Questo è inteso come una introduzione alla registrazione di patch clamp da ovociti di Xenopus laevis. Esso copre la rimozione della membrana vitellina, la formazione di un sigillo gigaohm (gigaseal), e la conversione facoltativa delle patch al di fuori-out topologia.
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Articolo metodologico
Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dal suo sviluppo da Sakmann e Neher 1, 2, la patch clamp si è affermata come una tecnica estremamente utile per la misurazione elettrofisiologica dei canali ionici singole o multiple nelle cellule. Questa tecnica può essere applicata a canali ionici, sia il loro ambiente nativo ed espresso in cellule eterologhe, come gli ovociti raccolti dalla rana africana artigliata, Xenopus laevis. Qui, descriviamo la consolidata tecnica di registrazione patch clamp da ovociti di Xenopus. Questa tecnica viene utilizzata per misurare le proprietà dei canali ionici espressi sia nelle popolazioni (macropatch) o singolarmente (un solo canale di registrazione). Ci concentriamo sulle tecniche per ottimizzare la qualità della preparazione degli ovociti e la generazione di tenuta. Con tutti i fattori ottimizzato, questa tecnica dà una probabilità di generazione sigillo di successo superiore al 90 per cento. Il processo può essere ottimizzato in modo diverso da ogni ricercatore sulla base dei fattori lui o lei trova la più importante, e vi presentiamo l'approccio che hanno portato al più grande successo nelle nostre mani.
Protocollo
Parte 1: Rimozione della membrana vitellina
- Preparare due serie di pinze. Noi preferiamo n ° 5 pinze, dove un gruppo è stata leggermente affilato con una lima. Anche preparare una pipetta di vetro trasferimento da taglio e la lucidatura fuoco un 7 "pipetta Pasteur.
- Consigliato: Per evitare che gli ovociti di scivolare, tagliare un cerchio di griglia (1 quadrati mm) e colla nel fondo di un piatto 60 millimetri Petri. Questo piatto può essere riutilizzata all'infinito se tenuto pulito tra usi.
- Riempire la piastra Petri con una soluzione a metà strada iperosmotico (vedi ricetta) e posto sotto un microscopio da dissezione. ....
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Discussione
Ci sono molti parametri di registrazione elettrofisiologica non discusso qui. Installazione impianto di perforazione, il rumore del sistema di gestione, espressione dei canali e protocolli di registrazione sono anche fondamentali per buoni risultati sperimentali.
Nella nostra esperienza, questi sono i parametri più critici per formare guarnizioni affidabile: gli ovociti di qualità, eliminando la membrana vitellina velocemente (aka, "peeling"), utilizzare pipette appena tirato al riparo dalla polvere, pipette liscio, pressi.......
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Ringraziamenti
Ricetta soluzione restringimento è dal laboratorio di RW Aldrich. Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Amplificatore per tecnica del patch clamp & Software | Strumento | HEKA Instruments | EPC-10 | o altro dispositivo analogo (ad es. HEKA EPC-9 o Axopatch 200B) |
| Pinzette n. 5 (due paia) | Strumento | Fine Science Tools | ||
| Soluzione per il restringimento dell'ovocita | Reagente | Ingrediente In mMN-metil-D-glucammina 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Acido aspartico 220KCl 2pH 7,4 con N-metil-D-glucammina | ||
| maglia intrecciata | 800 µm | Spectrum Labs | 146481 |
Riferimenti
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Sackmann, B., Neher, E. Single-channel Recording. , Plenum Press. New York. (1983).
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Ristampe e permessi
