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Le curve di calibrazione vengono utilizzate per comprendere la risposta strumentale a un analita e per prevedere la concentrazione di analita in un campione.
Una curva di calibrazione viene creata preparando prima una serie di soluzioni standard con concentrazioni note dell'analita. La risposta dello strumento viene misurata per ciascuno di essi e tracciata rispetto alla concentrazione della soluzione standard. La porzione lineare di questo grafico può quindi essere utilizzata per prevedere la concentrazione di un campione dell'analita, correlando la sua risposta alla concentrazione.
Questo video introdurrà le curve di calibrazione e il loro utilizzo, dimostrando la preparazione di una serie di standard, seguita dall'analisi di un campione con concentrazione sconosciuta.
Per preparare la curva di calibrazione viene utilizzato un insieme di soluzioni standard. Queste soluzioni sono costituite da un intervallo di concentrazioni che comprendono la concentrazione approssimativa dell'analita.
Le soluzioni standard sono spesso preparate con una diluizione seriale. Una diluizione seriale viene eseguita preparando prima una soluzione madre dell'analita. La soluzione madre viene quindi diluita di una quantità nota, spesso di un ordine di grandezza. La nuova soluzione viene poi diluita allo stesso modo, e così via. Ciò si traduce in un insieme di soluzioni con concentrazioni che variano su diversi ordini di grandezza.
La curva di calibrazione è un grafico del segnale strumentale rispetto alla concentrazione. Il grafico degli standard dovrebbe essere lineare e può essere adattato all'equazione y=mx+b. Le porzioni non lineari del grafico devono essere scartate, poiché questi intervalli di concentrazione sono al di fuori del limite di linearità.
L'equazione della linea più adatta può quindi essere utilizzata per determinare la concentrazione del campione, utilizzando il segnale dello strumento per correlarlo alla concentrazione. I campioni con misure che si trovano al di fuori dell'intervallo lineare del grafico devono essere diluiti, per essere nell'intervallo lineare.
Il limite di rilevamento dello strumento, o la misura più bassa che può essere determinata statisticamente sul rumore, può essere calcolato anche dalla curva di calibrazione. Un campione bianco viene misurato più volte. Il limite di rilevamento è generalmente definito come il segnale vuoto medio più 3 volte la sua deviazione standard.
Infine, è possibile calcolare anche il limite di quantificazione. Il limite di quantificazione è la quantità più bassa di analita che può essere quantificata con precisione. Questo è calcolato come 10 deviazioni standard al di sopra del segnale vuoto.
Ora che hai appreso le basi di una curva di calibrazione, vediamo come prepararla e utilizzarla in laboratorio.
Innanzitutto, preparare una soluzione madre concentrata dello standard. Pesare accuratamente lo standard e trasferirlo in un matraccio tarato. Aggiungere una piccola quantità di solvente e mescolare in modo che il campione si dissolva. Quindi, riempire la linea con solvente. È importante utilizzare lo stesso solvente del campione.
Per preparare gli standard, pipettare la quantità necessaria nel matraccio tarato. Quindi riempire il pallone fino alla linea con solvente e mescolare.
Continuare a stabilire gli standard pipettando dalla soluzione madre e diluendo. Per una buona curva di calibrazione, sono necessarie almeno 5 concentrazioni.
Ora, eseguire i campioni con lo strumento analitico, in questo caso uno spettrofotometro UV-Vis, al fine di determinare la risposta strumentale necessaria per la curva di calibrazione.
Prendi la misura del primo standard. Esegui gli standard in ordine casuale, nel caso in cui ci siano errori sistematici. Misurare ogni standard 3?5x?per ottenere una stima del rumore.
Misura il resto degli standard, ripetendo le misurazioni per ciascuno. Registra tutti i dati.
Infine, eseguire l'esempio. Utilizzare la stessa matrice di campionamento e le stesse condizioni di misurazione utilizzate per gli standard. Assicurarsi che il campione rientri nell'intervallo degli standard e del limite dello strumento.
Per costruire la curva di calibrazione, utilizzare un programma per computer per tracciare i dati come segnale rispetto alla concentrazione. Utilizzare la deviazione standard delle misurazioni ripetute per ciascun punto dati per creare barre di errore.
Rimuovere le parti della curva che non sono lineari, quindi eseguire una regressione lineare e determinare la linea più adatta. L'output dovrebbe essere un'equazione nella forma y = m x + b. Un valore R2 vicino a 1 denota un buon adattamento.
Questa è la curva di calibrazione per il colorante blu #1, misurata a 631 nm. La risposta è lineare tra 0 e 15 mM.
Calcolare la concentrazione del campione utilizzando l'equazione della retta più adatta. L'assorbanza per il campione era di 0,141 e corrispondeva a una concentrazione di 6,02 mM.
Ora che hai visto come una curva di calibrazione può essere utilizzata con uno spettrofotometro UV-Vis, diamo un'occhiata ad alcune altre applicazioni utili.
Le curve di calibrazione sono spesso utilizzate con applicazioni elettrochimiche, poiché il segnale dell'elettrodo deve essere calibrato in base alla concentrazione di ioni nella soluzione. In questo esempio, sono stati raccolti i dati per un elettrodo iono-selettivo per il fluoruro.
I dati di concentrazione devono essere tracciati sulla scala logaritmica per ottenere una linea. Questa curva di calibrazione può essere utilizzata per misurare la concentrazione di fluoro in una soluzione, come un dentifricio o acqua potabile.
La cromatografia liquida ad alte prestazioni, o HPLC, è una tecnica di separazione e analisi molto utilizzata in chimica analitica. L'HPLC separa i componenti di una miscela in base al tempo necessario alle molecole per percorrere la lunghezza della colonna cromatografica. Questo tempo varia a seconda di una serie di proprietà chimiche delle molecole.
L'eluizione delle molecole viene misurata utilizzando un rivelatore, ottenendo un cromatogramma. L'area del picco può essere correlata alla concentrazione utilizzando una semplice curva di calibrazione di una gamma di soluzioni standard, come in questo esempio di ingredienti popolari per la soda.
In alcuni casi, in cui la matrice della soluzione interferisce con la misurazione del soluto, una curva di calibrazione classica può essere imprecisa. In questi casi, viene preparata una curva di calibrazione modificata. A tal fine, al campione viene aggiunta una gamma di volumi di soluzione standard. Viene creato il grafico segnale-concentrazione, dove l'intercetta x è uguale alla concentrazione originale della soluzione campione. Per maggiori dettagli su questa tecnica, guarda il video di educazione scientifica di JoVE, "Il metodo dell'addizione standard".
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla curva di calibrazione. A questo punto è necessario capire dove viene utilizzata la curva di calibrazione, come crearla e come utilizzarla per calcolare le concentrazioni dei campioni.
Come sempre, grazie per la visione!
