2.3: Colorazione di Gram dei batteri provenienti da fonti ambientali

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere il campione di terreno e trasportare al laboratorio per l'analisi microbica.
2. In laboratorio, pesare un campione di 10 g utilizzando una bilancia analitica.
3. Diluire il campione 1:10 in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (10 parti di terreno equivale a 5 parti di liquido acquoso) e vortice da miscelare(Figura 2,Fase 1).
4. Eseguire successive diluizioni 1:10 fino ad almeno 10^-5 g di terreno per mL e diluizioni selezionate a piastre di diffusione in repliche di due o tre su un mezzo agar a basso contenuto di nutrienti(ad esempio,R2A) (Figura 2, Passaggi 2-3).
5. Incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente (Figura 2, Passo 4).
6. Selezionare una o due colonie per l'isolamento e strisciare su piastre di agar fresche (Figura 3, Passaggi 1-3).
7. Incubare le piastre striata per due o tre giorni a temperatura ambiente (Figura 3, Fase 4).

2. Preparazione di strisci batterici

1. Osservare le piastre striate per le colonie isolate.
2. Per preparare ogni preparazione dello striscio, immergere un ciclo di inoculazione nell'etanolo, sterilizzare a fiamma e posizionare da 1 a 2 cicli di acqua distillata sterile al centro di vetrini pre-puliti.
3. Sterilizzare nuovamente il ciclo di inoculazione come descritto in precedenza. Una volta raffreddato, rimuovere una piccola quantità di coltura da una singola colonia isolata e mescolarla con le goccioline d'acqua sul vetrino (lo striscio dovrebbe assomigliare al latte scremato diluito). Il ciclo di inoculazione deve essere raffreddato prima dell'isolamento della colonia. Un ciclo troppo caldo causerà lo schizzo della colonia e / o del mezzo, che può portare all'aerosolizzazione dei batteri. Generalmente, quando il loop è troppo caldo per l'uso, si sentirà un suono "sissante" quando applicato all'agar o alla colonia. Il raffreddamento improprio del loop può anche comportare un trasferimento da coltura a diapositiva meno efficiente e una distorsione della morfologia cellulare.
4. Stendere lo striscio sulla superficie del vetrino di circa 2,5 cm x 2,5 cm e lasciarlo asciugare all'aria. È importante che l'essiccazione all'aria avvenga in condizioni di flusso laminare. Le diapositive non devono essere asciugate in modo da non interrompere lo striscio. Inoltre, i vetrini non devono essere essiccati a fiamma, al fine di mantenere la morfologia cellulare.
5. Dopo l'asciugatura, il calore fissa lo striscio facendo passare rapidamente la diapositiva attraverso una fiamma 2-3x. Il vetrino non deve essere tenuto fermo nella fiamma, per evitare distorsioni della morfologia cellulare e/o danni al vetrino.

3. Colorazione del grammo

1. Fissare la diapositiva a un'estremità usando una molletta pulita.
2. Coprire lo striscio con viola cristallo (macchia primaria) e tenere premuto per 2 o 3 minuti.
3. Lavare accuratamente lo scivolo con acqua distillata. Il flusso d'acqua non deve essere diretto verso lo striscio per evitare danni e/o distacchi dal vetrino.
4. Coprire lo striscio con lo iodio di Gram e tenere premuto per 2 minuti, quindi risciacquare delicatamente lo scivolo con acqua.
5. Decolorare lo striscio usando il 95% di etanolo fino a quando la macchia non si lava più dal vetrino (questo di solito non richiede più di 20 s a seconda dello spessore dello striscio), quindi risciacquare immediatamente con acqua distillata. Questo passaggio è fondamentale per evitare la decolorazione eccessiva della diapositiva, che può portare a una falsa designazione della macchia di Gram(cioè grammo-variabile).
6. Aggiungere la controstain (safranin) allo striscio e tenere premuto per 30 s. Quindi risciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata e asciugare con carta assorbente.

4. Osservazione microscopica dei vetrini

1. Osservare le diapositive utilizzando obiettivi bassi(ad esempio,4X o 10X), ad alta secchezza(ad esempio,40X) e ad immersione in olio (100X). Per l'immersione in olio, aggiungere l'olio direttamente allo striscio.
2. Per i risultati rappresentativi dei batteri del suolo Gram-positivi e Gram-negativi, vedere le figure 4 e 5.

Figura 2. Tecnica di diluizione e Spalmatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Isolamento della colonia utilizzando la tecnica streak plate.

Figura 4. Batterio del suolo Gram-positivo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Batterio del suolo Gram-negativo Escherichia coli.

La colorazione di Gram consente una rapida visualizzazione della morfologia batterica e un'ampia distinzione cellulare da un'ampia gamma di campioni ambientali. Per colorare i batteri, viene applicato uno striscio uniforme su un lato del vetro e lasciato asciugare. Dopo aver fissato a caldo lo striscio, viene applicato il cristallovioletto.

Un agente decolorante risciacqua il cristallovioletto dalle cellule Gram-negative, ma non dalle cellule Gram-positive. Un secondo colorante, tipicamente la safranina, viene utilizzato come colorante di fondo per visualizzare le cellule Gram-negative. Una volta colorate, le cellule possono essere valutate per la morfologia, le dimensioni e la disposizione cellulare, come catene o cluster.

Questo video dimostrerà come preparare un campione ambientale, isolare le specie batteriche che vi si trovano ed eseguire una colorazione di Gram sulle colonie isolate

La colorazione di Gram consente la categorizzazione della maggior parte dei batteri in due grandi classi strutturali: Gram-positivi e Gram-negativi. Sebbene entrambe le classi abbiano una membrana plasmatica fosfolipidica sottostante, la struttura della parete cellulare varia notevolmente. La parete cellulare Gram-positiva è composta principalmente da uno spesso strato di peptidoglicano, che è un polimero costituito da zuccheri e amminoacidi. Le pareti cellulari Gram-negative hanno uno strato più sottile di peptidoglicano, inserito tra una seconda membrana lipidica. Questa membrana esterna contiene tipicamente lipopolisaccaridi.

Il cristallovioletto caricato positivamente si lega debolmente alla parete cellulare batterica caricata negativamente. Lo iodio di Gram forma un complesso insolubile con il colorante cristallovioletto, fissandolo così nella parete cellulare.

Durante la fase di decolorazione, il peptidoglicano nelle cellule Gram-positive viene disidratato, provocando la contrazione e l'intrappolamento dei complessi cristallovioletto-iodio. Nelle cellule Gram-negative, l'agente decolorante compromette la membrana esterna, aumentandone la porosità. Ciò consente di lavare via i complessi cristallovioletto-iodio.

Ora che hai compreso i principi alla base della colorazione dei batteri del suolo di Gram, vediamo il processo eseguito sui batteri del suolo in laboratorio.

Dopo aver raccolto un campione di terreno sul campo, portarlo in laboratorio per l'analisi. Affinare il campione con un setaccio e pesare 10 g di terreno setacciato utilizzando una bilancia analitica.

Diluire il campione in 95 mL di soluzione salina tamponata con fosfato e vortice per miscelare. Eseguire ulteriori diluizioni da 1 a 10, vorticando tra ogni diluizione. Trasferire aliquote di almeno 3 diluizioni successive su piastre di agarosio replicate a basso contenuto di nutrienti.

Dopo la sterilizzazione con etanolo-fiamma e il raffreddamento di una bacchetta di vetro piegata picchiettando sul terreno, distribuire il campione sulla superficie delle piastre. Incubare le piastre a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione per 3-5 giorni, selezionare la diluizione più alta con 30-300 colonie discrete. Con un circuito di inoculazione sterile, selezionare le colonie di interesse per l'isolamento.

Strisci la colonia su una sezione di un piatto fresco. Sterilizzando l'anello tra le strisce, fare strisce successive a zig-zag su ciascuna sezione della piastra per consentire il successivo isolamento di singole colonie discrete. Incubare le piastre per 1 o 2 giorni a temperatura ambiente.

Per iniziare la preparazione degli strisci batterici, collegare una clip a un vetrino in vetro pre-pulito per facilitarne la manipolazione. Per ogni striscio batterico, pulire e sterilizzare a fiamma un ansa di inoculazione. Posizionare 2 anelli di acqua distillata sterile al centro del vetrino.

Dopo aver sterilizzato nuovamente l'ansa, rimuovere una piccola quantità di coltura da una colonia isolata e mescolare con l'acqua sul vetrino. È importante raffreddare il circuito prima di toccare la coltura toccando più volte una porzione non inoculata di agar. Lo striscio dovrebbe assomigliare al latte diluito. Lasciare asciugare il vetrino a temperatura ambiente. Dopo l'asciugatura, fissare a caldo lo striscio facendolo passare rapidamente attraverso una fiamma.

Una volta asciutto, pipettare il cristallovioletto sullo striscio e lasciare riposare per 2 - 3 minuti. Sciacquare accuratamente il vetrino con acqua distillata puntando il flusso diretto verso la parte superiore del vetrino, lasciando che l'acqua scorra delicatamente verso il basso. Non dirigere il flusso d'acqua direttamente verso lo striscio.

Coprire il vetrino con lo iodio di Gram. Dopo 2 minuti, sciacquare delicatamente con acqua distillata. Decolorare il vetrino con etanolo al 95% fino a quando la macchia non si lava più via. Risciacquare immediatamente con acqua distillata. Ciò limiterà l'eccessiva decolorazione dello striscio.

Aggiungere la safranina come contromacchia allo striscio per 30 s. Questo colorerà tutte le cellule Gram-negative presenti. Sciacquare delicatamente con acqua distillata e asciugare con carta assorbente. Osservare il vetrino risultante con un microscopio. Utilizzare prima un obiettivo a bassa potenza per effettuare regolazioni grossolane e trovare una parte ideale della macchia prima di passare al campo visivo più piccolo degli ingrandimenti più elevati.

Dopo un'ulteriore imaging e la regolazione dello striscio con un obiettivo di media potenza, aggiungere olio da immersione direttamente allo striscio. L'olio è necessario per obiettivi ad alta potenza che forniranno le migliori micrografie. I batteri Gram-positivi appariranno di colore blu o viola, mentre le cellule Gram-negative saranno rosse o rosa. Oltre alla struttura della parete cellulare, la forma e la disposizione sono chiarite dalle micrografie risultanti.

La capacità della colorazione di Gram di studiare qualitativamente i batteri è importante per un'ampia gamma di campi scientifici.

Il suolo è solo una delle fonti ambientali da cui i batteri possono essere isolati e analizzati. Per l'acqua potabile, la preparazione del campione deve essere modificata. I campioni di acqua del rubinetto possono essere prelevati da un rubinetto e piastrati su terreni di crescita che facilitano la crescita di diverse colonie batteriche eterotrofe. Dopo la placcatura su un mezzo come l'R2A, il processo è quasi identico alla procedura del terreno.

Per alcune tecniche di identificazione batterica, i parametri dipendono dal tipo di parete cellulare dei batteri di interesse. In questo esempio, è stato testato il sangue di un paziente settico che ospitava batteri Gram-positivi.

Con queste informazioni, sono state scelte sonde di acido nucleico peptidico specie-specifiche che si legassero all'rRNA delle cellule. Queste sonde erano legate a coloranti fluorescenti che venivano utilizzati per identificare le specie presenti.

A causa delle differenze fondamentali nella struttura cellulare Gram-positiva e -negativa, i batteri hanno risposte uniche ad altri composti oltre al cristallovioletto. Questo esperimento ha cercato di isolare il Clostridium difficile, un batterio Gram-positivo, da campioni fecali. La cicloserina, che inibisce la crescita delle cellule Gram-negative, è stata aggiunta alla piastra di agar. Le cellule Gram-positive che sono cresciute sulla piastra sono state ulteriormente isolate con altri metodi.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla colorazione di Gram per gli studi ambientali. Ora dovresti capire i vantaggi del processo e come eseguire la tecnica e utilizzare i risultati. Grazie per l'attenzione!