Analisi dell'RNA di campioni ambientali mediante RT-PCR

La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa, o RT-PCR, consente il rilevamento dei virus a RNA e dell'espressione genica microbica nell'ambiente.

A differenza degli organismi cellulari, dall'uomo ai batteri, che utilizzano il DNA come materiale genetico, alcuni virus hanno genomi fatti di RNA, inclusi molti virus patogeni come l'influenza, l'Ebola e l'HIV. Mentre alcuni virus possono essere rilevati osservando il fenotipo patogeno che si sviluppa quando viene utilizzato per infettare le cellule in coltura cellulare, la maggior parte non ha metodi di caratterizzazione basati sulle colture. La RT-PCR può essere utilizzata per rilevare la presenza di questi virus nell'ambiente con un'elevata sensibilità.

Allo stesso tempo, gli organismi con genomi basati sul DNA "esprimono" le informazioni genetiche codificate nei loro genomi di DNA "trascrivendole" in messaggero o "m"RNA", che può poi essere "tradotto" in proteine per svolgere funzioni enzimatiche o strutturali nelle cellule. Poiché i microbi rispondono e si adattano ai cambiamenti nell'ambiente attivando o disattivando vari percorsi genetici, la RT-PCR può essere utilizzata per monitorare tali alterazioni nell'espressione genica e fungere da potenziali valutatori dell'ecosistema.

Questo video esaminerà i principi alla base della RT-PCR, delineerà una procedura generalizzata per eseguire questa tecnica e, infine, esaminerà alcuni dei modi in cui questo metodo viene applicato oggi nella microbiologia ambientale.

Ci sono due parti chiave in questa procedura: l'estrazione dell'RNA da campioni biologici, seguita dalla sua trascrizione inversa in DNA.

L'isolamento dell'RNA comporta la lisi delle cellule nel campione mediante l'aggiunta di un detergente che scompone lipidi e proteine, seguito da una disgregazione meccanica. L'estrazione dell'RNA dai virus di solito richiede l'aggiunta di proteinasi, che sono enzimi che digeriscono le proteine, per abbattere i capsidi dei virus, i duri rivestimenti proteici che formano la particella virale. D'altra parte, quando si ottiene l'RNA da organismi cellulari, potrebbe essere necessario trattare il lisato con enzimi che degradano il DNA, o DNAasi, per evitare che i risultati a valle vengano confusi dalla presenza del DNA chimicamente simile.

L'RNA può quindi essere purificato dai lisati in due modi. In un metodo, noto come estrazione acida guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio, il lisato viene miscelato con una miscela organica-acquosa che viene poi centrifugata per separare le fasi. Le proteine saranno suddivise nella fase organica, i detriti cellulari lisati nell'interfase torbida e gli acidi nucleici nella fase acquosa. La fase acquosa superiore può quindi essere raccolta e l'RNA viene precipitato mediante l'aggiunta di alcol come l'isopropanolo, che diminuisce la solubilità dell'acido nucleico in acqua.

Nell'isolamento dell'RNA su colonna, il lisato viene miscelato con alcol e quindi fatto passare attraverso una colonna di filtrazione su gel con una resina caricata negativamente, come la silice. Il lisato viene preparato in modo che gli ioni caricati positivamente nel tampone formino "ponti salini" che consentono alla spina dorsale del fosfato caricata negativamente degli acidi nucleici di legarsi alla resina. Tutti gli altri contaminanti vengono quindi lavati via. Gli acidi nucleici vengono "eluiti" dalla colonna utilizzando un tampone a basso contenuto di sale o acqua. Poiché l'RNA a singolo filamento ha meno cariche negative rispetto al DNA a doppio filamento, può essere eluito preferenzialmente utilizzando tamponi di concentrazioni specifiche.

Una volta isolato, l'RNA viene trasformato nel DNA chimicamente più stabile. Gli scienziati hanno sfruttato un enzima naturalmente codificato da retrovirus come l'HIV. Questo enzima è noto come trascrittasi inversa o "RT".

La RT sintetizza il DNA complementare o "c" da un breve tratto di nucleotidi noto come primer. Questo primer può avere sequenze diverse, a seconda dello scopo dell'esperimento. Ad esempio, il primer può essere progettato per avere una sequenza specifica, al fine di rilevare geni o organismi specifici. Una volta sintetizzato, questo cDNA del "primo filamento" può essere amplificato mediante PCR regolare.

Ora che abbiamo compreso i principi alla base della RT-PCR, diamo un'occhiata a un protocollo per eseguire questa tecnica su campioni di RNA raccolti dall'ambiente.

Per iniziare la procedura, trovare un punto di raccolta del campione utilizzando le coordinate GPS o la vista. Scegli punti casuali all'interno di un'area per ottenere un'indagine generale degli habitat microbici.

Per raccogliere il campione solido, spingere e ruotare una trivella manuale nel terreno fino alla profondità predeterminata. Quando la coclea viene sollevata, il terreno può essere trovato all'interno del gambo cavo della coclea.

Questo terreno viene raschiato, direttamente in un sacco di raccolta del terreno, e il sacco è etichettato con il luogo, il nome, la data, l'ora di raccolta e qualsiasi altra informazione necessaria.

Trasferire il terreno in laboratorio e passare il terreno attraverso un setaccio da 2 mm per rimuovere ghiaia e roccia. Analizza un campione del terreno per il contenuto di umidità, che può essere informativo sul livello di attività microbica nel suolo. Per fare ciò, fare riferimento al video di questa raccolta "Determinazione del contenuto di umidità del suolo".

Per la raccolta dei campioni d'acqua, scegliere un sito di interesse simile alla raccolta del suolo e raccogliere l'acqua in una bottiglia di plastica sterile a pareti spesse. Prendere nota del volume d'acqua raccolto. Testare immediatamente l'acqua per parametri come temperatura, pH e salinità, che possono fornire informazioni importanti sui livelli microbici previsti nel campione. Quindi, metti la bottiglia nel frigorifero e trasferiscila in laboratorio.

I microrganismi come i virus vengono raccolti e concentrati dal campione ambientale.

L'RNA può essere estratto dai virus raccolti con il metodo della colonna di rotazione utilizzando kit di estrazione dell'RNA commerciali secondo le istruzioni del produttore. Il tampone di lisi, integrato con etanolo, viene prima miscelato con il campione. Posizionare il numero appropriato di colonne di centrifuga nelle provette di raccolta, quindi applicare i campioni sulla matrice della colonna. Centrifugare le colonne a circa 12.000 x g per 1-2 minuti per consentire agli acidi nucleici di legarsi alla colonna ed eliminare il flusso di liquido.

Aggiungere il tampone di lavaggio alle colonne e centrifugare nuovamente. Posizionare le colonne in nuove provette sterili da 1,5 mL a bassa aderenza. Quindi, aggiungere acqua priva di RNasi, che sono enzimi che degradano l'RNA, alle colonne e centrifugare per 30 s per eluire l'RNA. L'RNA eluito può essere conservato a -80 ? C fino all'uso.

Prima dell'esperimento, devono essere progettati primer appropriati per rilevare le sequenze di interesse, che possono fungere da marcatori per la presenza di microrganismi specifici.

Estrarre i reagenti RT conservati a -20 ? C e scongelare i reagenti congelati con ghiaccio (o a temperatura ambiente). Questi includono nucleotidi, tampone di trascrizione inversa e primer. Una volta scongelati, tenere i reagenti in ghiaccio; l'enzima trascrittasi inversa e l'inibitore della RNasi devono essere sempre tenuti in ghiaccio.

Mentre i reagenti si scongelano, calcolare i volumi e le concentrazioni dei componenti della reazione. Una volta scongelati i reagenti, agitare delicatamente e far girare ogni provetta per assicurarsi che il contenuto sia ben miscelato.

Lavorando in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni, assemblare i componenti in una miscela master da aggiungere a ciascuna provetta per PCR. Quando si assembla la miscela master in una provetta Eppendorf, assicurarsi di sostituire i puntali delle pipette tra un reagente e l'altro per evitare contaminazioni. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti alla provetta Eppendorf, agitare delicatamente e far girare la provetta di miscelazione master per garantire una miscela omogenea.

Etichettare un set di provette per PCR, assicurandosi di includere i controlli. Aliquotare un volume uguale della miscela master in ciascuna provetta. Quindi, aggiungi componenti specifici della reazione, come gli estratti di RNA o l'acqua per il controllo negativo.

Una volta aggiunti tutti i componenti, posizionare le provette in un termociclatore e impostare l'esecuzione del programma di trascrizione inversa. Il cDNA può quindi essere sottoposto ad amplificazione PCR. Per una descrizione dettagliata di questo passaggio, fare riferimento al video di questa raccolta sulla PCR.

Al termine della PCR, una parte del prodotto PCR può essere separata e visualizzata su un gel di agarosio. Ad esempio, qui è stato utilizzato un primer specifico per il gene per rilevare la presenza di un virus a RNA. Dalla reazione RT-PCR si ottengono bande della dimensione prevista ma non dai controlli negativi, indicando la presenza di questo virus nel campione d'acqua in esame.

L'identificazione di microrganismi a base di RNA mediante RT-PCR consente l'analisi della salute ecologica, dei rischi ambientali e della conservazione della biodiversità.

L'utilizzo di microrganismi per bonificare idrocarburi e solventi da terreni e acque inquinate rappresenta un'alternativa di bonifica ecosostenibile. La comprensione dell'espressione genica microbica nativa può evidenziare specifici percorsi microbici che scompongono i contaminanti in queste condizioni. La RT-PCR viene spesso utilizzata per amplificare l'mRNA da tali campioni ambientali.

Le misure di sanità pubblica spesso richiedono una rapida sorveglianza delle fonti virali di infezione nell'ambiente. L'influenza aviaria, ad esempio, è altamente infettiva e può diffondersi rapidamente al pollame, al bestiame e persino all'uomo. In questo particolare esempio, i ricercatori hanno cercato la minaccia dell'influenza aviaria diffusa dagli uccelli selvatici.

Utilizzando una configurazione e un apparato RT-PCR portatili, hanno esaminato una serie di uccelli selvatici, anche in aree remote, per rilevare precocemente le infezioni e prevenire la trasmissione.

Infine, la RT-PCR può essere utilizzata per caratterizzare i "biopesticidi" in fase di sviluppo per colpire parassiti come il tiratore scelto dalle ali vetrose, Homalodisca vitripennis, l'ospite di una malattia che danneggia gravemente la vite in Nord America. Un nuovo RNA-virus a filamento singolo è in fase di sviluppo come agente per infettare questo insetto. Utilizzando una combinazione di colture cellulari di Homalodisca e la conferma RT-PCR della carica virale, questi autori sono stati in grado di propagare un'alta concentrazione di virus per l'uso come agente di controllo biologico.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'analisi degli organismi ambientali basati sull'RNA mediante RT-PCR. Ora dovresti capire la teoria alla base del protocollo, come applicare la tecnica alla tua ricerca e alcuni dei modi in cui viene utilizzata oggi sul campo. Grazie per l'attenzione!