Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)

1. Fare la fase mobile

1. Preparare la fase mobile aggiungendo 400 ml di acetonitrile a circa 1,5 L di acqua DI purificata.
2. Aggiungere con attenzione 2,4 ml di acido acetico glaciale a questa soluzione.
3. Diluire la soluzione ad un volume totale di 2,0 L in un matraccio volumetrico con acqua DI purificata. La soluzione risultante dovrebbe avere un pH compreso tra 2,8 e 3,2.
4. Regolare il pH a 4,2 aggiungendo il 40% di idrossido di sodio, in base alle gocce con l'uso di un pHmetro digitale calibrato. Aggiungere molto lentamente una volta che il pH raggiunge 4.0. Questo dovrebbe richiedere circa 50 gocce per realizzare.
5. Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana nylon 66 da 0,47 μm sotto vuoto per degassare la soluzione e rimuovere i solidi che potrebbero tappare la colonna cromatografica. È importante degassare la fase mobile per evitare di avere una bolla, che potrebbe causare un vuoto nella fase stazionaria all'ingresso della colonna o farsi strada nella cella del rivelatore, causando instabilità con l'assorbanza UV.

2. Creazione delle soluzioni dei componenti

I tre componenti che devono essere prodotti sono caffeina (0,8 mg / mL), benzoato di potassio (1,4 mg / mL) e aspartame (L-aspartyl-L-fenilalanina metile estere) (6,0 mg / mL). Queste concentrazioni, una volta diluite nello stesso modo, mettono gli standard ai livelli trovati nei campioni di soda.

1. Aggiungere 0,40 g di caffeina in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI.
2. Aggiungere 0,70 g di benzoato in un matraccio volumetrico da 500 ml, quindi diluire fino al segno di 500 ml con acqua DI.
3. Aggiungere 0,60 g di aspartame a un matraccio volumetrico da 100 ml, quindi diluire fino al segno di 100 ml con acqua DI. Mettere questa soluzione in frigorifero per evitare la decomposizione durante la conservazione.

3. Realizzare le 7 soluzioni standard

I tre componenti hanno tutti coefficienti di distribuzione diversi, che influenzano il modo in cui ciascuno interagisce con entrambe le fasi. Maggiore è il coefficiente di distribuzione, maggiore è il tempo che il componente trascorre nella fase stazionaria, con conseguenti tempi di ritenzione più lunghi nel raggiungere il rivelatore.

1. Seguendo il grafico della tabella 1, convogliare la quantità corretta di ciascun componente in un matraccio tarare da 50 ml.
2. Diluire ciascuna delle soluzioni stock fino al segno di 50 ml sui palloni volumetrici con fase mobile.
3. Versare ogni soluzione standard in piccoli flaconcini etichettati in un rack di campioni.
4. Conservare le scaffalature dei campioni in frigorifero, insieme alle soluzioni rimanenti nei palloni volumetrici da 50 ml.

4. Verifica delle impostazioni iniziali del sistema HPLC

1. Verificare che la linea dei rifiuti si trova in un contenitore dei rifiuti e che non venga riciclata nella fase mobile.
2. Verificare che la portata della fase mobile sia impostata su 0,5 ml/min. Questo è abbastanza alto da consentire a tutti i picchi di eluire entro 5 minuti e abbastanza lento da consentire una buona risoluzione.
3. Verificare che la pressione minima e massima e la portata siano impostate sui valori corretti sul pannello frontale del sistema di erogazione del solvente (la pompa).
   1. Impostazione della pressione minima: 250 psi (questo per spegnere la pompa, se si verifica una perdita).
   2. Impostazione della pressione massima: 4.000 psi (questo per proteggere la pompa dalla rottura, se si forma uno zoccolo).
4. Premere "zero" sul pannello frontale del rilevatore per impostare lo spazio vuoto (lo spazio vuoto è la fase mobile pura).
5. Risciacquare una siringa da 100 μL con acqua deionizzata, quindi con diversi volumi di uno degli standard di lavoro da analizzare, e riempire la siringa con quella soluzione. Inizia con i 3 campioni monocomponenti, che consentono di identificare il picco di ciascun componente di interesse.

5. Iniezione manuale del campione e della raccolta dei dati

1. Con la maniglia dell'iniettore in posizione di carico, iniettare lentamente 100 μL di soluzione attraverso la porta del setto.
2. Verificare che il programma di raccolta dati sia impostato per raccogliere dati per 300 s, il che consente tempo sufficiente affinché tutti e 3 i picchi eluino attraverso il rilevatore.
3. Quando si è pronti per iniziare la prova, ruotare la maniglia dell'iniettore nella posizione di iniezione (che inietta il campione nella fase mobile) e fare clic su "Avvia prova" sul programma di raccolta dati del computer immediatamente. Per gli standard 1-3, solo uno dei tre picchi sequenziali viene visualizzato sullo schermo durante l'esecuzione (Figura 1).
4. Una volta trascorsi 300 s, la raccolta dati invia una richiesta per salvare il file di dati. Salvare i dati con un nome di file adatto(ad esempio,STD#1).
5. Prendere nota del tempo in secondi per il picco di ogni prova, che viene utilizzato per identificare quel componente.
6. Rimuovere la siringa dal setto e ripetere il processo per ciascuno degli standard di lavoro rimanenti, utilizzando lo stesso tempo per cromatogramma determinato dalla prima esecuzione.

Figura 1. Il cromatogramma dei 3 componenti. Da sinistra a destra, sono caffeina, aspartame e benzoato.

6. I campioni di bibite dietetiche

Diet Coke, Diet Pepsi e Coke Zero sono le "incognite". Sono stati lasciati fuori in contenitori aperti durante la notte per sbarazzarsi della carbonatazione, poiché le bolle non sono buone per il sistema HPLC. Questo elimina sufficientemente tutti i gas nei campioni.

1. Aspirare circa 2 ml di soda dietetica in una siringa di plastica.
2. Attaccare la punta del filtro alla siringa tramite Luer-Lok ruotandola in posizione.
3. Spingere il liquido nella siringa attraverso il filtro e in un piccolo flaconcino di vetro. Questo elimina le particelle indesiderate che potrebbero potenzialmente ostruire la colonna di separazione.
4. Diluire ogni campione con una quantità uguale di acqua DI, in modo che siano al 50% di purezza.
5. Iniettare 100 μL del campione nel ciclo del campione ed eseguire prove con gli stessi parametri degli standard.

7. Calcoli

1. Dalle concentrazioni delle soluzioni dei componenti, calcolare la concentrazione di tutti i componenti negli standard, in base alle diluizioni effettuate per i 7 campioni.
2. Determinare le aree di picco sui cromatogrammi per ciascun campione standard e sconosciuto con il metodo triangolare, che equivale all'altezza del picco volte la larghezza a 1/2 altezza (Figura 2). Dopo aver determinato quale picco corrisponde a ciascun componente in base al tempo necessario a ciascun componente per mostrare il rispettivo picco, inserisci queste aree di picco in un foglio di calcolo del computer.
3. Creare curve di calibrazione dell'area di picco rispetto alla concentrazione (mg/L) negli standard per tutti e tre i componenti.
4. Determinare i minimi quadrati adatti a ciascuna curva di calibrazione.
5. Calcola la concentrazione di ciascun componente nelle bibite dietetiche dalle aree di picco mostrate dagli studi HPLC per i campioni. Ricorda che la soda dietetica è stata diluita di un fattore 2 prima di essere iniettata nel sistema HPLC.
6. Calcolare la quantità, in mg/L, di ogni componente delle bibite dietetiche.
7. Sulla base dei risultati, calcolare i milligrammi di ciascun componente trovato in una lattina di soda da 12 once. Supponiamo 12 oz = 354,9 ml.

Figura 2. Un esempio di base dell'altezza e della larghezza di picco di una curva, che devono essere moltiplicate (altezza di picco per larghezza a 1/2 altezza).