Identificazione dei roditori II

La capacità di identificare i singoli animali da ricerca è un aspetto essenziale della registrazione scientifica e della raccolta dei dati. La distinzione tra gli animali garantisce che venga utilizzato il soggetto corretto per la procedura sperimentale prevista.

Esistono diversi metodi permanenti e temporanei che gli scienziati utilizzano per identificare i singoli animali da laboratorio. In questo video, discuteremo i metodi che prevedono il tatuaggio della coda di un roditore adulto, delle dita dei piedi dei neonati e delle dita dei piedi degli adulti. Successivamente, toccheremo la tecnica di posizionamento del microchip comunemente eseguita nei ratti adulti, seguita dal metodo di identificazione temporanea universale che utilizza coloranti non tossici.

Prima di approfondire i protocolli per questi metodi, esaminiamo le considerazioni, i vantaggi e le carenze di ciascuna di queste tecniche. Il tatuaggio della coda è utile in molti protocolli di ricerca, come gli esperimenti che coinvolgono l'imaging MRI o quelli in cui gli animali sono geneticamente predisposti a condizioni della pelle tra cui la dermatite ulcerosa. Un altro vantaggio dei tatuaggi sulla coda è che sono facilmente visualizzabili senza dover trattenere manualmente l'animale.

Alcuni protocolli sperimentali richiedono la genotipizzazione dei neonati già dal primo giorno, il che rende essenziale che questi cuccioli siano identificati in modo permanente. L'uso del tatuaggio delle dita dei piedi consente di identificare tali animali fino a quando non sono abbastanza grandi per l'etichettatura delle orecchie o la punzonatura dell'orecchio. È una buona idea applicare un tatuaggio simile sulla madre adulta per evitare che reagisca in modo eccessivo e pulisca eccessivamente il nuovo tatuaggio del suo cucciolo. Sebbene ci siano diversi vantaggi nell'utilizzo di questo metodo, lo svantaggio è che la procedura richiede abilità, pratica, mano ferma e attrezzature specializzate.

Il prossimo metodo di identificazione permanente in esame è il microchip. Sebbene l'impianto di microchip sia un processo relativamente semplice, ci sono diversi fattori che ne limitano l'utilità. Innanzitutto, queste patatine hanno all'incirca le dimensioni di un grosso chicco di riso e richiedono un ago calibro 10-12 per l'impianto, che è troppo grande per un topo, limitando così il metodo ai ratti adulti. In secondo luogo, i microchip sono costosi e quindi non sono ideali per identificare un gran numero di animali. Infine, i microchip non possono essere utilizzati negli esperimenti che prevedono la risonanza magnetica. Tuttavia, se esiste un gruppo di animali di valore come gli animali da riproduzione con una genetica unica che deve essere identificata in modo permanente, è possibile utilizzare i microchip.

L'ultimo metodo di cui parleremo è l'identificazione temporanea utilizzando marcatori non tossici. I pennarelli atossici sono realizzati per colorare il pelo degli animali da ricerca. Questo metodo è ideale per studi a breve termine che richiedono l'identificazione degli animali solo per poche ore o giorni, anche se i coloranti possono rimanere visibili per diverse settimane. Alcuni ricercatori usano questi marcatori in combinazione con altri metodi di identificazione per individuare facilmente animali specifici in un gruppo.

Ora che abbiamo discusso il background, impariamo le procedure, a partire dal tatuaggio della coda. Qui dimostreremo la procedura su topi adulti, ma lo stesso può essere applicato per i ratti allo svezzamento e adulti.

Per ridurre al minimo l'apprensione o l'angoscia per gli animali, il tatuaggio della coda deve essere eseguito nella sala operatoria piuttosto che nell'area di stabulazione degli animali. Prima di applicare il tatuaggio, trattenere il mouse utilizzando un fermata, con la coda tesa dall'apertura. La flangia della tazza è tenuta in posizione tramite una piattaforma di vetro specializzata. Quindi, pulisci la coda con una piccola quantità di detergente per tessuti diluito su un batuffolo di cotone. Questo passaggio è importante per rimuovere eventuali accumuli di calcare e detriti che potrebbero interferire con il tatuaggio. Quindi, applicare l'olio per tessuti sulla pelle della coda con un altro tampone. Ciò riduce al minimo il danno ai tessuti ammorbidendo la pelle e fornendo lubrificazione per l'ago del tatuaggio. Inoltre, l'olio dissolve lo sporco non rimosso dal processo di pulizia e previene le macchie di inchiostro sulla pelle non tatuata. Ora sei pronto per applicare il tatuaggio.

Mentre la macchina è spenta, immergi la punta dell'ago per tatuaggi, che è una lancetta o un ago ipodermico, nel pigmento. Quindi, attiva la pistola usando il pedale, posiziona lo strumento per tatuaggi sulla coda e porta la punta dell'ago sul sito del tatuaggio. Approcciare la pelle con l'ago a 90? angolo e penetrare abbastanza in profondità nel derma in modo che il pigmento si depositi in modo permanente. Un cambiamento nel suono dell'ago attivato può aiutare a discernere la profondità. Fai brevi tratti uniformi in una direzione, formando numeri e lettere. Cerca di utilizzare curve e angoli minimi quando applichi il tatuaggio.

Per aggiungere ulteriore pigmento, immergi la punta dell'ago nel serbatoio del colorante per ogni uno-due caratteri per i topi e per ogni carattere per i ratti. Tampona il tatuaggio completato con un tovagliolo di carta per rimuovere il pigmento in eccesso. La presenza di sangue sul tatuaggio o sul tovagliolo di carta indica che il tatuaggio è stato fatto troppo in profondità, ed è quindi improbabile che sia permanente. Rinforza i caratteri sottili con pigmento aggiuntivo posizionando l'ago parallelamente, non sopra il pigmento già depositato. Pulisci accuratamente l'attrezzatura per tatuaggi dopo ogni utilizzo e tra le gabbie deve essere utilizzato un ago nuovo o sterilizzato e una nuova scorta di inchiostro per prevenire la trasmissione di malattie.

Successivamente, impareremo come applicare i tatuaggi delle dita dei piedi ai neonati e agli adulti. Qui, dimostreremo la procedura nei topi, ma gli stessi passaggi sono applicabili ai ratti.

I neonati sono tatuati sulle dita dei piedi poiché i coccige non sono ossificati e la lunghezza della coda è troppo piccola. Inoltre, man mano che la coda cresce, la pelle si allunga e i numeri possono diventare distorti, sbiaditi e illeggibili. Inizia posizionando una macchia di pasta per tatuaggi verde su una superficie non porosa come un foglio di alluminio. Quindi, prendi in mano il cucciolo pre-svezzato usando una garza. Posiziona il piede tra il pollice e l'incavo dell'indice per esporre le dita dei piedi scelte per il tatuaggio. Tenere il piede vicino alle dita dei piedi in modo che la punta selezionata abbia una superficie solida dietro di essa per evitare che si pieghi.

Ora, immergi la punta di una lancetta da 4,5 mm nella pasta per tatuaggi. Quindi, colpisci la punta desiderata secondo il codice predeterminato. Per garantire una corretta permeazione, colpire lo stesso punto tre volte. Penetrare nella pelle abbastanza in modo che la pasta lasci un segno, ma evitare di colpire così in profondità che la punta sanguini. Tampona delicatamente il nuovo tatuaggio con la garza per rimuovere la pasta per tatuaggi in eccesso e rimetti l'animale nella sua gabbia. Usa una nuova lancetta per la prossima cucciolata. Un giorno dopo la procedura, verificare che il tatuaggio sia visibile.

Quando i cuccioli che allattano sono tatuati, è consigliabile tatuare anche la madre. Questo potrebbe impedirle di reagire in modo eccessivo e di curare eccessivamente i tatuaggi del suo cucciolo. Per applicare un tatuaggio del dito del piede a un adulto, ancora una volta, posiziona prima una piccola macchia di pasta per tatuaggi verde su un foglio di alluminio. Quindi, trattieni l'animale utilizzando un cono di plastica o un sistema di ritenuta in plexiglass che consenta l'accesso alle zampe posteriori. Estendi il piede dal dispositivo di ritenuta e posiziona il piede tra il pollice e l'incavo dell'indice per esporre le dita dei piedi scelte per il tatuaggio.

Ora, immergi la punta di una lancetta da 5 mm nella pasta per tatuaggi. E, come prima, applicare il tatuaggio colpendo e forando la pelle del dito desiderato almeno tre volte per garantire una corretta penetrazione. Quindi, tampona delicatamente il tatuaggio per rimuovere la pasta in eccesso e rimetti l'animale nella sua gabbia. Come per i neonati, verificare il tatuaggio un giorno dopo la procedura. Se il segno è visibile il giorno dopo il tatuaggio, dovrebbe rimanere visibile per tutta la vita dell'animale. Se è debole o non visibile, rifai il tatuaggio come descritto in precedenza.

Il prossimo metodo di identificazione di cui parleremo prevede l'impianto di microchip nei roditori. Il chip comunemente usato per etichettare gli animali da laboratorio è un chip di identificazione a radiofrequenza, o RFID. Di solito, il chip è precaricato in aghi, che possono poi essere inseriti nell'applicatore. Per l'inserimento del chip, utilizzare un tubo di plexiglass per trattenere l'animale assicurandosi di poter ancora afferrare la pelle sopra le spalle. Per prima cosa, tende la pelle per creare una tasca. Quindi posizionare l'ago attraverso la pelle, smussare verso l'alto, parallelamente alla colonna vertebrale e diretto verso la coda. Espellere il microchip per via sottocutanea ed estrarre l'ago. Pizzicare la pelle nel sito di iniezione per evitare che il chip segua l'ago fuori dalla pelle. Continuare ad applicare pressione per fornire emostasi per qualsiasi sanguinamento cutaneo. Rimuovere l'animale dal dispositivo di ritenuta e scansionare il chip utilizzando il lettore fornito dal produttore per confermare il codice di identificazione.

Infine, impariamo come applicare coloranti temporanei ai roditori per l'identificazione. Cominciamo con i topi. Innanzitutto, trattieni l'animale in modo che l'area tra le scapole sia accessibile. Questa parte del corpo è al sicuro dall'auto-toelettatura. Posiziona una macchia o una striscia di colorante sulla pelliccia in quest'area e rimetti l'animale nella sua gabbia.

Per i ratti, trattenere manualmente l'animale afferrando la coda e tenendola tesa. Ciò garantisce che l'area per l'applicazione del colorante sia facilmente accessibile, che potrebbe essere la testa, le spalle o la groppa. Metti una macchia o una striscia di colorante sulla pelliccia. A volte è possibile applicare un colorante non tossico senza trattenere l'animale. Controlla periodicamente i segni su questi animali, soprattutto se li usi come unico identificatore per più di qualche giorno.

Ora che abbiamo esaminato le procedure di questi diversi metodi di identificazione, vediamo come gli scienziati li utilizzano oggi in diversi studi di ricerca.

L'uso di roditori negli esperimenti comportamentali è piuttosto comune. Qui, i ricercatori hanno usato il tatuaggio della coda per contrassegnare gli animali in modo permanente e poi li hanno osservati per diversi giorni in un ambiente di gabbie domestiche costruito artificialmente. I dati raccolti hanno rivelato differenze nei comportamenti, come la distanza percorsa, tra gli animali di controllo e quelli da esperimento, in un periodo di 10 giorni dopo l'intervento chirurgico.

In un altro esperimento comportamentale, i ricercatori hanno eseguito il tatuaggio delle dita dei piedi nei neonati e li hanno messi in una scatola di registrazione con microfoni speciali per registrare le vocalizzazioni ultrasoniche. Lo scopo di questo esperimento era quello di esaminare le differenze nel tasso di chiamata, cioè il numero di vocalizzazioni al minuto, nei topi wild type e deficienti di Shank2 - un modello di autismo nel periodo neonatale di 12 giorni e nell'età adulta.

Infine, come discusso in precedenza, l'uso di coloranti non tossici è un modo efficace per marcare gli animali per esperimenti a breve termine. Qui, gli scienziati erano interessati all'espressione transitoria di una proteina plasmatica. Quindi hanno contrassegnato gli animali con marcatori temporanei, iniettato il DNA plasmidico per via endovenosa e raccolto il campione di sangue due giorni dopo per determinare l'espressione proteica utilizzando la tecnica del western blot.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al tatuaggio, al posizionamento di microchip e ai metodi di identificazione temporanea per topi e ratti da laboratorio. L'identificazione degli animali è una componente primaria della tenuta dei registri nella ricerca. Pertanto, quando si sceglie il metodo di identificazione appropriato, è necessario deliberare su molti fattori. Ciò include il livello di disagio per l'animale, la facilità della tecnica, le esigenze sperimentali e, infine, il costo associato al metodo. Come sempre, grazie per la visione!