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Visualizzazione dei microrganismi del suolo tramite il test su vetrino a contatto e microscopia

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Visualizing Soil Microorganisms via the Contact Slide Assay and Microscopy

2.3: Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

2.10: Water Quality Analysis via Indicator Organisms

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10:04 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz

Il suolo comprende il sottile strato sulla superficie terrestre, contenente fattori biotici e abiotici che contribuiscono alla vita. La porzione abiotica comprende particelle inorganiche di dimensioni e forma variabili che determinano la consistenza del suolo. La porzione biotica incorpora residui vegetali, radici, materia organica e microrganismi. L’abbondanza e la diversità dei microbi del suolo è espansiva, poiché un grammo di terreno contiene 10^{batteri 7-8, 10 6-8} actinomiceti,^{10 funghi 5-6,} ^{10 3} lieviti,^{10 4-6} protozoi,^{10 3-4} alghe e 5³ nematodi. Insieme, i fattori biotici e abiotici formano architetture attorno alle radici delle piante, note come rizosfera, che forniscono condizioni favorevoli per i microrganismi del suolo.

I fattori biotici e abiotici promuovono la vita nei suoli. Tuttavia, contribuiscono anche a dinamiche stressanti che limitano i microbi. Lo stress biotico comporta la competizione tra la vita per adattarsi e sopravvivere in condizioni ambientali. Ad esempio, i microbi possono secernere sostanze inibitorie o tossiche per danneggiare i microrganismi vicini. Penicillium notatum è un fungo famigerato, in quanto riduce la competizione per i nutrienti producendo un antimicrobico, che gli esseri umani raccolgono per creare la penicillina farmaceutica. Gli stress abiotici derivano da proprietà fisiche o chimiche che limitano la sopravvivenza microbica, come luce, umidità, temperatura, pH, sostanze nutritive e consistenza.

Principles

Osservare direttamente le interrelazioni tra organismi del suolo, particelle e comportamenti all’interno di ambienti del suolo diversi è difficile, ma il test del vetrino di contatto, noto anche come tecnica del vetrino sepolto, sviluppato da Rossi et al. (1936) fornisce un punto di vista istantaneo nella microbiologia del suolo. Questo metodo è utile per osservare funghi del suolo, actinomiceti e batteri tramite microscopia. Tuttavia, non è destinato a quantificazioni microbiche, in quanto implica solo una piccola porzione di un ambiente eterogeneo più grande.

Questo metodo viene facilmente eseguito seppellendo un vetrino nel terreno per diversi giorni, quindi fissando i microrganismi sul vetrino con acido acetico. I microbi sono colorati con colorante Rose Bengal e osservati al microscopio utilizzando l’immersione in olio sull’obiettivo 100X. Si possono distinguere tre gruppi microbici, poiché i batteri appaiono come piccole forme arrotondate, i filamenti actinomiceti come stringhe sottili e le ife fungine come fili spessi. Nel suolo, quasi tutti i batteri sono più piccoli e più rotondi di quelli in coltura pura a causa dello stress nutrizionale, che provoca restringimento e arrotondamento per un rapporto superficie/volume più favorevole. Le forme scure irregolari non macchiate sono particelle di terreno. Diversi emendamenti nutrizionali possono essere aggiunti al suolo per fornire fonti di carbonio e glucosio che promuovono la crescita e le interazioni microbiche. Questa tecnica consente una facile osservazione della microbiologia del suolo e aiuta a identificare diversi organismi presenti nell’ambiente.

Procedure

1. Preparazione del microcosmo del scivolo del suolo

Raccogliere il terreno del giardino dalla superficie (profondità 0-6 “) e pesare 150 g di terreno in due tazze separate.
1. Se il terreno ha un’alta densità di materia organica, pesare 100 g.
Etichettare una tazza “Trattamento” e l’altra “Controllo”.
Calcola la quantità di acqua necessaria per alterare il contenuto di umidità.
1. Il contenuto di umidità è spesso vicino alla capacità del campo.
Misurare la quantità di acqua distillata con un cilindro graduato.
Versare la quantità di acqua distillata in due flaconcini.
Etichettare una fiala “Trattamento” e l’altra “Controllo”.
Modificare l’acqua nel flaconcino “Trattamento” con glucosio sufficiente per una concentrazione finale di glucosio nel suolo dell’1%, in base a una base di peso secco nel terreno “Trattamento”.
Aggiungere 200 mg di NH₄NO₃ nel flaconcino “Trattamento” e mescolare per sciogliere le modifiche. Il nitrato funge da fonte di azoto di nutrienti per i microbi del suolo.
Non modifichi il flaconcino “Controllo”.
In piccole aliquote di circa 50 mg, mescolare il contenuto del flaconcino “Trattamento” nella tazza “Trattamento”. Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
In piccole aliquote, mescolare il contenuto del flaconcino “Control” nella tazza “Control”. Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
Etichettare quattro vetrini per microscopio puliti: due vetrini “Trattamento” e due vetrini “Controllo”.
Inserire i due vetrini “Trattamento” nella coppa del terreno “Trattamento” e inserire i due vetrini “Control” nella tazza del terreno “Control”. Lasciare 2 cm di ogni diapositiva sporgente sopra la superficie del terreno e assicurarsi di lasciare uno spazio tra le due diapositive.
Coprire le tazze con pellicola trasparente e fissarla con un elastico.
Forare l’involucro più volte per consentire l’aria, ma evitare comunque un’eccessiva evaporazione.
Registra il peso di entrambe le tazze.
Incubare le tazze piene di terreno a temperatura ambiente in un’area designata / incubatore per 7 giorni.

2. Colorazione e microscopia a vetrino

Registra il peso di entrambe le tazze.
Calcola l’umidità del suolo al momento della rimozione della diapositiva.
Rimuovere le due diapositive da ciascuna tazza premendo ciascuna diapositiva in posizione inclinata e ritirandosi in modo che la faccia superiore della diapositiva non venga disturbata.
Identificare e contrassegnare il lato della diapositiva da macchiare e osservare.
Picchiettare delicatamente le diapositive sul piano di lavoro per rimuovere le particelle di terreno di grandi dimensioni.
Usando un asciugamano di carta umido, pulire la faccia inferiore delle diapositive. Asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
Indossando occhiali protettivi e tenendo ogni vetrino con una pinna, immergere i vetrini in acido acetico al 40% (v / v) per 1-3 minuti sotto un cappa aspirante.
Lavare via l’acido in eccesso sotto un leggero getto d’acqua.
Usando una bottiglia contagocce, coprire la superficie dei vetrini con Rose Bengal fenolico. Sostenere la diapositiva su un rack di colorazione sopra un contenitore per catturare la macchia in eccesso. Fare attenzione, non lavare con forza che potrebbe rimuovere i microrganismi dalla superficie dei vetrini.
Macchiare i vetrini per 5-10 minuti. Non lasciare asciugare il vetrino. Aggiungi più macchie se necessario.
Lavare delicatamente le diapositive per rimuovere le macchie in eccesso.
Lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
Utilizzando l’obiettivo di immersione in olio, osservare il vetrino utilizzando un microscopio (Figura 1).

Figura 1. Un vetrino al microscopio.

Le relazioni tra i vari organismi e i componenti inorganici nel suolo sono vitali per comprendere i cambiamenti del suolo e gli stress ambientali, ma non possono essere chiarite senza una visualizzazione diretta.

Il suolo, un sistema estremamente complesso, è un habitat per milioni di organismi diversi. La regione del suolo direttamente intorno alle radici delle piante in particolare, chiamata rizosfera, contiene una serie unica di organismi che sono direttamente influenzati dalle radici delle piante.

La componente abiotica, o non biologica, della rizosfera comprende particelle inorganiche di dimensioni e forma variabili che contribuiscono alla consistenza del suolo. La porzione biotica, o biologica, comprende residui vegetali, radici, materia organica e microrganismi.

Questo video dimostrerà la visualizzazione diretta dei componenti biotici e abiotici del suolo della rizosfera, al fine di comprendere i fattori che influenzano i cambiamenti del suolo e prevedere gli stress ambientali.

Gli organismi microscopici tendono a risiedere nell’acqua situata all’interno dei pori del suolo. I batteri sono tra gli organismi più semplici e abbondanti presenti nel suolo e si trovano in molte morfologie tra cui sfere chiamate cocchi, bastoncelli chiamati bacilli e forme filamentose.

Le specie fungine, come lieviti e muffe, sono i secondi organismi più abbondanti nel suolo. Lavorano per decomporre e riciclare la materia organica morta. I funghi filamentosi microscopici differiscono visivamente dagli altri microrganismi, in quanto possiedono ife lunghe e ramificate che rilasciano spore.

L’osservazione diretta delle relazioni tra questi organismi è impegnativa, ma può essere ottenuta utilizzando un test di vetrino a contatto. Questo metodo viene eseguito immergendo un vetrino nel terreno per diversi giorni e consentendo agli organismi e alle particelle del suolo di adsorbirsi sulla superficie del vetrino.

La diapositiva viene quindi rimossa ad angolo per evitare sbavature della superficie. I microbi sono fissati con acido acetico e colorati con macchia Rose Bengal per consentire la visualizzazione tramite microscopia ottica.

Ora che hai compreso i principi alla base della tecnica di analisi del vetrino a contatto, diamo un’occhiata al processo in laboratorio.

Per prima cosa, raccogli il terreno del giardino superficiale e trasferisci il terreno in laboratorio. Pesare 150 g di terreno nei 2 contenitori separati. Un contenitore deve essere etichettato come campione di trattamento, che sarà modificato con sostanze nutritive per incoraggiare una rapida proliferazione degli organismi. Etichettare l’altro come controllo, che rimarrà invariato.

Calcola il contenuto di acqua nel terreno, utilizzando la tecnica mostrata nel video Determinazione del contenuto di umidità nel suolo di questa raccolta. Sulla base di questo calcolo, determinare la quantità di acqua nel terreno su una base di peso secco. Ora calcola la quantità di acqua che deve essere aggiunta per dare un contenuto di umidità del suolo del 15%. Questo porta l’umidità alla capacità del campo, ottimale per la crescita dei microrganismi.

Misurare la quantità calcolata di acqua distillata utilizzando un cilindro graduato. Versare il volume d’acqua calcolato in ciascun contenitore. Sulla base del peso secco precedentemente determinato del terreno, calcolare la quantità di glucosio necessaria per ottenere una concentrazione finale di glucosio nel suolo dell’1% in massa, utilizzando la base del peso secco. Pesare questa quantità di glucosio e aggiungerla solo al contenitore di trattamento.

Pesare 200 mg di nitrato di ammonio, quindi aggiungerlo solo al contenitore di trattamento. Il nitrato di ammonio funge da fonte di nutrienti azotati per i microbi del suolo. Mescolare la miscela di terreno, glucosio e nitrato di ammonio nel contenitore.

Quindi, etichettare 4 vetrini per microscopio puliti: due come trattamento e due come controllo. Inserire i due vetrini di trattamento nel contenitore del terreno di trattamento. Lasciare una sezione di ogni diapositiva esposta sopra la superficie del terreno e assicurarsi che vi sia uno spazio tra le due diapositive.

Inserire le due diapositive di controllo nel contenitore del terreno di controllo nello stesso modo. Coprire le tazze con un involucro di plastica e fissare con un elastico. Forare più volte l’involucro di plastica per consentire il trasferimento d’aria, ma evitare comunque un’eccessiva evaporazione.

Infine, pesare entrambe le tazze, registrarne il peso e incubarle in un’area designata a temperatura ambiente per sette giorni.

Dopo l’incubazione di sette giorni, calcola il contenuto di umidità del suolo pesando le tazze del terreno. Determinare se il peso è stato perso a causa dell’evaporazione dell’acqua e sostituire l’acqua se necessario.

Rimuovere l’involucro di plastica dal contenitore e rimuovere i due vetrini dal terreno premendo ogni diapositiva in posizione inclinata e ritirandosi in modo che la faccia superiore della diapositiva sia indisturbata.

Picchiettare delicatamente le diapositive per rimuovere le particelle di terreno di grandi dimensioni. Usando un asciugamano di carta umido, pulire la faccia inferiore delle diapositive. Lasciarli asciugare a temperatura ambiente in una cappa aspirante. Una volta asciutto, raccogliere un vetrino con una pinica e immergerlo in acido acetico per 1-3 minuti.

Risciacquare la parte superiore del vetrino con un leggero flusso di acqua distillata per rimuovere l’acido in eccesso. Ripetere questi passaggi per tutte le diapositive. Lasciare asciugare all’aria le diapositive.

Sostenere la diapositiva su un rack di colorazione sopra un contenitore per catturare il colorante in eccesso. Usando un contagocce, coprire delicatamente la superficie di ogni diapositiva con colorante fenolico Rose Bengal. Lasciare macchiare le diapositive per 5-10 minuti, avendo cura di aggiungere più colorante secondo necessità per mantenere le diapositive bagnate. Risciacquare delicatamente i vetrini con acqua per rimuovere le macchie in eccesso e lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente.

Esaminare i vetrini su un microscopio ottico, utilizzando un obiettivo di immersione in olio. Il terreno trattato avrà più microbi del suolo.

Le interazioni spaziali tra organismi fungini e batterici nei tipici campioni di suolo possono essere facilmente visualizzate. Le particelle di suolo mostrano forme scure irregolari.

Gli organismi fungini mostrano spesse ife filamentose, mentre gli actinomiceti mostrano sottili ife filamentose.

I batteri si trovano come piccoli cocchi o forme di bastoncello, tipicamente in ciuffi, particelle di terreno o ife fungine di rivestimento.

L’isolamento diretto degli organismi dal suolo è importante per la comprensione delle caratteristiche del suolo e dell’ambiente.

I nematodi entomopatogeni sono vermi rotondi microscopici che parassitano gli insetti. Sebbene non siano visualizzati nel test del vetrino di contatto, possono essere isolati dai campioni di terreno raccolti, come mostrato in questo esempio.

In primo luogo, i nematodi sono stati innescati nel terreno usando insetti identificati dall’esame visivo. I nematodi sono stati isolati dall’esca degli insetti morti, posizionando gli insetti morti in un ambiente umido e buio e permettendo ai nematodi di migrare nell’acqua circostante. I nematodi sono stati quindi raccolti dall’acqua e analizzati.

I funghi filamentosi sono vitali per la salute del suolo a causa del loro ruolo nel riciclaggio dei nutrienti. L’isolamento e l’osservazione di funghi filamentosi dal suolo sono stati condotti in questo esempio.

I campioni di terreno sono stati diluiti con acqua e aggiunti a piastre sterili separate di streptomicina agar Rose Bengal. La streptomicina ha impedito la crescita batterica e ha permesso la crescita dei funghi. Le colonie fungine sono state contate e montate su un vetrino usando nastro adesivo. I funghi sono stati poi ripresi usando un microscopio ottico.

I microrganismi del suolo scompongono naturalmente i componenti nel suolo, come piante e organismi morti. È stata esaminata la biodegradazione e la colonizzazione di film plastici biodegradabili, come mostrato in questo esempio.

I funghi sono stati isolati da film plastici sepolti nel terreno per diversi mesi. I funghi sono stati poi testati individualmente per la crescita su film plastici. I film plastici sono stati quindi incubati con il ceppo fungino selezionato senza mezzi di crescita, al fine di osservare la degradazione diretta della plastica da parte dei funghi.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE al test del vetrino a contatto per l’imaging qualitativo dei microbi del suolo. Ora dovresti capire come preparare la diapositiva di contatto e visualizzare i microbi del suolo. Grazie per l’attenzione!

Results

I funghi mostrano ife spesse e filamentose (Figura 2). Gli actinomiceti mostrano ife sottili e filamentose. I batteri mostrano piccoli cocchi o forme di bastoncello. Si trovano spesso in ciuffi, particelle di terreno o ife fungine di rivestimento. Le particelle del suolo mostrano forme irregolari e scure (Figura 3).

Figura 2. Immagine della diapositiva a contatto utilizzando l’obiettivo 100X.
Foto per gentile concessione di W.H. Fuller.

Figura 3. Immagine della diapositiva a contatto utilizzando l’obiettivo 100X.
Foto per gentile concessione di W.H. Fuller.

Applications and Summary

Il test del vetrino a contatto, noto anche come scivolo sepolto, è una tecnica semplice utilizzata per osservare qualitativamente il biota del suolo. Questo test mostra qualitativamente le interazioni spaziali tra ife fungine, filamenti actinomiceti, batteri e particelle del suolo. Gli individui o l’industria possono utilizzare questo test per raccogliere conoscenze sulla salute di un particolare suolo per quanto riguarda l’agricoltura, il giardinaggio, il compostaggio, l’insegnamento e lo studio. Tuttavia, questa tecnica non quantifica il micro biota del suolo, in quanto comprende solo un piccolo ritratto di un ambiente eterogeneo più ampio.

Le relazioni tra gli organismi del suolo possono essere osservate eseguendo il test del vetrino di contatto e visualizzando i risultati attraverso la microscopia ad immersione in olio 100X (Figure 2 e 3). La semplicità e la facilità di eseguire questo test lo rendono un’ottima tecnica di partenza per coloro che non sono mai stati esposti alla microbiologia e potrebbero visualizzare i microrganismi attraverso un microscopio per la prima volta.

References

Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

Transcript

The relationships between the various organisms and inorganic components in soil are vital to understanding soil changes and environmental stresses, but cannot be elucidated without direct visualization.

Soil, an extremely complex system, is a habitat for millions of diverse organisms. The region of soil directly around plant roots in particular, called the rhizosphere, contains a unique array of organisms that are directly influenced by the plant roots.

The abiotic, or non-biological, component of the rhizosphere includes inorganic particles ranging in size and shape that contribute to the soil’s texture. The biotic, or biological, portion includes plant residues, roots, organic matter, and microorganisms.

This video will demonstrate the direct visualization of the biotic and abiotic components of rhizosphere soil, in order to understand factors affecting soil changes and to predict environmental stresses.

Microscopic organisms tend to reside in the water located within soil pores. Bacteria are among the simplest and most plentiful organisms present in soil, and are found in many morphologies including spheres called cocci, rods called bacilli, and filamentous forms.

Fungal species, such as yeast and molds, are the second most abundant organisms in soil. They work to decompose and recycle dead organic matter. Microscopic filamentous fungi visually differ from other microorganisms, as they possess long and branched hyphae that release spores.

Direct observation of the relationships between these organisms is challenging, but can be achieved using a contact slide assay. This method is performed by submerging a glass slide into soil for several days and allowing the organisms and soil particles to adsorb to the slide surface.

The slide is then removed at an angle to prevent smearing of the surface. The microbes are fixed with acetic acid, and stained with Rose Bengal stain to enable visualization via light microscopy.

Now that you understand the principles behind the contact slide assay technique, lets take a look at the process in the laboratory.

First, collect surface garden soil and transfer the soil into the lab. Weigh 150 g of soil into the 2 separate containers. One container should be labeled as the treatment sample, which will be modified with nutrients to encourage rapid proliferation of organisms. Label the other as the control, which will be unchanged.

Calculate the water content in the soil, using the technique shown in this collection’s Determination of Moisture Content in Soil video. Based on this calculation, determine the amount of water in the soil on a dry weight basis. Now calculate the amount of water that needs to be added to give a 15% soil moisture content. This brings the moisture to field capacity, optimal for microorganism growth.

Measure the calculated amount of distilled water using a graduated cylinder. Pour the calculated volume of water into each container. Based on the previously determined dry weight of the soil, calculate the amount of glucose needed to achieve a final soil glucose concentration of 1% by mass, using the dry weight basis. Weigh this amount of glucose and add it to the treatment container only.

Weigh 200 mg of ammonium nitrate, then add it to the treatment container only. The ammonium nitrate serves as the nitrogenous nutrient source for the soil microbes. Mix the soil, glucose, and ammonium nitrate mixture in the container.

Next, label 4 clean microscope slides: two as treatment, and two as control. Insert the two treatment slides into the treatment soil container. Leave a section of each slide exposed above the soil surface, and ensure that there is a gap between the two slides.

Insert the two control slides into the control soil container in the same way. Cover the cups with plastic wrap, and secure with a rubber band. Puncture the plastic wrap several times to allow air transfer, but still prevent excessive evaporation.

Finally, weigh both cups, record their weight, and incubate them in a designated area at room temperature for seven days.

After the seven-day incubation, calculate the soil moisture content by weighing the soil cups. Determine if weight has been lost due to water evaporation, and replace the water if needed.

Remove the plastic wrap from the container, and remove the two slides from the soil by pressing each slide to an inclined position, and withdrawing so that the upper face of the slide is undisturbed.

Gently tap the slides to remove large soil particles. Using a damp paper towel, clean the lower face of the slides. Allow them to dry at room temperature in a fume hood. Once dry, pick up a slide with forceps, and immerse it into acetic acid for 1 to 3 min.

Rinse the top of the slide with a gentle stream of distilled water to remove excess acid. Repeat these steps for all slides. Allow the slides to air dry.

Support the slide on a staining rack over a container to catch excess dye. Using a dropper, gently cover the surface of each slide with phenolic Rose Bengal dye. Allow the slides to stain for 5 to 10 min, taking care to add more dye as needed to keep the slides wet. Gently rinse the slides with water to remove excess stain, and allow the slides to dry at room temperature.

Examine the slides on a light microscope, using an oil immersion objective. The treated soil will have more soil microbes.

The spatial interactions between fungal and bacterial organisms in typical soil samples can easily be visualized. Soil particles display dark irregular shapes.

Fungal organisms display thick filamentous hyphae, while actinomycetes display thin filamentous hyphae.

Bacteria are found as small cocci or rod shapes, typically in clumps, on soil particles or lining fungal hyphae.

The direct isolation of organisms from soil is important to the understanding of soil and environment characteristics.

Entomopathogenic nematodes are microscopic round worms that parasitize insects. While they are not visualized in the contact slide assay, they can be isolated from collected soil samples, as shown in this example.

First, the nematodes were baited in the soil using insects identified from visual examination. Nematodes were isolated from the dead insect bait, by placing the dead insects in a moist and dark environment and allowing the nematodes to migrate out into the surrounding water. The nematodes were then collected from the water, and analyzed.

Filamentous fungi are vital to soil health due to their role in nutrient recycling. The isolation and observation of filamentous fungi from soil was conducted in this example.

Soil samples were diluted with water, and added to separate sterile Rose Bengal streptomycin agar plates. The streptomycin prevented bacterial growth, and enabled fungal growth. Fungal colonies were counted and mounted to a glass slide using adhesive tape. The fungi were then imaged using a light microscope.

Soil microorganisms naturally break down components in soil, such as dead plants and organisms. Biodegradation and colonization of biodegradable plastic films was examined, as shown in this example.

Fungi were isolated from plastic films buried in soil for several months. The fungi were then tested individually for growth on plastic films. Plastic films were then incubated with the selected fungal strain with no growth media, in order to observe direct degradation of the plastic by the fungi.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the contact slide assay for qualitative imaging of soil microbes. You should now understand how to prepare the contact slide, and visualize soil microbes. Thanks for watching!