La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

1. Gelatinizzare T75 beuta con una soluzione di 0,1% di gelatina e la piastra di incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ colture di tessuti incubatore durante la notte un giorno prima.
2. Estrarre le cellule MES da incubare, aspirare il terreno, lavare la coltura delle cellule ES con PBS, aggiungere la soluzione tripsina 0,05% per ricoprire il fondo del piatto (2 piastra ml/100mm).
3. Incubare a 37 ° C per circa 1 minuti, fino a quando le cellule sono muta fuori dal piatto.
   
4. Delicatamente triturare (pipetta su e giù) le cellule trypsinized quattro a sei volte per disperdere le cellule ES con una pipetta Pasteur collegato,. Trasferire le cellule ES dispersi in un tubo da 15 ml per centrifuga conica contenente preriscaldata (37 ° C) media MES.
   
5. Raccogliere le cellule per centrifugazione. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 ml di terreno MES e pipettare su e giù per formare una sospensione di cellule singole.
   
6. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone T75 preverniciato con 0,1% di gelatina e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per un'ora
   
   * Dopo un'ora, i fibroblasti hanno attaccato alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel terreno. Pipettare il medium per raccogliere le cellule staminali.
   
   
7. Spin le cellule a 1000 rpm per 5 minuti e aspirare al largo della media MES. Quindi aggiungere un altro 10 ml di medium di differenziazione MES e risospendere le cellule pipettando ripetitivo fino a quando non sembra essere una sospensione fine di cellule.
8. Contare le celle con un mezzo di differenziazione emocitometro utilizzare per diluire la sospensione di cellule staminali ad una concentrazione da 400 a 500 cellule per 20 ul (20ul/drop) in una bacinella sterile.
9. Sollevare il coperchio, capovolgere delicatamente e collocarlo sulla parte superiore del piatto che contiene 10 ml di PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, fare file di 20 ul gocce sul up-trasformato superficie interna del coperchio del piatto coltura di tessuti.
10. Con attenzione la capsula in incubatrice per 2 giorni. Dopo due giorni, con attenzione capovolgere la piastra di copertura, aspirare 180 media ul differenziazione fresco e mettere alcune gocce nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ultrabassa attaccamento. Poi la goccia pick-up con le gocce pipetta e il trasferimento, uno ad uno, alla piastra a 96 pozzetti. Posizionare le piastre in indisturbati per 3 giorni incubatrice.
    
11. Cappotto ciascun pozzetto di una 48-e piastra di coltura tissutale con 300ul di 0,1% di gelatina. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra di una notte a 37 ° C un giorno prima prima del trasferimento della Ebs.
    
12. Il giorno dopo, aspirare la gelatina dal 48-pozzetti. Poi aggiungere 300 ul di medio differenziazione in ciascun pozzetto. Trasferire la EB dal 96 pozzetti alle 48 e gelatina rivestite piatti uno per uno. Modificare il medium il giorno dopo e quindi modificare il medium a giorni alterni per mantenere le cellule.
    
13. Spontanea contrazioni cardiaomyocyte dovrebbe essere evidente entro 7 giorni.

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.