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Articolo di ricerca

Meccanismi centrali dell'elettroagopuntura nello scompenso cardiaco cronico: approfondimenti dalla proteomica quantitativa del nucleo del tratto solitario

172 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/73867

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18 settembre 2026

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1School of Chinese Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 2Anhui Province Key Laboratory of Meridian Viscera Correlationship, 3School of Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Rehabilitation Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, 5School of Acupuncture and Tuina, Anhui University of Chinese Medicine, 6College of Integrated Chinese and Western Medicine (School of Life Science), Anhui University of Chinese Medicine, 7South China Research Center for Acupuncture and Moxibustion, Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'elettroagopuntura attenua l'insufficienza cardiaca cronica e il rimodellamento cardiaco patologico ripristinando l'attività neuronale all'interno del nucleo del tratto solitario. Questa neuromodulazione terapeutica centrale è associata all'upregolazione del fattore trascrizionale YY1, un possibile bersaglio biologico.

Abstract

L'insufficienza cardiaca cronica (CHF) è una delle principali cause globali di mortalità cardiovascolare, determinata da una disregolazione autonoma e da un'iperattivazione del sistema simpatico. Sebbene l'elettroacupuntura (EA) eserciti effetti cardioprotettivi attraverso una neuromodulazione centrale, i suoi specifici bersagli molecolari all'interno del nucleo del tratto solitario (NTS), un centro chiave per l'integrazione autonoma, rimangono poco chiari. Per indagare questo aspetto, è stato sviluppato un modello di ratto con insufficienza cardiaca cronica mediante legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra. I ratti sono stati sottoposti a elettroacupuntura nei punti di agopuntura HT7 bilaterali per sette giorni consecutivi. La funzione cardiaca e il danno miocardico sono stati valutati mediante ecocardiografia, saggi immunoenzimatici (ELISA) e colorazioni istologiche. L'attività neuronale del NTS è stata analizzata mediante immunofluorescenza per c-Fos ed elettrofisiologia in vivo. I meccanismi molecolari sono stati studiati utilizzando proteomica quantitativa e bioinformatica, con i bersagli principali verificati tramite PCR quantitativa e immunoblotting. L'elettroacupuntura ha migliorato la frazione di eiezione del ventricolo sinistro, ridotto la fibrosi miocardica e abbassato i marcatori sierici di scompenso cardiaco. Contestualmente, l'EA ha ripristinato le frequenze di scarica neuronale spontanea, l'energia del potenziale di campo locale e l'espressione di c-Fos nel NTS. L'analisi proteomica ha identificato 85 proteine differenzialmente espresse modulate dall'EA. La stratificazione funzionale delle 58 proteine downregolate e delle 27 upregolate ha rivelato il loro coinvolgimento rispettivamente nell'organizzazione della matrice extracellulare e nel rimodellamento della cromatina dipendente da ATP. L'approccio di screening graduale, che integra mappatura topologica delle reti, arricchimento di percorsi biologici e profilo di espressione tissutale, ha identificato il fattore di trascrizione YY1 come un probabile bersaglio altamente responsivo. La validazione in vivo ha confermato che l'EA aumenta l'espressione di YY1. Nel complesso, l'elettroacupuntura ha attenuato il rimodellamento cardiaco patologico e ripristinato l'attività neuronale del NTS. YY1 è stato identificato come un possibile bersaglio associato a questa neuromodulazione centrale, fornendo nuove informazioni molecolari sui meccanismi alla base degli effetti dell'EA nell'insufficienza cardiaca cronica.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca cronica (CHF) è ampiamente riconosciuta come la fase terminale di diverse patologie cardiovascolari e continua a essere una delle principali cause di mortalità cardiovascolare a livello mondiale, imponendo un peso enorme sui sistemi sanitari globali1. Il decorso fisiopatologico della CHF è determinato principalmente da una disregolazione del sistema nervoso autonomo, caratterizzata da un'eccessiva attivazione simpatica sostenuta e da un ritiro parasimpatico2. Il ripristino dell'omeostasi autonomico è pertanto considerato una strategia terapeutica fondamentale per attenuare il rimodellamento cardiaco patologico e migliorare la funzione cardiaca globale3.

L'elettroagopuntura (EA) rappresenta un progresso moderno dell'agopuntura tradizionale e ha ottenuto un ampio riconoscimento per la sua efficacia clinica nella gestione delle patologie cardiovascolari4. Numerose ricerche, incluse i nostri studi precedenti, hanno evidenziato che questa terapia esercita effetti cardioprotettivi significativi principalmente modulando il sistema nervoso autonomo centrale. In particolare, abbiamo dimostrato che l'elettroagopuntura nel punto Shenmen (HT7) può efficacemente sopprimere l'eccessiva attività simpatica e ripristinare l'equilibrio simpato-vagale attraverso meccanismi neurali centrali mirati, attenuando così la progressione patologica della scompenso cardiaco cronico (CHF)5,6,7,8.

Il nucleo del tratto solitario (NTS), situato nel midollo allungato, è un centro di integrazione fondamentale per il mantenimento dell'equilibrio autonomico centrale. Funge da stazione di relè primaria per i riflessi cardiovascolari e per gli input sensoriali periferici, regolando l'equilibrio dinamico tra il tono simpatico e quello vagale9. Nonostante la sua importanza anatomica e funzionale, le specifiche alterazioni molecolari all'interno di questo centro critico del tronco encefalico durante il trattamento con elettroagopuntura (EA) per l'insufficienza cardiaca cronica (CHF) rimangono in gran parte sconosciute. La proteomica ad alto rendimento avanzata, combinata con l'analisi bioinformatica, offre uno strumento potente per mappare in modo imparziale le complesse reti proteiche e le cascate di segnalazione coinvolte in questo processo neurobiologico centrale10.

Pertanto, lo scopo di questo studio era indagare gli effetti dell'elettroacupuntura (EA) nel punto di agopuntura HT7 sulla funzione cardiaca e sull'attività neuronale del nucleo del tratto solitario (NTS) nell'insufficienza cardiaca cronica (CHF) e caratterizzare le alterazioni molecolari all'interno del NTS associate al trattamento con EA. Integrando elettrofisiologia in vivo con proteomica quantitativa, analisi bioinformatiche e validazione molecolare, questo studio ha cercato di identificare potenziali bersagli molecolari associati alla neuromodulazione centrale mediata dall'EA nell'insufficienza cardiaca cronica.

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Protocollo

Tutti i metodi che coinvolgono animali vertebrati sono stati eseguiti in conformità con il Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Anhui, con numero di approvazione AHUCM-rats-2024145. I reagenti e l'attrezzatura utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.

Preparazione e raggruppamento degli animali

Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati ratti maschi Sprague-Dawley di grado pulito, di 8 settimane di età e del peso compreso tra 200 e 250 g. Gli animali sono stati allevati in un ambiente controllato mantenuto a 24 ± 2 °C e con umidità relativa del 50%–60%, sotto un ciclo luce-buio standard di 12 ore. A tutti i ratti è stato concesso libero accesso a cibo e acqua ed è stato effettuato un periodo di ambientamento della durata di 1 settimana prima di qualsiasi procedura sperimentale.

Per l'Esperimento I, che ha valutato l'attività funzionale e neurale centrale, 24 ratti sono stati suddivisi casualmente in quattro gruppi di sei animali ciascuno: gruppi Sham, CHF, EA e Sham EA (Figura 1A). Per l'Esperimento II, che ha valutato i bersagli molecolari e la proteomica ad alto rendimento, 36 ratti sono stati assegnati casualmente a tre gruppi di 12 ciascuno: Sham, CHF ed EA. Le dimensioni dei campioni sono state determinate in base al Metodo dell'Equazione delle Risorse per rispettare l'etica del benessere animale e il principio di riduzione, garantendo al contempo validità statistica (E = 20 per l'Esperimento I; E = 33 per l'Esperimento II)11. Questa strategia relativa alle dimensioni del campione era coerente con i protocolli utilizzati in studi precedenti sull'EA per le malattie cardiovascolari8,12. Analisi post hoc della potenza statistica hanno indicato che una potenza superiore a 0,90 sosteneva l'adeguatezza di questa ripartizione. Il gruppo Sham EA è stato escluso dall'Esperimento II poiché valutazioni funzionali preliminari avevano indicato un'assenza di efficacia terapeutica.

Creazione del modello di scompenso cardiaco cronico

I ratti sono stati sottoposti a digiuno per 12 h prima dell'intervento chirurgico e hanno avuto libero accesso all'acqua. L'anestesia è stata indotta con isoflurano al 3% e mantenuta con isoflurano all'1,5%–2% durante l'intervento. Poiché l'isoflurano è un anestetico volatile, è stato utilizzato un adeguato sistema di aspirazione e l'intervento è stato eseguito in un'area ben ventilata per prevenire l'esposizione professionale.

Sono stati registrati continuamente elettrocardiogrammi (ECG) degli arti. È stata eseguita una toracotomia sinistra per esporre il cuore e l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) è stata legata in modo permanente a 2-3 mm sotto l'appendice atriale sinistro utilizzando un punto di sutura non riassorbibile 7-013. L'ischemia riuscita è stata confermata identificando un rialzo del tratto ST di almeno 0,2 mV sull'ECG (Figura 1B). Sono state somministrate iniezioni intraperitoneali di penicillina (200.000 U/mL) e iniezioni sottocutanee di carprofene (5 mg/kg) ogni giorno per tre giorni consecutivi dopo l'intervento per prevenire infezioni e alleviare il dolore.

Per il gruppo di controllo sham, è stata eseguita una procedura di toracotomia identica, seguita da un'inserzione superficiale dell'ago nella corrispondente sede anatomica senza legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD). È stata fornita una cura e un monitoraggio postoperatori identici. La valutazione ecocardiografica è stata effettuata a 4 settimane dall'intervento chirurgico. Il modello è stato considerato correttamente stabilito quando la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) era ≤45%8 (Figura 1C). Gli animali che non hanno soddisfatto questi criteri, che presentavano anomalie baseline dell'ECG preoperatorie o che hanno subìto una mortalità prematura sono stati esclusi sistematicamente. Ratti supplementari sono stati sottoposti a protocolli chirurgici identici per sostituire immediatamente gli animali esclusi e mantenere una dimensione campionaria uniforme.

Intervento di elettroagopuntura

In conformità con i protocolli anatomici comparativi stabiliti14, i punti auricolari bilaterali HT7 del meridiano del Cuore del Fuoco-Shaoyin della mano sono stati individuati sulla superficie palmare della piega trasversale del polso, in prossimità del margine ulnare, esattamente nella depressione radiale del tendine del muscolo flessore ulnare del carpo. La zona locale è stata disinfettata secondo le procedure standard. Due aghi sterili monouso (0.25 x 25 mm) sono stati inseriti perpendicolarmente in ciascuna area del punto HT7 fino a una profondità target di 2-3 mm e posizionati a circa 1 mm di distanza l'uno dall'altro, in modo da rimanere rigorosamente all'interno della medesima regione del punto. Per la documentazione video, la profondità di inserzione è stata verificata visivamente pre-marcando lo stelo dell'ago alla posizione di 3 mm prima dell'inserimento.

Un ago è stato collegato al terminale catodico dell'apparecchio di EA e l'ago adiacente è stato collegato al terminale anodico per stabilire un circuito elettrico localizzato (Figura 1D). È stata erogata una forma d'onda elettrica continua a una frequenza costante di 2 Hz e a un'intensità di 1 mA, calibrata per produrre contrazioni muscolari visibili ma lievi negli arti corrispondenti, per 30 minuti al giorno per sette giorni consecutivi sotto anestesia da isoflurano.

È stato applicato un protocollo minimo di agopuntura al gruppo di intervento fittizio per tenere conto delle risposte somatosensoriali non specifiche15,16. Aghi sterili sono stati inseriti in modo superficiale fino a una profondità di 0,5–1 mm in corrispondenza delle stesse sedi HT7, senza collegare elettrodi né somministrare corrente, mantenendo una durata di 30 minuti analoga a quella dell’anestesia. I gruppi di controllo Sham e CHF sono stati sottoposti a un’identica esposizione giornaliera a isoflurano (1,5%–2% di isoflurano per 30 minuti al giorno per sette giorni consecutivi), senza inserimento di aghi né stimolazione elettrica. Questa procedura ha standardizzato la condizione basale sotto anestesia in tutti i gruppi sperimentali e ha permesso di controllare eventuali artefatti neurosoppressivi o cardioprotettivi indotti da ripetute esposizioni ad anestetici volatili.

Valutazione ecocardiografica ed eutanasia dell'animale

Dopo l'intervento, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% per l'induzione e all'1% per il mantenimento, quindi fissati in posizione supina sulla piattaforma per animali. I peli del torace sono stati rimossi con cura utilizzando un agente depilatorio e un mezzo di accoppiamento acustico è stato applicato uniformemente sulla cute esposta. La funzione cardiaca è stata valutata mediante un sistema ecografico digitale dotato di un trasduttore eco da 18 MHz. È stata registrata l'ecocardiografia in modo M per misurare la frazione di eiezione del ventricolo sinistro (LVEF) e l'accorciamento frazionario del ventricolo sinistro (LVFS), e il valore medio ottenuto da 3 replicati tecnici è stato calcolato per l'analisi finale.

Il sangue è stato prelevato dall'aorta addominale mentre gli animali erano ancora sotto anestesia, per prevenire successive perdite ematiche e coagulazione e per garantire la qualità del campione per il saggio immunoenzimatico (ELISA). I ratti sono stati soppressi immediatamente mediante induzione continua con isoflurano al 5% fino alla cessazione del battito cardiaco e della respirazione.

I campioni di tessuto sono stati successivamente assegnati in base al disegno sperimentale. Per l'Esperimento I, 3 ratti per gruppo sono stati utilizzati per prelevare il cuore per la colorazione con ematossilina ed eosina (HE)/Masson e il cervello per l'immunofluorescenza di c-Fos. I tre ratti rimanenti sono stati destinati all'elettrofisiologia in vivo. Per l'Esperimento II, i tessuti del NTS bilaterali sono stati estratti da sei ratti per gruppo per la proteomica. I tessuti dei sei ratti rimanenti sono stati raccolti per la verifica molecolare: tre sono stati utilizzati per il Western blotting e la qPCR, e tre sono stati utilizzati esclusivamente per la qPCR.

Saggio immunoenzimatico

Ai campioni di sangue raccolti è stato permesso di coagulare naturalmente a 4 °C per 10–20 min. I campioni sono stati centrifugati a 1.000 x g per 15 min a 4 °C per separare il siero, e i soprannatanti sono stati raccolti. Quando l'analisi non è stata eseguita immediatamente, i campioni di siero sono stati conservati a −80 °C fino al momento dell'uso. Le concentrazioni sieriche di peptide natriuretico cerebrale N-terminale (NT-proBNP) e troponina T cardiaca (cTnT) sono state quantificate utilizzando kit ELISA specifici secondo le istruzioni standard. Sono stati misurati i valori di assorbanza e i livelli dei biomarcatori sono stati calcolati in base alle curve standard.

Colorazione istologica e immunofluorescenza

I tessuti cardiaci raccolti sono stati sciacquati in soluzione pre-raffreddata di cloruro di sodio allo 0,9%, sezionati a 5 mm sopra l'apice e inclusi in paraffina. Le sezioni di tessuto sono state deparaffinate e reidratate. La colorazione con ematossilina-eosina è stata eseguita applicando ematossilina per 10 min, seguita da una controcolorazione con eosina per 2,5 min. La colorazione di Masson è stata effettuata applicando ematossilina per 60 s e la tricromia di Masson per 30–60 s. Le sezioni sono state differenziate in acido fosforico al 6%–8% e controcolorate con verde leggero per 5 min. La frazione volumetrica del collagene (CVF) è stata quantificata per valutare la fibrosi miocardica.

I tessuti cerebrali raccolti sono stati fissati in paraformaldeide al 4%, disidratati in soluzioni di saccarosio a concentrazione crescente e sezionati con uno spessore di 30 µm. Poiché la paraformaldeide è tossica e sospettata di essere cancerogena, è stata manipolata all'interno di una cappa chimica indossando idonei dispositivi di protezione individuale. Le sezioni sono state bloccate con un buffer contenente Triton X-100 allo 0,5% e albumina sierica bovina al 3%, quindi incubate tutta la notte a 4 °C con un anticorpo primario contro c-Fos. Successivamente, le sezioni sono state lavate con soluzione salina tamponata al fosfato e incubate con gli anticorpi secondari corrispondenti per 2 h a temperatura ambiente al buio. Le sezioni sono state montate con una soluzione antiossidante per la fluorescenza contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e i neuroni positivi per c-Fos sono stati analizzati mediante imaging.

Elettrofisiologia in vivo

I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% per l'induzione e all'1% per il mantenimento, quindi fissati su un apparato stereotassico per il cervello. Il cuoio capelluto è stato rasato e disinfettato. È stata eseguita un'incisione mediana per esporre il bregma e la dura madre è stata rimossa. Un foro cranico è stato praticato con precisione sopra la regione del NTS in base alle seguenti coordinate stereotassiche relative al bregma: anteroposteriore (AP) ±12,6 mm, mediolaterale (ML) ±0,9–2,1 mm e dorsoventrale (DV) ±7,6–8,1 mm.

Al termine delle registrazioni elettrofisiologiche, è stata verificata la localizzazione stereotassica esatta della punta dell'elettrodo. È stata applicata brevemente una corrente continua di 1 mA all'elettrodo di registrazione per 10 s al fine di creare una piccola lesione elettrolitica. Al termine dell'esperimento, il bulbo è stato sezionato e il tratto della lesione è stato confermato istologicamente essere localizzato anatomicamente all'interno del NTS.

Un array microelettrodico a otto canali (2 x 4) è stato impiantato e avanzato lentamente fino alla regione cerebrale bersaglio a una velocità di 5 µm/s utilizzando un micromanipolatore motorizzato. Una volta stabilita un'attività neurale stabile, le registrazioni sono state acquisite continuamente per 400 s. Un sistema di acquisizione multicanale è stato utilizzato per registrare i potenziali d'azione neuronali (filtrati a 150–8.000 Hz, frequenza di campionamento 40 kHz) e i potenziali di campo locali (LFP; filtrati a 0,7–400 Hz, frequenza di campionamento 1 kHz).

Un software di spike-sorting è stato utilizzato per eliminare i segnali di interferenza e gli artefatti tipici ad alta ampiezza mediante cross-correlazione delle forme d'onda. L'analisi successiva del segnale neuronale è stata eseguita utilizzando un software di analisi neurale. I neuroni sono stati classificati come attivi solo quando presentavano una frequenza media di scarica spontanea >2 Hz e mantenevano un rapporto segnale-rumore stabile >3:1. La soglia di 2 Hz è stata scelta in base alle caratteristiche fisiologiche consolidate dei neuroni del NTS correlati all'autonomia; tale soglia ha efficacemente escluso le cellule prevalentemente silenti e le scariche ritmiche respiratorie a bassa frequenza, assicurando così che l'analisi fosse focalizzata sui neuroni attivi in modo tonico e coinvolti nella regolazione cardiovascolare basale17,18,19,20. Sono state generate la frequenza media di scarica neuronale e le rappresentazioni grafiche raster delle scariche degli impulsi in base a questi criteri. Sono stati costruiti spettrogrammi energetici del LFP 2D e topografie tridimensionali della densità spettrale di potenza (PSD) per valutare le caratteristiche energetiche delle oscillazioni neurali.

Dopo la registrazione, l'incisione è stata suturata e i ratti sono stati monitorati fino al completo recupero dall'anestesia. La penicillina è stata somministrata mediante iniezione intraperitoneale e il carprofene (5 mg/kg, s.c.) è stato somministrato quotidianamente per tre giorni consecutivi.

Analisi proteomica quantitativa mediante acquisizione indipendente dai dati

Le proteine totali sono state estratte con un buffer di lisi e quantificate mediante il metodo dell'acido bicinconico. Le proteine sono state denaturate, sottoposte ad alchilazione riduttiva e digerite con tripsina a 37 °C per 2 h. I peptidi risultanti sono stati desalati utilizzando una colonna C18, concentrati a 45 °C e risospesi per l'analisi successiva mediante spettrometria di massa.

I peptidi sono stati caricati su una colonna di trappia (C18 da 5 µm, 300 µm x 5 mm) equilibrata con il 96% di tampone A (acido formico 0,1% in acqua). I peptidi sono stati separati lungo una colonna analitica ad alte prestazioni ad alta capacità utilizzando un gradiente rigorosamente ottimizzato di tampone A e tampone B (acido formico 0,1% in acetonitrile al 80%).

La spettrometria di massa è stata eseguita in modalità di acquisizione indipendente dai dati (DIA) in ioni positivi con una tensione a spruzzo elettrostatico di 1,9 kV. Scansioni complete del spettrometro di massa sono state acquisite in un intervallo di massa da 380 a 980 m/z con una risoluzione di 240.000, un obiettivo di controllo automatico del guadagno (AGC) del 500% e un tempo massimo di iniezione di 3 ms. Gli spettri MS/MS sono stati acquisiti con una risoluzione di 80.000 (obiettivo AGC: 500%; tempo massimo di iniezione: 3 ms; ampiezza della lente RF: 40%). Gli ioni precursori sono stati frammentati mediante dissociazione collisionale ad alta energia, utilizzando una finestra di isolamento di 2 Th e un'energia di collisione normalizzata del 25% in un tempo di ciclo definito di 0,6 s.

I dati grezzi di spettrometria di massa sono stati elaborati utilizzando il software DIA-NN. È stata generata una libreria spettrale mediante l'algoritmo interno di apprendimento profondo e la funzione di corrispondenza tra analisi è stata applicata per la quantificazione rispetto al database del proteoma di riferimento di Rattus norvegicus, con digestione tripsinica e fino a 2 scissioni mancate. La matrice proteica quantitativa finale è stata filtrata utilizzando una soglia rigorosa del 1% di tasso di falsa scoperta a livello di ione precursore e a livello proteico.

Analisi bioinformatica ed identificazione dei geni hub

Le analisi di bioinformatica e le visualizzazioni dei dati sono state eseguite principalmente utilizzando l'ambiente di programmazione R insieme a software specializzati per la visualizzazione di reti. Per garantire trasparenza metodologica e riproducibilità, tutti gli script R personalizzati utilizzati durante questi processi analitici sono stati forniti nel File Supplementare 1. Sono state effettuate valutazioni iniziali del controllo di qualità dei dati e della distribuzione complessiva utilizzando il pacchetto ropls. Sono state compilate statistiche riassuntive relative all'identificazione/quantificazione delle proteine; è stata eseguita un'analisi discriminante basata sui minimi quadrati parziali (PLS-DA) tra i tre gruppi; è stata effettuata un'analisi discriminante ortogonale basata sui minimi quadrati parziali (OPLS-DA) per i confronti a coppie; e sono state generate mappe termiche di correlazione tra i campioni utilizzando il pacchetto pheatmap.

Le proteine differenzialmente espresse nel nucleo sono state selezionate utilizzando soglie che comprendevano un valore di p <0,05, un fold change >1,2 e un punteggio di importanza variabile nella proiezione >1,0. I grafici a doppio vulcano sono stati generati utilizzando il pacchetto ggplot2, le intersezioni sono state identificate mediante il pacchetto ggVennDiagram e le mappe termiche di clustering gerarchico sono state tracciate utilizzando il pacchetto pheatmap per visualizzare le proteine intersecanti. Analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state eseguite separatamente per le proteine upregolate e downregolate utilizzando il pacchetto enrichR basato sul database Enrichr.

Tutte le proteine differenzialmente espresse sono state mappate sul database STRING con una soglia di confidenza pari a 0,4 per costruire la rete di interazione proteina-proteina. I dati sulle interazioni sono stati importati in un software di visualizzazione delle reti. Il plugin cytoHubba è stato utilizzato per calcolare i punteggi topologici, e i primi 18 geni con punteggio più alto sono stati estratti in base all'intensità del colore del nodo. I 18 candidati hub sono stati sottoposti ad analisi di arricchimento del percorso metabolico, e le 10 proteine più prominenti sono state selezionate per valutarne i livelli di espressione nei tessuti umani mediante il database Genotype-Tissue Expression (GTEx). Il gene hub più critico è stato identificato in base ai livelli di espressione nel cervello umano e ai punteggi topologici della rete. Il Cistrome Data Browser è stato utilizzato per prevedere i fattori di trascrizione a valle e le modifiche istoniche associate al gene hub specifico.

Immunoblotting e reazione a catena della polimerasi quantitativa

Le proteine totali sono state estratte da tessuti NTS utilizzando una miscela di lisi contenente tampone di lisi con fluoruro di fenilmetilsulfonile, PMSF e inibitori della fosfatasi. I campioni sono stati omogeneizzati mediante un disgregatore cellulare ad ultrasuoni e centrifugati a 13.800 x g per 20 min a 4 °C per raccogliere i soprannatanti. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit per saggio proteico con acido bicinconinico. Un totale di 20 µg di proteina da ciascun campione è stato separato mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di dodecilsolfato di sodio al 10% e successivamente trasferito su membrane di fluoruro di polivinilidene.

Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata al Tris con Tween (TBST) per 1 h a temperatura ambiente e incubate tutta la notte a 4 °C con specifici anticorpi primari diretti contro Yin Yang 1 (YY1) e β-actina, utilizzata come proteina di controllo. Le membrane sono state lavate con TBST per 5 minuti per tre volte e incubate con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per 1,5 h a temperatura ambiente. Le bande bersaglio sono state visualizzate mediante un kit di chemiluminescenza migliorata, acquisite utilizzando un sistema di imaging e quantificate in rapporto alla β-actina.

L'RNA totale è stato estratto da tessuti NTS utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state misurate mediante spettrofotometro e il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando un kit di trascrizione inversa. È stata eseguita una reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (PCR) utilizzando un kit PCR SYBR Green su un sistema PCR in tempo reale. Le sequenze specifiche dei primer utilizzate per l'amplificazione, insieme ai rispettivi numeri di accesso delle Sequenze di Riferimento NCBI, erano le seguenti: YY1 (NM_001002271.1), senso 5'-AGCGTTCGTTGAGAGCTCAA-3' e antisenso 5'-AGCCTTCGAATGTGCACTGA-3'; DPF2 (NM_001014264.1), senso 5'-TGTGATGACTGTGACCGTGG-3' e antisenso 5'-TCCAAACACAGGTGGCAACT-3'; DMAP1 (NM_001007705.1), senso 5'-GGTGTGACATTACGGAGCCA-3' e antisenso 5'-TCCAGCAGCATCTGTTCCAG-3'; e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (NM_017008.4), senso 5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3' e antisenso 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'. I livelli relativi di espressione dell'mRNA sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt e normalizzati rispetto al gene di riferimento interno GAPDH.

Analisi statistica

Tutti i dati sperimentali sono stati analizzati utilizzando un software statistico e sono riportati come media ± deviazione standard (SD). La normalità è stata valutata mediante il test di Shapiro-Wilk, e l'omogeneità della varianza è stata verificata con il test di Brown-Forsythe.

Per i confronti tra due gruppi indipendenti, è stato utilizzato il test t di Student o il test t per campioni appaiati per i dati che soddisfacevano i criteri di normalità. I dati che non soddisfacevano le assunzioni di normalità sono stati analizzati mediante il test U di Mann-Whitney o il test dei ranghi con segno di Wilcoxon. Per i confronti tra più gruppi, è stata utilizzata l'analisi della varianza ad un fattore, seguita dal test post hoc di Holm-Sidak, quando erano soddisfatte le assunzioni di normalità e di omogeneità. Il test H di Kruskal-Wallis, seguito dal test post hoc di Dunn, è stato utilizzato quando tali assunzioni non erano soddisfatte.

Le correlazioni sono state valutate utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson calcolato con il pacchetto Hmisc in R. I corrispondenti valori p sono stati aggiustati mediante il metodo di Benjamini-Hochberg per il tasso di falsa scoperta, disponibile nel pacchetto stats, al fine di controllare l'incremento dell'errore di tipo I dovuto ai test multipli. La significatività statistica generale è stata fissata a p <0,05.

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Risultati

L'elettroagopuntura migliora la funzione cardiaca e attenua il danno miocardico nei ratti con insufficienza cardiaca cronica

Per valutare gli effetti dell'EA sull'insufficienza cardiaca congestizia (CHF), è stato utilizzato un modello ratto mediante legatura dell'arteria coronaria discendente anteriore (LAD), seguita da specifici interventi di EA o di EA Sham. Sono state effettuate valutazioni sistematiche, inclusi esami ecocardiografici, saggi biochimici e colorazioni istolog...

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Discussione

The present study investigated the central mechanisms of EA at the HT7 acupoint in the rat model of CHF. Physiological and histological data indicated that EA improved LVEF and attenuated myocardial fibrosis. In parallel with these peripheral changes, in vivo electrophysiological recordings and neural mapping supported that EA restored neuronal firing rates within the NTS. Through mass spectrometry-based proteomics, the molecular landscape of the NTS was mapped, and 85 differentially expressed proteins whose abnormal exp...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi. Gli autori dichiarano inoltre che nessuno strumento di intelligenza artificiale è stato utilizzato in alcuna fase del processo di preparazione del manoscritto.

Ringraziamenti

Desideriamo esprimere la nostra sincera gratitudine a tutti i ricercatori che hanno contribuito a questo studio e riconosciamo con rispetto il sacrificio degli animali sperimentali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (grant no. 2022YFC3500500 e 2022YFC3500502) e dal programma di supporto per talenti a livello universitario Xu Nenggui (grant no. DT2400000222). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ratti maschi adulti Sprague-DawleyLiaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.No. SCXK (LIAO) 2025-0001RGD_70508
Aghi per agopunturaSuzhou Tianxie Acupuncture Instrument Co., Ltd.——
Mezzo di montaggio antifade con DAPIAibixin Biotechnology Co., Ltd.abs9235-25ml—
Anticorpo primario anti-YY1Proteintech Group, Inc66281-1-IgAB_2881664
Anticorpo primario anti-Beta Actin66009-1-IgAB_2687938
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma Odellie Trading Co., Ltd.V900933—
Kit per saggio proteico BCAShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P0012S—
c-Fos (9F6) mAb coniglioSai Xin Tong Biological Reagents Co., Ltd.2250SAB_2247211
CytoscapeThe Cytoscape Consortiumversione 3.2.1SCR_003032
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co., Ltd.Q711-02—
Apparecchio di elettroagopunturaNanjing Jisheng Medical Technology Co., Ltd.HANS-200A—
Matrice microelettrodica a otto canali (2 × 4)Kewa Suzhou Medical Technology Co., Ltd.-—
Kit ELISA (NT-proBNP)Wuhan Enzyme Immuno-Biotechnology Co., Ltd.MM-0329R1—
Kit ELISA (cTnT)MM-0795R2—
Kit di chemiluminescenza potenziataProteintech Group, IncPK10001—
Capra anti-coniglio IgGAimee Technology Co., Ltd.111-545-003AB_2338046
Anticorpo secondario capra anti-topo IgG coniugato con HRPBeiJing Cowin Biotech Co.,Ltd.CW0102N/A
HiScript III RT SuperMixVazyme Biotech Co., Ltd.R323-01—
Software ImageJNational Institutes of Healthversione 4.0SCR_003070
Sistema di imagingBio-Rad Laboratories, IncChemiDoc MP
Macchina per anestesia per piccoli animali a canali multipliRWD Life Science Co., LtdR510-22-10—
MicroscopioOlympus Optical Co., Ltd.DP72—
Software NeuroExplorerBeijing Plexon Technology Co., Ltd.versione 5.0SCR_001818
Software Offline SorterBeijing Plexon Technology Co., Ltd.versione 4.7.2SCR_000012
Orbitrap AstralThermo Fisher Scientific——
Sistema standard Powerlab derivazione arti II
AD Instruments International Trading Co., Ltd.ML118—
Colonna PepMap Neo TrapThermo Fisher Scientific——
Inibitori della fosfatasiShanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.P1081—
Software R—versione 4.5.2SCR_001905
Tampone di lisi RIPAYeasen Biotechnology Co., Ltd.20115ES60—
RNAiso PlusTaKaRa Biotechnology Co., Ltd.9108—
Sistema ad ultrasuoni digitale per piccoli animaliFeiyino Technology Co., Ltd.VINNO6 Lab—
Software statisticoGraphPad Software Versione 8.0SCR_002798
Sistema di acquisizione multicanale OmniPlex
Beijing Plexon Technology Co., Ltd.versione 1.20.0—
Triton X-100Beijing Solab Technology Co., Ltd.22298142—
Sistema Vanquish Neo UHPLCThermo Fisher Scientific——
Colonna µPAC Neo ad alta produttivitàThermo Fisher Scientific——

Riferimenti

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