Purificazione di un estratto lipidico totale con la cromatografia su colonna

1. Impostazione e preparazione dei materiali

1. Ottenere un estratto lipidico totale (TLE) utilizzando un metodo di estrazione con solvente (sonicazione, Soxhlet o estrazione con solvente accelerato (ASE)).
2. Raccogliere quanto segue: pipette e bulbi di vetro borosilicato bruciato, gel di silice, esano, diclorometano (DCM) e metanolo.
   1. Questi materiali possono essere acquistati da qualsiasi rivenditore di prodotti chimici. I reagenti devono essere puri e privi di idrocarburi.
3. Ottenere anche lana di vetro bruciata e fiale di vetro borosilicato da 4 ml.
4. Assicurarsi di disporre di un mezzo per sostenere la colonna e i flaconcini di raccolta durante la procedura. Ad esempio, un supporto con morsetti e un rack vile. Molti laboratori hanno progettato rack su misura che contengono diverse colonne e fiale di raccolta (Figura 2). Ciò consente di eseguire più colonne contemporaneamente.

2. Metodi

1. Iniziare con il campione secco in un flaconcino da 4 ml. Se il campione pesa più di ~ 10 mg quando è asciutto, potrebbe essere necessario dividerlo prima di eseguire i passaggi successivi poiché il gel di silice può reagire solo con una massa finita di materia organica.
2. Sospendere il campione in una piccola quantità di esano. Questo è il primo e il meno polare dei tre solventi utilizzati in questo esperimento.
3. Se c'è un campione attaccato all'interno del flaconcino, sonicare i campioni per 5 minuti.
4. Caricare una piccola quantità di lana di vetro nella parte superiore di una pipetta utilizzando un set di pinzette pulite. Spingere delicatamente la lana di vetro sul fondo della pipetta, usando un'altra pipetta, per formare una spina.
5. Trasferire con attenzione il gel di silice nella pipetta fino a quando non è circa mezzo pieno.
6. Posizionare un flaconcino di raccolta dei rifiuti da 4 ml sotto la colonna.
7. Immergere il gel di silice nella pipetta con 3 volumi di esano. Ciò condiziona la colonna, rimuove le bolle d'aria e risciacqua eventuali impurità dal gel di silice.
8. Una volta terminato il lavaggio finale, rimuovere il flaconcino di raccolta dei rifiuti e sostituirlo con un flaconcino per raccogliere la frazione apolare.
9. Trasferire con cura l'intero campione in esano sulla colonna utilizzando una pipetta. Risciacquare il flaconcino del campione altre due volte con piccoli volumi di esano e trasferirlo sulla colonna. Lasciare che l'esano in cui è stato trasferito il campione sia completamente immerso nel gel di silice. In nessun momento durante la procedura il gel di silice dovrebbe asciugarsi.
10. Continuare ad aggiungere esano nella parte superiore del campione fino a quando il flaconcino di raccolta sotto la colonna è quasi pieno (~4 ml).
    1. Lasciare che tutto l'esano entri nel gel di silice prima di iniziare con il solvente successivo.
11. Posizionare il flaconcino di raccolta a media polarità sotto la colonna.
12. Aggiungere DCM nella parte superiore della colonna fino a quando il flaconcino di raccolta è quasi pieno. Anche in questo caso, lasciare che tutto il DCM entri nel flaconcino di raccolta prima di iniziare il solvente successivo.
13. Posizionare il flaconcino di raccolta polare sotto la colonna.
14. Aggiungere metanolo nella parte superiore della colonna fino a quando il vile di raccolta è quasi pieno.