Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Sommario

L'osservazione microscopica-droga suscettibilità (MODS) è un test a basso costo, low-tech strumento di alte prestazioni di rilevamento della tubercolosi (TB) e la tubercolosi multi-resistente (MDRTB). Questo video descrive il liquido MODS mezzi metodo cultura.

Abstract

I pazienti con tubercolosi polmonare attiva (TB) infettare altre 10-15 persone l'anno, rendendo la diagnosi di TBC attiva essenziale sia per curare il paziente e prevenire nuove infezioni. Inoltre, la comparsa di tubercolosi multiresistente (MDRTB) significa che il rilevamento della resistenza ai farmaci è necessario per fermare la diffusione di ceppi resistenti ai farmaci. L'osservazione microscopica-droga suscettibilità (MODS) è un test a basso costo, low-tech strumento ad alte prestazioni di rilevamento della tubercolosi e MDRTB. Il saggio MODS si basa su tre principi: 1) Mycobacterium tuberculosis (MTB) cresce più velocemente in mezzi liquidi che su terreni solidi 2) la crescita MTB microscopici possono essere rilevati in precedenza in mezzi liquidi che aspettare l'aspetto macroscopico delle colonie su terreni solidi, e che la crescita è caratteristica della MTB, che permette di distinguerlo da micobatteri atipici contaminazioni batteriche o fungine o 3) i farmaci isoniazide e rifampicina può essere incorporato nel saggio MODS per consentire la simultanea rilevazione diretta di MDRTB, ovviando alla necessità di una sottocultura di effettuare indiretta farmaco test di sensibilità. Concorrenti diagnostica attuali sono ostacolati da una bassa sensibilità con striscio dell'espettorato, ritardo prolungato fino diagnosi con una solida cultura dei media, dei costi proibitivi con gli attuali metodi di liquido cultura dei media, e la necessità di fare sottocultura per i test indiretti sensibilità ai farmaci per rilevare MDRTB. Al contrario, il non proprietario metodo MODS ha una sensibilità elevata per la tubercolosi e MDRTB, è un metodo di cultura relativamente rapido, fornisce contemporaneamente test di sensibilità farmaco per MDRTB, ed è accessibile a risorse limitate a poco meno di 3 dollari per i test per la TBC e MDRTB.

Protocollo

1. Preparare soluzioni di
   1. Tampone fosfato magazzino
      1. Mescolare 950ml di soluzione di sodio bibasico (9.47g di fosfato di sodio dibasico sciolto in 1000 ml di acqua distillata) con 950ml di soluzione di potassio fosfato monobasico (9.07g di fosfato monobasico di potassio disciolti in 1000 ml di acqua distillata) e mescolare; trattenere 50ml di ciascuna soluzione per regolare pH, se necessario,
      2. Regolare il pH a 6,8 ± 0,2: aggiungere soluzione di fosfato di sodio bibasico per aumentare il pH, aggiungere la soluzione di potassio fosfato monobasico per abbassare il pH
      3. Autoclave a 121-124 ° C per 15 minuti per sterilizzare
      4. Piastra un'aliquota 100μl della soluzione tampone fosfato su agar nutriente in piastre di Petri e incubare a 37 ° C per 48 ore per confermare la sterilità
      5. Conservare in frigorifero a 2-8 ° C fino a un mese
         
         Nota: ogni campione di espettorato richiede 10 ml di tampone fosfato
         
   2. Decontaminazione magazzino
      1. Combina volumi uguali di soluzione di idrossido di sodio (8.0g di idrossido di sodio sciolto in 200 ml di acqua distillata sterile) e citrato di sodio (5,8 g di sodio citrato in 200ml di acqua distillata sterile distillata)
      2. Mescolare e autoclave a 121-124 ° C per 15 minuti
      3. Conservare in frigorifero a 2-8 ° C fino a un mese
         
         Nota: ogni campione di espettorato richiede 2 ml di brodo di decontaminazione
         
   3. Cultura dei media magazzino
      1. In 900 ml di acqua distillata sterile aggiungere 3.1ml di glicerolo e 1.25g di casitone e di 5.9g di polvere medio 7H9; mescolare con agitazione costante fino a completo scioglimento
      2. Autoclave a 121-124 ° C per 15 minuti
      3. Raffreddare e dividere il medium sterile in aliquote a 4,5 ml sterili 16x tubi di 100 mm di vetro per la preparazione dei campioni, e 10.8ml aliquote per la preparazione di soluzioni di antibiotici e controlli interni
      4. Incubare a 37 ° C per 48 ore per verificare la sterilità (mancanza di torbidità)
      5. Conservare a 2-8 ° C con tappo ben chiuso per un massimo di un mese
         
         Nota: ogni campione di espettorato richiede una provetta contenente 4,5 ml di medium 7H9
         
   4. Soluzioni stock antibiotico
      1. A. isoniazide magazzino (8 mg / ml)
         1. Sciogliere 20 mg di isoniazide completamente in 2,5 ml di acqua distillata sterile
         2. Filtrare con filtro per siringa 0.2μm solvente acquoso
         3. Conservare in aliquote 20μl in sterili micro tubi di centrifugazione a -20 ° C fino a 6 mesi
            
            Nota: ogni aliquota memorizzata 20μl è sufficiente per un massimo di 100 campioni (tra cui gli sprechi)
            
      2. B. Rifampicina magazzino (8 mg / ml)
      1. Sciogliere rifampicina 20mg completamente in 1.25ml DMSO
      2. Aggiungi 1.25ml acqua sterile distillata e mescolare
      3. Filtrare con filtro siringa 0.2μm per solventi organici
      4. Conservare in aliquote 20μl in microprovette sterili a -20 ° C fino a 6 mesi
         
         Nota: ogni aliquota memorizzata 20μl è sufficiente per un massimo di 100 campioni (tra cui gli sprechi)
         
2. Preparare le soluzioni di lavoro
   1. Decontaminazione soluzione di lavoro
      1. Sciogliere 0,1 g di cristalli NALC in ogni 20ml di soluzione di decontaminazione richiesto
         
         Nota: Ogni campione deve 2 ml di soluzione di decontaminazione
         
         Nota: Eliminare le NaOH-NALC soluzione di decontaminazione che rimane inutilizzato dopo 24 ore come NALC perde la sua attività mucolitica nel tempo
         
   2. Soluzione cultura mediatica di lavoro
      1. Di cui:
         1. 1 tubo di media 7H9 per ogni campione di espettorato per essere trasformata, maggiorato di 1 tubo aggiuntivo per ogni piatto (per la colonna di controllo negativo)
         2. 2 tubi di medio 7H9 per i controlli positivi (3 se ceppi monoresistant sono utilizzati)
         3. 1-2 tubi con 7H9 10.8ml per la preparazione di una soluzione antibiotica
      2. Aggiungere 0,5 ml OADC al 4,5 ml di 7H9 in ogni provetta
      3. Aggiungi OADC 1,2 ml di tubi con 10.8ml 7H9
      4. Mettere da parte 2 tubi con 5ml 7H9-OADC per i controlli positivi, e tubo (s) con 12ml 7H9-OADC da utilizzare per la preparazione di una soluzione antibiotica (questi programmi non richiedono PANTA)
      5. Ricostituire PANTA e aggiungere 0,1 ml per ogni provetta e per i tubi di controllo negativo (7H9-OADC-PANTA: volume = 5.1ml)
         
         Nota: media Completo di PANTA (7H9-OADC-PANTA) viene utilizzato per campioni di espettorato e controlli negativi; uso 7H9-OADC senza PANTA per i controlli positivi e per la preparazione di una soluzione antibiotica
         
   3. Antibiotico soluzioni di lavoro
      1. 1. Vedere la Figura 1 per la procedura per rendere la soluzione antibiotica che lavorano in un inutilizzato 24-pozzetti
         
         Nota: Per ottenere risultati accurati suscettibilità, le concentrazioni finali antibiotico sono critici. La seguente procedura è adatto per laboratories dotato di micropipette. Se non sono disponibili micropipette, siringhe tubercolina può essere utilizzato con una diversa serie di diluizioni descritto nel Manuale dell'utente Appendice 3 a modsperu.org
         
         Nota: non ri-congelare o riutilizzo di lavoro antibiotico o soluzioni stock dell'attività del farmaco può essere perso Eliminare tutte le soluzioni non utilizzate antibiotici alla fine del trattamento in giornata, figura 1.. Rendere le soluzioni antibiotiche di lavoro (da Guida dell'utente al modsperu.org)
         
3. L'espettorato del campione e la piastra di preparazione
   1. Decontaminazione
      1. 2ml luogo di campione di espettorato in un tubo da centrifuga 15 ml (se meno, portare a 2 ml con tampone fosfato, se più, utilizzare solo 2 ml)
      2. Aggiungere 2 ml di NaOH-NALC soluzione
      3. Tappo e tubo vortex per 20 secondi; invertire tubo per assicurare NaOH-NALC contatti soluzione l'intera superficie interna del tubo e coperchio
      4. Lasciate riposare per un minimo di 15 minuti - può prolungare di qualche minuto, se il campione è particolarmente viscoso. Per evitare un eccesso di trattamento, non dovrebbe superare i 20 minuti
      5. Riempire il tubo 14 ml con tampone fosfato (pH 6,8) per neutralizzare alcali e terminare il processo di decontaminazione, e mescolare bene invertendo il tubo di 4 volte
      6. Centrifugare a 3000 g per 15 minuti (vedi appendice 2 nella Guida al modsperu.org per l'equazione di rotazioni al minuto necessario per raggiungere 3000 g)
      7. Versare cautamente fuori surnatante in un contenitore di rifiuti liquidi con ipoclorito di sodio al 10% o altro disinfettante appropriato e conservare il pellet
   2. Preparazione della sospensione campione finale e di backup
      1. Utilizzando 7H9-OADC-PANTA (dal tubo contenente 5.1ml), risospendere il campione di pellet in un volume totale di 2 ml in provetta con una pipetta Pasteur, mescolare bene
      2. Togliere 1 ml di sospensione dei campioni e conservare in una provetta a 2-8 ° C come backup
      3. Aggiungere il 1ml seconda sospensione del campione per il tubo con il restante 7H9-OADC-PANTA, mescolare bene. Questa è la soluzione campione finale pronto per la placcatura
   3. Posizionamento sospensioni campione nel 24-pozzetti
      1. 900μl luogo della sospensione campione finale in ciascuno dei 4 pozzetti di una colonna del 24-pozzetti
      2. Ripetere con campioni supplementari fino a quando tutte le colonne del piatto, ad eccezione di Colonna 3, sono piene (o fino a quando tutti i campioni sono placcati)
      3. 900μl Luogo di 7H9-OADC mezzo senza il campione in 4 pozzi di colonna 3 di ogni piatto del campione (negativo dei controlli interni)
   4. L'aggiunta di antibiotici ai campioni
      1. Utilizzando una pipetta multicanale, con attenzione riempire 4 punte con 100μl dai pozzi con le soluzioni di lavoro 7H9-OADC e antibiotico (colonna 2 nella diluizione antibiotico piastra-vedi Figura 1)
      2. Aggiungere le aliquote 100μl al 1 pozzi colonna con soluzioni campione 900μl senza toccare piastra o campione
      3. Ripetere fino a quando tutte le colonne hanno ricevuto il 100μl aggiuntivo di media (drug-free pozzi) o soluzioni antibiotiche (compresa colonna di controllo negativo 3)
      4. Chiudere la piastra con il coperchio e mettere in un sigillabile politene (Ziplock) sacchetto e guarnizione (borsa non si apre di nuovo da questo punto in poi)
      5. Incubare a 37 ° C (CO ₂ arricchimento non è necessario)
4. Controllo qualità
   1. Controlli negativi sono eseguiti su ogni piatto. La presenza di una crescita in uno dei pozzi nella colonna di controllo negativo indica la contaminazione crociata, quindi l'intera piastra deve essere scartata ed i campioni ri-plated.
   2. I controlli positivi sono eseguiti su un piatto a parte alla fine della giornata. Un pieno di droga sensibili ceppo viene eseguito in una colonna e un ceppo resistente a INH e RIF viene eseguito in un'altra colonna. Se vi è preoccupazione per l'esecuzione un ceppo MDR, sia un ceppo INH monoresistant e un ceppo RIF monoresistant può essere eseguito al posto dei ceppi sensibili e MDR. Tutti i controlli positivi dovrebbero avere una crescita nel drug-free pozzi per dimostrare che la crescita dei supporti. Per dimostrare che le concentrazioni di farmaco siano corrette, il ceppo sensibili non dovrebbero crescere in INH o RIF pozzi, ma il ceppo MDR dovrebbe crescere anche crescere nella INH e RIF pozzi.
      
5. Piastra di lettura
   1. Con il giorno della placcatura come "giorno 0", lettura targhe inizia il 5 ° giorno, e se negativo al giorno 5 lettura avviene ogni giorno (o giorni alterni a seconda del carico di lavoro) fino al giorno 14 e poi ogni 2-3 giorni dal giorno 15 -21. Le piastre sono esaminati in unainvertito microscopio ottico con l'obiettivo 10x
   2. Una cultura positiva è quella in cui ci sono due o più unità formanti colonia (> 2 CFU) in entrambi i farmaci senza pozzi. All'inizio la crescita dei micobatteri sembra piccolo virgole curve o spirali (giorni 5-9). Formazione di colonie di solito progredisce a "corde" o "grovigli" (vedi libreria di immagini su modsperu.org)
   3. Il giorno una cultura positiva nei 2 drug-free pozzi, il farmaco contenente i pozzi devono essere lette. Qualsiasi crescita in presenza di un farmaco indica che la resistenza al farmaco.
      
      Nota: Se la lettura del farmaco contenente pozzi viene fatto> 1 settimana dopo una cultura positiva è notato nel drug-free pozzi, questo non può rappresentare la resistenza di rottura attraverso la crescita è occasionalmente
      
   4. I campioni che non sono positivi dopo 21 giorni sono considerati colture negative
   5. Nuvolosità dei pozzi è il risultato della crescita eccessiva contaminazione, mentre la crescita dei micobatteri non determina nuvolosità
   6. Al termine di 21 giorni culture può essere scartata. Culture rimanere nel loro sacchetti sigillati e sono disposti in sacchetti autoclave e sterilizzati in autoclave a 121-124 ° C per 45-60 minuti

Discussione

Il saggio MODS è rivolto a risorse limitate. Per la prima volta, MODS porta la capacità per una rapida individuazione coltura liquida di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente a risorse limitate a poco meno di $ 3 per prova. MODS è un non-proprietarie, iterativo metodologia, e la comunità MODS è sempre interessata a miglioramenti che altri laboratori sono riusciti a fare.

Una preoccupazione ricorrente è la biosicurezza di liquido cultura mediatica di tubercolosi, perché i liquidi possono essere versato o aerosol. Crediamo che ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Frigorifero/congelatore	Attrezzatura			per conservare brodo pre-preparato e scorte di antibiotici
Attrezzatura			vortice	per facilitare la decontaminazione dell'espettorato
Attrezzatura			centrifughe	per la concentrazione di espettorato; in grado di raggiungere i 3000 g; d– non è necessario essere refrigerato, ma DEVE essere biosicuro (i secchi possono essere sigillati)
Incubatore (37 gradi C)	Attrezzatura			per la coltura; non è necessario essere arricchito di CO2
Microscopio a luce invertita	Microscopio			per leggere le piastre MODS
Autoclave	Attrezzatura			per sterilizzare terreni, PBS e piastre usate
Attrezzatura				per bilanciereper pesare isoniazide, rifampicina e NALC
brodo Middlebrook 7H9 (Difco)	Reagente	Fisher Scientific	DF0713-17-9	500gr/bottiglia; terreno di coltura base
Casitone (caseina digest pancreatica)	Reagente	Fisher Scientific	DF0259‐ 17‐ 9	500gr/bottiglia; terreno di coltura a base
di glicerolo (glicerina) reagente liofilizzato		Sigma-Aldrich	G‐ 33‐ 500	500ml/flacone; terreno di coltura base
PANTA (Miscela antibiotica liofilizzata BD)	Reagente	Fisher Scientific B4345114		6 flaconi/confezione; integratore di terreni antibiotici
OADC (Middlebrook OADC enrichment BD)	Reagente	Fisher Scientific	B11886	10 x 20ml/confezione; integratore di terreni nutrizionali
Dimetil solfossido (Hibri-Max)	Reagente	Sigma-Aldrich	D-2650	100ml/flacone; per la preparazione del brodo di rifampicina
Stock di antibiotici: isoniazide	Reagente	Sigma-Aldrich	I-3377	50gr/flacone; test di sensibilità diretta
Stock di antibiotici: reagente rifampicina		Sigma-Aldrich	R-3501	1gr/flacone; test di sensibilità diretta
Idrossido di sodio (pellet)	Reagente	Sigma-Aldrich	221465	500gr/bottiglia; Decontaminazione dell'espettorato
Citrato di sodio (sale trisodico diidrato)	Reagente	Sigma-Aldrich	S-4641	500gr/flacone; decontaminazione dell'espettorato
Reagente N-acetil-L-cisteina		Sigma-Aldrich	A-7250	50gr/flacone; decontaminazione dell'espettorato
Fosfato di potassio Cristallo monobasico. KH2PO4	Reagente	Sigma-Aldrich	P0662	500gr/flacone; decontaminazione dell'espettorato
Sodio Fosfato Bibasico, anidro. Na2HPO4	Reagente	Sigma-Aldrich	S0876	500gr/flacone; decontaminazione dell'espettorato
Ipoclorito di sodio	Reagente	candeggina domestica	per smaltire i rifiuti contaminati
15 ml (polipropilene 15 ml Falcon 35‐ 2096)	Materiale di consumo	Fisher Scientific	14‐ 959‐ 49B	500ea/caso; per la decontaminazione e la concentrazione dell'espettorato
Piastre a 24 pozzetti (Piastre Tissue 24 pozzetti BD Falcon 35‐ 3047)	Materiale di consumo	Fisher Scientific	08-772-1	50 piastre/cassa; per coltura e lettura
Sacchetti di polietilene sigillabili 6 X 6 “ (chiusura lampo)	Materiale di consumo			per la biosicurezza per contenere una piastra da 24 pozzetti Provette
di vetro con coperchio (16 x 100 mm e 18 x 145 mm)	Materiale di consumo	VWR international	47729-583	500 provette/cassa; per conservare aliquote di brodo preparato
Provette per microcentrifuga con tappo a vite (1,5 ml)	Materiale di consumo	Fisher Scientific	05‐ 669‐ 22	1000ea/cassa; per conservare aliquote di scorte di antibiotici
0,22μ m filtri (solventi acquosi) Filtro per siringa Millex blue	Consumabile	Fisher Scientific	SLGL 025 OS	50 unità/cassa; per filtrare le scorte di antibiotici
0,22μ m filtri (solventi organici) Filtro per siringa Millex giallo	Consumabile	Fisher Scientific	SLGV 033 RS	50 unità/cassa; per filtrare le scorte di antibiotici
Pipette monouso Pasteur in vetro borosilicato 9″	Materiale di consumo	Fisher Scientific	13‐ 678‐ 20C	720ea/cassa; miscelare PANTA con la miscela di terreni
Punte barriera per aerosol 1000‐ 1300μ l	Materiale di consumo	Fisher Scientific	02‐ 707‐ 51	1000ea/pk; per erogare il terreno nella piastra
USA Scientific Tips One 1‐ 200μ l punte gialle	Consumabile	Fisher Scientific	1111‐ 0006	1000 puntali/sacchetto; per diluire le scorte di antibiotici