3.10: Estrazione tramite sonicazione di biomarcatori lipidici dal sedimento

1. Raccogli i materiali necessari

1. Campioni (foglie, sporco, funghi, corteccia, tessuto), solitamente congelati, liofilizzati, frantumati e omogeneizzati prima dell'estrazione, estratti in gruppi per massimizzare l'efficienza. Estrarre tre campioni.
2. A seconda delle dimensioni del campione, possono essere utilizzati flaconcini con volumi compresi tra 4 e 60 ml. Per questo esperimento vengono utilizzate fiale di vetro borosilicato (40 ml) e tappi sicuri con solvente. Flaconcini, pipette di vetro borosilicato e barattoli di pesatura devono essere bruciati a 550 °C per 6 ore prima di garantire la rimozione di eventuali contaminanti organici.
3. Il diclorometano e il metanolo sono comuni nella maggior parte dei laboratori di geochimica organica. Sono usati singolarmente per risciacquare strumenti di laboratorio e vetreria prima dell'uso. Una miscela di diclorometano (DCM) a metanolo (MeOH; 9:1) viene utilizzata in molti laboratori per estrarre in modo efficiente biomarcatori con una vasta gamma di polarità. I solventi devono essere privi di contaminanti organici.
4. Utilizzare un bagno d'acqua sonicante a temperatura ambiente. Una gamma di dimensioni di sonicatori e sonicazione con o senza calore sono disponibili presso i principali rivenditori di apparecchiature scientifiche.
5. I rack delle fiale, che dovrebbero essere impermeabili, saranno collocati nel bagno di sonicazione.
6. Cappuccio chimico approvato con solvente.

2. Preparazione del campione

1. Posizionare una teglia bruciata sulla bilancia da laboratorio e quindi tarare.
2. Risciacquare la spatola da laboratorio con solvente, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione nella scatola di pesatura e registrare la massa.
   1. La massa del campione varia a seconda del suo contenuto di materia organica. Il materiale magro relativamente organico (fango marino) può richiedere diversi grammi, mentre il materiale ricco di materia organica (tessuto fogliare) può richiedere molto meno.
3. Trasferire tutto il materiale nella scatola di pesatura in un flaconcino bruciato, prepesato ed etichettato. Chiudere il flaconcino, quindi scartare la teglia pesata.
4. Eseguire i passaggi da 2.1 a 2.3 per ogni campione da estrarre.

3. Estrazione

1. Utilizzando una pipetta e una lampadina pre-bruciate, trasferire ~20 mL della miscela DCM:MeOH (9:1) in ciascun flaconcino (il flaconcino deve essere circa mezzo pieno). Ricapitolare i flaconcini prima di passare al campione successivo, in modo che i solventi volatili non evaporino.
   1. Le volatilità di DCM e MeOH sono diverse. L'evaporazione del solvente di estrazione a causa di fiale di campioni non tappate ha la capacità di cambiare la sua polarità e quindi l'estrazione.
2. Posizionare i flaconcini campione in un rack per flaconcini impermeabile.
3. Verificare che il livello dell'acqua nel bagno di sonicazione sia sufficientemente profondo da immergere le fiale del campione fino alla parte superiore del solvente di estrazione. Troppa acqua può far galleggiare le fiale; troppo poca acqua può impedire ai campioni di essere adeguatamente agitati.
4. Posizionare il rack del flaconcino con i campioni in esso direttamente nel bagno di sonicazione.
5. Sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il rack campione dal sonicatore. Se si estraggono sedimenti, lasciare impostare per 30 minuti per consentire l'assestamento. Se si estrae un altro set di campioni, inserire il sonicatore in questo momento.
7. Rimuovere la miscela DCM:MeOH dal flaconcino di estrazione, utilizzando una pipetta e un bulbo pre-bruciati, e inserirla in un altro flaconcino da 40 mL pre-pesato, pre-bruciato ed etichettato.
8. Ripetere 3.1 - 3.7 3x per tutti i campioni.
9. Lasciare asciugare i campioni estratti nei loro flaconcini, tappi e nel cappuccio, coperti liberamente con un pezzo di lamina. Etichettare come "residuo estratto" e conservare.
10. Etichettare gli estratti combinati per ciascun campione come 'TLE'.

Il primo passo in paleoclimatologia è raccogliere, o estrarre, i biomarcatori dai sedimenti in cui si trovano. I campioni ambientali sono composti da componenti non organici, come minerali, acqua e metalli, e componenti organici creati dagli organismi viventi nell'area. Prima che questi componenti organici possano essere utilizzati dagli scienziati per chiarire le informazioni sul passato, devono essere rimossi dal loro ambiente. La sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche, è la più semplice e la meno costosa di queste tecniche.

Questo video fa parte di una serie sull'estrazione, la purificazione e l'analisi dei lipidi dai sedimenti. Illustrerà l'estrazione dei lipidi mediante ultrasuoni e presenterà alcune applicazioni del metodo.

A causa dell'ampia gamma di biomarcatori, non esiste un unico solvente ottimizzato per estrarli tutti. Ciò è riassunto dalla cosiddetta regola "il simile dissolve il simile", in base alla quale le molecole relativamente apolari si dissolvono in solventi apolari come il diclorometano e le molecole più polari si dissolvono in solventi più polari come il metanolo. Le miscele di solventi per l'estrazione di lipidi specifici o gruppi di lipidi sono generalmente ottimizzate empiricamente.

Per accelerare l'estrazione e aumentare la resa, viene utilizzato un sistema di sonicazione per applicare onde ultrasoniche con frequenze superiori a 20 kHz, in combinazione con la miscela di solventi. Quando queste onde entrano in contatto con la fase organica liquida, provocano la formazione di microbolle di vapore di solvente di breve durata che crescono e collassano rapidamente. Collassando, queste bolle rilasciano un'enorme quantità di energia come taglio meccanico, facilitando la solubilizzazione dei lipidi e aumentando notevolmente l'efficienza dell'estrazione.

Dopo il processo di estrazione con solvente assistita da ultrasuoni, il risultato è un preparato di estratto grezzo, chiamato estratto lipidico totale, che viene sottoposto ad ulteriore purificazione per consentire l'esame qualitativo e quantitativo delle firme lipidiche. Ora che hai compreso alcuni dei principi fondamentali alla base dell'estrazione dei lipidi mediante sonicazione, diamo un'occhiata a un protocollo per l'esecuzione della procedura.

Raccogli i materiali campione necessari da un luogo prescelto. Alcuni esempi sono i sedimenti lacustri e marini, i suoli terrestri, le colture microbiche o le foglie delle piante. Il materiale raccolto viene congelato durante la notte. Successivamente viene liofilizzato in un liofilizzatore per 2 o 3 giorni. Frantumare e omogeneizzare i campioni liofilizzati prima dell'estrazione con un mortaio e un pestello risciacquati con solvente. Per rimuovere i contaminanti organici, bruciare le pipette, le fiale e i barattoli di vetro borosilicato necessari in un forno. Dopo aver lasciato raffreddare la vetreria nel forno, sciacquare gli strumenti di metallo con una miscela di diclorometano e metanolo. Una volta preparati il campione e la vetreria, può iniziare la procedura di sonicazione.

Da questo punto in poi, tutti i contenitori e la vetreria devono essere bruciati prima dell'uso. Posizionare la latta di pesata su una bilancia e tarare. Sciacquare la spatola da laboratorio con la miscela di solvente, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione omogeneizzato liofilizzato nel barattolo di pesata e registrare la massa. Trasferire con cura il campione pesato in una fiala etichettata. Utilizzando il flacone a spruzzo di DCM:MeOH, aggiungere una quantità sufficiente a coprire il campione con 1 o 2 cm di solvente e tappare la fiala. Posizionare la fiala su una rastrelliera impermeabile, ora pronta per la sonicazione. Posizionare il rack direttamente nel bagno di sonicazione. Verificare che il livello dell'acqua nel bagno di sonicazione sia sufficientemente profondo da immergere le fiale del campione fino alla parte superiore del solvente di estrazione. Sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, rimuovere la cremagliera dal sonicatore. Lasciare riposare le fiale per consentire la sedimentazione dei sedimenti.

Rimuovere la fase superiore di diclorometano-metanolo dal flaconcino di estrazione utilizzando una pipetta e un bulbo e trasferirla in un altro flaconcino pre-pesato ed etichettato. Ripetere il processo di sonicazione per un totale di tre volte per ogni campione. Raccogli gli estratti in una fiala. Lasciare asciugare i campioni estratti nelle fiale, senza tappo e nel cappuccio, coperti con un foglio di alluminio. Etichettare come "residuo estratto" e conservare nel solvente di estrazione. Ora che i biomarcatori sono stati estratti, devono essere purificati prima che l'analisi possa avvenire.

La sonicazione accelera diversi processi di estrazione con solvente ed è ampiamente utilizzata negli studi geochimici. Molti archeologi lavorano con i geochimici per ricostruire le circostanze ambientali e culturali in cui vivevano le prime civiltà umane. La ceramica, una delle più antiche invenzioni umane, una volta portata alla luce, può contenere fossili molecolari residui di vino, riso o altri contenuti che un tempo erano conservati all'interno.

Per portare alla luce prove chimiche di sostanze assorbite sulle superfici, piccoli campioni di ceramica vengono sonicati in presenza di solventi organici e i composti estratti possono essere successivamente identificati a valle con metodi spettroscopici. Questo tipo di analisi aiuta gli archeologi a rilevare i tipi di risorse che erano disponibili per le popolazioni antiche e a ricostruire le condizioni del loro habitat.

Le microalghe fotosintetiche si trovano negli ecosistemi marini e d'acqua dolce. Poiché crescono in substrati a base di acqua di mare e la loro coltura occupa aree significativamente più piccole, sono ora ampiamente studiati come una promettente alternativa alle piante terrestri per la produzione di biocarburanti.

Per estrarre i lipidi da una biomassa microalgale, questi ricercatori descrivono un'estrazione con solvente assistita da sonicazione. La cavitazione acustica durante la sonicazione distrugge efficacemente le pareti cellulari rigide delle microalghe per liberare i lipidi. Tali tecniche aiutano la caratterizzazione di nuove microalghe dall'ambiente per la produzione di fonti di energia non petrolifere.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione assistita da sonicazione di biomarcatori dai sedimenti. I seguenti video spiegheranno come l'estratto viene ulteriormente purificato per l'analisi.

Grazie per l'attenzione!