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La cromatografia su colonna è una tecnica flessibile per purificare la complessa miscela di composti presenti nei sedimenti. Le miscele si separano mentre si muovono attraverso la colonna e vengono raccolte in frazioni, ciascuna contenente una diversa classe chimica di composti. Pertanto, la cromatografia su colonna viene spesso utilizzata come fase di purificazione aggiuntiva dopo l'isolamento iniziale del composto desiderato. Gli estratti organici come gli estratti lipidici totali possono essere miscele complesse di molti composti. Alcune tecniche di purificazione, come la saponificazione, introducono composti che possono danneggiare gli strumenti analitici e quindi devono essere rimossi prima dell'analisi. Questo video fa parte di una serie sull'estrazione, la purificazione e l'analisi dei lipidi dai sedimenti. Una volta raccolto un estratto lipidico totale da un campione sedimentario, la cromatografia su colonna viene utilizzata per purificare sia gli alchenoni che i GDGT, a seconda dell'analisi desiderata.
Nella cromatografia su colonna, una miscela di composti chimici viene caricata su una fase stazionaria solida come il gel di silice. Una fase mobile come un solvente organico viene quindi utilizzata per eluire o rimuovere i composti dalla colonna. L'ordine in cui i composti vengono eluiti dipende dalla forza delle interazioni dei composti con il gel di silice e con l'eluente.
L'eluato viene raccolto in frazioni, ciascuna contenente composti diversi dalla miscela. A seconda delle proprietà dei composti, un singolo solvente può fornire una separazione sufficiente ed eluire tutti i composti di interesse. In caso contrario, vengono utilizzati più solventi per eluire a turno ciascun composto di interesse.
I composti polari, che hanno una distribuzione irregolare della carica, si adsorbono fortemente al gel di silice polare, mentre i composti apolari si adsorbono debolmente. I solventi polari hanno una maggiore affinità per il gel di silice e quindi sono eluenti più potenti dei solventi apolari. Pertanto, i solventi apolari eluiscono solo composti apolari, mentre i solventi polari eluiscono sia composti apolari che polari.
Quando i composti desiderati sono moderatamente polari, i composti apolari devono essere lavati via dalla colonna con un solvente apolare prima di utilizzare un solvente polare. Per evitare di eluire composti altamente polari indesiderati come gli acidi, un eluente polare non dovrebbe avere un potere di eluizione maggiore del necessario per il composto più polare desiderato.
Ora che hai compreso i principi della cromatografia su colonna, esaminiamo una procedura per la purificazione dei biomarcatori lipidici da un estratto lipidico totale mediante cromatografia su colonna su gel di silice.
Per rimuovere i contaminanti organici, bruciare pipette in vetro borosilicato, fiale in vetro borosilicato e lana di vetro per 6 ore a 550 °C. Una volta che la vetreria è pronta per l'uso, allestire un rack per contenere pipette e fiale. Procurati bulbi per pipette, pinzette pulite, una spatola da laboratorio, gel di silice, esano, diclorometano e metanolo. Con una pinzetta pulita, metti un piccolo ciuffo di lana di vetro nella bocca di una pipetta. Spingere delicatamente la lana di vetro sul fondo della pipetta con lo stelo di un'altra pipetta per formare un tappo allentato. Caricare con cautela il gel di silice nella pipetta fino a riempirla a metà. Fissare la pipetta in posizione verticale nel rack. Fissare una fiala di vetro borosilicato da 4 ml sotto la punta della pipetta per la raccolta dei rifiuti. In un'altra fiala di vetro borosilicato, sospendere fino a 10 mg di campione secco dal processo di saponificazione in esano. Se il campione si attacca alle pareti della fiala, sonicare la fiala per 5 minuti. La procedura cromatografica può ora iniziare.
Per iniziare la cromatografia, lavare la colonna di gel di silice con 3 volumi di esano per rimuovere bolle d'aria e impurità. Quindi, sostituire il flaconcino di scarto con un flaconcino vuoto per la frazione apolare. Con una pipetta di vetro, caricare il campione sulla colonna e lasciare che la sospensione si immerga nel gel di silice. Lavorare rapidamente in modo che la colonna non si asciughi durante la procedura. Sciacquare due volte la fiala del campione con piccole porzioni di esano e trasferire ogni risciacquo sulla colonna. Continuare ad aggiungere esano alla colonna fino a quando la fiala di raccolta non è quasi piena. Lascia che tutto l'esano finisca di entrare nel gel di silice. Quindi, sostituire la fiala piena con una fiala vuota per la frazione polare media. Quindi, sciacquare la fiala del campione con DCM e aggiungerla alla colonna 3 volte. Continuare ad aggiungere DCM alla colonna fino a quando la fiala di raccolta non è quasi piena. Lasciare che il DCM finisca di immergersi nel gel di silice, quindi sostituire il flaconcino riempito con un flaconcino vuoto per la frazione polare. Ripeti questo processo con metanolo.
Una volta che la fiala è quasi piena, lasciare che il metanolo finisca di gocciolare nella fiala e poi tappare tutte le fiale. La frazione polare media contiene gli alchenoni desiderati, mentre i GDGT si trovano nella frazione polare. Per campioni di alchenoni particolarmente sporchi o complessi, la frazione medio-polare deve essere ulteriormente purificata con adduzione dell'urea, prima dell'analisi.
La cromatografia su colonna è ampiamente utilizzata in chimica come tecnica analitica e di purificazione.
I nanotubi di carbonio, o CNT, sono sempre più utilizzati in molti settori, ma c'è una crescente preoccupazione per i loro effetti sulla salute umana. Variando le proprietà dei CNT si cambia il modo in cui si comportano nell'acqua e nel suolo. Per studiare quanto bene i mezzi porosi come sabbia e terra trattengono i CNT, è stata preparata una colonna con terreno poroso come fase stazionaria. In primo luogo, le frazioni sono state raccolte durante il caricamento della soluzione di CNT sulla colonna per analizzare il trasporto di CNT attraverso il suolo. Quindi, i CNT ancora adsorbiti nel terreno sono stati eluiti e le frazioni analizzate per la quantità di CNT che era rimasta nel suolo. I risultati forniscono informazioni sulla relazione tra la funzionalizzazione delle superfici dei CNT e i loro meccanismi di trasporto nell'ambiente.
La cromatografia su colonna può essere utilizzata sia su larga che su piccola scala e viene quindi utilizzata nella progettazione di sintesi per applicazioni industriali. Le sete di ragno hanno un'eccellente resistenza alla trazione e duttilità, ma non possono essere raccolte su scala industriale. Dopo la sintesi delle proteine della seta, le proteine della seta ricombinanti vengono purificate mediante cromatografia di affinità, in cui la fase stazionaria è progettata per intrappolare solo la molecola desiderata. Il lavaggio e l'eluizione accurati garantiscono le frazioni proteiche pure necessarie per filare la seta di ragno su larga scala.
Sono disponibili molte fasi stazionarie per la cromatografia su colonna. Una fase stazionaria potrebbe non essere adatta a tutti i potenziali prodotti di una sintesi con un ampio campo di applicazione dei sostituenti, come questa sintesi di iodoaziridina. Il prodotto grezzo viene miscelato con varie fasi stazionarie e la decomposizione viene valutata mediante NMR protonica. Poiché l'NMR protonica è altamente sensibile, molte fasi stazionarie possono essere sottoposte a screening per la decomposizione del prodotto utilizzando una piccola quantità di prodotto grezzo. La cromatografia su colonna viene quindi eseguita con la fase stazionaria ottimale, consentendo la purificazione di composti nuovi e altamente reattivi.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla cromatografia su colonna per la purificazione di un estratto lipidico totale. Il seguente video dimostrerà come purificare ulteriormente miscele complesse contenenti alcheni.
Grazie per l'attenzione!
