Questo protocollo descrive un modello ex vivo di infarto miocardico nel cuore isolato di topo perfuso con cristalloidi. Questo approccio aggira le variabili sistemiche, consentendo così ai ricercatori di valutare direttamente gli effetti cardiaci in assenza di fattori estrinseci che potrebbero alterare la sopravvivenza dei cardiomiociti e di testare interventi farmacologici localizzati.
Articolo metodologico
Modello Ex Vivo di Infarto Miocardico nel Cuore di Topo Perfusionato con Soluzione Cristalloide
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infarto miocardico sperimentale (MI) è comunemente modellato negli animali mediante occlusione transitoria dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) o, a livello cellulare, attraverso protocolli di ipossia-riossigenazione. Come modello alternativo a livello d'organo dell'ischemia, il cuore perfuso con tecnica di Langendorff è rimasto uno strumento fondamentale per lo studio degli effetti di perturbazioni fisiologiche e interventi farmacologici sulla cardioprotezione. In questo studio, presentiamo la metodologia di base e le regole fondamentali necessarie per stabilire un modello di ischemia/riperfusione miocardica regionale nel cuore isolato di topo. In breve, dopo l'arresto cardioplegico, l'arteria LAD è stata legata a seguito di un breve lavaggio con PBS freddo. Il cuore è stato quindi montato su un apparato di Langendorff e perfuso con un buffer ossigenato ricco di nutrienti a 37°C, mantenendo una pressione costante di perfusione pari a 110 cmH₂O. L'ischemia miocardica è stata indotta per periodi di 30, 45, 60, 90 e 120 minuti, seguiti da 90 minuti di riprofusione. La vitalità dei cardiomiociti e l'estensione dell'infarto sono state valutate mediante colorazione microscopica con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolo (TTC). Abbiamo dimostrato che il modello di infarto miocardico ex vivo produce in modo affidabile un danno miocardico riproducibile, caratterizzato da una perdita progressiva di cardiomiociti vitali nella regione infartuata all'aumentare della durata dell'ischemia. Inoltre, sono stati necessari almeno 30 minuti di riprofusione per ottenere una chiara delimitazione dell'area infartuata mediante colorazione con TTC. Questo approccio elimina le variabili sistemiche, consentendo ai ricercatori di valutare direttamente gli effetti cardiaci in assenza di influenze regolatorie estrinseche, come fattori umorali circolanti e infiltrazione di cellule immunitarie, che potrebbero alterare l'evoluzione dell'infarto miocardico, e di testare interventi farmacologici localizzati. Pertanto, il modello ex vivo di infarto miocardico rappresenta una piattaforma utile per studiare i meccanismi cardioprotettivi che agiscono direttamente sui cardiomiociti.
Introduzione
Un'infarto miocardico (IM) si verifica quando il flusso sanguigno coronarico si interrompe, causando morte del tessuto e grave compromissione funzionale. Sebbene venga tipicamente studiato negli organismi interi, il termine può riferirsi a un IM regionale limitato a specifiche strutture cardiache, oppure a modelli sperimentali di cuore isolato ex vivo (ad esempio, perfusione di Langendorff), utilizzati per studiare gli infarti in assenza di influenze sistemiche1. Per tale motivo, il cuore perfuso con metodo Langendorff ha rappresentato un modello sperimentale solido e ben consolidato per lo studio delle lesioni ischemiche miocardiche da oltre 50 anni2.
Il modello ex vivo di infarto miocardico (MI) nel cuore isolato offre diversi vantaggi, tra cui un controllo preciso dell'ambiente sperimentale e la possibilità di valutare gli effetti diretti di interventi, come agenti farmacologici, sul miocardio indipendentemente da influenze sistemiche, tra cui fattori umorali circolanti, componenti del sangue e regolazione neuroumorale3. Riducendo al minimo questi fattori di confondimento, il modello ex vivo rappresenta un approccio più prevedibile e riproducibile rispetto ai modelli in vivo e consente quindi indagini rigorose sui processi patologici e sui percorsi molecolari coinvolti nell'infarto miocardico4.
Nei cuori isolati, l'ischemia miocardica può essere indotta in modo globale o regionale5. Nel modello di IM globale, il flusso del perfusato attraverso l'intera circolazione coronarica viene completamente interrotto, mentre nel modello di IM regionale viene occlusa transitoriamente solo l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) mediante legatura, provocando un danno ischemico limitato al miocardio distale al sito di legatura. Sebbene il modello di IM globale sia tecnicamente semplice da eseguire, presenta diverse limitazioni che ne restringono l'applicabilità negli studi sulla cardioprotezione6. Una delle principali limitazioni è che la durata dell'ischemia è vincolata dalla tolleranza duratura dell'intero cuore, rendendo difficile indurre ischemie prolungate e ottenere un'infarto transmurale paragonabile a situazioni in vivo7. Inoltre, sebbene i modelli ex vivo offrano generalmente un'eccellente riproducibilità quando le durate di ischemia e riperfusione sono attentamente controllate, questi protocolli variano notevolmente tra i diversi laboratori. Tale variabilità evidenzia la necessità di una migliore standardizzazione e caratterizzazione del cuore isolato di topo, soprattutto perché molti dettagli metodologici critici rimangono descritti in modo insufficiente nella letteratura scientifica8.
D'altro canto, il modello regionale di infarto miocardico (MI) è tecnicamente più complesso da realizzare. Qui presentiamo diverse modifiche e strategie pratiche per ottimizzare l'induzione di un infarto miocardico ex vivo affidabile nel cuore isolato del topo, in particolare per valutare interventi farmacologici mirati alla cardioprotezione9,10. Pertanto, questo protocollo modificato di infarto miocardico ex vivo, che utilizza il cuore di topo perfuso con il metodo di Langendorff, fornisce una piattaforma efficace per valutare direttamente la sopravvivenza del miocardio a seguito di interventi terapeutici.
Protocollo
Il modello di cuore isolato perfuso qui descritto è un esperimento acuto a non sopravvivenza ed è stato approvato dalle autorità locali (O1019/25, LANUV della Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le linee guida ARRIVE e con il NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L'elenco dell'attrezzatura e dei reagenti necessari per gli esperimenti è riportato nella Tabella dei materiali.
1. Configurazione di un sistema di retro-perfusione Langendorff per il cuore isolato del topo
NOTA: È stato progettato un sistema non circolante, alimentato per gravità, per fornire un perfusato cristalloide ossigenato (soluzione tampone di Krebs-Henseleit, KHB) al cuore isolato del topo a una pressione costante di 110 cmH2O (Figura 1A).
- Pulire la strumentazione Langendorff con HCl 0,1 M/L, etanolo al 100% e quindi risciacquare con acqua distillata prima di assemblare il sistema.
- Pesare tutti i composti necessari per la preparazione di 2 L di KHB modificato secondo le seguenti concentrazioni finali (mM): 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4·7H2O, 1,21 KH2PO4, 2,52 CaCl2·2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucosio, 2,0 piruvato di sodio.
- Sciogliere tutti i composti tranne il CaCl₂ in acqua bidistillata in un matraccio da 2 L, contemporaneamente insufflando Carbogen (95% O₂/5% CO₂) per almeno 10 minuti per equilibrare il pH a 7,4.
- Aggiungere successivamente il CaCl₂ alla soluzione per evitare la precipitazione.
- Continuare a insufflare la soluzione con Carbogen per ulteriori 10 minuti.
- Filtrare la soluzione di KHB a vuoto attraverso un filtro a membrana da 0,2 µm per eliminare le particelle microscopiche che potrebbero ostruire la microvascolatura coronarica.
- Trasferire la soluzione di KHB filtrata in un serbatoio di vetro da 2 L posizionato in un bagno d'acqua preriscaldato mantenuto a 37 °C.
- Collegare il serbatoio di KHB alla colonna di vetro sotto pressione, consentendo al KHB ossigenato di riempire continuamente la colonna grazie alla pressione generata dal gas Carbogen nel serbatoio.
- Verificare che il sistema di tubi di uscita sia privo di bolle d'aria.
- Equilibrare ulteriormente la soluzione di KHB con Carbogen per altri 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Isolazione e cannullatura del cuore
NOTA: Negli esperimenti qui descritti sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J del peso di 20–25 g. Tutte le procedure sperimentali devono essere documentate adeguatamente in conformità con le normative locali, inclusi la motivazione, la data e il metodo di eutanasia.
- Posizionare delicatamente il topo in una camera di induzione contenente 5% di isoflurano (v/v) per l'induzione dell'anestesia.
- Verificare la profondità dell'anestesia assicurandosi dell'assenza completa di risposta a una forte pinzatura del dito del piede, quindi trasferire l'animale sul tavolo operatorio. Eutanasia immediata del topo mediante dislocazione cervicale, indicata dall'assenza di respirazione e dalla perdita del tono muscolare nella parte inferiore del corpo.
- Tagliare bilateralmente la gabbia toracica verso lo sterno per esporre completamente il cuore e l'aorta ascendente.
- Afferrare il tessuto extracardiaco con una pinzetta ed escindere il cuore.
- Posizionare il cuore in un piccolo becher pre-raffreddato contenente 50 mL di soluzione KHB ghiacciata per almeno 30 s per indurre l'arresto cardioplegico.
NOTA: Poiché l'attività cardiaca è altamente sensibile alla temperatura, il cuore viene completamente arrestato dall'immersione nella soluzione KHB ghiacciata. - Trasferire il cuore su un tampone di cotone pre-raffreddato e inumidito con KHB, posizionato in un piatto metallico, dove è stato predisposto un sistema di cannula collegato a un rubinetto a tre vie. (Figura 1B).
NOTA: Il sistema di perfusione deve essere privo di bolle d'aria. - Preparare un nodo semiquadro allentato utilizzando un filo di seta 5-0 sull'estremità distale della cannula.
- Dissezionare con attenzione il timo, il tessuto connettivo e i tessuti extracardiaci residui (inclusi polmoni ed esofago) per esporre e rifinire la radice aortica.
NOTA: Assicurarsi una lunghezza adeguata dell'aorta ascendente per una cannulazione riuscita. - Montare il cuore sulla cannula e fissarlo con un punto di sutura precedentemente posizionato.
- Sciacquare il cuore con 5 mL di PBS ghiacciato per rimuovere il sangue residuo dalla circolazione coronarica.
3 Ischemia e riperfusione miocardica ex vivo
NOTA: L'ischemia miocardica globale è stata indotta semplicemente interrompendo la perfusione del cuore, mentre l'ischemia miocardica regionale è stata creata mediante legatura transitoria dell'arteria discendente anteriore (LAD) sotto un microscopio stereoscopico.
- Posizionare l'arteria discendente anteriore (LAD) al centro del campo visivo ruotando delicatamente il cuore mediante regolazione del tampone di cotone sottostante. Durante la perfusione con PBS, la LAD diventa trasparente e chiaramente distinguibile dal miocardio circostante.
- Fare passare un ago conico provvisto di sutura in polipropilene 8–0 al di sotto della LAD, a 1 mm al di sotto del margine inferiore dell'atrio sinistro.
NOTA: Assicurarsi che la LAD si trovi esattamente a metà tra i due punti di perforazione per evitare lesioni vascolari dovute alla legatura. - Posizionare un pezzo di tampone morbido sulla LAD.
- Stringere saldamente la sutura per interrompere la perfusione a valle del sito di legatura.
- Trasferire il cuore cannullato nell'apparato di Langendorff e avviare una perfusione retrograda.
- Immergere il cuore nel bagno d'organo con giacca d'acqua per mantenere una temperatura costante (37 °C) per tutta la durata dell'esperimento.
- Monitorare il flusso coronarico massimo e allo stato stazionario (Tabella 1).
- Nei tempi prestabiliti di ischemia miocardica (vedere sezione dei risultati), interrompere la perfusione ed estrarre il cuore cannullato dall'apparato di perfusione.
- Immergere immediatamente il cuore in KHB ghiacciato (4 °C) per arrestare completamente la contrazione cardiaca.
- Riposizionare il cuore sul tampone di cotone nella bacinella metallica pre-raffreddata e rimuovere la legatura della LAD.
- Per studi di intervento farmacologico, iniettare 5 µL di interleuchina-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) nella parete anteriore infartuata utilizzando una siringa per insulina da 30 G in questa fase.
- Rimontare il cuore cannullato sull'apparato di perfusione e riprendere la perfusione cardiaca (riperfusione).
4. Valutazione del danno miocardico e della sopravvivenza
NOTA: La colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolo (TTC) evidenzia il miocardio vitale in rosso scuro, mentre il tessuto infartuato o necrotico appare beige dopo la fissazione con soluzione di Zamboni.
ATTENZIONE: Il TTC è generalmente considerato pericoloso e richiede una manipolazione accurata poiché può causare lieve irritazione cutanea, grave irritazione oculare ed è tossico se inalato. Smaltire i rifiuti e i residui in conformità ai requisiti delle autorità locali.
- Interrompere la perfusione 90 minuti dopo la riperfusione e immergere immediatamente il cuore in KHB freddo di ghiaccio per arrestare la contrazione cardiaca.
- Collegare la cannula a una siringa da 3 mL pre-riempita con soluzione di colorazione TTC (TTC all'1% in PBS) via un rubinetto a tre vie.
- Infondere 1 mL di soluzione di TTC nel cuore, ripetere l'infusione tre volte e somministrare un volume totale di 3 mL nell'arco di 15 minuti.
- Coprire il cuore con carta da filtro inumidita per evitare l'essiccamento della superficie.
- Posizionare il cuore in un tubo da centrifuga contenente 3 mL di soluzione di TTC 4 °C per tutta la notte
- Preparare un blocco di tessuto con composto OCT (Optimal Cutting Temperature).
NOTA: il blocco di tessuto può essere conservato a −80 °C per diversi mesi fino all'analisi successiva. - Montare il blocco di tessuto su un mandrino criostatico utilizzando il composto OCT.
- Tagliare in successione il cuore in criosezione con uno spessore di 50 µm e raccogliere ogni 10th sezione; in genere si ottengono circa 8 fette di tessuto per cuore.
- Allineare tutte e 8 le sezioni su un unico vetrino e asciugarle con un asciugacapelli per 2–3 min.
- Immergere le sezioni in una camera di colorazione contenente soluzione di Zamboni (un fissativo contenente paraformaldeide al 2% e acido picrico allo 0,4% in peso/volume) per tutta la notte a 4 °C.
AVVERTENZA: Il fissativo di Zamboni può causare reazioni allergiche della pelle ed è sospettato di provocare difetti genetici e carcinogenesi. Smaltire i rifiuti e i residui in conformità con le normative locali. - Lavare le sezioni 3 volte con PBS e coprire i preparati con mezzo di montaggio.
NOTA: il campione cardiaco colorato con TTC può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. - Acquisire immagini del cuore utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo 1,25x mediante il software CellSens.
- Per la quantificazione delle dimensioni dell'infarto, importare i file delle immagini nella piattaforma ImageJ.
- Dal menu di ImageJ, selezionare Immagine -> Regolare -> Soglia del colore per aprire la finestra Soglia colore (Figura 2B).
- Selezionare una piccola regione di interesse (ROI) all'interno della sezione cardiaca e utilizzare il miocardio vitale di colore rosso scuro e il tessuto infartuato/necrotico di colore beige come riferimenti cromatici.
- Fare clic su Campione nel Soglia del colore regolare la finestra e affinare l'intervallo di saturazione finché la regione selezionata corrisponde esattamente all'area cromatica di riferimento.
- Fare clic su Selezione per delineare l'area corrispondente al colore selezionato.
- Dal menu di ImageJ, selezionare Analizzare -> MisurareL'area della regione selezionata, riportata in pixel, verrà visualizzata nella finestra dei risultati.
- Esportare i dati di misurazione in un foglio di calcolo Excel per il calcolo della dimensione dell'infarto planimetrico.
- Per quantificare il miocardio vitale all'interno della regione infartuata, delimitare l'area di interesse (ROI), principalmente sulla parete ventricolare anteriore infartuata, dove è stata iniettata l'IL-6.
- Aprire il Gestore delle aree di interesse (ROI) dal menu di ImageJ e fare clic su Aggiungere per salvare l'area di interesse (ROI) selezionata nell'elenco delle ROI (Figura 2C).
- Utilizzare le funzioni «Sample» e «Selection» descritte in precedenza per delimitare il miocardio vitale (rosso scuro).
- Aggiungere l'area vitale selezionata all'elenco "Gestore Aree di Interesse", quindi selezionare E per ottenere l'overlap tra la ROI e il miocardio vitale.
- Misurare l'area di miocardio vitale e calcolare la percentuale di sopravvivenza dei cardiomiociti all'interno della ROI selezionata.
NOTA: I dettagli metodologici per la colorazione con TTC e la quantificazione della dimensione dell'infarto sono stati precedentemente descritti11.
Risultati
Nella piattaforma ex vivo di infarto miocardico (MI), sono stati valutati due protocolli ischemici nel cuore isolato del topo. L'ischemia globale, ampiamente utilizzata negli studi ex vivo sull'infarto miocardico, ha determinato un danno ischemico eterogeneo in tutto il cuore. Mediante un approccio microscopico affidabile e ad alta risoluzione basato sul rilevamento del TTC12, si è dimostrato che il miocardio atriale e la regione apicale erano relativamente resistenti all'ischemia e mantenevano la vitalità dopo 45 minuti di ischemia globale senza flusso (Figura 2A, pannello superiore). Al contrario, l'infarto miocardico regionale ha indotto un danno ischemico localizzato nel miocardio distale al sito di legatura dell'arteria discendente anteriore (LAD). In queste condizioni, alcune porzioni del miocardio subepicardico sono rimaste positive al TTC, indicando la preservazione di tessuto vitale (Figura 2A, pannello inferiore). Questi risultati evidenziano pattern distinti di sopravvivenza miocardica tra i due protocolli ischemici.
La durata minima di ischemia e riperfusione necessaria per indurre in modo affidabile e riproducibile l'infarto miocardico è stata ulteriormente studiata nel cuore di topo isolato. Il danno miocardico è aumentato progressivamente all’aumentare della durata dell’ischemia da 30 min a 120 min (Figura 3A). In particolare, la dimensione dell’infarto è più che raddoppiata passando da 30 min (n = 3) a 45 min (n = 5) di ischemia e ha raggiunto un plateau quando la durata ischemica è stata estesa a 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) e 120 min (n = 3) (Figura 3B). Questi risultati indicano che la vitalità miocardica è altamente sensibile alla durata dell’ischemia oltre i 30 min. Rispetto al modello di infarto miocardico in vivo (ivMI, n = 5), il modello ex vivo (evMI, n = 8) ha prodotto dimensioni di infarto quasi identiche con durate comparabili di ischemia e riperfusione (36,88% ± 3,91% vs. 37,8% ± 2,17%, p = 0,27), suggerendo che il danno miocardico non è stato sostanzialmente influenzato dalla perfusione con soluzione cristalloide. Tuttavia, i cuori evMI hanno mostrato pareti ventricolari più spesse e un lume ventricolare ridotto, probabilmente a causa dell’edema miocardico associato alla perfusione cristalloide (Figura 3C).
Sfruttando l'ambiente relativamente controllato, privo di influenze extracardiche, sono stati valutati gli effetti cardioprotettivi della somministrazione intramiocardica di IL-6. Nei cuori di controllo trattati con PBS, erano ancora rilevabili cardiomiociti vitali (CM vitali; rosso intenso) sparsi ma misurabili all'interno della regione infartuata/necrotica (beige), anche dopo 45 minuti di ischemiaFigura 4; 1.05% ± 0,44%, SEM, n = 4). In modo significativo, la somministrazione intramiocardica di IL-6 (i.m.; frecce) ha aumentato notevolmente la quantità di CM vitali, localizzate principalmente attorno al sito di iniezione all'interno della regione di interesse (ROI; 4,08% ± 0,99%, EPM, n = 6; p = 0,005, test t di Student test t). Questi risultati suggeriscono che l'IL-6 possa migliorare la sopravvivenza dei cardiomiociti dopo un danno ischemico.
Infine, l'attuale modello ex vivo di infarto miocardico presenta diversi potenziali inconvenienti che potrebbero influire sulla riproducibilità dei risultati sperimentali. Come mostrato nella Figura 5, lo scivolamento della ligatura può determinare un'occlusione inadeguata dell'arteria discendente anteriore (LAD) e una sopravvivenza miocardica estesa (4/168); nel frattempo, una riapertura incompleta può verificarsi quando i rami dell'LAD vengono danneggiati (12/168). Inoltre, l'embolia aerea durante la canulazione aortica può causare danno miocardico (frecce, 7/168), rendendo difficile distinguere il danno ischemico da quello embolico ai fini della quantificazione. Infine, una colorazione inadeguata con TTC può verificarsi quando il cuore viene perfuso eccessivamente (11/168), ostacolando notevolmente la delimitazione dell'area di infarto.
Figura 1: Schema dell'apparato sperimentale. Il sistema Langendorff a pressione costante, non ricircolante e a gravità, è stato progettato per erogare un buffer di Krebs–Henseleit (KHB) arricchito di nutrienti e ossigenato, a una pressione idrostatica costante di 110 cmH₂O. Il KHB veniva inizialmente preriscaldato a 37 °C in un serbatoio e inviato a una colonna pressoria rivestita a doppia parete, dove una pressione idrostatica costante di 110 cmH2O veniva mantenuta tramite un regolatore di pressione. Il cuore perfuso era immerso in un bagno d'organo rivestito a doppia parete e regolabile in altezza, al fine di mantenere una temperatura costante di 37 °C per tutta la durata dell'esperimento (A). L'infarto miocardico veniva indotto mediante legatura transitoria dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD), dopo arresto cardioplegico su un tampone di cotone posto in una capsula metallica preraffreddata (B). L'intervento veniva eseguito al microscopio stereoscopico. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Infarto miocardico (IM) regionale rispetto a globale e determinazione delle dimensioni dell'infarto. L'IM globale induce un danno ischemico in tutta l'anatomia cardiaca, come indicato dalla colorazione gialla nelle immagini microscopiche con TTC. Il miocardio atriale e la regione apicale sembravano più resistenti all'ischemia e rimanevano vitali dopo 45 min di ischemia globale senza flusso (pannello superiore in A). L'IM regionale induce un danno ischemico nel miocardio distale al sito di legatura dell'arteria discendente anteriore (LAD). In questo contesto, alcune porzioni del miocardio subepicardico risultano colorate di rosso, suggerendo la preservazione di tessuto vitale (pannello inferiore in A). Le dimensioni dell'infarto sono state quantificate utilizzando ImageJ, delineando l'area infartuata/necrotica e il miocardio vitale in base ai rispettivi colori di colorazione (B). La sopravvivenza dei cardiomiociti all'interno dell'area di interesse (ROI) è stata calcolata determinando la percentuale di colorazione rosso scuro nella ROI selezionata (C). Barre della scala: 1 mm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3Impatto della durata dell'ischemia sulla dimensione dell'infarto. Il danno miocardico è progressivamente peggiorato all'aumentare della durata dell'ischemia, da 30 min a 120 min (A). L'estensione dell'infarto è più che raddoppiata tra i 30 min (n = 3) e i 45 min (n = 5) di ischemia e ha apparentemente raggiunto un plateau quando la durata dell'ischemia è stata prolungata a 60 min (n = 5), 90 min (n = 4) e 120 min (n = 3) (B). Rispetto al in vivo modello MI (ivMI, n = 5), il ex vivo MI (evMI, n = 8) ha prodotto dimensioni dell'infarto quasi identiche con durate ischemiche comparabili (36,88%) ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0,27, test t di Student t-Test). I cuori evMI presentavano una parete ventricolare più spessa e un lume ventricolare ridotto, probabilmente a causa di edema miocardico associato alla perfusione con cristalloide (C). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media (DSM). Barre della scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: l'IL-6 ha potenziato la sopravvivenza dei cardiomiociti in seguito a lesione ischemica. La somministrazione intramiocardica (i.m.) di IL-6 nel modello evMI ha prodotto un numero misurabile di cardiomiociti vitali (CM vitali; rosso scuro) all'interno della regione infartuata/necrotica (beige), localizzati principalmente intorno al sito di iniezione di IL-6 (frecce, pannello sinistro). La quantificazione dei CM vitali all'interno della regione di interesse (ROI, indicata dalle linee tratteggiate) ha rivelato che l'iniezione di PBS ha determinato soltanto una piccola frazione di miocardio vitale (1,05%) ± 0,44%, SEM, n = 4), mentre l'iniezione di IL-6 ha aumentato significativamente la quantità di CM vitali all'interno dell'area di interesse (ROI) (4,08% ± 0,99%, SEM, n = 6; p = 0,005, test t di Student t-test). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media (DSM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esiti insoddisfacenti o non riusciti causati da errori tecnici. Come illustrato dal danno miocardico rappresentativo nel modello di infarto miocardico ex vivo (a sinistra), il miocardio vitale e quello necrotico possono generalmente essere chiaramente distinti nella colorazione tipica con TTC. Tuttavia, diversi errori tecnici possono portare a risultati insoddisfacenti o non interpretabili. Un'insufficiente legatura dell'arteria discendente anteriore (LAD) causata da scivolamento del punto di sutura può determinare una sopravvivenza estesa del miocardio nonostante un'ischemia prolungata. Una riattivazione incompleta può verificarsi quando i rami dell'LAD vengono danneggiati durante la legatura e successivamente risultano scarsamente perfusi, producendo un quadro simile al fenomeno del “no-reflow” osservato clinicamente. Tali aree possono presentare una colorazione rosea (frecce). L'embolizzazione microvascolare causata da bolle d'aria entrate nella circolazione coronarica durante la procedura di canulazione può anch'essa provocare danno miocardico (frecce), rendendo difficile distinguere il danno ischemico da quello embolico ai fini della quantificazione. Infine, una colorazione inadeguata con TTC può verificarsi quando il cuore viene eccessivamente perfuso, il che può causare danno miocardico indipendente dall'ischemia. Barre della scala: 1 mm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| F-picco (n = 19) | F-stazionario (n = 19) | RF-picco (n = 19) | RF-stazionario (n = 19) | |
| Medie (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| DS | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
Tabella 1: Flusso coronarico ai livelli massimo (F-picco) e di stato stazionario (F-stazionario) durante l'ischemia e la riperfusione (RF-picco e RF-stazionario).
Discussione
L'attuale modello ex vivo di infarto miocardico si basa principalmente su sofisticati sistemi cardiaci perfusi con tecnica di Langendorff2. Un errore comune durante il preparativo è l'introduzione di bolle d'aria nella circolazione coronarica, che possono causare lesioni emboliche e interferire con la valutazione del danno ischemico. Per prevenire questo problema, è essenziale un'accurata ispezione del sistema di perfusione immediatamente prima di ogni esperimento. Se piccole bolle d'aria rimangono intrappolate nel sistema di tubi, una flushing retrograda con KHB per spostare le bolle nella colonna di pressione può aiutare a risolvere il problema.
Il passaggio fondamentale di questo protocollo è la legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD). In primo luogo, è quindi fondamentale un'accurata identificazione visiva della LAD. Nella maggior parte dei casi, i vasi coronarici diventano traslucidi dopo che il cuore è stato lavato con PBS freddo di ghiaccio, rendendo la LAD chiaramente distinguibile dal miocardio circostante. Inoltre, una tecnica di legatura adeguata e abile è altrettanto importante, poiché una tensione eccessiva sul filo di polipropilene 8-0 potrebbe recidere la LAD, rendendo impossibile la successiva riperfusione. Per ridurre al minimo questo rischio, è opportuno posizionare un tassello morbido di dimensioni adeguate tra il filo e il vaso, in modo da distribuire la forza di legatura e proteggere l'arteria coronaria da lesioni meccaniche. Tuttavia, una lieve lesione miocardica indotta dalla legatura è inevitabile, ma in genere non compromette la perfusione coronarica né influenza l'esito dell'esperimento. Infine, poiché la lesione miocardica è altamente sensibile alla temperatura13, mantenere una temperatura costante durante l'esperimento è di importanza critica. In particolare, in condizioni di perfusione a pressione costante, è probabile una perdita di calore tra la colonna di perfusione e il cuore, che varia dinamicamente in base alla portata coronarica14. Di conseguenza, tali fluttuazioni potrebbero provocare variazioni della temperatura miocardica. In questo contesto, un bagno d'organo con giacca d'acqua è altamente consigliabile per mantenere condizioni termiche stabili (Figura 1A).
Una volta superate queste sfide tecniche, il modello di infarto miocardico ex vivo fornisce una piattaforma affidabile e riproducibile per indurre lesioni miocardiche nel cuore isolato del topo (Figura 3A). Rappresenta quindi un sistema sperimentale prezioso per studiare la sopravvivenza miocardica post-infarto, valutare interventi terapeutici somministrati localmente ed eseguire imaging ad alta risoluzione senza interferenze dovute al movimento respiratorio o cardiaco. Sebbene il protocollo di infarto globale sia tecnicamente semplice e sia stato ampiamente utilizzato in studi precedenti4, il suo principale limite è che la durata dell'ischemia globale è generalmente limitata a meno di 45 min3. Di conseguenza, a differenza del modello di infarto regionale, raramente produce un'infarto transmurale (Figura 2).
Una caratteristica unica del modello ex vivo di infarto miocardico è l'assenza di influenze sistemiche, compresa la regolazione neurale e i componenti circolanti del sangue, il che consente ai ricercatori di valutare gli effetti locali diretti degli interventi terapeutici sul miocardio8. Questo aspetto è particolarmente rilevante per citochine come l'IL-6 e la successiva via di segnalazione PI3K/AKT, che sono state dimostrate avere un effetto cardioprotettivo nei cardiomiociti isolati15. In vivo, tuttavia, gli effetti cardiaci dell'IL-6 sono spesso incoerenti o addirittura contraddittori, poiché l'IL-6 attiva contemporaneamente le cellule immunitarie e promuove risposte infiammatorie che possono annullare le sue azioni cardioprotettive dirette16. In linea con questo concetto, il nostro modello ex vivo ha dimostrato in modo convincente che la somministrazione locale intramiocardica di IL-6 preserva in modo significativo la vitalità miocardica dopo un danno ischemico17,18, sostenendo un effetto cardioprotettivo diretto dell'IL-6 sui cardiomiociti (Figura 4).
Riconosciamo diverse limitazioni del presente modello di infarto miocardico ex vivo. Nell'attuale configurazione, la funzione contrattile cardiaca non è stata valutata nel presente protocollo.3. Ciò era dovuto al fatto che l'obiettivo primario era caratterizzare la sopravvivenza del miocardio in un modello di infarto miocardico regionale, e al fatto che la disfunzione contrattile riflette un danno funzionale successivo a lesione ischemica, ma non indica necessariamente la morte dei cardiomiociti8. Inoltre, il ex vivo Il modello di IMA esclude intrinsecamente componenti circolanti del sangue, cellule immunitarie e influenze neuroumorali che possono contribuire in modo significativo alla progressione dell'IMA e al rimodellamento cardiaco in vivo. Sebbene questa riduzione della complessità sistemica rappresenti un vantaggio significativo del ex vivo modello di MI, limita anche il suo ampio utilizzo nella simulazione delle risposte infiammatorie, vascolari, neurali ed endocrine che possono verificarsi in vivoInfine, è stato osservato che la perfusione con cristalloidi è associata a edema miocardico, come evidenziato da un aumento dello spessore della parete ventricolare e da una riduzione della cavità ventricolare rispetto a in vivo cuori con IM. La notoria comparsa di edema può alterare l'architettura miocardica, la diffusione tissutale e potenzialmente la vitalità cellulare. Pertanto, il presente modello dovrebbe essere considerato una piattaforma controllata per lo studio del danno miocardico e dei meccanismi specifici dei cardiomiociti.
Tuttavia, il modello ex vivo di IM descritto in questo studio rappresenta una piattaforma semplice ed economica per valutare la sopravvivenza del miocardio in assenza di influenze regolatorie estrinseche. Considerando l'uso sempre più diffuso di modelli murini modificati geneticamente, questo approccio potrebbe risultare particolarmente utile per indagare i meccanismi cardioprotettivi mediante tecniche avanzate di imaging, registrazione elettrofisiologica e analisi molecolari. Inoltre, il modello potrebbe essere adattato per testare in modo sistematico interventi farmacologici localizzati o basati su geni, nonché per analizzare meccanismi specifici dei cardiomiociti senza la presenza di fattori di confondimento sistemici. Pertanto, il modello ex vivo di IM fornisce una piattaforma sperimentale complementare che facilita l'identificazione e lo studio meccanicistico delle vie cardioprotettive.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi. Gli autori dichiarano che non sono stati utilizzati strumenti di intelligenza artificiale (AI) o tecnologie assistite da intelligenza artificiale generativa nella stesura, nell'analisi dei dati, nella generazione delle figure o nella validazione di questo lavoro.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Generale della Jiangsu Geriatrics Society (JGS2026MS019 a WO), dalla Fondazione per lo Sviluppo Sociale del Dipartimento della Scienza e Tecnologia della Città di Zhenjiang (contributi n. SH2023023 a H.Z. e SH2023057 a X.L.), dal Programma FoKo (contributo n. 23/2013 a ZD) e dall'Istituto di Ricerca Cardiovascolare di Düsseldorf (CARID).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro | Milipore | 1.08380.0100 | Prodotti chimici |
| Cannula aortica | BD | 305895 (20 G) | Retro-perfusione |
| Aquamount | BDH | 362262H | Sezione criostatica |
| Bilancia | Ohaus | - | Pesatura di prodotti chimici |
| Pinze grandi | AESCULAP | - | Strumenti chirurgici |
| Analizzatori di gas ematici | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Analizzatore di gas |
| Cloruro di calcio diidrato | Fluka | 21097 | Prodotti chimici |
| Carbogeno | Linde | 4040152 | Apparato di Langendorff |
| CellSens | Olympus | Versione 3.1.1 | Software di imaging |
| Cotone idrofilo | BEESana | PZN-1330900 | Strumenti chirurgici |
| Coverslip | Epredia | BB02400500A113MN20 | Sezione criostatica |
| Criostato | Leica | M850 | Sezione criostatica |
| D(+)-Glucosio anidro | Merck | 8337.1000 | Prodotti chimici |
| Acqua bidistillata | Milipore | - | Scioglimento di prodotti chimici |
| Etilene (100%) | Merck | 64-17-5 | Pulizia dei tubi |
| Etilene (70%) | VWR | UN1170 | Pulizia dei tubi |
| Membrana filtrante (0,2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | Apparato di Langendorff |
| Portata metro | Transonic | T4S410 | Apparato di Langendorff |
| Vetrini per microscopio in vetro | Engelbrecht | 11102 | Sezione criostatica |
| Colonna d'acqua in vetro | Fatto in casa | - | Apparato di Langendorff |
| Acido cloridrico | Roth | P074.1 | Prodotti chimici |
| ImageJ | NIH | versione 1.54g | Software |
| Interleuchina-6 | Biolegend | 570804 | Prodotti chimici |
| Isolfurano | Piramal | 14150097146754 | Prodotti chimici |
| Microscopio ottico | Olympus | BX61 | Imaging |
| Solfato di magnesio eptaidrato | Merck | 5886.1000 | Prodotti chimici |
| Probo di flusso medico | Transonic | 3PXN | Apparato di Langendorff |
| Guanto metallico | Fatto in casa | - | Strumenti chirurgici |
| Siringa Micro-Fine | BD | 30G / 0,3 mL | Apparato di Langendorff |
| Topo | Janvier | C57BL/6J | Animali |
| Obiettivo (x 1,25) | Olympus | PlanApo 1,25X/0,04 | Imaging |
| Composto OCT | Sakura | 4583 | Prodotti chimici |
| Piastra di Petri | Thermo Scientific | 172931 | Apparato di Langendorff |
| Soluzione salina tamponata al fosfato | Roth | 9143.1 | Prodotti chimici |
| Cloruro di potassio | Merck | 4936.1000 | Prodotti chimici |
| Fosfato diidrogeno di potassio | Merck | 4873.1000 | Prodotti chimici |
| Seta per sutura | F.S.T | 18020-60 | Strumenti chirurgici |
| Cloruro di sodio | Sigmaaldrich | SZBD0810V | Prodotti chimici |
| Bicarbonato di sodio | Roth | 6885.2 | Prodotti chimici |
| Piruvato di sodio | Sigmaaldrich | 113-24-6 | Prodotti chimici |
| Imbottitura morbida | Deknatel | L-705 | Strumenti chirurgici |
| Pinze in acciaio inossidabile (8 mm) | F.S.T | 11052-10 | Strumenti chirurgici |
| Forbici in acciaio inossidabile | AESCULAP | BC702R | Strumenti chirurgici |
| Forbici in acciaio inossidabile | AESCULAP | BC257R | Strumenti chirurgici |
| Stereomicroscopio | Leica | MZ6 | Strumenti chirurgici |
| Sutura (8-0) | Ethicon | TG-108 | Strumenti chirurgici |
| Siringa (3 mL) | B. Braun | 4617100V | Retro-perfusione |
| Valvola a tre vie | B. Braun | 16494C | Retro-perfusione |
| Tubi | Tygon | T3304-23 | Apparato di Langendorff |
| Bagno termostatato | HAAKE | DC1/B3 | Apparato di Langendorff |
| Soluzione di Zamboni | Morphisto | 12773.0050 | Prodotti chimici |
Riferimenti
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