Analisi della curva di crescita batterica e sue applicazioni ambientali

1. Raccolta delle aliquote di coltura batterica

1. Un giorno prima della raccolta dei punti temporali di crescita, inoculare 20 mL di brodo di soia triptasi (TSB) in un matraccio da 50 ml con E. coli.
2. Incubare durante la notte a 27 °C. Questo periodo di incubazione relativamente lungo si traduce in una popolazione in fase stazionaria di E. coli selvatico di circa 10⁹ CFU/ml.
3. Il giorno seguente, utilizzare 100 μL della coltura preparata per inoculare 250 mL di TSB (in un matraccio da 500 mL). Mescolare accuratamente.  Rimuovere un'aliquota di 5 ml e conservare immediatamente in frigorifero a 4 °C. Questo è T = 0 o T₀ punto temporale e dovrebbe contenere circa 4 x 10⁵ CFU / mL.
4. Collocare il matraccio del rimanente E. coli (245 ml) in un incubatore vibrante a 37 °C. Rimuovere aliquote di coltura da 5 ml ogni ora, fino a 8 ore. Conservare ogni aliquota a 4 °C. Designare queste aliquote da T₁ a T₈.

2. Diluizione seriale

1. Rimuovere le aliquote di E. coli dal frigorifero e metterle sul ghiaccio per il trasporto. Mantenere tutte le colture sul ghiaccio fino all'uso.
2. Impostare una serie di tubi di diluizione per ottenere varie diluizioni di ciascuna coltura di E. coli (Figura 3). I tubi microfuga sono convenienti per questa funzione. Ogni tubo di diluizione deve avere 900 μL di liquido di diluizione (soluzione salina sterile). È necessaria una serie di diluizioni per ogni coltura di E. coli (da T₀ a T_8); etichettare ogni tubo secondo la Tabella 2.
   
   Figura 3. Schema che mostra la procedura per la placcatura di E. coli.
3. Iniziare le diluizioni aggiungendo 100 μL di E. coli dal tubo etichettato T₀ (la coltura iniziale di E. coli) al tubo A, che è la diluizione 10^-1 di T₀. Vortice il tubo per 5 s.
4. Successivamente, aggiungere 100 μL di Tubo A al successivo tubo di soluzione salina, Tubo B, che è la diluizione 10^-2 di T₀. Continuare la serie di diluizione necessaria per ogni aliquota del punto temporale. Ricorda di vorticosare ogni tubo prima del trasferimento. È anche importante utilizzare una nuova punta della pipetta per ogni trasferimento.

Coltura di E. coli	Diluizioni necessarie e tubo #
	Un	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Tabella 2. Serie di diluizione richieste per ogni coltura di E. coli.

3. Placcatura

1. Saranno placcate tre diluizioni per ogni aliquota del punto temporale di coltura di E. coli, secondo la Tabella 3. Etichettare le piastre con il punto temporale (da T₁ a T_8),il fattore di diluizione e il volume da aggiungere. Utilizzare piastre triplicate per ogni diluizione.
2. Aggiungere 100 μL di ogni diluizione alla piastra pipettando la quantità al centro della piastra di agar (Figura 3). Distribuire immediatamente l'aliquota utilizzando un'asta di vetro a forma di "L" sterilizzata a fiamma. Se l'aliquota non viene diffusa immediatamente, assorbe in situ sulla piastra, con conseguente crescita eccessiva batterica nel punto di inoculazione iniziale.
3. Ripetere la placcatura per ogni serie di diluizione per i punti temporali da T₁ a T₈. Ricordarsi di sterilizzare l'asta tra le piastre e soprattutto tra le diverse diluizioni.
4. Una volta che le piastre si sono asciugate per alcuni minuti, invertire e posizionare in un incubatore a 37 °C durante la notte. L'inversione delle piastre impedisce alla condensa di cadere sulla piastra di agar. Dopo l'incubazione notturna, le piastre devono essere conservate in frigorifero.

Coltura di E.coli	Diluizioni da placcare
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^* Le diluizioni più basse tengono conto delle popolazioni più basse a causa della fase di morte.

Tabella 3. Protocollo di placcatura per colture di E. coli.

4. Conteggio delle colonie e calcolo del tempo medio di generazione

1. Esaminare le piastre per l'uniformità delle colonie e la mancanza di contaminazione.
2. Per ogni punto temporale (da T₀ a T_8),scegli una diluizione che contiene tra 30 e 300 colonie e conta le piastre triplicate.
3. Utilizzando il fattore di diluizione, calcolare a ricalcolo il numero di cellule per mL di coltura originale nei punti temporali da T₀ a T₈. Ad esempio, se il numero di colonie risultanti da una diluizione^{10 -4} è 30, 28 e 32:
   Numero medio di colonie = 30 colonie
   Questi sono nati da 0,1 ml di una diluizione 10^-4
   Numero di colonie per mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Plot log₁₀ CFU/mL rispetto al tempo (in ore).
5. Dal grafico, identifica la fase esponenziale della crescita. Utilizzando 2 punti temporali all'interno della fase di crescita esponenziale e i numeri di cella corrispondenti in ogni momento, calcolare il tempo medio di generazione.