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La saponificazione è una tecnica comunemente usata per rimuovere gli esteri metilici degli acidi grassi da una miscela organica complessa.
I campioni organici complessi vengono spesso analizzati mediante gascromatografia, che viene utilizzata per determinare le concentrazioni relative dei singoli componenti.
Tuttavia, i composti che sono simili per dimensioni e struttura non possono essere distinti dallo strumento, distorcendo i risultati. Pertanto, i composti indesiderati che producono segnali sovrapposti devono essere rimossi per ottenere risultati accurati.
Questo video illustra l'uso della saponificazione per purificare gli alchenoni per la paleoclimatologia. È il primo di una serie che descrive in dettaglio la purificazione di campioni di biomarcatori complessi. Coprirà la procedura, così come alcuni altri usi della tecnica.
È stato dimostrato che gli alchilchetoni polinsaturi a catena lunga, chiamati alcheni, forniscono informazioni utili sulla temperatura superficiale del mare nel passato.
Tuttavia, gli organismi che producono alchenoni spesso creano esteri metilici di acidi grassi simili per dimensioni e struttura chimica, chiamati alchenoati. A causa di queste somiglianze, gli alchenoati devono essere rimossi prima di poter ottenere un'analisi accurata.
La saponificazione è una tecnica comune utilizzata per prevenire la co-eluizione di queste molecole. La saponificazione utilizza l'acqua per scindere il legame molecolare di un estere. Una base si attacca al carbonio nel cuore dell'alchenato. Questa reazione di addizione crea un intermedio instabile e l'alcossido viene espulso.
L'idrogeno dell'acido appena formato si sposta verso l'alcossido espulso e l'anione carbossilato risultante forma un legame ionico con il catione dalla base. Il risultato è un alcol e un sale di acidi grassi. L'aggiunta di un acido forte rigenererà l'acido carbossilico. A questo punto, l'alchenoato incriminato è stato convertito in una forma che non eluisce più con l'alchenone di interesse.
Ora che hai capito come la saponificazione può essere utilizzata per purificare una miscela organica, sei pronto per iniziare la procedura.
Innanzitutto, acquisisci un estratto lipidico totale essiccato - o TLE - ottenuto utilizzando un metodo di estrazione con solvente. Successivamente, preparare le soluzioni di saponificazione come indicato nel protocollo di testo. Assicurarsi che tutti i componenti siano puri e privi di idrocarburi. Una volta preparate le soluzioni, aggiungere il TLE essiccato in una fiala di vetro borosilicato da 60 ml. Aggiungere 2 mL di idrossido di potassio normale 2 e sigillare il flaconcino. Quindi, riscaldare la fiala a 60 ? C per 2,5 ore per scindere il legame estere. Al termine, lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente. Una volta che il campione si è raffreddato, aggiungere 2 mL di soluzione di cloruro di sodio al 5% al flaconcino. Tappare la fiala e agitare brevemente. Aggiungere 6 N di acido cloridrico goccia a goccia fino a raggiungere un pH di 2, utilizzando la carta pH per il test. L'aggiunta di questo acido protonerà l'anione carbossilato per formare il prodotto finale: l'acido carbossilico stabile.
Ora che la soluzione acidificata è priva di esteri, aggiungere 5 mL di esano. Tappate e agitate energicamente per 5 secondi per estrarre i composti organici dall'acqua. Lasciare riposare la soluzione fino a quando le fasi organica e acquosa non si separano completamente. I sali, gli ioni e l'acido cloridrico non reagito rimarranno nella fase acquosa, mentre i composti organici si separeranno nell'esano. Una volta che le fasi si sono completamente separate, rimuovere circa il 75% dell'esano utilizzando una pipetta ed erogare in un altro flaconcino da 40 ml. Ripetere questo processo di estrazione altre due volte, aggiungendo 5 ml di esano ogni volta. Una volta completato, gettare la soluzione acquosa rimanente in un contenitore per rifiuti adeguato. Etichettare il flacone contenente la fase organica appena saponificata. Gli acidi carbossilici prodotti non possono essere iniettati negli strumenti comunemente utilizzati per l'analisi degli alchenoni senza un'ulteriore purificazione. Gli acidi carbossilici iniettati in un gascromatografo si accumulano rapidamente e rovinano gli ingressi, i rivestimenti di ingresso e l'estremità anteriore delle colonne. Per rimuovere questi acidi, il campione deve prima essere sottoposto a un'altra tecnica di purificazione: la separazione tramite cromatografia su colonna.
La saponificazione ha diverse applicazioni nell'estrazione e nella purificazione di molecole organiche.
La saponificazione può essere utilizzata non solo per separare i biomarcatori, ma anche per estrarre singoli componenti da utilizzare in prodotti commerciali. In questo esempio, i composti dell'albero del tabacco -? Nicotiana glauca?- sono stati isolati e analizzati per studiare il loro potenziale come materia prima per un'ampia varietà di prodotti a base biologica, come carburante, calore e una serie di composti chimici.
Le foglie sono state prima omogeneizzate, poi centrifugate, per concentrare le molecole di interesse. Il materiale vegetale concentrato è stato poi saponificato. Il materiale estratto è stato analizzato con cromatografia liquida-spettrometria di massa, per determinare la concentrazione di tocoferolo, una famiglia di composti della vitamina E tipicamente presenti nelle piante.
Il materiale estratto può anche essere ricostituito, in vitro, nella sua composizione originale. In questo esempio, la saponificazione è stata utilizzata per estrarre carotenoidi dalle piante di spinaci, per essere successivamente ricostituiti in vitro. Gli spinaci sono stati prima omogeneizzati, poi centrifugati, per raccogliere le molecole di pigmento. Queste molecole sono state poi sospese in una soluzione di idrossido di potassio in un imbuto separatore, avviando la saponificazione. I carotenoidi saponificati si separarono in uno strato di etere, che fu raccolto ed essiccato. Utilizzando una serie di tamponi in soluzione, i carotenoidi - e altre molecole di pigmentazione - sono stati successivamente ricostituiti in vitro. Questa purificazione ha permesso l'analisi di questi pigmenti senza l'interferenza di composti organici strutturati in modo simile.
Grazie alla sua capacità di idrolizzare gli esteri, la saponificazione può essere utilizzata per "liberare" composti che altrimenti sarebbero legati alle macromolecole. In questo esempio, una fase di saponificazione anidra viene utilizzata per convertire il 4-fluorobenzoato di etile nel sale dell'acido carbossilico del potassio4-fluorobenzoato. Questa deprotezione attraverso la saponificazione consente la produzione di SFB grezzo, una reazione che non sarebbe possibile se la molecola fosse rimasta "bloccata".
Avete appena visto l'introduzione di JoVE alla purificazione di campioni di Uk'37 attraverso la saponificazione. Ora dovresti capire come funziona la saponificazione e come usarla per purificare gli alchenoni in un estratto lipidico totale. Ulteriori processi di purificazione saranno dimostrati nei video successivi.
Grazie per l'attenzione!