Analisi della curva di crescita batterica e sue applicazioni ambientali

Misurare il tasso di crescita dei batteri è una tecnica microbiologica fondamentale e ha un uso diffuso nella ricerca di base e nelle applicazioni agricole e industriali.

I batteri sono tra le forme di vita più abbondanti sulla Terra, essendo presenti in ogni ecosistema, incluso il corpo umano. Alcune specie batteriche sono anche geneticamente altamente trattabili e sono state sfruttate come modelli di ricerca o per produrre prodotti naturali o sintetici su scala industriale. Tuttavia, non tutte le specie batteriche possono essere coltivate in laboratorio. Per quelli che possono, una caratteristica importante è il tasso di moltiplicazione, o “cinetica di crescita”.

Misurare il tasso di crescita di una coltura batterica può informare gli scienziati sulle loro funzioni fisiologiche e metaboliche ed è anche utile per ottenere un numero preciso di cellule dei batteri per applicazioni a valle.

Questo video introdurrà i principi alla base dell’analisi del tasso di crescita batterica, dimostrerà un protocollo per caratterizzare il tasso di crescita con una “curva di crescita” e, infine, esplorerà diverse applicazioni di scienze ambientali per misurare la cinetica della crescita batterica.

I batteri generalmente si riproducono asessualmente, moltiplicandosi per la semplice fissione binaria in cui una cellula parentale si divide in due cellule figlie identiche. In condizioni di crescita favorevoli in cui i nutrienti sono disponibili in abbondanza e i parametri ambientali come la temperatura sono tutti favorevoli alla crescita, il tasso di moltiplicazione supera di gran lunga il tasso di mortalità. Ciò si traduce in una crescita esponenziale.

Misurando la quantità di batteri in una coltura in funzione del tempo, è possibile ottenere una curva di crescita. La crescita di batteri in una coltura liquida in condizioni ottimali produce una curva di crescita con una forma caratteristica che può essere suddivisa in varie fasi. La curva inizia con una “fase di ritardo”, quando la crescita è lenta mentre i batteri si acclimatano alle condizioni di coltura. Il prossimo è il “log” o “fase esponenziale”, quando i batteri sperimentano una crescita esponenziale. La crescita alla fine si blocca una volta che i nutrienti si esauriscono e i prodotti di scarto si accumulano, risultando in una “fase stazionaria”. Infine, una volta che il tasso di moltiplicazione è superato dal tasso di morte cellulare, la coltura entra nella “fase di morte”.

Per costruire una curva di crescita, i numeri batterici in un pallone di coltura liquida vengono contati in diversi punti temporali durante un certo periodo di coltivazione. La conta batterica può essere ottenuta con una serie di metodi diversi. Un approccio comune è quello di misurare la densità ottica – o “OD” – 600, che è l’assorbanza della luce della soluzione batterica a una lunghezza d’onda di 600 nm.

Un altro metodo è quello di determinare il “CFU”, o unità formanti colonie, per millilitro della coltura. A causa della natura clonale della crescita batterica, un batterio in una coltura può teoricamente espandersi in una colonia osservabile su una piastra di agar. Placcando una serie di diluizioni di una coltura batterica per raggiungere una concentrazione batterica in cui è possibile osservare colonie individuali e discrete, un metodo chiamato “placcatura di diluizione seriale”, il conteggio delle colonie può essere utilizzato per calcolare a ricalcolo la concentrazione batterica in termini di CFU per mL.

Ora che hai capito come la crescita batterica può essere analizzata, passiamo attraverso un protocollo per condurre l’analisi della curva di crescita su colture pure di un modello batterico ben consolidato, Escherichia coli, utilizzando il metodo di placcatura di diluizione seriale.

Un giorno prima della raccolta del punto temporale, inoculare 20 mL di brodo di soia triptasi pre-sterilizzato, o TSB, mezzo in un matraccio da 50 ml con una singola colonia di E. coli.

Incubare la coltura durante la notte a 37 °C con agitazione. Per E. coli, ciò comporterebbe una popolazione in fase stazionaria di circa 10⁹ CFU/ml.

Il giorno seguente, inoculare 100 μL della coltura notturna in 250 mL di TSB in un matraccio da 500 mL. Mescolare accuratamente. Questo produce una coltura diluita di circa 4 x 10⁵ CFU/ml. Conservare 5 ml di questa coltura diluita in un tubo di coltura. Questa è l’aliquota dal punto temporale 0, o T₀. Conservare in frigorifero immediatamente a 4 °C.

Incubare il volume rimanente della coltura a 37 °C con agitazione. Ogni ora successiva per un massimo di 8 ore, raccogliere aliquote da 5 ml dalla coltura. Designare questi campioni da T₁ a T₈e conservarli tutti a 4 °C fino all’uso.

Il giorno dell’esperimento, rimuovere le aliquote del punto temporale di E. coli dal frigorifero e tenerle sul ghiaccio. Utilizzare tubi di microfuga sterili, ciascuno con 900 μL di soluzione salina sterile, per impostare una serie di diluizione per ogni aliquota secondo la seguente tabella.

Mescolare bene la_coltura T 0 ruotando delicatamente, quindi aggiungere 100 μL al tubo A della sua serie di diluizione, facendo una diluizione 1 in 10 o 10^-1. Vortex Tube A per mescolare e, utilizzando una punta di pipetta fresca, aggiungere 100 μL di Tube A al Tube B, facendo la diluizione 1-in-100 o 10^-2.

Ripetere il processo per ogni aliquota di coltura e fare la serie di diluizione appropriata secondo la tabella 2. Una volta effettuata la serie di diluizione per tutti i campioni di punti temporali, preparare il numero appropriato di piastre sterili di agar di soia triptasi per la placcatura batterica.

3 diluizioni di ogni coltura di punti temporali saranno placcate in triplice secondo la seguente tabella. Etichettare le piastre di conseguenza. Quindi, pipettare 100 μL di ogni coltura opportunamente diluita sul centro della rispettiva piastra di agar. Sterilizzare a fiamma un’asta di vetro a forma di “L”, raffreddare toccando l’asta all’agar lontano dall’inoculo e distribuire immediatamente il liquido sulla superficie dell’agar. Si prega di notare che un ritardo nella diffusione potrebbe causare una crescita eccessiva batterica nel punto dell’inoculazione.

Continuare a placcare ogni serie di diluizione per tutte le colture a 9 punti temporali, sterilizzando a fiamma l’asta di diffusione del vetro tra ciascuna serie di diluizione.

Una volta che le piastre sono state lasciate asciugare per alcuni minuti, invertitele e mettete nell’incubatrice a 37 °C durante la notte. Dopo questo periodo di crescita, le piastre possono essere conservate a 4 °C.

Dopo l’incubazione notturna delle piastre di diluizione, esaminarle per la contaminazione e l’uniformità delle colonie. Per ogni coltura del punto temporale, scegli una diluizione per la quale ci sono tra 30-300 colonie per piastra. Contare il numero di colonie su ciascuna delle piastre triplicate per quella diluizione.

Utilizzando il numero medio di colonie per ogni diluizione e il fattore di diluizione, calcolare la concentrazione di batteri nella coltura originale in ogni punto temporale in CFU/mL. Ad esempio, se ci sono in media 30 colonie dal set di piastre triplicate ottenute da 0,1 mL della diluizione^{10 -4}, o 1 su 10.000, allora ce ne sarebbero 30 divise per 0,1 ml moltiplicate per 10.000, o 3 milioni di CFU / mL.

Utilizzando la concentrazione batterica calcolata per ogni punto temporale, tracciare un grafico del log in base 10 delle concentrazioni batteriche, in CFU/mL, rispetto al tempo in ore. Dal grafico, identificare la fase di log di crescita della coltura batterica originale e scegliere due dei punti temporali all’interno della fase log, designando il primo di questi punti temporali come t = 0. Calcola il tempo medio di generazione usando l’equazione X uguale a 2 alla potenza di n moltiplicata per X₀ dove X è la concentrazione batterica al tempo t, X₀ è la concentrazione iniziale a t = 0 e n è il numero di generazioni trascorse tra i due punti temporali.

Ad esempio, supponiamo che X₀ sia 1.000 CFU/mL e che a t = 6 h la concentrazione sia di 16.000 CFU/mL. Usando l’equazione, otteniamo che 4 generazioni si sono verificate entro 6 ore, il che dà un tempo di generazione di 6 diviso per 4 o 1,5 ore per generazione.

La misurazione della cinetica di crescita batterica è fondamentale per molte applicazioni per scopi di ricerca, agricoltura o bioingegneria.

Un uso per conoscere il tasso di crescita batterica è quello di consentire una quantità accurata di una coltura batterica da ottenere per inoculare un’altra coltura o mezzo. Ad esempio, alcune colture, come i legumi, devono essere coltivate con batteri simbiotici noti come rizobia che colonizzano le radici delle piante per formare noduli e “fissare” l’azoto – convertendo l’azoto atmosferico in ammoniaca che può essere utilizzata dalla pianta. Per le applicazioni agricole, una quantità nota di rizobia viene aggiunta a un mezzo di carbonio a base di torba, che viene quindi utilizzato per inoculare i semi di legumi per stabilire la simbiosi pianta-batterio.

L’analisi della crescita può anche essere utilizzata per identificare specie batteriche che possono degradare i rifiuti industriali e possibilmente generare sottoprodotti preziosi. In questo esempio, i ricercatori hanno studiato come i mezzi di crescita integrati con il liquore nero, un prodotto di scarto della polpa di legno e della produzione di carta, abbiano influenzato la crescita di un isolato microbico ambientale.

I batteri non solo hanno dimostrato una maggiore crescita con il liquore nero, ma hanno anche mostrato un modello di crescita “difasico”, indicando la presenza di più di una fonte di carbonio nel liquore nero che i batteri possono metabolizzare. I singoli componenti del liquore nero potrebbero quindi essere estratti per un’analisi della crescita più dettagliata.

Infine, le misurazioni del tasso di crescita sono utili anche per caratterizzare i batteri che sono stati progettati per particolari scopi industriali, ad esempio per la bonifica dell’inquinamento da petrolio. Qui, gli scienziati hanno creato ceppi batterici geneticamente modificati che contengono enzimi per degradare i componenti idrocarburici del petrolio. L’analisi della crescita è stata eseguita, ad esempio, per verificare che i batteri ingegnerizzati hanno aumentato il tasso di crescita rispetto ai batteri normali in presenza di idrocarburi tossici, indicando una migliore tolleranza che consentirà ai batteri ingegnerizzati di svolgere la loro funzione di pulizia dell’inquinamento.

Hai appena visto il video di JoVE sull’analisi dei tassi di crescita batterica con le curve di crescita. Ora dovresti capire le diverse fasi di crescita delle colture batteriche, come eseguire un esperimento per ottenere una curva di crescita utilizzando la raccolta di punti temporali e la placcatura di diluizione seriale e come l’analisi della crescita può essere applicata alla ricerca e agli scopi industriali. Come sempre, grazie per aver guardato!