizioni protette dalla luce, coprire completamente le membrane e incubare per 90 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS per tre volte, 10 minuti ciascuna, proteggendo dalla luce.
    2. Aggiungere la soluzione di colorazione DAPI pronta all'uso per coprire le membrane e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS per tre volte, 10 minuti ciascuna, proteggendo dalla luce.
  5. Chiarificazione, montaggio e acquisizione delle immagini
    1. Aggiungere un volume appropriato di reagente di chiarificazione per colture cellulari 3D per coprire le membrane e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in condizioni protette dalla luce.
    2. Trasferire le membrane su vetrini con pinze oftalmiche, aggiungere un mezzo di montaggio antifade e montare i campioni in condizioni protette dalla luce. Osservare e acquisire le immagini dei campioni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.

7. Presentazione dei dati statistici

  1. Per i confronti funzionali, n = 3 indica tre repliche biologiche indipendenti per ogni condizione, e ogni replica biologica è stata considerata come unità sperimentale. Punti dati individuali per tutte e tre le repliche biologiche. I dati sono presentati come media ± DS. Eseguire i confronti utilizzando test t di Student non appaiati a due code, con valori esatti di t e p.

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Figura 1: Illustrazione schematica e flusso di lavoro di costruzione del modello BTB. (A) Le HBMEC sono state seminate sul lato basale della membrana porosa dell'inserto per colture cellulari, mentre le cellule HA e le cellule HMC3-RFP sono state distribuite sul lato apicale. Uno strato di matrice della membrana basale è stato utilizzato per separare gli sferoidi tumorali dal compartimento delle cellule della barriera. Per il controllo abbinato privo di sferoidi, è stata utilizzata la stessa sovrapposizione di matrice della membrana basale e lo stesso trattamento, ma gli sferoidi tumorali sono stati omessi. (B) I numeri cerchiati nella parte superiore indicano i corrispondenti giorni di coltura. La costruzione della BBB e la preparazione degli sferoidi tumorali sono state eseguite contemporaneamente. Dopo l'aggiunta di uno strato di matrice della membrana basale sulla superficie superiore dell'inserto per colture cellulari, gli sferoidi tumorali sono stati trasferiti nella camera superiore utilizzando una punta di pipetta tagliata. Il modello BTB è stato quindi mantenuto in coltura fino a 1 settimana prima del prelievo dei campioni. I campioni possono normalmente essere raccolti al Giorno 7 per esperimenti successivi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Nel controllo BBB abbinato senza sferoidi, sovrapposto alla stessa quantità di matrice della membrana basale, i segnali di HMC3-RFP erano distribuiti in modo relativamente ampio lungo lo strato apicale delle cellule (Figura 2). Nella condizione BTB, le immagini al termine dell'esperimento mostravano segnali di HMC3-RFP principalmente in regioni non coperte dai sferoidi tumorali, con un segnale ridotto al di sotto dei sferoidi e nelle zone immediatamente adiacenti (Figura 2). Questi dati dimostrano un'associazione spaziale tra la presenza di sferoidi tumorali e la distribuzione finale delle cellule HMC3-RFP. Poiché non è stata valutata la distribuzione basale di HMC3-RFP prima dell'introduzione dei sferoidi né è stato effettuato un monitoraggio longitudinale delle cellule, i dati attuali non dimostrano una migrazione attiva delle microglia, una repulsione o un'esclusione indotta dal tumore.

Gli astrociti hanno mostrato anche differenze nel segnale dei marcatori e nella morfologia nella condizione BTB (Figura 2). Rispetto al controllo abbinato senza sferoidi/matrice della membrana basale, le immagini rappresentative indicavano una maggiore fluorescenza di GFAP sia nelle regioni peri-sferoidali che distali. Gli astrociti al margine dello sferoide presentavano corpi cellulari ingranditi, prolungamenti più spessi e allungati, e prolungamenti orientati verso il bordo dello sferoide (Figura 2). Queste caratteristiche finali sono coerenti con un fenotipo simile a quello dell'astrocita reattiva, ma non dimostrano di per sé un programma specifico di astrogliosi reattiva né il relativo meccanismo sottostante. Strutture astrocitiche peritumorali morfologicamente simili sono state osservate in sezioni di tessuto di metastasi cerebrale da carcinoma mammario umano, in cui la colorazione immunofluorescente mostrava caratteristiche compatibili con l'astrogliosi reattiva peritumorale (Figura 3A). Per caratterizzare ulteriormente le caratteristiche astrocitiche associate ad AQP4, è stata effettuata la colorazione immunofluorescente per AQP4 nel modello BBB abbinato senza sferoidi e nelle regioni distali e peri-sferoidali del modello BTB (Figura 3B). Le immagini rappresentative del modello BBB, della regione distale del modello BTB e della regione peri-sferoidale adiacente agli sferoidi tumorali sono mostrate rispettivamente nella prima, seconda e terza riga (Figura 3B). All'interno del modello BTB, gli astrociti peri-sferoidali mostravano differenze morfologiche rispetto agli astrociti distali. Nel complesso, le osservazioni morfologiche e quelle relative a GFAP/AQP4 supportano una rimodellizzazione astrocitica associata agli sferoidi tumorali in questo modello; la somiglianza con il tessuto del paziente deve essere interpretata come una similarità fenotipica piuttosto che come prova che il modello riproduca completamente l'astrogliosi peritumorale umana.

Per valutare le modifiche associate agli sferoidi tumorali nell'organizzazione delle giunzioni endoteliali, è stata eseguita una colorazione immunofluorescente della proteina di giunzione stretta ZO-1 nello strato basale di HBMEC nei modelli semplificati di BBB e BTB, utilizzando condizioni con e senza sferoidi abbinati, sovrapposti a uguali quantità di matrice della membrana basale. L'imaging al microscopio confocale è stato focalizzato sulla regione corrispondente agli sferoidi tumorali (Figura 4A). Nel controllo abbinato senza sferoidi, i segnali di ZO-1 tra le HBMEC mostravano una distribuzione relativamente continua e lineare, con bordi intercellulari ben definiti. Nella condizione BTB, la fluorescenza di ZO-1 nelle regioni corrispondenti agli sferoidi tumorali appariva più rada, con interruzioni focali e discontinuità (Figura 4A). Queste immagini finali sono compatibili con una perdita locale dell'organizzazione delle giunzioni strette. Tuttavia, in assenza di ulteriori marcatori molecolari specifici per BTB o di esperimenti di perturbazione meccanicistica, i dati attuali non permettono di distinguere un rimodellamento specifico di BTB da un danno endoteliale o da una rottura della barriera associati in modo non specifico al tumore.

A livello funzionale, le misurazioni della resistenza transepiteliale (TEER) e i saggi di permeabilità al dextrano-FITC sono stati eseguiti contemporaneamente al Giorno 7 nei condizioni di controllo senza sferoidi/matrice della membrana basale abbinata e nella condizione di BTB contenente sferoidi (Figura 4B). I valori individuali provenienti da tutte e tre le repliche biologiche indipendenti sono riportati come punti dispersi in Figura 4B, con i dati riassuntivi espressi come media ± DS. Il valore TEER della condizione BTB (106,0 ± 9,5255 Ω·cm2, n = 3 repliche biologiche indipendenti) era inferiore rispetto a quello del controllo abbinato (168,0 ± 5,1325 Ω·cm2, n = 3 repliche biologiche indipendenti). In modo coerente, il coefficiente di permeabilità apparente (Papp) misurato nel saggio al dextrano-FITC da apicale a basale era più elevato nella condizione BTB (5,851 ± 1,2080 × 10⁻3 cm/s, n = 3 repliche biologiche indipendenti) rispetto al controllo abbinato (2,656 ± 1,0937 × 10⁻3 cm/s, n = 3 repliche biologiche indipendenti). I test t di Student non appaiati a due code hanno evidenziato differenze statisticamente significative [TEER: t(4) = 9,920, p = 0,0006; Papp: t(4) = 3,395, p = 0,0274] (Figura 4B). All'interno di questa configurazione sperimentale, la riduzione concordante della resistenza elettrica e l'aumento della permeabilità al dextrano-FITC dimostrano una ridotta integrità della barriera in presenza di sferoidi tumorali. Tali misurazioni da sole non consentono di stabilire un meccanismo specifico di rimodellamento da BBB a BTB, e il saggio al dextrano-FITC da apicale a basale non deve essere interpretato come un esperimento fisiologico di somministrazione del farmaco dal sangue al tumore.

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Figura 2: Colorazione immunofluorescente nel modello di BTB. Immagini rappresentative di immunofluorescenza per Pan-CK e GFAP negli strati cellulari apicali del controllo BBB senza sferoidi e del modello BTB, entrambi sovrapposti a uguali quantità di matrice della membrana basale, con segnale HMC3-RFP mostrato separatamente. La prima colonna presenta illustrazioni schematiche, e il quadrato nero indica l'area di osservazione per l'immagine al microscopio confocale. La prima riga mostra il controllo corrispondente senza sferoidi (Nessuno Sferoide); la seconda riga mostra le regioni distali rispetto ai sferoidi tumorali nel modello BTB (Regione Distale); e la terza riga mostra le regioni adiacenti ai sferoidi tumorali nel modello BTB (Regione Peri-sferoide). Le frecce indicano aree con caratteristiche morfologiche astrocitiche compatibili con un fenotipo reattivo. I nuclei cellulari sono stati contrastati con DAPI (blu), le cellule tumorali sono state marcate con pan-citocheratina (Pan-CK; verde), i microglia esprimenti RFP sono mostrati in rosso e la colorazione per GFAP è mostrata in ciano. Barra delle scale = 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: La colorazione immunofluorescente rivela caratteristiche morfologiche compatibili con astrogliosi reattiva peritumorale nel modello BTB. (A) Sezioni di tessuto cerebrale provenienti da pazienti con metastasi cerebrali da carcinoma mammario sono state sottoposte a H&Colorazione #38;E. Le strutture astrocitarie all'interfaccia tra tessuto tumorale e parenchima cerebrale o vasi sanguigni mostravano caratteristiche morfologiche compatibili con astrogliosi reattiva peritumorale. Le frecce nere indicano regioni rappresentative. La colorazione immunofluorescente mostrava ulteriormente caratteristiche morfologiche astrocitarie compatibili con un fenotipo reattivo; la freccia rossa evidenzia una regione rappresentativa. Barre della scala: 50 µm per l'H&immagini colorate con ematossilina ed eosina nella prima riga, 10 µm per l'H&immagini colorate con E nella seconda riga, e 50 µm per le immagini di immunofluorescenza della terza riga. (B) La colorazione immunofluorescente per AQP4 è stata eseguita nel modello BBB abbinato senza sferoidi e nelle regioni distali e peri-sferoidali del modello BTB. La prima riga mostra immagini rappresentative del modello BBB, la seconda riga mostra immagini rappresentative della regione distale del modello BTB e la terza riga mostra immagini rappresentative della regione peri-sferoidale adiacente ai sferoidi tumorali. Le frecce indicano i cambiamenti morfologici astrocitari nella regione peri-sferoidale. I nuclei sono stati colorati con DAPI e sono mostrati in blu, mentre AQP4 è mostrato in giallo. Barra della scala = 100 µm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Caratterizzazione funzionale del modello BTB. (A) Colorazione mediante immunofluorescenza per ZO-1 nello strato basale di cellule endoteliali nei modelli di BBB e BTB sovrapposti a una quantità uguale di matrice della membrana basale. La prima colonna mostra diagrammi schematici, con riquadri neri che indicano le regioni selezionate per l'acquisizione delle immagini confocali. La prima riga mostra immagini rappresentative dello strato basale di cellule nel modello di BBB senza sferoidi tumorali (Nessuno Sferoide), mentre la seconda riga mostra immagini rappresentative dello strato basale di cellule nel modello di BTB con sferoidi tumorali (Con Sferoide). La freccia rossa evidenzia una regione con fluorescenza scarsa per ZO-1 e discontinuità focali. I nuclei sono stati colorati con DAPI e appaiono in blu, mentre ZO-1 è mostrato in verde. Barra della scala = 50 µm. (B) Valori di resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e coefficienti di permeabilità apparente (Papp) di destrano-FITC (4 kDa) nei corrispondenti controlli privi di sferoidi (Nessuno Sferoide) e nella condizione BTB (Con Sferoide), entrambi sovrapposti a una quantità uguale di matrice della membrana basale. n = 3 replicati biologici indipendenti per ogni condizione. Sono mostrati i singoli punti dati per tutti e tre i replicati biologici, e i dati riassuntivi sono presentati come media ± DS. I valori di Papp per destrano-FITC sono stati ottenuti nella direzione apicale-basale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

È stato utilizzato un modello a sferoide per introdurre un componente tumorale tridimensionale che fornisce un'organizzazione spaziale e vincoli di diffusione non riscontrabili nei tradizionali colture cellulari tumorali bidimensionali. La sua semplicità e riproducibilità lo rendono inoltre compatibile con flussi di lavoro orientati allo screening. I sferoidi sono stati combinati con un compartimento umano a tre cellule che comprende cellule endoteliali microvascolari cerebrali, astrociti e microglia, al fine di costruire un modello semplificato in vitro multicellulare della barriera emato-encefalica (BTB). Il sistema è facile da utilizzare, compatibile con la coltura in piastre multipozzetto e con misurazioni quantitative della barriera (Figura 1) e permette la visualizzazione della morfologia cellulare e della distribuzione spaziale mediante colorazione immunofluorescente. I cambiamenti astrocitari associati a GFAP/AQP4 osservati e la loro somiglianza morfologica con gli astrociti peritumorali nei tessuti di metastasi cerebrale del carcinoma mammario supportano l'appropriatezza del modello per lo studio di specifiche interazioni tumore-glia-endotelio5, sebbene questi risultati non dimostrino un'equivalenza completa con l'intera barriera emato-encefalica umana.

È stato utilizzato il metodo della goccia sospesa per generare sferoidi tumorali, che sono stati co-colti con cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane, astrociti umani e microglia umana per stabilire una piattaforma semplificata in vitro del BTB umano multicellulare. Nelle condizioni testate, gli sferoidi tumorali erano associati a una riduzione del TEER, a un aumento della permeabilità apicale-basale del dextrano-FITC, a un'organizzazione alterata della ZO-1 e a modifiche nei marcatori e nella morfologia degli astrociti. Le misurazioni del TEER e della permeabilità rappresentano approcci consolidati per valutare l'integrità della barriera nei sistemi di barriera in vitro13,14. Questi risultati dimostrano un deterioramento della barriera associato agli sferoidi tumorali e un rimodellamento gliale all'interno di questo sistema definito. Tuttavia, questa piattaforma del BTB non riproduce una trasformazione completa da BBB a BTB, la migrazione attiva della microglia o un meccanismo molecolare specifico del rimodellamento del BTB. La piattaforma deve quindi essere considerata un modello sperimentale accessibile per la generazione di ipotesi e per studi controllati sulle interazioni tumore-glia-endotelio, richiedendo saggi del trasporto con andamento appropriato quando si modella la somministrazione sistemica dei farmaci.

Questo modello semplificato presenta diverse limitazioni importanti. In primo luogo, non contiene l'unità neurovascolare completa né il microambiente cerebrale-tumorale. Mancano periciti, neuroni, una membrana basale/matrice extracellulare fisiologicamente completa e cellule immunitarie circolanti. I periciti sono regolatori importanti della funzione neurovascolare e della barriera15,16,17, ma la loro inclusione in un modello umano standardizzato in vitro rimane una sfida a causa della disponibilità limitata e della variabilità tra lotti dei periciti umani primari. Pertanto, questo modello non dovrebbe essere descritto come una BTB umana completa, ma piuttosto come una piattaforma sperimentale semplificata. In secondo luogo, lo studio attuale utilizza SK-BR-3 come unica linea cellulare di carcinoma mammario. I fenotipi osservati non possono quindi essere generalizzati all'intera biologia dei BCBM. Sarà importante validare i risultati con ulteriori sottotipi di carcinoma mammario, modelli con tropismo cerebrale e sferoidi o organoidi derivati da pazienti con BCBM, al fine di stabilire generalizzabilità e rilevanza clinica. In terzo luogo, i dati attuali relativi agli HMC3-RFP rappresentano osservazioni a tempo finale e non chiariscono se il pattern spaziale derivi da una migrazione attiva, da una sopravvivenza differenziale o da una distribuzione preesistente. Sarebbero necessarie acquisizioni longitudinali con imaging cellulare vitale per distinguere tra queste possibilità. In quarto luogo, i dati relativi a ZO-1, TEER e FITC-destrano dimostrano un'alterazione della barriera, ma non distinguono un rimodellamento specifico della BTB da un danno endoteliale aspecifico; sono necessarie ulteriori caratterizzazioni molecolari e controlli meccanicistici. In quinto luogo, poiché gli HBMEC vengono seminati sulla faccia basale della membrana in questa configurazione, il saggio di FITC-destrano apicale-a-basale riportato rappresenta una misura dell'integrità della barriera piuttosto che un saggio fisiologico di trasporto dal sangue al tumore. Negli studi sul rilascio sistemico, il tracciante o il farmaco dovrebbero essere introdotti nel compartimento inferiore/basale rivolto all'endotelio e il trasporto verso il compartimento tumorale superiore/apicale dovrebbe essere validato. Infine, le misurazioni funzionali attuali si basano su tre repliche biologiche indipendenti per condizione. Sebbene questo disegno sperimentale permetta di distinguere tra replica biologica e tecnica, un numero maggiore di repliche biologiche indipendenti rafforzerebbe ulteriormente la valutazione della riproducibilità. L'inclusione di questi affinamenti, tra cui periciti e materiali derivati da pazienti, potrebbe aumentare progressivamente la rilevanza fisiologica e traslazionale della piattaforma.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

This work was supported by the Educational Reform Project of Liaoning Province (JG24DB110), the Life and Health Guidance Plan Project of Dalian (2025ZDJH01PT101), the 1+X Program of the Second Hospital of Dalian Medical University (2024LCJSYL07), and the United Foundation of the Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, and Dalian Medical University (DMU-2&DICP UN202509).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tripsina-EDTA 0,25% (1×) (per distaccare le cellule HMC3-RFP)NCM BiotechC100C1Utilizzato per distaccare le cellule HMC3-RFP durante la preparazione cellulare.
Provette da centrifuga da 1,5 mLJet BiofilCFT001015Utilizzate per raccogliere, lavare e manipolare gli sferoidi tumorali.
Piastra da coltura cellulare a 12 pozzettiJet BiofilTCP011012Utilizzata per ospitare gli inserti da coltura cellulare a 12 pozzetti durante la costruzione del modello BBB/BTB.
Reagente per la chiarificazione della coltura cellulare 3DThermo FisherV11326Utilizzato per chiarificare le membrane di coltura cellulare colorate prima del montaggio e dell'analisi al microscopio confocale.
Anticorpo secondario anti-coniglio marcato con Alexa Fluor 488ProteintechRGAR002Anticorpo secondario fluorescente utilizzato per la rivelazione immunofluorescente di anticorpi primari di coniglio.
Anticorpo secondario anti-topo marcato con Alexa Fluor 647ProteintechRGAM005Anticorpo secondario fluorescente utilizzato per la rivelazione immunofluorescente di anticorpi primari murini.
Diluente per anticorpiSolarbioA1800Utilizzato per diluire gli anticorpi primari durante la colorazione immunofluorescente.
Mezzo di montaggio anti-sfaldamentoSolarbioS2100Utilizzato per montare le membrane colorate e ridurre lo sfaldamento della fluorescenza durante l'analisi.
Supplemento per la crescita degli astrociti (AGS)ScienCell1852Supplemento utilizzato per la coltura degli astrociti umani.
Mezzo per astrociti (AM)ScienCell1801Mezzo di coltura utilizzato per gli astrociti umani e come componente del mezzo misto del compartimento superiore.
Piastra per coltura cellulareServicebioCCD-100Utilizzata per la coltura cellulare di routine e per la preparazione degli sferoidi tumorali con metodo a goccia sospesa.
Collagene di tipo ICorning354249Utilizzato per rivestire i contenitori per coltura e gli inserti prima della semina cellulare.
CoprioggettiCitotest10212450CUtilizzati per il montaggio e la preparazione per microscopia.
Soluzione colorante DAPIServicebioG1012-10MLUtilizzata per la controcolorazione nucleare durante la colorazione immunofluorescente.
DMEM base (1×)GibcoC11995500BTUtilizzato come mezzo basale nel saggio di permeabilità al dextrano-FITC.
Supplemento per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS)ScienCell1052Supplemento utilizzato per la coltura delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane.
Mezzo per cellule endoteliali (ECM)ScienCell1001Mezzo di coltura utilizzato per le HBMEC e per il compartimento inferiore del modello BBB/BTB.
Siero fetale bovino (FBS)GibcoA5669701Supplemento sierico utilizzato nei mezzi di coltura cellulari completi.
Dextrano marcato con FITC (PM 4.000)BeyotimeST2930-50mgTracciante fluorescente utilizzato per valutare la permeabilità paracellulare e calcolare il Papp.
Diluente per anticorpi fluorescentiSolarbioA1840Utilizzato per diluire gli anticorpi secondari fluorescenti durante la colorazione immunofluorescente.
Acido acetico glacialeSigma27225Utilizzato per preparare la soluzione di rivestimento con collagene di tipo I.
HAAstrocita umanoNAComponente astrocitario per valutare le risposte morfologiche e di marcatori associate al tumore
HBMECCellule endoteliali microvascolari cerebrali umaneNAComponente della barriera endoteliale BBB/BTB
HMC3-RFPLinea cellulare di microglia umana marcata con RFP (HMC3)NAComponente microgliale per il tracciamento fluorescente
MatrigelCorning354230Matrice della membrana basale utilizzata come strato di rivestimento per separare gli sferoidi tumorali dal compartimento cellulare della barriera.
Mezzo completo MEM (con NEAA) (10)Procell SystemPM150410BMezzo utilizzato come componente del mezzo di coltura misto del compartimento superiore.
Vetrini per microscopioCitotest188105Utilizzati per montare le membrane colorate asportate per l'analisi confocale.
Anticorpo anti-GFAP murino anti-uomoEMD MilliporeMAB360-25μLAnticorpo primario utilizzato per rivelare GFAP negli astrociti mediante immunofluorescenza.
ParaformaldeideServicebioG1101-500MLUtilizzata per fissare le cellule prima della colorazione immunofluorescente.
Polvere di PBS (soluzione salina tamponata al fosfato)ServicebioG0002-2LUtilizzata per lavaggi, equilibratura e preparazione in varie fasi del protocollo.
Soluzione di penicillina-streptomicina (P/S)ServicebioG4003-100MLSupplemento antibiotico utilizzato nei mezzi di coltura cellulari completi.
PipettaEppendorf3123000250Utilizzata per la manipolazione dei liquidi durante le procedure di coltura cellulare e i saggi.
Punte per pipettaMWM Bio800201Utilizzate per la manipolazione di routine dei liquidi; punte tagliate modificate sono utilizzate per il trasferimento degli sferoidi tumorali.
Anticorpo policlonale anti-PAN-CK di coniglio anti-uomoMedChemExpressHY-P81164Anticorpo primario utilizzato per identificare le cellule tumorali mediante immunofluorescenza.
Anticorpo anti-ZO-1 di coniglio anti-uomoProteintech21773-1-APAnticorpo primario utilizzato per valutare l'organizzazione delle giunzioni strette endoteliali mediante immunofluorescenza.
SK-BR-3Linea cellulare di carcinoma mammario umanoNAComponente dello sferoide tumorale per la costruzione del BTB
Inserto per piastra da coltura tissutale (membrana PET da 0,4 μm), piastre a 12 pozzettiJet BiofilTCS016012Inserto poroso per coltura cellulare utilizzato per costruire il modello di co-coltura BBB/BTB.
Misuratore di resistenza transepiteliale (TEER)MillicellERS-2Utilizzato per misurare la resistenza elettrica attraverso l'inserto di coltura cellulare come indicatore di integrità della barriera.
TrypLE Express (1×) (per distaccare le cellule HBMEC e HA)Gibco12605-010Utilizzato per distaccare le cellule HBMEC e HA durante la preparazione cellulare.

Riferimenti

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