Analisi dell'RNA di campioni ambientali mediante RT-PCR

1. Raccolta del campione: campione di terreno

1. Trova una posizione di esempio tramite GPS, coordinate o vista.
2. Per il campionamento casuale, scegli punti casuali all'interno di un'area per ottenere un censimento generale degli habitat microbici. Il campionamento del transetto raccoglie da punti lungo una linea retta, ad esempio, adiacenti a un letto di torrente. I campioni della griglia vengono prelevati sistematicamente da punti a intervalli regolari e sono utili per mappare le comunità microbiche in un'area sconosciuta o variabile.
3. Il campionamento all'interno di una profondità di 3-6 pollici (7,5-15 cm) fornisce l'accesso all'attività microbica più abbondante che è vicina, ma non all'interno, la rizosfera (la stretta regione del suolo direttamente interessata dalle radici delle piante e dai loro microrganismi associati).
4. Per raccogliere il campione di terreno, spingere e ruotare una coclea a mano nel terreno alla profondità predeterminata.
5. Sollevare la coclea. Il terreno si trova all'interno del gambo cavo della coclea.
6. Raschiare il terreno sul fondo della coclea in un sacchetto di raccolta del terreno. Assicurati di non toccare o contaminare il terreno.
7. Etichetta correttamente la borsa con posizione, nome, data e ora.
8. In laboratorio, passare il terreno attraverso un setaccio di 2 mm per rimuovere ghiaia e roccia.
9. Analizzare una parte del terreno per il contenuto di umidità del suolo. Per i dettagli di questo passaggio, fare riferimento al video di JoVE Science Education sull'umidità del suolo.

2. Raccolta del campione: campione d'acqua

1. Trova la posizione di esempio tramite GPS, coordinate o vista.
2. Raccogli l'acqua in una bottiglia di stoccaggio. Registrare il volume d'acqua raccolto; se i microbi nel campione sono analizzati quantitativamente, la concentrazione microbica può essere determinata in base al volume raccolto.
3. Testare immediatamente l'acqua per eventuali parametri richiesti per l'esperimento (temperatura, pH, conducibilità, salinità, contenuto di azoto e fosforo, ecc.) utilizzando le apposite sonde elettroniche.
4. Posizionare la bottiglia contenente il campione d'acqua in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio. Trasferire il dispositivo di raffreddamento in laboratorio.

3. Estrazione dell'RNA

1. Per raccogliere e concentrare i microrganismi dal campione ambientale, fare riferimento al video Di educazione scientifica JoVE sull'estrazione di acidi nucleici della comunità.
2. Estrarre l'RNA dai virus utilizzando un kit di estrazione commerciale secondo le istruzioni del produttore.
3. In breve, prima mescolare i campioni con tampone di lisi integrato con etanolo, quindi aggiungere i campioni in colonne di spin.
4. Centrifugare le colonne a circa 12.000 x g, scartare il flowthrough. Aggiungere il tampone di lavaggio alle colonne e centrifugare di nuovo.
5. Aggiungere acqua priva di RNasi alle colonne e centrifugare per 30 s per eluire l'RNA in tubi sterili da microfuga a bassa adesione da 1,5 mL.

4. Trascrizione inversa - PCR

1. Recuperare i seguenti reagenti dal congelatore a -20 °C: dNTP, buffer di trascrizione inversa concentrato(ad esempio,10x), primer (in questo esempio, primer casuali). Scongelarli sul ghiaccio o a temperatura ambiente all'interno di una cappa pulita e tenerli sul ghiaccio una volta scongelati. Recupera anche la trascrittasi inversa e l'inibitore della RNasi e tienili sul ghiaccio.
2. Calcolare i volumi di reagenti necessari per realizzare un "master mix" che combini tutti i reagenti costanti tra ogni reazione (vedere tabella 1 per una reazione del campione). Preparare abbastanza master mix per ogni campione, così come un controllo positivo (utilizzando un modello di trascrizione noto) e un controllo negativo(ad esempio,senza trascrittasi inversa, con solo acqua come modello, ecc.) reazioni. Includi un ulteriore 10% in volume.
3. Assemblare la miscela principale in tubi microfuga a bassa adesione da 1,5 ml. Ciò riduce al minimo il legame delle molecole di reagente alle pareti di plastica dei tubi.
4. Quando i reagenti vengono scongelati, aggiungere volumi calcolati al tubo del microfuga. Vortice delicato e centrifuga ogni tubo prima dell'aggiunta. Assicurarsi di cambiare le punte delle pipette tra l'aggiunta di ciascun reagente per evitare la contaminazione.
5. Dopo aver aggiunto tutti i reagenti, vortice e centrifuga la miscela principale per garantire una miscela omogenea. Rimettere i reagenti in deposito a -20 °C.
6. Preparare ed etichettare strisce PCR a 8 tubi, designando una provetta per ogni campione o reazione di controllo.
7. Aliquota di un volume uguale di miscela master in ciascun tubo. Quindi, aggiungere componenti specifici della reazione, come gli estratti di RNA.
8. Posizionare saldamente il tappo della striscia sulla striscia PCR e centrifugare in una minicentrifuga con un adattatore per tubo strisciante per assicurarsi che tutto il liquido venga raccolto sul fondo di ciascun tubo (Figura 2).
9. Posizionare saldamente la striscia PCR nel termociclatore. Premere verso il basso per assicurarsi che i tubi siano fissati.
10. Impostare il termiciclo per eseguire il programma appropriato per l'RT utilizzato (vedere la Tabella 2 per un protocollo di esempio). Al termine del programma, i tubi conterranno prodotti cDNA, che potranno quindi essere sottoposti ad amplificazione PCR. Per i dettagli, fare riferimento ai video di JoVE Science Education sulla PCR e la PCR quantitativa. Conservare il cDNA a -20 °C fino all'uso.

Figura 2. Striscia a 8 tubi con cappuccio contenente miscela principale ed estratto.

Reagente	Volume per 1 reazione (μL)
Buffer RT 10x	2.0
25x dNTP	0.8
10x Primer casuale	2.0
Multiscrivito	1.0
Inibitore della rnasi	1.0
Grado molecolare H2O	3.2
Volume totale	10

Tabella 1. RT Master Mix Ingredienti.

Fase 1	Fase 2	Fase 3	Fase 4
25 °C , 10 min	37 °C , 120 min	85 °C , 5 min	4 °C , ∞

Tabella 2. Programma termociclatore a reazione RT.