In vitro e in Imaging bioluminescenza gene reporter in vivo di cellule staminali embrionali umane

Sommario

Con il crescente interesse per le terapie con cellule staminali, le tecniche di imaging molecolare sono ideali per il monitoraggio del comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto. Geni reporter luciferasi hanno permesso non invasiva, la valutazione ripetitivo della sopravvivenza cellulare, la posizione e la proliferazione in vivo. Questo video dimostra come monitorare la proliferazione hESC in un topo vivo.

Abstract

La scoperta delle cellule staminali embrionali umane (hESC) ha notevolmente aumentato gli strumenti a disposizione degli scienziati medici interessati alla medicina rigenerativa. Tuttavia, l'iniezione diretta di hESC, e le cellule differenziate da hESC, in organismi viventi è stata finora ostacolata dalla morte delle cellule significativi, la formazione di teratoma, e il rifiuto immune. Comprensione del comportamento hESC vivo dopo trapianto richiede nuove tecniche di imaging di monitorare longitudinalmente localizzazione hESC, la proliferazione e la vitalità. L'imaging molecolare ha dato un mezzo investigatori high-throughput, poco costoso, e sensibile per il monitoraggio della proliferazione cellulare in vivo per giorni, settimane e anche mesi. Questo progresso ha notevolmente aumentato la comprensione della spazio-temporale cinetica di attecchimento hESC, la proliferazione, e teratoma-formazione in soggetti viventi.

Una delle principali innovazioni nel campo dell'imaging molecolare è stata l'estensione del test non invasivo gene reporter di biologia molecolare e cellulare in vivo in modalità multi-piattaforme di imaging. Questi geni reporter, sotto il controllo di promotori ingegnerizzati e stimolatori che sfruttano macchinari trascrizionale della cellula ospite s, vengono introdotte nelle cellule utilizzando una varietà di metodi vettoriali e non vettoriale. Una volta nella cellula, i geni giornalista può essere trascritto sia costitutivamente o solo in particolari condizioni biologiche o cellulare, a seconda del tipo di promotore utilizzato. Trascrizione e traduzione di geni reporter in proteine ​​bioattive viene poi rilevato con sensibili, strumentazione non invasiva (ad esempio, fotocamere CCD), utilizzando il segnale che generano sonde come la D-luciferina.

Per evitare la necessità di luce eccitatoria per monitorare le cellule staminali in vivo, come è richiesto per l'imaging di fluorescenza, la bioluminescenza giornalista sistemi di imaging gene richiedono solo una sonda esogena somministrata per indurre emissione di luce. Firefly luciferasi, derivato dal Fotino lucciola pyralis, codifica un enzima che catalizza D-luciferina al otticamente metabolita attivo, oxyluciferin. Attività ottica può quindi essere monitorato con una fotocamera esterna CCD. Trasdotte stabilmente cellule che trasportano il giornalista costruire nel loro DNA cromosomico passerà il giornalista costruire DNA alle cellule figlie, consentendo il monitoraggio longitudinale di sopravvivenza hESC e la proliferazione in vivo. Inoltre, poiché l'espressione del prodotto del gene reporter è richiesto per la generazione del segnale, solo le cellule vitali genitore e figlia creerà segnale di bioluminescenza; cellule in apoptosi o morte no.

In questo video, i materiali e metodi specifici necessari per la proliferazione delle cellule staminali il monitoraggio e la formazione di teratomi, con immagini bioluminescenza saranno descritti.

Protocollo

1. Costruzione di Gene Doppia Reporter Fusion
   1. Al fine di eseguire l'imaging bioluminescenza delle cellule staminali embrionali umane, è necessario prima di ottenere cellule che esprimono stabilmente un gene luciferasi giornalista come luciferasi lucciola guidata da un promotore costitutivo come ubiquitina o EF1a.
   2. Il focus di questo protocollo è sulle applicazioni gene reporter, in modo dettagliato le procedure non sono forniti qui. Tuttavia, la strategia generale del nostro laboratorio è quello di utilizzare un doppio vettore costruire fusione che contiene lucciola luciferasi (fluttuazioni) e migliorato proteina verde fluorescente (EGFP) separate....

Discussione

Rispetto ad altre modalità come la PET e risonanza magnetica, la bioluminescenza è limitata risoluzione spaziale e di penetrazione nel tessuto ridotto a causa della relativamente debole energia dei fotoni emessi (2-3 eV), per queste ragioni che finora non è stato applicabile in animali di grandi dimensioni. Tuttavia, bioluminescenza ha il vantaggio di essere a basso costo, ad alta produttività, e non invasivo, il che rende altamente auspicabile che in cellule staminali in vivo inseguimento nei piccoli animali. Non bioluminescenza geni repor.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo Dulbecco’s Modified Eagle’s (DMEM)		Hyclone
Matrice di membrana basale BD Matrigel™	Ridotta nei fattori di crescita (opzionale: priva di fenolo rosso)	BD Biosciences
Mezzo di mantenimento mTeSR1 per cellule staminali embrionali umane		Stem Cell Technologies
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)
D-Luciferina di lucciola, sale potassico		Biosynth International, Inc
Soluzione di Collagenasi IV				Sciogliere 30 mg di Collagenasi di Tipo IV in 30 mL di mezzo DMEM-F12. Filtrare in condizioni sterili e conservare a 4 gradi (Celsius).
Pipette Pasteur sterili preriscaldate
Piastre da coltura cellulare a 6 pozzetti		Techno Plastic Products	92006