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Colorazione di Gram dei batteri provenienti da fonti ambientali

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Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

2.2: Aseptic Technique in Environmental Science

2.10: Water Quality Analysis via Indicator Organisms

99,810 Views

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09:31 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba – Università dell’Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

Lo spettro della ricerca in microbiologia ambientale è ampio per portata e potenziale applicativo. Sia che il lavoro sia su scala di banco con isolati batterici noti, o sul campo raccogliendo campioni di suolo o acqua contenenti isolati batterici sconosciuti, la capacità di discernere rapidamente e visivamente popolazioni di interesse coltivabili rimane di grande importanza per i microbiologi ambientali ancora oggi con l’abbondanza di tecniche molecolari disponibili per l’uso. Questo video dimostrerà una di queste tecniche, nota come colorazione di Gram.

Principles

La colorazione Gram è una tecnica di colorazione classica e importante che rimane ampiamente utilizzata dai microbiologi ambientali. Simile a una semplice macchia, consente di valutare la morfologia delle cellule batteriche(ad esempio,cocchi, bastoncelli, formatori di spore), dimensioni e disposizione(ad esempio,catene o grappoli). Inoltre, consente di differenziare i batteri in due gruppi distinti – Gram-negativi e Gram-positivi – in base alla composizione e alla struttura della parete cellulare (Figura 1).

La colorazione di Gram è un processo in più fasi. Prima della colorazione, uno striscio batterico viene preparato utilizzando una piastra, un’inclinazione o una coltura di brodo. La preparazione dello striscio viene asciugata e fissata su un vetrino pulito. Una macchia primaria di cristallo viola viene quindi applicata allo striscio fisso. Il viola cristallo è una macchia di base composta da ioni colorati caricati positivamente(cioè cromofori) che formano deboli legami ionici con gruppi funzionali caricati negativamente presenti nella parete cellulare batterica. Dopo aver risciacquo delicatamente il vetrino con acqua, viene applicato lo iodio di Gram e forma complessi insolubili con il viola cristallino nella parete cellulare. I complessi cristallo viola-iodio si legano ulteriormente con il peptidoglicano, un componente principale delle pareti cellulari batteriche. Dopo un secondo risciacquo con acqua, un agente decolorante viene brevemente applicato allo striscio. Per i batteri Gram-negativi, il complesso cristallo viola-iodio viene lavato via durante la fase di decolorazione, con i batteri Gram-positivi che mantengono la macchia viola. Un terzo e ultimo risciacquo con acqua è seguito da una controstain di safranina che colora i batteri Gram-negativi rosa o rosso.

Figura 1. Confronto della parete cellulare dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi.

Procedure

1. Raccolta dei campioni

Raccogliere il campione di terreno e trasportare al laboratorio per l’analisi microbica.
In laboratorio, pesare un campione di 10 g utilizzando una bilancia analitica.
Diluire il campione 1:10 in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (10 parti di terreno equivale a 5 parti di liquido acquoso) e vortice da miscelare(Figura 2,Fase 1).
Eseguire successive diluizioni 1:10 fino ad almeno 10^-5 g di terreno per mL e diluizioni selezionate a piastre di diffusione in repliche di due o tre su un mezzo agar a basso contenuto di nutrienti(ad esempio,R2A) (Figura 2, Passaggi 2-3).
Incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente (Figura 2, Passo 4).
Selezionare una o due colonie per l’isolamento e strisciare su piastre di agar fresche (Figura 3, Passaggi 1-3).
Incubare le piastre striata per due o tre giorni a temperatura ambiente (Figura 3, Fase 4).

2. Preparazione di strisci batterici

Osservare le piastre striate per le colonie isolate.
Per preparare ogni preparazione dello striscio, immergere un ciclo di inoculazione nell’etanolo, sterilizzare a fiamma e posizionare da 1 a 2 cicli di acqua distillata sterile al centro di vetrini pre-puliti.
Sterilizzare nuovamente il ciclo di inoculazione come descritto in precedenza. Una volta raffreddato, rimuovere una piccola quantità di coltura da una singola colonia isolata e mescolarla con le goccioline d’acqua sul vetrino (lo striscio dovrebbe assomigliare al latte scremato diluito). Il ciclo di inoculazione deve essere raffreddato prima dell’isolamento della colonia. Un ciclo troppo caldo causerà lo schizzo della colonia e / o del mezzo, che può portare all’aerosolizzazione dei batteri. Generalmente, quando il loop è troppo caldo per l’uso, si sentirà un suono “sissante” quando applicato all’agar o alla colonia. Il raffreddamento improprio del loop può anche comportare un trasferimento da coltura a diapositiva meno efficiente e una distorsione della morfologia cellulare.
Stendere lo striscio sulla superficie del vetrino di circa 2,5 cm x 2,5 cm e lasciarlo asciugare all’aria. È importante che l’essiccazione all’aria avvenga in condizioni di flusso laminare. Le diapositive non devono essere asciugate in modo da non interrompere lo striscio. Inoltre, i vetrini non devono essere essiccati a fiamma, al fine di mantenere la morfologia cellulare.
Dopo l’asciugatura, il calore fissa lo striscio facendo passare rapidamente la diapositiva attraverso una fiamma 2-3x. Il vetrino non deve essere tenuto fermo nella fiamma, per evitare distorsioni della morfologia cellulare e/o danni al vetrino.

3. Colorazione del grammo

Fissare la diapositiva a un’estremità usando una molletta pulita.
Coprire lo striscio con viola cristallo (macchia primaria) e tenere premuto per 2 o 3 minuti.
Lavare accuratamente lo scivolo con acqua distillata. Il flusso d’acqua non deve essere diretto verso lo striscio per evitare danni e/o distacchi dal vetrino.
Coprire lo striscio con lo iodio di Gram e tenere premuto per 2 minuti, quindi risciacquare delicatamente lo scivolo con acqua.
Decolorare lo striscio usando il 95% di etanolo fino a quando la macchia non si lava più dal vetrino (questo di solito non richiede più di 20 s a seconda dello spessore dello striscio), quindi risciacquare immediatamente con acqua distillata. Questo passaggio è fondamentale per evitare la decolorazione eccessiva della diapositiva, che può portare a una falsa designazione della macchia di Gram(cioè grammo-variabile).
Aggiungere la controstain (safranin) allo striscio e tenere premuto per 30 s. Quindi risciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata e asciugare con carta assorbente.

4. Osservazione microscopica dei vetrini

Osservare le diapositive utilizzando obiettivi bassi(ad esempio,4X o 10X), ad alta secchezza(ad esempio,40X) e ad immersione in olio (100X). Per l’immersione in olio, aggiungere l’olio direttamente allo striscio.
Per i risultati rappresentativi dei batteri del suolo Gram-positivi e Gram-negativi, vedere le figure 4 e 5.

Figura 2. Tecnica di diluizione e Spalmatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Isolamento della colonia utilizzando la tecnica streak plate.

Figura 4. Batterio del suolo Gram-positivo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Batterio del suolo Gram-negativo Escherichia coli.

La colorazione di Gram consente una rapida visualizzazione della morfologia batterica e un’ampia distinzione cellulare da una vasta gamma di campioni ambientali. Per macchiare i batteri, uno striscio uniforme viene applicato su un lato di vetro e lasciato asciugare. Dopo aver fissato a caldo lo striscio, viene applicato il viola cristallo.

Un agente decolorante risciacqua via il viola cristallino dalle cellule Gram-negative, ma non dalle cellule Gram-positive. Un secondo colorante, tipicamente safranina, viene utilizzato come macchia di sfondo per visualizzare le cellule Gram-negative. Una volta colorate, le cellule possono essere valutate per la morfologia, le dimensioni e la disposizione delle cellule, come catene o cluster.

Questo video dimostrerà come preparare un campione ambientale, isolare le specie batteriche ivi trovate ed eseguire una macchia di Gram sulle colonie isolate

La colorazione di Gram consente la categorizzazione della maggior parte dei batteri in due ampie classi strutturali: Gram-positivo e Gram-negativo. Mentre entrambe le classi hanno una membrana plasmatica fosfolipidica sottostante, la struttura della parete cellulare varia notevolmente. La parete cellulare Gram-positiva è composta principalmente da uno spesso strato di peptidoglicano, che è un polimero costituito da zuccheri e amminoacidi. Le pareti cellulari Gram-negative hanno uno strato più sottile di peptidoglicano, inserito tra una seconda membrana lipidica. Questa membrana esterna contiene tipicamente lipopolisaccaridi.

Il viola cristallino caricato positivamente si lega debolmente alla parete cellulare batterica caricata negativamente. Lo iodio di Gram forma un complesso insolubile con il colorante viola cristallino, fissandolo così nella parete cellulare.

Durante la fase di decolorazione, il peptidoglicano nelle cellule Gram-positive viene disidratato, facendolo contrarre e intrappolare i complessi cristallo viola-iodio. Nelle cellule Gram-negative, l’agente decolorante compromette la membrana esterna, aumentandone la porosità. Ciò consente di lavare via i complessi cristallo viola-iodio.

Ora che hai capito i principi alla base dei batteri del suolo che colorano Gram, vediamo il processo eseguito sui batteri del suolo in laboratorio.

Dopo aver raccolto un campione di terreno sul campo, portalo in laboratorio per l’analisi. Raffinare il campione con un setaccio e pesare 10 g del terreno setacciato utilizzando una bilancia analitica.

Diluire il campione in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato e vortice per mescolare. Eseguire ulteriori da 1 a 10 diluizioni, vorticando tra ogni diluizione. Trasferire aliquote di almeno 3 diluizioni successive, su piastre di acarosio a basso contenuto di nutrienti replicate.

Dopo la sterilizzazione a fiamma di etanolo e il raffreddamento di un’asta di vetro piegata picchiettando il supporto, distribuire il campione sulla superficie delle piastre. Incubare le piastre a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione per 3-5 giorni, selezionare la diluizione più alta con 30-300 colonie discrete. Con un ciclo di inoculazione sterile, selezionare le colonie di interesse per l’isolamento.

Striscia la colonia su una sezione di un piatto fresco. Sterilizzando l’anello tra le strisce, fare strisce successive in uno schema a zig-zag su ogni sezione della piastra per consentire il successivo isolamento di singole colonie discrete. Incubare le piastre per 1 o 2 giorni a temperatura ambiente.

Per iniziare la preparazione di strisci batterici, attaccare una clip a una diapositiva di vetro pre-pulita per facilitare la manipolazione. Per ogni striscio batterico, pulire e sterilizzare a fiamma un ciclo inoculante. Posizionare 2 loopful di acqua distillata sterile al centro dello scivolo.

Dopo aver sterilizzato nuovamente il cappio, rimuovere una piccola quantità di coltura da una colonia isolata e mescolare con l’acqua sullo scivolo. È importante raffreddare il ciclo prima di toccare la cultura toccando più volte una porzione non inoculata di agar. Lo striscio dovrebbe assomigliare al latte diluito. Lasciare asciugare la diapositiva a temperatura ambiente. Dopo l’asciugatura, il calore fissa lo striscio facendolo passare rapidamente attraverso una fiamma.

Una volta asciutto, pipettare il cristallo viola sullo striscio e lasciare riposare per 2 – 3 minuti. Risciacquare accuratamente il vetrino con acqua distillata puntando il flusso diretto verso la parte superiore del vetrino, consentendo all’acqua di scorrere delicatamente verso il basso. Non puntare il flusso d’acqua direttamente sullo striscio.

Coprire la diapositiva con lo iodio di Gram. Dopo 2 minuti, risciacquare delicatamente con acqua distillata. Decolorare il vetrino con etanolo al 95% fino a quando la macchia non si lava più via. Risciacquare immediatamente con acqua distillata. Ciò limiterà l’eccessiva decolorazione dello striscio.

Aggiungere la safranina come contromacchia allo striscio per 30 s. Questo macchierà tutte le cellule Gram-negative presenti. Risciacquare delicatamente con acqua distillata e asciugare con carta assorbente. Osservare il vetrino risultante con un microscopio. Usa prima un obiettivo a bassa potenza per effettuare regolazioni grossolane e trova una porzione ideale dello striscio prima di passare al campo visivo più piccolo degli ingrandimenti più elevati.

Dopo un’ulteriore creazione di immagini e la regolazione dello striscio con un obiettivo di media potenza, aggiungere olio di immersione direttamente allo striscio. L’olio è necessario per obiettivi ad alta potenza che forniranno le migliori micrografie. I batteri Gram-positivi appariranno di colore blu o viola, mentre le cellule Gram-negative saranno rosse o rosa. Oltre alla struttura, la forma e la disposizione della parete cellulare sono chiarite dalle micrografie risultanti.

La capacità della colorazione di Gram di studiare qualitativamente i batteri è importante per una vasta gamma di campi scientifici.

Il suolo è solo una delle fonti ambientali da cui i batteri possono essere isolati e analizzati. Per l’acqua potabile, la preparazione del campione deve essere modificata. Campioni di acqua del rubinetto possono essere prelevati da un rubinetto e placcati su mezzi di crescita che facilitano la crescita di diverse colonie batteriche eterotrofiche. Dopo la placcatura su un mezzo come R2A, il processo è quasi identico alla procedura del terreno.

Per alcune tecniche di identificazione batterica, i parametri dipendono dal tipo di parete cellulare dei batteri di interesse. In questo esempio, il sangue di un paziente settico è stato testato ed è stato trovato che ospitava batteri Gram-positivi.

Con queste informazioni, sono state scelte sonde di acido nucleico peptidico specie-specifiche che si sarebbero legate all’rRNA delle cellule. Queste sonde erano legate a coloranti fluorescenti che venivano utilizzati per identificare le specie presenti.

A causa delle differenze fondamentali nella struttura cellulare Gram-positiva e negativa, i batteri hanno risposte uniche ad altri composti oltre al cristallo viola. Questo esperimento ha cercato di isolare clostridium difficile,un batterio Gram-positivo, da campioni fecali. La cicloserina, che inibisce la crescita delle cellule Gram-negative, è stata aggiunta alla piastra di agar. Le cellule Gram-positive che sono cresciute sulla piastra sono state ulteriormente isolate tramite altri metodi.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla colorazione di Gram per studi ambientali. Ora dovresti capire i vantaggi del processo e come eseguire la tecnica e utilizzare i risultati. Grazie per l’attenzione!

Applications and Summary

La macchia di Gram è utilizzata nei numerosi sottocampi della microbiologia sia ambientale che clinica. Gli scienziati della qualità dell’acqua possono utilizzare la macchia di Gram come strumento di conferma per il rilevamento di batteri fecali nei campioni d’acqua. Gli isolati batterici dei suoli sono colorati di Gram per caratterizzare ulteriormente le comunità del suolo coltivabili. Per i microbiologi ambientali, la colorazione gramino aiuta nella categorizzazione delle popolazioni batteriche in base alla struttura della parete cellulare. Questo, a sua volta, fornisce informazioni sulla capacità generale di una determinata comunità microbica di resistere all’essiccazione e ad altri fattori di stress ambientale. La conoscenza della designazione della colorazione Gram è anche importante nella ricerca e nello sviluppo di disinfettanti e altri antimicrobici, poiché i batteri Gram-positivi tendono ad essere più resistenti all’inattivazione da parte di particolari sostanze chimiche rispetto ai batteri Gram-negativi.

Per le applicazioni di microbiologia clinica, la macchia di Gram viene utilizzata per confermare l’identità degli agenti batteriologici insieme ai metodi diagnostici tradizionali. È anche di grande aiuto quando la coltivazione è fallita o non è un’opzione. La colorazione gram di campioni clinici può rivelare la presenza di agenti eziologici che potrebbero non essere stati osservati altrimenti.

Transcript

Gram staining allows for quick visualization of bacterial morphology and broad cellular distinction from a wide range of environmental samples. To stain bacteria, a uniform smear is applied to a glass side and allowed to dry. After heat-fixing the smear, crystal violet is applied.

A decolorizing agent rinses away the crystal violet from Gram-negative cells, but not Gram-positive cells. A second dye, typically safranin, is used as a background stain to visualize the Gram-negative cells. Once stained, the cells can be assessed for cell morphology, size, and arrangement, such as chains or clusters.

This video will demonstrate how to prepare an environmental sample, isolate the bacterial species found therein, and perform a Gram stain on the isolated colonies

Gram staining allows for the categorization of most bacteria into two broad structural classes: Gram-positive and Gram-negative. While both classes have an underlying phospholipid plasma membrane, the structure of the cellular wall varies greatly. The Gram-positive cell wall is primarily composed of a thick layer of peptidoglycan, which is a polymer that consists of sugars and amino acids. Gram-negative cell walls have a thinner layer of peptidoglycan, sandwiched between a second lipid membrane. This outer membrane typically contains lipopolysaccharides.

The positively-charged crystal violet binds weakly to the negatively-charged bacterial cell wall. Gram’s iodine forms an insoluble complex with the crystal violet dye, thereby fixing it in the cell wall.

During the decolorizing step, the peptidoglycan in the Gram-positive cells is dehydrated, causing it to contract and trap the crystal violet-iodine complexes. In Gram-negative cells, the decolorizing agent compromises the outer membrane, increasing its porosity. This allows the crystal violet-iodine complexes to be washed away.

Now that you understand the principles behind Gram staining soil bacteria, let’s see the process performed on soil bacteria in the laboratory.

After collecting a soil sample in the field, bring it into the laboratory for analysis. Refine the sample with a sieve, and weigh 10 g of the sieved soil using an analytical balance.

Dilute the sample into 95 mL of phosphate-buffered saline and vortex to mix. Perform additional 1 to 10 dilutions, vortexing between each dilution. Transfer aliquots of at least 3 successive dilutions, onto replicate low nutrient agarose plates.

Following ethanol-flame sterilization and cooling of a bent glass rod by tapping onto the media, spread the sample over the surface of the plates. Incubate the plates at room temperature. After incubating for 3 to 5 days, select the highest dilution with 30 to 300 discrete colonies. With a sterile inoculating loop, select colonies of interest for isolation.

Streak the colony onto one section of a fresh plate. Sterilizing the loop between streaks, make successive streaks in a zig-zag pattern onto each section of the plate to allow for subsequent isolation of discrete single colonies. Incubate the plates for 1 to 2 days at room temperature.

To begin preparation of bacterial smears, attach a clip to a pre-cleaned glass slide for ease of handling. For each bacterial smear, clean and flame-sterilize an inoculating loop. Place 2 loopfuls of sterile distilled water onto the center of the slide.

After sterilizing the loop again, remove a small amount of culture from an isolated colony, and mix with the water on the slide. It’s important to cool the loop before touching the culture by tapping an uninoculated portion of agar several times. The smear should resemble diluted milk. Allow the slide to dry at room temperature. After drying, heat fix the smear by quickly passing it through a flame.

Once dry, pipette crystal violet onto the smear, and let sit for 2 – 3 min. Carefully rinse the slide with distilled water by aiming the direct flow towards the top of the slide, allowing the water to gently flow down. Do not aim the water flow directly at the smear.

Cover the slide with Gram’s iodine. After 2 min, gently rinse with distilled water. Decolorize the slide with 95% ethanol until stain no longer washes away. Immediately rinse with distilled water. This will limit over-decolorizing the smear.

Add safranin as a counter-stain to the smear for 30 s. This will stain any Gram-negative cells present. Gently rinse with distilled water and blot dry with absorbent paper. Observe the resulting slide with a microscope. Use a low power objective first to make coarse adjustments and find an ideal portion of the smear before moving on to the smaller field-of-views of the higher magnifications.

After further imaging and adjusting the smear with a medium power objective, add immersion oil directly to the smear. The oil is needed for high power objectives that will provide the best micrographs. Gram-positive bacteria will appear blue or purple in color, while Gram-negative cells will be red or pink. In addition to cell wall structure, shape and arrangement are elucidated from the resulting micrographs.

The ability of Gram staining to qualitatively study bacteria is important to a wide range of scientific fields.

Soil is just one of the environmental sources from which bacteria can be isolated and analyzed. For drinking water, sample preparation must be modified. Samples of tap water can be drawn from a faucet, and plated onto growth media that facilitates the growth of diverse, heterotrophic bacterial colonies. Upon plating onto a medium such as R2A, the process is nearly identical to the soil procedure.

For certain bacterial identification techniques, the parameters are dependent on the cell wall type of the bacteria of interest. In this example, a septic patient’s blood was tested and was found to be harboring Gram-positive bacteria.

With this information, species-specific peptide nucleic acid probes were chosen that would bind to the cells’ rRNA. These probes were bound to fluorescent dyes that were used to identify the species present.

Because of the fundamental differences in Gram-positive and -negative cellular structure, bacteria have unique responses to other compounds besides crystal violet. This experiment sought to isolate Clostridium difficile, a Gram-positive bacterium, from fecal samples. Cycloserine, which inhibits the growth of Gram-negative cells, was added to the agar plate. The Gram-positive cells that grew on the plate were further isolated via other methods.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Gram staining for environmental studies. You should now understand the benefits of the process and how to perform the technique and utilize the results. Thanks for watching!

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