Curve di calibrazione

1. Fare gli standard: diluizioni seriali

1. Crea una soluzione stock concentrata dello standard. Tipicamente, il composto viene accuratamente pesato e quindi trasferito quantitativamente in un pallone volumetrico. Aggiungere un po 'di solvente, mescolare in modo che il campione si dissolva, quindi riempire fino alla linea con il solvente appropriato.
2. Eseguire diluizioni seriali. Prendere un altro matraccio volumetrico e pipettare la quantità di standard necessaria per la diluizione, quindi riempire fino alla linea con solvente e mescolare. In genere viene effettuata una diluizione di dieci volte, quindi per un pallone volumetrico da 10 ml, aggiungere 1 mL della diluizione precedente.
3. Continuare se necessario per ulteriori diluizioni, pipettare dalla soluzione precedente per diluirla per fare il campione successivo. Per una buona curva di calibrazione, sono necessarie almeno 5 concentrazioni.

2. Eseguire i campioni per la curva di calibrazione e l'ignoto

1. Eseguire i campioni con lo spettrofotometro UV-Vis per determinare la risposta strumentale necessaria per la curva di calibrazione.
2. Prendi la lettura con il primo campione. È una buona idea eseguire i campioni in ordine casuale(cioè non dal più alto al più basso o dal più basso al più alto) nel caso in cui ci siano errori sistematici. Per ottenere una stima del rumore, ripetere la lettura su un dato campione 3-5x.
3. Eseguire i campioni standard aggiuntivi, ripetendo le misurazioni per ciascun campione per ottenere una stima del rumore. Registrare i dati per creare un grafico in un secondo momento.
4. Eseguire i campioni sconosciuti. Utilizzare condizioni il più possibile simili all'esecuzione degli standard. Pertanto, la matrice del campione o il tampone dovrebbero essere gli stessi, il pH dovrebbe essere lo stesso e la concentrazione dovrebbe essere nell'intervallo degli standard eseguiti.

3. Creazione della curva di calibrazione

1. Registra i dati in un foglio di calcolo e utilizza un programma per computer per tracciare i dati rispetto alla concentrazione. Se sono state effettuate almeno misurazioni triplicate per ciascun punto, è possibile tracciare barre di errore della deviazione standard di tali misurazioni per stimare l'errore di ciascun punto. Per alcune curve, potrebbe essere necessario tracciare i dati con un asse come registro per ottenere una linea. L'equazione che governa la curva di calibrazione è generalmente nota in anticipo, quindi un log-plot viene utilizzato quando c'è un log nell'equazione.
2. Esaminate la curva di calibrazione. Sembra lineare? Ha una porzione che sembra non lineare(cioè ha raggiunto il limite della risposta strumentale)? Per verificare, adattare tutti i dati a una regressione lineare utilizzando il software. Se il coefficiente di determinazione (R²) non è elevato, rimuovere alcuni dei punti all'inizio o alla fine della curva che non sembrano adattarsi alla linea ed eseguire nuovamente la regressione lineare. Non è accettabile rimuovere i punti nel mezzo solo perché hanno una grande barra di errore. Da questa analisi, decidi quale porzione della curva è lineare.
3. L'output della lineare dovrebbe essere un'equazione del formato y=mx+b, dove m è la pendenza e b è l'intercetta y. Le unità per la pendenza sono l'unità/concentrazione dell'asse y, in questo esempio (Figura 1) assorbanza/μM. Le unità per l'intercetta y sono le unità dell'asse y. Si ottiene un coefficiente di determinazione (R²). Più alta è la R^2, migliore è la vestibilità; una vestibilità perfetta dà un R² di 1. Il programma può anche essere in grado di fornire una stima dell'errore sulla pendenza e dell'intercetta.

4. Risultati: curva di calibrazione dell'assorbanza del colorante blu #1

1. La curva di calibrazione per l'assorbanza del colorante blu #1 (a 631 nm) è mostrata di seguito (Figura 1). La risposta è lineare da 0 a 10 μM. Al di sopra di tale concentrazione il segnale inizia a livellarsi perché la risposta è al di fuori dell'intervallo lineare dello spettrofotometro UV-Vis.
2. Calcola il LOD. Dalla pendenza della curva di calibrazione, il LOD è 3*S.D. (rumore)/m. Per questa curva di calibrazione, il rumore è stato ottenuto prendendo una deviazione standard di misurazioni ripetute ed è stato 0,021. Il LOD sarebbe 3*0.021/.109=0.58 μM.
3. Calcola il LOQ. Il LOQ è 10 * S.D. (rumore) / m. Per questa curva di calibrazione, LOQ è 10 * 0,021 / .109 = 1,93 μM.
4. Calcola la concentrazione dell'ignoto. Utilizzare l'equazione di linea per calcolare la concentrazione del campione sconosciuto. La curva di calibrazione è valida solo se l'incognita rientra nell'intervallo lineare dei campioni standard. Se le letture sono troppo alte, potrebbe essere necessaria una diluizione. In questo esempio, la bevanda sportiva sconosciuta è stata diluita 1:1. L'assorbanza era di 0,243 e questo corrispondeva ad una concentrazione di 2,02 μM. Così la concentrazione finale di colorante blu #1 nella bevanda sportiva era di 4,04 μM.

Figura 1. Curve di calibrazione per l'assorbanza UV-Vis del colorante blu. A sinistra: l'assorbanza è stata misurata di diverse concentrazioni di colorante blu #1. Le risposte si livellano dopo 10 μM, quando l'assorbanza è superiore a 1. Le barre di errore provengono da misurazioni ripetute dello stesso campione e sono deviazioni standard. A destra: La parte lineare della curva di calibrazione è adatta a una linea, y = 0,109 * x + 0,0286. I dati sconosciuti sono mostrati in nero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.