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Meccanismo Multitarget di Corydalis yanhusuo contro la Sindrome da Fibromialgia: Uno Studio di Farmacologia in Rete e di Docking Molecolare

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DOI:

10.3791/74233

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23 ottobre 2026

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1Department of Rheumatology and Immunology, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha utilizzato la farmacologia delle reti e il docking molecolare per indagare i meccanismi predetti di Corydalis yanhusuo nel sindrome da fibromialgia.

Abstract

La sindrome della fibromialgia (FMS) è un disturbo del dolore cronico con opzioni terapeutiche limitate. Questo studio ha avuto lo scopo di prevedere il meccanismo multibersaglio di Corydalis yanhusuo contro la FMS utilizzando la farmacologia di rete e il docking molecolare. Gli ingredienti attivi sono stati recuperati dal database e piattaforma di analisi della farmacologia dei sistemi della medicina tradizionale cinese (TCMSP) con una biodisponibilità orale (OB) ≥30% e un grado di somiglianza ai farmaci (DL) ≥0,18. I bersagli della malattia sono stati ottenuti da GeneCards. I bersagli sovrapposti sono stati utilizzati per analisi di interazione proteina-proteina (PPI), ontologia genica (GO) e analisi del Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Il docking molecolare è stato eseguito utilizzando CB-Dock2. Sono stati identificati un totale di 49 ingredienti attivi e 53 bersagli sovrapposti. I bersagli principali includevano il fattore di necrosi tumorale (TNF), l'interleuchina-6 (IL6), l'interleuchina-1 beta (IL1B), il recettore degli estrogeni 1 (ESR1) e la prostaglandina-endoperossido sintasi 2 (PTGS2). L'analisi KEGG ha rivelato vie di segnalazione dell'interleuchina-17 (IL-17), del TNF, del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e dell'interazione tra ligandi neuroattivi e recettori. I punteggi di docking previsti variavano da −10,1 a −6,5 kcal/mol, con lo stigmasterolo che mostrava l'energia di legame prevista più bassa verso il recettore colinergico muscarinico 3 (CHRM3) (−10,1 kcal/mol). Questi risultati suggeriscono che C. yanhusuo potrebbe esercitare effetti anti-FMS potenziali attraverso meccanismi multicomponente, multibersaglio e multipercorso, in particolare modulando l'infiammazione neurogena e la segnalazione dei neurotrasmettitori. È richiesta una validazione sperimentale.

Introduzione

La sindrome della fibromialgia (FMS) è un disturbo del dolore cronico che colpisce circa il 2–4% della popolazione mondiale1,2,3. Si verifica prevalentemente nelle donne e si manifesta con dolore muscoloscheletrico diffuso, affaticamento, disturbi del sonno e disfunzione cognitiva4,5,6. Nel frattempo, la sindrome della fibromialgia si presenta spesso come complicanza di diverse malattie, tra cui l'artrite reumatoide e il lupus eritematoso sistemico7,8,9. Nonostante decenni di ricerca, la sua eziologia rimane in gran parte sconosciuta10,11. Le evidenze attuali indicano la sensibilizzazione centrale come meccanismo fondamentale, che coinvolge un'amplificazione anomala dei segnali del dolore all'interno del sistema nervoso centrale12. Questo processo è ulteriormente modulato da squilibri nei neurotrasmettitori come la serotonina, la dopamina e la noradrenalina, insieme a neuroinfiammazione cronica, stress ossidativo e predisposizione genetica13,14,15. Questa patofisiologia multifattoriale non solo spiega l'elevata eterogeneità nelle manifestazioni cliniche, ma rende anche conto dell'efficacia limitata delle terapie farmacologiche convenzionali, che tipicamente agiscono su un singolo percorso molecolare. Farmaci come antidepressivi, anticonvulsivanti e oppioidi spesso offrono solo un modesto sollievo e sono frequentemente associati a effetti avversi16,17,18,19. Pertanto, è necessario sviluppare ulteriormente nuove terapie farmacologiche in grado di modulare contemporaneamente più bersagli patogenetici.

La farmacologia delle reti è un approccio potente di biologia dei sistemi che integra l'analisi delle reti farmaco–bersaglio–malattia per chiarire in modo sistematico i meccanismi sinergici delle terapie multicomponente20,21. A differenza delle strategie riduzioniste convenzionali, questo metodo permette di prevedere ingredienti attivi potenziali, i loro bersagli proteici corrispondenti e i percorsi biologici che modulano collettivamente, fornendo così un quadro razionale per esplorare i meccanismi delle medicine erboristiche22,23,24. Il docking molecolare, come strumento complementare in silico, valuta ulteriormente le interazioni ligando–bersaglio previste e le modalità di legame potenziali tra molecole piccole e i loro bersagli, aumentando così significativamente l'affidabilità delle previsioni basate sulle reti25. C. yanhusuo, una nota erba analgesica ricca di alcaloidi isoquinolinici come la corydalina e la deidrocorydalina, ha mostrato effetti promettenti nei disturbi correlati al dolore, ma il suo meccanismo specifico contro la sindrome da fibromialgia (FMS) rimane in gran parte poco chiaro26,27. In questo studio, abbiamo utilizzato la farmacologia delle reti combinata con il docking molecolare per indagare in modo sistematico il meccanismo multicomponente, multibersaglio e multipercorso di C. yanhusuo nel trattamento della FMS, con l'obiettivo di fornire una base teorica per la sua applicazione clinica e offrire spunti per la scoperta di farmaci multibersaglio per sindromi da dolore cronico complesso.

Protocollo

Acquisizione di principi attivi e bersagli

È stato effettuato un ricerca nel Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (https://www.tcmsp-e.com, consultato il 2 agosto 2026)28 utilizzando il nome dell'erba "yanhusuo" per recuperare tutti gli ingredienti disponibili, insieme ai rispettivi ID, nomi, pesi molecolari, biodisponibilità orale (OB), somiglianza ai farmaci (DL) e formule strutturali. Gli ingredienti con OB ≥30% e DL ≥0,18 sono stati selezionati come ingredienti chiave per la successiva costruzione di una rete regolatoria29,30. Successivamente, i bersagli associati a questi ingredienti chiave sono stati ottenuti dal database TCMSP. Le proteine bersaglio ottenute sono state quindi standardizzate in simboli genici ufficiali utilizzando il database UniProt (versione 2025_01; https://www.uniprot.org; consultato il 2 agosto 2026)31. Dopo aver rimosso le voci duplicate, i bersagli rimanenti sono stati definiti come bersagli legati al farmaco.

Acquisizione di bersagli correlati alla malattia

È stato effettuato una ricerca nel database GeneCards (https://www.genecards.org/, consultato il 2 agosto 2026)32 utilizzando la parola chiave “fibromyalgia”. Tutte le proteine bersaglio ottenute sono state scaricate e utilizzate per l'analisi di intersezione successiva senza ulteriore filtraggio basato su soglie.

Costruzione della rete regolatoria "farmaco-principi attivi-target-malattia"

I bersagli legati al farmaco e alla malattia sono stati incrociati e i geni sovrapposti sono stati identificati come i bersagli terapeutici di  C. yanhusuo  contro la fibromialgia. Sono state create associazioni in fogli di calcolo tra  C. yanhusuo  e i suoi principi attivi, tra i principi attivi e i bersagli terapeutici, e tra i bersagli terapeutici e la fibromialgia, rispettivamente. Questi dati di associazione sono stati quindi convertiti in file di testo (TXT). Successivamente, il software Cytoscape (versione 3.7.2, https://cytoscape.org/)  è stato utilizzato per visualizzare la rete, in cui farmaci, principi attivi, bersagli e malattie sono stati distinti mediante colori e simboli diversi, e le relative interconnessioni sono state rappresentate graficamente33.

Analisi della rete di interazione proteina-proteina (PPI)

È stato consultato il database STRING (https://cn.string-db.org/, accesso effettuato il 2 agosto 2026)34 e le proteine bersaglio terapeutico di C. yanhusuo contro la fibromialgia sono state incollate nel campo di ricerca "Proteine multiple", selezionando "Homo sapiens" come organismo. Dopo il recupero della rete di interazione proteina-proteina (PPI), le fonti di interazione attive sono state impostate in modo da includere Textmining, Esperimenti, Basi di dati, Co-espressione, Vicinato, Fusione genica e Co-occorrenza, mentre il punteggio minimo richiesto per l'interazione è stato fissato al valore di confidenza media (0,400). Le associazioni risultanti della rete PPI sono state esportate come file TSV ed in seguito importate nel software Cytoscape. Dopo il caricamento dei dati, è stata eseguita un'analisi topologica completa mediante lo strumento Network Analyzer, ordinando tutti i nodi in ordine decrescente in base ai valori di Degree35. Infine, i primi 20 bersagli con la maggiore connettività nella rete PPI sono stati rappresentati graficamente mediante un diagramma a barre.

Analisi di arricchimento GO e KEGG

I bersagli terapeutici di C. yanhusuo contro la fibromialgia sono stati uniformemente mappati e convertiti nei corrispondenti ID Entrez utilizzando il database del National Center for Biotechnology Information (NCBI). È stata eseguita un'analisi di arricchimento dell'ontologia genica (GO) su questi bersagli utilizzando il clusterProfiler pacchetto nel software R (versione 4.3.1, https://www.r-project.org/), che comprende i termini relativi al processo biologico (BP), al componente cellulare (CC) e alla funzione molecolare (MF)36,37I risultati dell'arricchimento sono stati visualizzati mediante grafici a barre e diagrammi circolari GO. Per l'analisi dell'arricchimento dei percorsi metabolici del Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), il enrichKEGG() funzione all'interno del Il pacchetto clusterProfiler è stato applicato allo stesso insieme di geni bersaglio. La significatività dell'arricchimento è stata stabilita a p < 0,05 e i valori p grezzi sono stati utilizzati per la visualizzazione. I termini dei percorsi KEGG ottenuti sono stati filtrati per escludere le due categorie ampie di "Malattie umane" e "Metabolismo", che in questo contesto non presentano rilevanza biologica diretta. Successivamente, sono stati selezionati i 15 principali percorsi di segnalazione (ordinati per significatività) e visualizzati mediante grafici a bolle. Inoltre, le associazioni tra i bersagli e i percorsi sono state estratte e importate nel software Cytoscape per la visualizzazione della rete.

Selezione del bersaglio per il docking molecolare

Le proteine bersaglio per il docking sono state selezionate dalla rete regolatoria „farmaco–principio attivo–bersaglio–malattia“ piuttosto che dalla rete PPI. In particolare, tutti i nodi bersaglio presenti nella rete regolatoria sono stati ordinati in base al grado, e i primi 10 nodi con la maggiore connettività sono stati selezionati per il docking molecolare. Questi 10 bersagli sono PTGS2, PTGS1, KCNH2, ADRB2, CHRM3, OPRM1, OPRD1, SLC6A4, SLC6A3 ed ESR1.

Docking molecolare

Le strutture bidimensionali (2D) dei principi attivi sono state recuperate dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, consultato il 3 agosto 2026)38 utilizzando i codici CID di PubChem elencati nella Tabella Supplementare 1 e salvate in formato Structure Data File (SDF) per essere utilizzate come ligandi per il docking. Le strutture tridimensionali (3D) dei 10 principali bersagli centrali della rete regolatoria sono state recuperate e scaricate dal database AlphaFold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk/, consultato il 3 agosto 2026)39 utilizzando gli ID delle voci AlphaFold DB indicati nella Tabella Supplementare 2 in formato Protein Data Bank (PDB), da utilizzare come recettori per il docking. Sebbene per alcuni di questi bersagli siano disponibili strutture cristalline sperimentali, i modelli AlphaFold sono stati utilizzati in modo uniforme per tutti e 10 i bersagli per garantire coerenza metodologica, poiché diversi bersagli non dispongono di strutture sperimentali complete o ad alta risoluzione e l’uso misto di fonti strutturali potrebbe introdurre bias. Prima del docking, non sono state apportate modifiche strutturali manuali né ai ligandi né ai recettori. Ogni ligando è stato abbinato a ciascun recettore e inviato alla piattaforma online di docking cieco CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/, consultato il 3 agosto 2026) per i calcoli di docking molecolare. CB-Dock2 ha eseguito automaticamente i passaggi necessari di preparazione, inclusa la rimozione delle molecole d’acqua co-cristallizzate, l’aggiunta di atomi di idrogeno, l’assegnazione delle cariche e la conversione in formati pronti per il docking. Questa piattaforma, basata sull’algoritmo AutoDock Vina40, identifica e racchiude automaticamente potenziali tasche di legame sulla superficie della proteina per prevedere le conformazioni di docking tra piccole molecole e proteine. Al termine del docking, è stata esportata una tabella riassuntiva di tutte le combinazioni ligando-recettore, contenente i valori di energia di legame più bassi per ogni coppia. Per ogni coppia ligando-recettore, la conformazione con l’energia di legame prevista più bassa è stata selezionata come modalità di legame rappresentativa. I dati risultanti del docking sono stati organizzati e visualizzati mediante una mappa termica. Per la visualizzazione tridimensionale, il file di output del docking e il file del recettore sono stati importati contemporaneamente in ChimeraX (versione 1.1). È stata selezionata la piccola molecola ligando e lo strumento "Contact/H-bonds" presente in "Structural Analysis" è stato utilizzato con l’opzione "Limit by selection: with at least one end selected" per evidenziare gli atomi dei residui interagenti e registrare le interazioni. Successivamente, è stato inserito il comando "cartoon suppress false" per visualizzare gli atomi dei residui quando le interazioni erano collegate al nastro della proteina. Infine, è stato utilizzato il comando "label @@display" per visualizzare i nomi dei residui. Sono stati generati diagrammi bidimensionali delle interazioni utilizzando LigPlus (versione 2.3.1) per mostrare in modo completo le interazioni molecolari, inclusi i legami a idrogeno e le interazioni idrofobiche.

Risultati

Acquisizione di geni sovrapposti per C. yanhusuo contro la fibromialgia

Una ricerca nel database TCMSP ha individuato 77 componenti di  C. yanhusuo. Un'ulteriore selezione mediante i criteri di OB ≥30% e DL ≥0,18 ha prodotto 49 ingredienti attivi (Tabella 1). Un totale di 177 bersagli per gli ingredienti attivi di C. yanhusuo e 485 bersagli associati alla fibromialgia sono stati recuperati rispettivamente dai database TCMSP e GeneCards. L'analisi dell'intersezione tra i due insiemi di bersagli ha evidenziato 53 bersagli comuni, identificati come i bersagli terapeutici di C. yanhusuo nella fibromialgia (Figura 1).

Costruzione della rete regolatoria "farmaco-principi attivi-target-malattia"

Per costruire ulteriormente una rete regolatoria «farmaco-principi attivi-target-malattia», nella rete sono stati inclusi un medicinale tradizionale cinese (C. yanhusuo), 49 principi attivi, 53 target potenziali e una malattia (fibromialgia) (Figura 2). Utilizzando il numero di target associati a ciascun principio attivo come criterio di selezione, sono stati identificati i 10 principi attivi centrali principali, ovvero quercetina, isocorypalmina, idarina, (R)-canadina, leonticina, (S)-scoulerina, fumarina, clarkeanidina, stigmasterolo e criptopina.

Analisi della rete di interazioni proteina-proteina

I bersagli terapeutici di C. yanhusuo contro la fibromialgia sono stati sottoposti ad analisi della rete PPI, ottenendo una rete composta da 53 nodi e 480 interazioni (Figura 3A). I primi 20 bersagli in ordine di importanza sono TNF, IL6, IL1B, ESR1, PTGS2, CXCL8, CCL2, IL1A, MMP9, ICAM1, IL10, IFNG, CRP, MYC, VCAM1, IL2, SERPINE1, CXCL10, ERBB2 e MMP1 (Figura 3B).

Analisi dell'arricchimento GO

È stata condotta un'analisi di arricchimento GO sui potenziali bersagli di C. yanhusuo per il trattamento della fibromialgia. I processi biologici (BP) arricchiti comprendevano la risposta allo stimolo xenobiotico, la risposta all'etanolo, il trasporto di monoammine, la risposta cellulare al lipopolisaccaride, il percorso di segnalazione del recettore accoppiato alla proteina G che attiva la fosfolipasi C, la risposta cellulare a una molecola di origine batterica, la risposta al lipopolisaccaride, la trasmissione sinaptica dopaminergica, la circolazione sanguigna e il processo metabolico dell'ossido nitrico. I componenti cellulari (CC) arricchiti erano la membrana postsinaptica, la membrana sinaptica, la membrana presinaptica, il corpo cellulare neuronale, la vescicola neuronale a nucleo denso, il granulo a nucleo denso, il complesso del recettore accoppiato alla proteina G, la membrana della vescicola sinaptica, la membrana della vescicola esocitica e la vescicola sinaptica. Per quanto riguarda le funzioni molecolari (MF), i termini arricchiti includevano attività citochinica, legame al recettore della citochina, legame al recettore del fattore di crescita, attività di trasportatore transmembrana di monoammine, legame della catecolammina, legame dell'ammina, attività del simportatore sodio:cloruro, attività di ossidoriduttasi che agisce sul gruppo CH-NH₂ dei donatori con ossigeno come accettore, attività chemochinica e attività del simportatore di anione monoatomico:sodio (Figura 4A,B).

Analisi di arricchimento KEGG

L'analisi di arricchimento KEGG dei geni sovrapposti tra  C. yanhusuo  e la fibromialgia ha prodotto 102 vie di segnalazione arricchite. Dopo l'esclusione delle vie associate a malattie umane e al metabolismo generale, sono state mantenute 39 vie con un chiaro significato regolatorio biologico. Le prime 15 vie sono state quella del segnale IL-17, quella dei ligandi neuroattivi, quella del segnale TNF, l'interazione citochina–recettore della citochina, l'interazione delle proteine virali con citochine e recettori delle citochine, la via di segnalazione NF-κB, la sinapsi serotoninergica, la segnalazione ormonale, la via di segnalazione del recettore di tipo lectina C, l'interazione ligando–recettore neuroattivo, la via di segnalazione del recettore di tipo Toll, la rete immunitaria intestinale per la produzione di IgA, la senescenza cellulare, la via di segnalazione JAK–STAT e la via di segnalazione HIF-1 (Figura 5A). Successivamente, è stata costruita una rete bersaglio–via, in cui i primi 10 bersagli erano IL6, TNF, IL1B, CXCL8, PTGS2, IL10, IL2, CXCL10, CCL2 e IFNG (Figura 5B).

Docking molecolare

È stato eseguito un docking molecolare tra i 10 principi attivi principali e i 10 bersagli centrali della rete regolatoria «farmaco–principio attivo–bersaglio–malattia». Questi 10 bersagli erano PTGS2, PTGS1, KCNH2, ADRB2, CHRM3, OPRM1, OPRD1, SLC6A4, SLC6A3 ed ESR1. Per tutte le combinazioni di docking, le energie di legame previste non hanno superato -5 kcal/mol, e la distribuzione complessiva dei punteggi è stata visualizzata sotto forma di mappa termica (Figura 6A). Tra tutti i modelli accoppiati, l'energia di legame prevista tra stigmasterolo e CHRM3 era il minimo globale (–10,1 kcal/mol). Pertanto, questo complesso è stato selezionato per ulteriori analisi visive, generando una struttura conformazionale tridimensionale e un diagramma bidimensionale della modalità di legame che illustra le interazioni chiave con i residui (Figura 6B). Questi valori rappresentano punteggi/energie di docking previsti, piuttosto che affinità di legame determinate sperimentalmente. Per il complesso stigmasterolo–CHRM3 selezionato, la modalità di legame prevista era stabilizzata principalmente da contatti idrofobici con i residui Thr215, Ser227, Asp518, Pro217, Leu226, Glu220, Asn514, Phe222, Lys523, Trp526, Tyr128 e Asn527. Nessun evidente legame a idrogeno è stato rilevato in questa conformazione di docking. Queste interazioni suggeriscono che lo stigmasterolo occupa una tasca predetta distinta su CHRM3; tuttavia, la relazione con siti di legame ortostatici o allosterici precedentemente identificati non è stata convalidata in modo indipendente.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

I dati a supporto dei risultati di questo studio sono disponibili liberamente nella Science Data Bank all'indirizzo https://doi.org/10.57760/sciencedb.013nm. Ulteriori dettagli possono essere ottenuti dal corrispondente autore su richiesta ragionevole.

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Figura 1: Diagramma di Venn dell'intersezione tra i bersagli del principio attivo di C. yanhusuo e i bersagli della fibromialgia. Il cerchio a sinistra rappresenta i bersagli associati alla fibromialgia; il cerchio a destra rappresenta i bersagli dei principi attivi di C. yanhusuo. La regione sovrapposta rappresenta i 53 bersagli comuni. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: La rete regolatoria «farmaco–principio attivo–bersaglio–malattia». I nodi rappresentano farmaci, principi attivi, bersagli e malattie, ciascuno distinto da un colore e una forma differente. I collegamenti rappresentano associazioni tra i nodi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Analisi della rete di interazione proteina-proteina dei bersagli terapeutici. (A) Rete di interazioni proteina-proteina (PPI) dei 53 bersagli terapeutici sovrapposti di C. yanhusuo contro la fibromialgia, visualizzata utilizzando Cytoscape. Tutti e 53 i bersagli sono stati mappati e mantenuti nella rete. I nodi rappresentano proteine, mentre i collegamenti rappresentano interazioni proteina-proteina. (B) I primi 20 bersagli ordinati per centralità del grado. L'asse x rappresenta il valore del grado, mentre l'asse y rappresenta i simboli genici dei bersagli. Abbreviazioni: PPI = interazione proteina-proteina. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Analisi di arricchimento GO delle proteine bersaglio dei principi attivi di C. yanhusuo e delle proteine bersaglio della fibromialgia. (A) Grafico a barre che mostra i termini GO maggiormente arricchiti. L'asse x rappresenta il numero di geni; l'asse y rappresenta i termini GO. (B) Grafici circolari che visualizzano i risultati dell'arricchimento GO. I termini GO sono raggruppati in processo biologico (BP), componente cellulare (CC) e funzione molecolare (MF). Le scale di colori indicano i valori p grezzi. Abbreviazioni: GO = Gene Ontology; BP = processo biologico; CC = componente cellulare; MF = funzione molecolare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Analisi di arricchimento KEGG dei bersagli dei principi attivi di C. yanhusuo e dei bersagli della fibromialgia. (A) Le prime 15 vie di segnalazione. L'asse x rappresenta il rapporto genico; l'asse y rappresenta i nomi delle vie. La dimensione dei punti indica il numero di geni; il colore dei punti indica il valore p grezzo. (B) Associazioni tra le prime 15 vie di segnalazione e i bersagli. In (B), i nodi sono colorati in base alla categoria della via: i nodi rossi/arancioni rappresentano vie infiammatorie/immunitarie, e i nodi blu rappresentano vie di segnalazione neuronale. Tra queste, le vie di segnalazione di IL-17, TNF, recettore tipo Toll e recettore di tipo lectina C agiscono come attivatori iniziali; NF-κB, interazione citochina–recettore della citochina, Janus chinasi-trasduttore del segnale e attivatore della trascrizione (JAK-STAT), fattore 1 inducibile da ipossia (HIF-1), senescenza cellulare e rete immunitaria intestinale per la produzione di IgA agiscono come effettori finali; mentre la segnalazione del ligando neuroattivo, l'interazione ligando neuroattivo–recettore, la sinapsi serotoninergica e la segnalazione ormonale svolgono il ruolo di amplificatori della sensibilizzazione centrale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Analisi di docking molecolare degli ingredienti attivi principali e delle proteine bersaglio. (A) Mappa termica delle energie di legame previste per il docking molecolare tra i 10 ingredienti attivi principali e i 10 bersagli centrali della rete regolatoria «farmaco–ingrediente attivo–bersaglio–malattia» (PTGS2, PTGS1, KCNH2, ADRB2, CHRM3, OPRM1, OPRD1, SLC6A4, SLC6A3 ed ESR1). (B) Diagrammi del modo di legame tridimensionale (3D) e bidimensionale (2D) dello stigmasterolo con CHRM3. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

ID MolecolaNome della molecolaPMOB(%)DL
MOL004193Clarkeanidina327.4186.650.5
MOL001460Criptopina369.4578.740.7
MOL0042342,3,9,10-tetrametossi-13-metil-5,6-diidroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-8-one381.4676.770.7
MOL004071Idarina355.4773.940.6
MOL000791bicucullina367.3869.670.9
MOL004195CORYDALINA369.565.840.7
MOL000785palmatina352.4464.60.7
MOL004191Capaurina371.4762.910.7
MOL004200metil-[2-(3,4,6,7-tetrametossi-1-fenantril)etil]ammina355.4761.150.4
MOL001463Diidrosanguinarina333.3659.310.9
MOL000787Fumarina353.459.260.8
MOL004232tetraidroprotopapaverina329.4357.280.3
MOL002903(R)-Canadina339.4255.370.8
MOL00422624240-05-9353.453.750.8
MOL004196Cordalmina340.4552.50.6
MOL004230stilopina323.3748.250.9
MOL000793C09367325.3947.540.7
MOL004203Deidrocorybulbina352.4446.970.6
MOL000098quercetina302.2546.430.3
MOL00419818797-79-0367.4346.060.9
MOL004215leoncina327.4645.790.3
MOL004190(-)-alfa-N-metilcanadina354.4645.060.8
MOL004210(1S,8'R)-6,7-dimetossi-2-metilspiro[3,4-diidroisoquinolina-1,7'-6,8-diidrociclopenta[g][1,3]benzodiossolo]-8'-olo369.4543.950.7
MOL004205Deidrocordalmina338.4143.90.6
MOL000449Stigmasterolo412.7743.830.8
MOL004228Saulatina396.4742.740.8
MOL004204deidrocordalina366.4741.980.7
MOL004220N-metilauratetanina341.4441.620.6
MOL00421613-metilpalmatrubina352.4440.970.6
MOL004214isocorybulbina368.5140.180.7
MOL004763Izoteolina327.4139.530.5
MOL004202deidrocavidina351.4338.990.8
MOL004208demetilcorydalmatina327.4138.990.5
MOL004225pseudocoptisina320.3438.970.9
MOL004199Corynoloxina365.4138.120.6
MOL001474sanguinarina332.3537.810.9
MOL004197Cordina341.4437.160.6
MOL000359sitosterolo414.7936.910.8
MOL001454berberina336.3936.860.8
MOL00420913-metildeidrocordalmina352.4435.940.6
MOL000790Isocorypalmina341.4435.770.6
MOL002670Cavidina353.4535.640.8
MOL004231Tetraidrocorysamina337.434.170.9
MOL001461Diidrocheleritrina349.4132.730.8
MOL000217(S)-Scoulerina327.4132.280.5
MOL004233ST057701341.4431.870.6
MOL001458coptisina320.3430.670.9
MOL004221norglaucing341.4430.350.6
MOL004224pontevedrina381.4130.280.7

Tabella 1: Ingredienti attivi di C. yanhusuo identificati da TCMSP e i loro parametri farmacocinetici. MW, peso molecolare; OB, biodisponibilità orale; DL, somiglianza ai farmaci. Sono stati considerati ingredienti chiave per la successiva costruzione della rete soltanto gli ingredienti con OB ≥30% e DL ≥0,18.

Tabella supplementare 1: Ligandi PubChem utilizzati per il docking molecolare. Vengono elencati i 10 principi attivi utilizzati come ligandi per il docking, con i rispettivi nomi, CID PubChem e formule molecolari. Tutte le strutture dei ligandi sono state ottenute da PubChem in formato SDF utilizzando i CID indicati.Cliccare qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Strutture recettoriali di AlphaFold utilizzate per il docking molecolare. Le 10 proteine bersaglio utilizzate come recettori per il docking sono elencate con i rispettivi simboli genici, numeri di accesso UniProt e ID delle voci nel database AlphaFold. Tutte le strutture recettoriali sono state scaricate dal database AlphaFold delle strutture proteiche in formato PDB.Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

Nel presente studio, abbiamo utilizzato un approccio di farmacologia delle reti combinato con il docking molecolare per predire in modo sistematico i meccanismi multi-obiettivo di C. yanhusuo nel potenziale trattamento della FMS. I risultati ottenuti in silico predicono che gli effetti terapeutici potenziali dei C. yanhusuo contro la FMS può essere mediata attraverso una rete regolatoria complessa che coinvolge 49 ingredienti attivi, 53 bersagli sovrapposti e diversi percorsi di segnalazione. Questa analisi completa è non solo coerente con l'uso tradizionale di C. yanhusuo come erba analgesica, ma fornisce anche indicazioni preliminari, basate su previsioni, a livello molecolare sui suoi potenziali meccanismi d'azione nel trattamento della sintomatologia multifattoriale della FMS.

La costruzione della rete regolatoria «farmaco‑principi attivi‑bersaglio‑malattia» ha identificato quercetina, isocoripalmina, idarina, (R)‑canadina, leonticina, (S)‑scoulerina, fumarina, clarkeanidina, stigmasterolo e criptopina come i 10 principali componenti attivi in base al loro grado di connettività con i bersagli. La quercetina è un comune composto flavonoideo con significative attività biologiche, tra cui effetti antiossidanti, antinfiammatori e immunomodulatori41. In studi farmacologici sperimentali, si è riportato che l'intervento con quercetina migliora in modo marcato l'iperalgesia muscolare, l'allodinia tattile e l'allodinia al freddo in ratti con modello di fibromialgia indotta da reserpina42. In un modello animale, si è riportato che lo stigmasterolo riduce in modo dose-dipendente l'allodinia meccanica e al freddo, l'iperalgesia termica indotta dal calore, l'allodinia meccanica periorbitale, la perdita di forza muscolare e i comportamenti dolorosi affettivo-motivazionali nel modello murino di fibromialgia indotta da reserpina43. Questi risultati ottenuti in vivo forniscono un supporto farmacologico indiretto alla possibile rilevanza di questi composti nei modelli di fibromialgia, ma non convalidano i specifici bersagli molecolari predetti nel presente studio. Isocoripalmina, idarina, (R)‑canadina, leonticina, (S)‑scoulerina, fumarina, clarkeanidina e criptopina sono alcaloidi presenti in C. yanhusuo, e si è riportato che questi alcaloidi producono effetti analgesici attraverso il blocco dei canali ionici, la regolazione dei neurotrasmettitori e l'inibizione della ciclossigenasi-2 (COX-2).

L'analisi della rete PPI ha identificato TNF, IL6, IL1B, ESR1 e PTGS2 come principali bersagli centrali, suggerendo un potenziale ruolo importante dell'infiammazione neurogena e della modulazione immunitaria nella fisiopatologia della SMF. Per andare oltre una semplice classificazione, abbiamo ulteriormente raggruppato i bersagli centrali in tre moduli funzionali in base alle loro funzioni biologiche note e alla connettività nella rete: un modulo infiammatorio/citochinico (TNF, IL6, IL1B, CXCL8), un modulo recettoriale per neurotrasmettitori (CHRM3, ADRB2, ESR1) e un modulo di trasduzione del segnale (PTGS2, MMP9). Questi moduli potrebbero cooperare nel perpetuare il circolo vizioso di «attivazione immunitaria periferica → sensibilizzazione centrale» nella SMF, piuttosto che agire in modo isolato. L'infiammazione cronica di basso grado è stata sempre più riconosciuta come un fattore contribuente alla sensibilizzazione centrale, un meccanismo fondamentale alla base della SMF. TNF e IL-1β sono citochine pro-infiammatorie chiave che amplificano il segnale del dolore attivando le cellule gliali e aumentando l'eccitabilità sinaptica nel midollo spinale e nelle aree cerebrali coinvolte nell'elaborazione del dolore44,45,46. La rete predetta suggerisce che diversi componenti attivi di C. yanhusuo, come la quercetina e lo stigmasterolo, potrebbero agire contemporaneamente su questi mediatori infiammatori, indicando un potenziale effetto anti-infiammatorio neurogeno a spettro ampio47,48,49. Ciò risulta particolarmente rilevante, considerando che le terapie farmacologiche convenzionali, come la pregabalina e la duloxetina, sono principalmente progettate per modulare i livelli di neurotrasmettitori e potrebbero non agire direttamente sul componente infiammatorio della SMF.

L'analisi dell'arricchimento GO ha ulteriormente predetto i processi biologici che C. yanhusuo potrebbe modulare, con termini rilevanti tra cui risposta allo stimolo xenobiotico, trasporto di monoammine, trasmissione sinaptica dopaminergica e risposta cellulare al lipopolisaccaride. Questi risultati predetti sono coerenti con i ruoli noti della dopamina e della serotonina nella modulazione del dolore e nel controllo dell'umore, entrambi frequentemente alterati nei pazienti con sindrome da fibromialgia (FMS). L'analisi dell'arricchimento dei percorsi KEGG ha predetto che i potenziali bersagli di C. yanhusuo potrebbero essere principalmente coinvolti nel percorso di segnalazione dell'IL-17, nell'interazione tra ligandi neuroattivi e recettori, nel percorso di segnalazione del TNF, nell'interazione citochina-recettore per citochine e nel percorso di segnalazione NF-κB.

Il percorso di segnalazione dell'IL-17 si è affermato come un fattore chiave nel dolore cronico associato a condizioni infiammatorie e autoimmuni, mediando il reclutamento dei neutrofili e promuovendo il rilascio di citochine pro-infiammatorie come TNF e IL-650,51,52. L'azione mirata di C. yanhusuo su questo percorso suggerisce che l'erba possa attenuare l'attivazione immunitaria periferica e la conseguente neuroinfiammazione centrale, entrambe riconosciute in misura crescente come fattori che contribuiscono alle riacutizzazioni dei sintomi della fibromialgia. Inoltre, il percorso di interazione tra ligandi neuroattivi e recettori rappresenta un punto di convergenza per diversi sistemi di neurotrasmettitori, tra cui la segnalazione glutammatergica, GABAergica e colinergica, tutti coinvolti nell'elaborazione del dolore e nei disturbi cognitivi associati alla fibromialgia50,51,52,53,54,55. La regolazione di questo percorso da parte di C. yanhusuo potrebbe in parte spiegare il potenziale previsto dell'erba di modulare non soltanto il dolore, ma anche la stanchezza, i disturbi del sonno e i disturbi dell'umore associati alla fibromialgia.

I risultati del docking molecolare hanno fornito una previsione in silico delle potenziali interazioni di legame tra i 10 principi attivi più attivi e i 10 principali bersagli centrali della rete regolatoria «farmaco–principio attivo–bersaglio–malattia» (PTGS2, PTGS1, KCNH2, ADRB2, CHRM3, OPRM1, OPRD1, SLC6A4, SLC6A3 ed ESR1). In particolare, le energie di legame previste per tutte le coppie ligando-recettore erano inferiori a -5 kcal/mol, indicando un legame previsto da moderato a forte. Il punteggio di docking più basso è stato osservato per stigmasterolo–CHRM3 (−10,1 kcal/mol), seguito da quercetina–ADRB2 (−9,8 kcal/mol) e stigmasterolo–OPRM1 (−9,6 kcal/mol). Lo stigmasterolo, un fitosterolo di origine vegetale precedentemente identificato in C. yanhusuo, ha dimostrato attività anti-infiammatorie e antiossidanti in vari modelli di malattia56,57,58. Il suo forte legame previsto con CHRM3 e ADRB2 suggerisce che, oltre agli alcaloidi, anche costituenti non alcaloidali potrebbero contribuire all'efficacia terapeutica di C. yanhusuo modulando i segnali colinergici e adrenergici, fondamentali per la regolazione del sistema nervoso autonomo e la modulazione del dolore. Il forte legame previsto dello stigmasterolo con CHRM3 e ADRB2 potrebbe essere rilevante rispetto alla proprietà tradizionale di C. yanhusuo di «regolare il Qi e alleviare il dolore». A differenza dei farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS), C. yanhusuo potrebbe agire potenzialmente sia attraverso mediatori infiammatori sia attraverso recettori per neurotrasmettitori autonomi, suggerendo un possibile meccanismo doppio. I contributi relativi del percorso anti-infiammatorio colinergico e del percorso classico TNF/IL-6 devono ancora essere validati sperimentalmente. Tra i principi attivi principali, la quercetina potrebbe agire come componente anti-infiammatorio a spettro ampio, mentre lo stigmasterolo potrebbe mostrare interazioni di docking relativamente forti con bersagli selezionati come CHRM3 e ADRB2. Questo schema di «ampia copertura + alta precisione» potrebbe corrispondere alle caratteristiche eterogenee del dolore nella fibromialgia (FMS).

Tradurre le previsioni in limitazioni
Sebbene la farmacologia delle reti sia di natura predittiva, i risultati ottenuti devono essere interpretati con cautela. Sulla base delle previsioni, ipotizziamo che la frazione clinicamente più promettente C. yanhusuo potrebbe trattarsi di un estratto specifico arricchito in quercetina e stigmasterolo, piuttosto che dell'intera miscela. Questa ipotesi richiede una validazione sperimentale. Studi futuri dovrebbero concentrarsi sull'isolamento e sul test di tali frazioni arricchite in vitro e in vivo per confermare i bersagli e le vie predette.

Conclusione

Questo studio suggerisce che si prevede che C. yanhusuo eserciti effetti terapeutici contro la sindrome della fibromialgia attraverso un meccanismo sinergico che coinvolge molteplici componenti, bersagli e vie metaboliche, con azioni centrali che potrebbero essere incentrate sulla soppressione dell'infiammazione neurogena e sulla neuromodulazione. Le analisi integrate di farmacologia in rete e docking molecolare rivelano che ingredienti attivi chiave, come la quercetina e lo stigmasterolo, potrebbero regolare in modo collettivo mediatori infiammatori cruciali e vie di segnalazione neuroattive, modulando così potenzialmente sia l'attivazione immunitaria periferica sia la sensibilizzazione centrale. Questi risultati forniscono una giustificazione preliminare, basata su previsioni, per future indagini sperimentali e per l'eventuale applicazione clinica di C. yanhusuo nella SMF, e potrebbero guidare la scoperta di farmaci multi-bersaglio basata su ipotesi per disturbi complessi del dolore cronico. È necessaria una validazione sperimentale per confermare queste previsioni.

Limitazioni:

Questo studio si basa esclusivamente su previsioni di farmacologia delle reti e docking molecolare in silico, che mancano di validazione sperimentale e clinica. Le soglie OB ≥30% e DL ≥0,18 sono standard nella farmacologia delle reti; tuttavia, potrebbero escludere composti potenzialmente attivi con bassa OB, come alcuni alcaloidi analgesici. L'uso di strutture predette da AlphaFold anziché strutture cristalline sperimentali per il docking molecolare rappresenta una limitazione. Studi futuri di docking dovrebbero validare queste previsioni utilizzando, ove possibile, strutture disponibili nel PDB. Indagini future includeranno esperimenti in vitro e in vivo per validare i bersagli e i percorsi identificati, seguiti da studi clinici per valutare l'efficacia terapeutica e la sicurezza dell'estratto di C. yanhusuo in pazienti con fibromialgia. In definitiva, miriamo a sviluppare una preparazione standardizzata di C. yanhusuo per l'applicazione clinica nella sindrome da fibromialgia.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interessi.

Dichiarazione sull'uso dell'IA: durante la preparazione di questo lavoro, gli autori hanno utilizzato Deepseek per la revisione linguistica e la verifica grammaticale. Tutti i contenuti assistiti dall'IA sono stati esaminati e rielaborati dagli autori, che si assumono piena responsabilità per la pubblicazione.

Ringraziamenti

Gli autori hanno dichiarato che non è stato ricevuto alcun sostegno finanziario per questo lavoro e/o la sua pubblicazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Database delle Strutture Proteiche AlphaFoldDeepMind & EMBL-EBIhttps://alphafold.ebi.ac.uk/Strutture 3D scaricate (PDB) delle proteine bersaglio principali utilizzate come recettori per il docking.
CB-Dock2Piattaforma online per il docking ciecohttps://cadd.labshare.cn/cb-dock2/Docking cieco basato su AutoDock Vina; identificazione delle tasche di legame, previsione delle conformazioni ed esportazione delle energie di legame più basse.
ChimeraXRisorsa UCSF per Biocomputazione, Visualizzazione e Informaticahttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Visualizzazione delle conformazioni tridimensionali di complessi proteina–ligando. Versione 1.1
CytoscapeConsorzio Cytoscapehttps://cytoscape.org/Costruzione e visualizzazione di reti farmaco–ingrediente–bersaglio–malattia e reti PPI; analisi topologica tramite Network Analyzer (classificazione per grado). Versione 3.7.2
GeneCardsIstituto Weizmann di Scienze, Israelehttps://www.genecards.org/Recupero di bersagli associati alla fibromialgia utilizzando la parola chiave “fibromialgia”; tutti i bersagli recuperati sono stati mantenuti senza ulteriore filtraggio per soglia.
LigPlusNon applicabilehttp://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/Generazione di diagrammi bidimensionali delle interazioni che mostrano legami a idrogeno e interazioni idrofobiche. Versione 2.3.1
PubChemBiblioteca Nazionale di Medicina (NCBI), USAhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/Recupero delle strutture 2D (SDF) dei 10 ingredienti più attivi da utilizzare come ligandi per il docking.
RFondazione R per la Computazione Statisticahttps://www.r-project.org/Analisi di arricchimento GO e KEGG eseguita con clusterProfiler; esclusi i percorsi di tipo "Malattie umane" e "Metabolismo". Versione 4.3.1
STRINGConsorzio STRING (EMBL, SIB, ecc.)https://string-db.org/Costruzione della rete PPI (Homo sapiens, valore di confidenza ≥0,400); esportazione in formato TSV per Cytoscape.
TCMSPUniversità Nord-Ovest A&F, Cinahttps://www.tcmsp-e.com/Recupero di tutti i componenti di C. yanhusuo; selezione degli ingredienti attivi (OB≥30%, DL≥0,18); ottenimento delle corrispondenti proteine bersaglio.
UniProtConsorzio UniProt (EBI, SIB, PIR)https://www.uniprot.org/Conversione delle proteine bersaglio nei simboli ufficiali dei geni (Homo sapiens). Versione 2025_01

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