Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
Fonte: Dr. Paul Bower - Purdue University
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è un importante metodo analitico comunemente usato per s…
1. Fare la fase mobile
- Preparare la fase mobile aggiungendo 400 ml di acetonitrile a circa 1,5 L di acqua DI purificata.
- Aggiungere con attenzione 2,4 ml di acido acetico glaciale a questa soluzione.
- Diluire la soluzione ad un volume totale di 2,0 L in un matraccio volumetrico con acqua DI purificata. La soluzione risultante dovrebbe avere un pH compreso tra 2,8 e 3,2.
- Regolare il pH a 4,2 aggiungendo il 40% di idrossido di sodio, in base alle gocce con l'uso di un pHmetro digitale calibrato. Aggiungere molto lentamente una volta che il pH raggiunge 4.0. Questo dovrebbe richiedere circa 50 gocce per realizzare.
- Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana nylon 66 da 0,47 μm sotto vuoto per degassare la soluzione e rimuovere i solidi che potrebbero tappare la colonna cromatografica. È importante degassare la fase mobile per evitare di avere una bolla, che potrebbe causare un vuoto nella fase stazionaria all'ingresso della colonna o farsi strada nella cella del rivelatore, causando instabilità con l'assorbanza UV.
2. Creazione delle soluzioni dei componenti
I tre componenti che devono essere prodotti sono caffeina (0,8 mg / mL), benzoato di potassio (1,4 mg / mL) e aspartame (L-aspartyl-L-fenilalanina metile estere) (6,0 mg / mL). Queste concentrazioni, una volta diluite nello stesso modo, mettono gli standard ai livelli trovati nei campioni di soda.
- Aggiungere 0,40 g di caffeina in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI.
- Aggiungere 0,70 g di benzoato in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI.
- Aggiungere 0,60 g di aspartame a un matraccio volumetrico da 100 ml, quindi diluire fino al segno di 100 ml con acqua DI. Mettere questa soluzione in frigorifero per evitare la decomposizione durante la conservazione.
3. Realizzare le 7 soluzioni standard
I tre componenti hanno tutti coefficienti di distribuzione diversi, che influenzano il modo in cui ciascuno interagisce con entrambe le fasi. Maggiore è il coefficiente di distribuzione, maggiore è il tempo che il componente trascorre nella fase stazionaria, con conseguenti tempi di ritenzione più lunghi nel raggiungere il rivelatore.
- Seguendo il grafico della tabella 1, convogliare la quantità corretta di ciascun componente in un matraccio tarare da 50 ml.
- Diluire ciascuna delle soluzioni stock fino al segno di 50 ml sui palloni volumetrici con fase mobile.
- Versare ogni soluzione standard in piccoli flaconcini etichettati in un rack di campioni.
- Conservare le scaffalature dei campioni in frigorifero, insieme alle soluzioni rimanenti nei palloni volumetrici da 50 ml.
4. Verifica delle impostazioni iniziali del sistema HPLC
- Verificare che la linea dei rifiuti si trova in un contenitore dei rifiuti e che non venga riciclata nella fase mobile.
- Verificare che la portata della fase mobile sia impostata su 0,5 ml/min. Questo è abbastanza alto da consentire a tutti i picchi di eluire entro 5 minuti e abbastanza lento da consentire una buona risoluzione.
- Verificare che la pressione minima e massima e la portata siano impostate sui valori corretti sul pannello frontale del sistema di erogazione del solvente (la pompa).
- Impostazione della pressione minima: 250 psi (questo per spegnere la pompa, se si verifica una perdita).
- Impostazione della pressione massima: 4.000 psi (questo per proteggere la pompa dalla rottura, se si forma uno zoccolo).
- Premere "zero" sul pannello frontale del rilevatore per impostare lo spazio vuoto (lo spazio vuoto è la fase mobile pura).
- Risciacquare una siringa da 100 μL con acqua deionizzata, quindi con diversi volumi di uno degli standard di lavoro da analizzare, e riempire la siringa con quella soluzione. Inizia con i 3 campioni monocomponenti, che consentono di identificare il picco di ciascun componente di interesse.
5. Iniezione manuale del campione e della raccolta dei dati
- Con la maniglia dell'iniettore in posizione di carico, iniettare lentamente 100 μL di soluzione attraverso la porta del setto.
- Verificare che il programma di raccolta dati sia impostato per raccogliere dati per 300 s, il che consente tempo sufficiente affinché tutti e 3 i picchi eluino attraverso il rilevatore.
- Quando si è pronti per iniziare la prova, ruotare la maniglia dell'iniettore nella posizione di iniezione (che inietta il campione nella fase mobile) e fare clic su "Avvia prova" sul programma di raccolta dati del computer immediatamente. Per gli standard 1-3, solo uno dei tre picchi sequenziali viene visualizzato sullo schermo durante l'esecuzione (Figura 1).
- Una volta trascorsi 300 s, la raccolta dati invia una richiesta per salvare il file di dati. Salvare i dati con un nome di file adatto(ad esempio,STD#1).
- Prendere nota del tempo in secondi per il picco di ogni prova, che viene utilizzato per identificare quel componente.
- Rimuovere la siringa dal setto e ripetere il processo per ciascuno degli standard di lavoro rimanenti, utilizzando lo stesso tempo per cromatogramma determinato dalla prima esecuzione.
Figura 1. Il cromatogramma dei 3 componenti. Da sinistra a destra, sono caffeina, aspartame e benzoato.
6. I campioni di bibite dietetiche
Diet Coke, Diet Pepsi e Coke Zero sono le "incognite". Sono stati lasciati fuori in contenitori aperti durante la notte per sbarazzarsi della carbonatazione, poiché le bolle non sono buone per il sistema HPLC. Questo elimina sufficientemente tutti i gas nei campioni.
- Aspirare circa 2 ml di soda dietetica in una siringa di plastica.
- Attaccare la punta del filtro alla siringa tramite Luer-Lok ruotandola in posizione.
- Spingere il liquido nella siringa attraverso il filtro e in un piccolo flaconcino di vetro. Questo elimina le particelle indesiderate che potrebbero potenzialmente ostruire la colonna di separazione.
- Diluire ogni campione con una quantità uguale di acqua DI, in modo che siano al 50% di purezza.
- Iniettare 100 μL del campione nel ciclo del campione ed eseguire prove con gli stessi parametri degli standard.
7. Calcoli
- Dalle concentrazioni delle soluzioni dei componenti, calcolare la concentrazione di tutti i componenti negli standard, in base alle diluizioni effettuate per i 7 campioni.
- Determinare le aree di picco sui cromatogrammi per ciascun campione standard e sconosciuto con il metodo triangolare, che equivale all'altezza del picco volte la larghezza a 1/2 altezza (Figura 2). Dopo aver determinato quale picco corrisponde a ciascun componente in base al tempo necessario a ciascun componente per mostrare il rispettivo picco, inserisci queste aree di picco in un foglio di calcolo del computer.
- Creare curve di calibrazione dell'area di picco rispetto alla concentrazione (mg/L) negli standard per tutti e tre i componenti.
- Determinare i minimi quadrati adatti a ciascuna curva di calibrazione.
- Calcola la concentrazione di ciascun componente nelle bibite dietetiche dalle aree di picco mostrate dagli studi HPLC per i campioni. Ricorda che la soda dietetica è stata diluita di un fattore 2 prima di essere iniettata nel sistema HPLC.
- Calcolare la quantità, in mg/L, di ogni componente delle bibite dietetiche.
- Sulla base dei risultati, calcolare i milligrammi di ciascun componente trovato in una lattina di soda da 12 once. Supponiamo 12 oz = 354,9 ml.
Figura 2. Un esempio di base dell'altezza e della larghezza di picco di una curva, che devono essere moltiplicate (altezza di picco per larghezza a 1/2 altezza).
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una tecnica altamente versatile che separa i componenti di una miscela liquida in base alle loro diverse interazioni con una fase stazionaria.
L'HPLC è un adattamento della cromatografia su colonna. Nella cromatografia su colonna, una colonna è impacchettata con microsfere su microscala chiamate fase stazionaria. Le perle di fase stazionaria sono funzionalizzate con gruppi chimici che inducono un'interazione tra la perlina e i componenti di una miscela situata nella fase liquida, o mobile. Mentre la miscela scorre attraverso la colonna, i componenti interagiscono con la fase stazionaria in modo diverso.
Nell'HPLC, la cromatografia su colonna viene eseguita a una velocità di flusso più elevata, e quindi a una pressione più elevata, rispetto alla cromatografia su colonna classica. Ciò consente l'uso di perle di fase stazionarie più piccole con un rapporto superficie/volume maggiore, che aumenta notevolmente l'interazione della fase stazionaria e dei componenti nella fase mobile.
Questo video introdurrà le basi del funzionamento dell'HPLC dimostrando la separazione dei componenti di varie bibite dietetiche.
Esistono due tipi di HPLC utilizzati in laboratorio: analitica e preparativa. Nell'HPLC analitica, lo strumento viene utilizzato per identificare componenti di piccolo volume e il campione analizzato viene quindi scartato come rifiuto. Nell'HPLC preparativa, lo strumento viene utilizzato per purificare una miscela e la quantità desiderata di ciascun componente viene raccolta in frazioni.
La strumentazione HPLC è costituita da una serie di semplici componenti. In primo luogo, la fase mobile, contenuta in serbatoi di solvente, viene pompata attraverso il sistema da una o più pompe a portata costante. Il campione viene iniettato nel flusso di fase mobile dall'iniettore di campioni. Il campione, diluito dalla fase mobile, viene quindi consegnato alla colonna HPLC, dove i componenti del campione vengono separati. I componenti vengono quindi analizzati dal rivelatore e salvati in frazioni per un uso successivo o trasferiti in una bottiglia di scarto.
La colonna HPLC è il componente chiave del sistema. È composto da un cilindro di metallo o plastica, confezionato con microsfere di fase stazionaria o resina per cromatografia. La miscela di campioni scorre attraverso il letto di particelle impaccate a una velocità di flusso costante e ogni componente interagisce con la fase stazionaria mentre scorre.
I composti interagiscono con la fase stazionaria in modo diverso e quindi viaggiano lungo la lunghezza della colonna fino al rivelatore a una velocità diversa. Il tempo necessario a un componente per uscire dalla colonna, o eluire, è chiamato tempo di ritenzione. Il risultato è un grafico del tempo di ritenzione rispetto all'intensità, o un cromatogramma. Il tempo di ritenzione viene utilizzato per identificare il componente. La dimensione del picco, in particolare l'area sotto il picco, viene utilizzata per quantificare la quantità del composto nella soluzione iniziale.
La scelta della fase stazionaria dipende dalle proprietà dei componenti della miscela campione. La fase stazionaria più comunemente usata sono le perle di silice, poiché sono un materiale inerte non polare che forma microsfere e raggiunge una densità di impacchettamento sufficiente. Il tipo più comune di HPLC è la cromatografia in fase inversa, che utilizza una fase stazionaria idrofobica, tipicamente perle di silice con catene C18 legate alla superficie delle perle. I componenti vengono eluiti in ordine decrescente di polarità.
La fase mobile utilizzata nella cromatografia in fase inversa è tipicamente una miscela di acqua e un solvente organico, come l'acetonitrile. A seconda del campione, la fase mobile può rimanere un rapporto costante di acqua e solvente organico, noto come modalità isocratica. Tuttavia, questo può portare a picchi ampi, nel caso di un alto contenuto d'acqua, o a picchi sovrapposti, nel caso di un alto contenuto organico.
Il rapporto di fase mobile può anche essere modificato linearmente o gradualmente durante la separazione, per creare un gradiente di fase mobile. Un'eluizione a gradiente può prevenire l'allargamento del picco delle componenti meno polari, migliorando così la separazione e accorciando il tempo di eluizione.
Ora che le basi dell'HPLC sono state delineate, la tecnica HPLC sarà dimostrata in laboratorio. In questo esperimento, l'HPLC verrà utilizzato per separare e quantificare tre componenti comuni della soda dietetica.
Innanzitutto, per preparare la fase mobile, aggiungere 400 ml di acetonitrile a 1,5 litri di acqua deionizzata purificata. Quindi aggiungere con cautela 2,4 ml di acido acetico glaciale. Diluire la soluzione fino a un volume totale di 2 L. La soluzione risultante dovrebbe avere un pH compreso tra 2,8 e 3,2.
Regolare il pH a 4,2 aggiungendo il 40% di NaOH, goccia a goccia, alla soluzione di agitazione, con l'uso di un pHmetro calibrato.
Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,47 μm sotto vuoto per degassare la soluzione e rimuovere i solidi che potrebbero ostruire la colonna. È importante degassare la soluzione, poiché le bolle possono causare vuoti nella fase stazionaria o farsi strada verso la cella del rivelatore e causare instabilità nelle misurazioni.
Prepara tre soluzioni componenti di caffeina, benzoato e aspartame, che sono tre componenti tipici delle bibite dietetiche. Queste soluzioni componenti vengono quindi utilizzate per preparare le soluzioni standard che verranno utilizzate per determinare le incognite. Preparare 500 ml di soluzioni di caffeina e benzoato.
Preparare 100 mL della soluzione del componente aspartame. Conservare la soluzione in frigorifero quando non viene utilizzata per evitare la decomposizione.
Successivamente, prepara 7 soluzioni standard, ciascuna con diverse concentrazioni di caffeina, benzoato e aspartame. Inserire la giusta quantità di ciascun componente in un matraccio tarato e diluire fino a 50 ml con la fase mobile.
Le prime 3 soluzioni contengono ciascuna un componente, per consentire l'identificazione dei picchi. Le altre 4 soluzioni contengono un intervallo di concentrazioni di tutti e 3 i componenti, al fine di correlare l'altezza del picco alla concentrazione.
Versare ogni soluzione standard in una fiala etichettata in un rack per campioni. Conservare il rack per campioni con i campioni e le soluzioni rimanenti in frigorifero.
Per prima cosa, predisponi la fase mobile e i contenitori dei rifiuti. Assicurarsi che le linee di scarico vengano immesse in un contenitore di scarico e non vengano riciclate nella fase mobile. Assicurarsi che la linea di fase mobile di ingresso sia alimentata nel contenitore di fase mobile.
Verificare che la velocità di flusso della fase mobile sia impostata su 0,5 mL/min. Questa velocità di flusso consentirà a tutti i componenti di eluire entro 5 minuti, ma è abbastanza lenta da garantire la risoluzione dei singoli picchi.
Successivamente, verificare le pressioni minima e massima sul sistema di erogazione del solvente. Queste impostazioni spengono la pompa rispettivamente in caso di perdita o intasamento.
Premere "zero" sul pannello frontale del rivelatore per impostare il bianco. Risciacquare un 100-? L. siringa con acqua deionizzata, quindi con diversi volumi di 1 dei 7 standard di lavoro. Quindi riempi la siringa con quella soluzione. Iniziare con i 3 campioni monocomponente per identificare il picco di ciascun componente.
Successivamente, iniettare manualmente la soluzione, posizionando la maniglia dell'iniettore in posizione di carico. Iniettare lentamente il 100 ? L di soluzione attraverso la porta del setto.
Verificare che il programma di raccolta dati sia impostato per raccogliere dati per 300 s, il che consente un tempo sufficiente per l'eluizione di tutti e 3 i picchi attraverso il rivelatore. Quando si è pronti per iniziare la prova, ruotare la maniglia dell'iniettore in posizione di iniezione, al fine di iniettare il campione nella fase mobile. Immediatamente, fai clic su "Avvia prova" nel programma di raccolta dati. Al termine della scansione, ripetere il processo per ciascuna delle 7 soluzioni standard. Per ciascuno dei primi 3 standard, appare solo uno dei 3 picchi. Annotare la posizione del picco, che viene utilizzata per identificare il componente.
Seleziona 3 campioni di soda dietetica e lasciali riposare in contenitori aperti durante la notte per rimuovere la carbonatazione.
Dopo il degasaggio notturno, aspirare circa 3 ml di ciascuna bibita dietetica in una siringa di plastica. Quindi, collegare un puntale del filtro alla siringa e spingere la soda attraverso il filtro in una fiala di vetro, al fine di rimuovere eventuali particelle solide.
Diluire 2 mL di ciascun campione con 2 mL della fase mobile per dimezzare la concentrazione di soda.
Pareggio 100 ? L di uno dei campioni di soda in una siringa e iniettarlo nel circuito del campione. Esegui la versione di prova con parametri identici alle soluzioni standard. Ripetere l'operazione per ogni campione di soda.
Innanzitutto, correlare le aree di picco dei campioni standard alle concentrazioni note. A tal fine, determinare le aree di picco sui cromatografi per ciascun campione standard utilizzando il metodo triangolare. Calcola i tempi di altezza di picco con la larghezza a metà dell'altezza e usa questo valore come area di picco.
Utilizzando l'area del picco e le concentrazioni note, è possibile creare una curva di calibrazione per ciascun componente e determinare l'adattamento dei minimi quadrati per ciascuna curva di calibrazione.
Calcola la concentrazione di ciascun componente nelle bibite dietetiche dalle zone di picco. Ricorda che le bibite sono state tutte diluite di un fattore 2 prima dell'iniezione nell'HPLC. Sulla base di questi risultati, calcola i mg di ciascun componente in una lattina di soda da 12 once.
Non sorprende che tutte e 3 le bibite testate contenessero all'incirca la stessa quantità di conservante benzoato. Tuttavia, i prodotti Coca-Cola contenevano più caffeina. I valori calcolati per tutti i componenti erano ben correlati ai valori riportati dai produttori.
L'HPLC è uno strumento estremamente versatile, che viene utilizzato in un'ampia gamma di analisi.
L'HPLC viene spesso utilizzato per purificare le molecole peptidiche. In questo esempio, sono stati preparati complessi peptidici transmembrana e poi stabilizzati mediante reticolazione ossidativa delle proteine con legami disolfuro.
Le proteine sono state poi disciolte in acido formico e purificate utilizzando l'HPLC in fase inversa. Il campione è stato quindi eluito utilizzando un gradiente lineare di due solventi e la purezza è stata confermata con la spettrometria di massa.
L'HPLC può essere utilizzata anche per identificare i composti organici sintetizzati in laboratorio. Nell'esperimento di Miller-Urey è stata studiata la sintesi abiotica di composti organici sulla terra primordiale. I gas primordiali, come il metano e l'ammoniaca, sono stati introdotti in una fiaschetta contenente acqua, simulando i primi oceani. È stata quindi applicata una scarica elettrica, imitando i fulmini sulla terra primordiale.
L'acqua è stata quindi analizzata utilizzando HPLC accoppiata con spettrometria di massa e confrontata con standard di amminoacidi noti. In questo esperimento sono stati sintetizzati e identificati 23 amminoacidi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'HPLC. A questo punto è necessario comprendere le nozioni di base sull'esecuzione dello strumento e sull'analisi dei dati risultanti.
Grazie per l'attenzione!
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.