2.4: Visualizzazione dei microrganismi del suolo tramite il test su vetrino a contatto e microscopia

1. Preparazione del microcosmo del scivolo del suolo

1. Raccogliere il terreno del giardino dalla superficie (profondità 0-6 ") e pesare 150 g di terreno in due tazze separate.
   1. Se il terreno ha un'alta densità di materia organica, pesare 100 g.
2. Etichettare una tazza "Trattamento" e l'altra "Controllo".
3. Calcola la quantità di acqua necessaria per alterare il contenuto di umidità.
   1. Il contenuto di umidità è spesso vicino alla capacità del campo.
      
4. Misurare la quantità di acqua distillata con un cilindro graduato.
5. Versare la quantità di acqua distillata in due flaconcini.
6. Etichettare una fiala "Trattamento" e l'altra "Controllo".
7. Modificare l'acqua nel flaconcino "Trattamento" con glucosio sufficiente per una concentrazione finale di glucosio nel suolo dell'1%, in base a una base di peso secco nel terreno "Trattamento".
8. Aggiungere 200 mg di NH₄NO₃ nel flaconcino "Trattamento" e mescolare per sciogliere le modifiche. Il nitrato funge da fonte di azoto di nutrienti per i microbi del suolo.
9. Non modifichi il flaconcino "Controllo".
10. In piccole aliquote di circa 50 mg, mescolare il contenuto del flaconcino "Trattamento" nella tazza "Trattamento". Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
11. In piccole aliquote, mescolare il contenuto del flaconcino "Control" nella tazza "Control". Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
12. Etichettare quattro vetrini per microscopio puliti: due vetrini "Trattamento" e due vetrini "Controllo".
13. Inserire i due vetrini "Trattamento" nella coppa del terreno "Trattamento" e inserire i due vetrini "Control" nella tazza del terreno "Control". Lasciare 2 cm di ogni diapositiva sporgente sopra la superficie del terreno e assicurarsi di lasciare uno spazio tra le due diapositive.
14. Coprire le tazze con pellicola trasparente e fissarla con un elastico.
15. Forare l'involucro più volte per consentire l'aria, ma evitare comunque un'eccessiva evaporazione.
16. Registra il peso di entrambe le tazze.
17. Incubare le tazze piene di terreno a temperatura ambiente in un'area designata / incubatore per 7 giorni.

2. Colorazione e microscopia a vetrino

1. Registra il peso di entrambe le tazze.
2. Calcola l'umidità del suolo al momento della rimozione della diapositiva.
3. Rimuovere le due diapositive da ciascuna tazza premendo ciascuna diapositiva in posizione inclinata e ritirandosi in modo che la faccia superiore della diapositiva non venga disturbata.
4. Identificare e contrassegnare il lato della diapositiva da macchiare e osservare.
5. Picchiettare delicatamente le diapositive sul piano di lavoro per rimuovere le particelle di terreno di grandi dimensioni.
6. Usando un asciugamano di carta umido, pulire la faccia inferiore delle diapositive. Asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
7. Indossando occhiali protettivi e tenendo ogni vetrino con una pinna, immergere i vetrini in acido acetico al 40% (v / v) per 1-3 minuti sotto un cappa aspirante.
8. Lavare via l'acido in eccesso sotto un leggero getto d'acqua.
9. Usando una bottiglia contagocce, coprire la superficie dei vetrini con Rose Bengal fenolico. Sostenere la diapositiva su un rack di colorazione sopra un contenitore per catturare la macchia in eccesso. Fare attenzione, non lavare con forza che potrebbe rimuovere i microrganismi dalla superficie dei vetrini.
10. Macchiare i vetrini per 5-10 minuti. Non lasciare asciugare il vetrino. Aggiungi più macchie se necessario.
11. Lavare delicatamente le diapositive per rimuovere le macchie in eccesso.
12. Lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
13. Utilizzando l'obiettivo di immersione in olio, osservare il vetrino utilizzando un microscopio (Figura 1).

Figura 1. Un vetrino al microscopio.

Le relazioni tra i vari organismi e i componenti inorganici del suolo sono vitali per comprendere i cambiamenti del suolo e gli stress ambientali, ma non possono essere chiarite senza una visualizzazione diretta.

Il suolo, un sistema estremamente complesso, è l'habitat di milioni di organismi diversi. In particolare, la regione del suolo che circonda le radici delle piante, chiamata rizosfera, contiene una serie unica di organismi che sono direttamente influenzati dalle radici delle piante.

La componente abiotica, o non biologica, della rizosfera comprende particelle inorganiche di dimensioni e forma variabili che contribuiscono alla struttura del suolo. La parte biotica, o biologica, comprende residui vegetali, radici, materia organica e microrganismi.

Questo video dimostrerà la visualizzazione diretta delle componenti biotiche e abiotiche del suolo della rizosfera, al fine di comprendere i fattori che influenzano i cambiamenti del suolo e di prevedere gli stress ambientali.

Gli organismi microscopici tendono a risiedere nell'acqua situata all'interno dei pori del suolo. I batteri sono tra gli organismi più semplici e abbondanti presenti nel suolo e si trovano in molte morfologie, tra cui sfere chiamate cocchi, bastoncelli chiamati bacilli e forme filamentose.

Le specie fungine, come lieviti e muffe, sono i secondi organismi più abbondanti nel suolo. Lavorano per decomporre e riciclare la materia organica morta. I funghi filamentosi microscopici differiscono visivamente dagli altri microrganismi, in quanto possiedono ife lunghe e ramificate che rilasciano spore.

L'osservazione diretta delle relazioni tra questi organismi è impegnativa, ma può essere ottenuta utilizzando un saggio su vetrino a contatto. Questo metodo viene eseguito immergendo un vetrino nel terreno per diversi giorni e consentendo agli organismi e alle particelle del terreno di adsorbirsi sulla superficie del vetrino.

La slitta viene quindi rimossa ad angolo per evitare sbavature sulla superficie. I microbi sono fissati con acido acetico e colorati con la colorazione Rose Bengal per consentire la visualizzazione tramite microscopia ottica.

Ora che hai compreso i principi alla base della tecnica del saggio su vetrino a contatto, diamo un'occhiata al processo in laboratorio.

Per prima cosa, raccogli il terreno superficiale del giardino e trasferisci il terreno in laboratorio. Pesare 150 g di terra nei 2 contenitori separati. Un contenitore deve essere etichettato come campione di trattamento, che verrà modificato con sostanze nutritive per incoraggiare la rapida proliferazione degli organismi. Etichetta l'altro come controllo, che rimarrà invariato.

Calcola il contenuto d'acqua nel suolo, utilizzando la tecnica mostrata nel video Determinazione del contenuto di umidità nel suolo di questa raccolta. Sulla base di questo calcolo, determinare la quantità di acqua nel terreno in base al peso secco. Ora calcola la quantità di acqua che deve essere aggiunta per ottenere un contenuto di umidità del suolo del 15%. Questo porta l'umidità alla capacità del campo, ottimale per la crescita dei microrganismi.

Misurare la quantità calcolata di acqua distillata utilizzando un cilindro graduato. Versare il volume d'acqua calcolato in ogni contenitore. Sulla base del peso secco del terreno precedentemente determinato, calcolare la quantità di glucosio necessaria per raggiungere una concentrazione finale di glucosio nel suolo dell'1% in massa, utilizzando la base del peso secco. Pesare questa quantità di glucosio e aggiungerla solo al contenitore per il trattamento.

Pesare 200 mg di nitrato di ammonio, quindi aggiungerlo solo al contenitore di trattamento. Il nitrato di ammonio funge da fonte di nutrienti azotati per i microbi del suolo. Mescola la miscela di terreno, glucosio e nitrato di ammonio nel contenitore.

Quindi, etichettare 4 vetrini da microscopio puliti: due come trattamento e due come controllo. Inserire i due vetrini di trattamento nel contenitore del terreno di trattamento. Lasciare una sezione di ogni scivolo esposta sopra la superficie del terreno e assicurarsi che ci sia uno spazio tra i due scivoli.

Inserire allo stesso modo le due slitte di controllo nel contenitore del terreno di controllo. Copri le tazze con pellicola trasparente e fissale con un elastico. Forare più volte l'involucro di plastica per consentire il trasferimento dell'aria, ma evitare comunque un'eccessiva evaporazione.

Infine, pesa entrambe le coppette, registra il loro peso e incubale in un'area designata a temperatura ambiente per sette giorni.

Dopo l'incubazione di sette giorni, calcolare il contenuto di umidità del suolo pesando le tazze del terreno. Determinare se il peso è stato perso a causa dell'evaporazione dell'acqua e, se necessario, sostituire l'acqua.

Rimuovere l'involucro di plastica dal contenitore e rimuovere i due vetrini dal terreno premendo ciascuno scivolo in posizione inclinata e ritirandolo in modo che la faccia superiore del vetrino non sia disturbata.

Picchiettare delicatamente i vetrini per rimuovere le particelle di terreno più grandi. Utilizzando un tovagliolo di carta umido, pulire la parte inferiore delle diapositive. Lasciarli asciugare a temperatura ambiente in una cappa aspirante. Una volta asciutto, raccogli un vetrino con una pinza e immergilo nell'acido acetico per 1-3 minuti.

Sciacquare la parte superiore del vetrino con un getto delicato di acqua distillata per rimuovere l'acido in eccesso. Ripeti questi passaggi per tutte le diapositive. Lasciare asciugare le diapositive all'aria.

Appoggiare il vetrino su una rastrelliera per la colorazione sopra un contenitore per raccogliere il colorante in eccesso. Utilizzando un contagocce, coprire delicatamente la superficie di ogni vetrino con colorante fenolico Rose Bengal. Lasciare macchiare i vetrini per 5-10 minuti, avendo cura di aggiungere altro colorante se necessario per mantenere i vetrini bagnati. Sciacquare delicatamente i vetrini con acqua per rimuovere le macchie in eccesso e lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente.

Esaminare i vetrini al microscopio ottico, utilizzando un obiettivo a immersione in olio. Il terreno trattato avrà più microbi del suolo.

Le interazioni spaziali tra organismi fungini e batterici nei tipici campioni di suolo possono essere facilmente visualizzate. Le particelle di terreno mostrano forme irregolari scure.

Gli organismi fungini mostrano ife filamentose spesse, mentre gli attinomiceti mostrano ife filamentose sottili.

I batteri si trovano sotto forma di piccoli cocchi o bastoncini, tipicamente in ciuffi, sulle particelle di terreno o sulle ife fungine di rivestimento.

L'isolamento diretto degli organismi dal suolo è importante per la comprensione delle caratteristiche del suolo e dell'ambiente.

I nematodi entomopatogeni sono microscopici vermi rotondi che parassitano gli insetti. Sebbene non siano visualizzati nel saggio del vetrino a contatto, possono essere isolati dai campioni di terreno raccolti, come mostrato in questo esempio.

In primo luogo, i nematodi sono stati innescati nel terreno utilizzando insetti identificati dall'esame visivo. I nematodi sono stati isolati dall'esca dell'insetto morto, posizionando gli insetti morti in un ambiente umido e buio e permettendo ai nematodi di migrare nell'acqua circostante. I nematodi sono stati quindi raccolti dall'acqua e analizzati.

I funghi filamentosi sono vitali per la salute del suolo grazie al loro ruolo nel riciclaggio dei nutrienti. In questo esempio è stato condotto l'isolamento e l'osservazione di funghi filamentosi dal suolo.

I campioni di terreno sono stati diluiti con acqua e aggiunti a piastre sterili separate di agar streptomicina del Rose Bengal. La streptomicina ha impedito la crescita batterica e ha permesso la crescita dei funghi. Le colonie fungine sono state contate e montate su un vetrino utilizzando del nastro adesivo. I funghi sono stati quindi ripresi utilizzando un microscopio ottico.

I microrganismi del suolo scompongono naturalmente i componenti del suolo, come le piante e gli organismi morti. È stata esaminata la biodegradazione e la colonizzazione di film plastici biodegradabili, come mostrato in questo esempio.

I funghi sono stati isolati da film di plastica sepolti nel terreno per diversi mesi. I funghi sono stati poi testati individualmente per la crescita su film plastici. I film plastici sono stati quindi incubati con il ceppo fungino selezionato senza mezzi di crescita, al fine di osservare la degradazione diretta della plastica da parte dei funghi.

Avete appena visto l'introduzione di JoVE al saggio su vetrino a contatto per l'imaging qualitativo dei microbi del suolo. Ora dovresti capire come preparare il vetrino di contatto e visualizzare i microbi del suolo. Grazie per l'attenzione!