Identificazione dei roditori I

La corretta identificazione degli animali da laboratorio è un requisito fondamentale della ricerca biomedica. È essenziale che gli investigatori siano in grado di distinguere tra i singoli animali in modo che l'animale corretto venga utilizzato per le procedure sperimentali e la raccolta dei dati. Gli scienziati hanno sviluppato diversi metodi permanenti e temporanei per identificare i singoli animali da laboratorio. Qui, discuteremo i due metodi più comunemente usati: l'etichettatura auricolare e la punzonatura dell'orecchio.

Prima di approfondire la procedura per la punzonatura dell'orecchio, introduciamo il codice del punzone all'orecchio, i tipi di punzoni disponibili e discutiamo i vantaggi e gli svantaggi di questo metodo. Come avrai intuito, la punzonatura all'orecchio comporta la perforazione di un foro o di una tacca nell'orecchio esterno o nel padiglione auricolare dell'animale. Al fine di standardizzare questo metodo, sono stati sviluppati codici universali per i punzoni dell'orecchio.

A seconda della posizione, le tacche sull'orecchio destro rappresentano cifre singole, come 1, 3 e 5, e una doppia tacca rappresenta 2. Utilizzando diverse combinazioni di queste tacche e sommando il valore per ogni tacca, puoi etichettare l'animale da 1 a 9. Allo stesso modo, sull'orecchio sinistro, le stesse tacche rappresentano le decine. E ancora, diverse combinazioni copriranno l'intervallo da 10 a 90. I fori al centro del padiglione destro e sinistro rappresentano rispettivamente 100 e 200. E i buchi in entrambi indicano 300. Pertanto, ad esempio, se si desidera etichettare l'animale 173, è necessario praticare un foro al centro dell'orecchio destro per 100, tre tacche nell'anno sinistro che sommano il totale a 70 e una singola tacca nell'orecchio superiore destro che rappresenta il posto dell'unità "tre".

Ora, discutiamo i tre stili di punzoni per le orecchie disponibili in commercio: il punzone a forbice, il punzone per il pollice e il punzone a leva. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi.

Il punzone per il pollice richiede un movimento di pizzicamento, ma è abbastanza piccolo da poter essere inserito in un tubo Eppendorf in modo che il tessuto dell'orecchio possa essere raccolto più facilmente. Ergonomicamente, il punzone a leva è più facile da usare rispetto al punzone per il pollice, soprattutto per le orecchie più spesse dei ratti più anziani. Il punzone a forbice non richiede un movimento di pizzicamento, evitando così l'affaticamento e le lesioni del tunnel carpale.

Nonostante sia un metodo di identificazione rapido e semplice, la punzonatura all'orecchio presenta alcune limitazioni. Innanzitutto, il codice del punzone dell'orecchio discusso sopra ha un limite massimo di 399, che potrebbe limitare l'uso di questo metodo in alcuni studi su larga scala. Un'altra limitazione è che la maggior parte degli animali deve essere afferrata per la collottola per poter leggere il codice, aumentando così i tempi in cui vengono maneggiati. Man mano che i ratti invecchiano, la pelle delle orecchie si ispessisce ed è difficile eseguire il pugno all'orecchio senza causare un disagio significativo all'animale. Pertanto, è meglio eseguire i pugni all'orecchio sui ratti giovani quando vengono svezzati. Per i ratti adulti che richiedono l'identificazione, l'uso di anestesia inalante dovrebbe essere preso in considerazione quando si eseguono pugni all'orecchio.

Ora che hai alcune informazioni di base sul codice del punzone dell'orecchio e sui tipi di strumenti disponibili, impariamo come eseguire questa tecnica nei topi.

Prima di iniziare la procedura, si consiglia di pulire gli strumenti di punzonatura con una soluzione disinfettante, sciacquarli con alcool e asciugarli accuratamente. Evita di sterilizzare in autoclave i punzoni per le orecchie, poiché alla fine li opacizzerà.

Per iniziare, decidi il codice sperimentale dell'animale e il pugno da utilizzare. Usiamo il codice 173 e il punzone a forbice come esempi qui. La stessa procedura è applicabile a qualsiasi altro codice o punzone. Quando sei pronto, trattieni l'animale afferrandolo per la collottola in modo che le orecchie siano facilmente accessibili. Inizia con il foro per 100. Posizionare l'orecchio destro nel punzone in modo che il foro del punzone sia posizionato lontano dal margine del padiglione auricolare. Quindi, applica una pressione per chiudere la forbice in modo rapido e deciso per tagliare la pelle. Quindi, rilascia il punzone e rimuovilo dall'orecchio. Evitare di tirare o torcere il punzone per evitare di strappare l'orecchio. Per fare una tacca, posiziona il punzone sul bordo del padiglione auricolare nel punto corretto, in questo caso nella parte superiore dell'orecchio destro per i "tre" al posto dell'unità del codice, e fai lo stesso: applica una pressione rapida e decisa e poi apri la forbice per rimuoverla. Ripeti la stessa procedura sull'altro orecchio per perforare tre tacche: due per "20" vicino all'angolo esterno e una per "50" vicino all'angolo interno, totalizzando il codice a "70".

Verifica che sia stato inserito il codice corretto prima di aggiungere nuovamente l'animale alla gabbia. Anche in questo caso, pulire il punzone con un disinfettante, sciacquare con alcool e asciugarlo accuratamente per evitare che si arrugginisca.

Passiamo ora all'eartagging, che è un altro metodo economico e facile da eseguire per l'identificazione individuale di topi e ratti. Ci sono una varietà di marchi auricolari disponibili in commercio. Questi includono: etichette in metallo che hanno una serie di numeri e/o lettere incise su di esse e etichette in plastica con caratteri o codici a barre su sfondi dai colori vivaci.

Uno svantaggio delle targhette metalliche è che spesso è necessario prendere in braccio l'animale per leggere il codice. Al contrario, le targhette di plastica sono facili da leggere senza dover maneggiare gli animali. Un altro vantaggio dei tag in plastica è la loro compatibilità con l'imaging MRI. Sebbene le etichette forniscano un identificatore individuale per un topo o un ratto, non sono infallibili. Le etichette possono essere perse a causa di una toelettatura eccessiva, dermatite o infezione, autotrauma inflitto cercando di rimuovere le etichette a causa di intolleranza, risse e comportamento riproduttivo aggressivo. Se più animali sono ospitati nella stessa gabbia, la perdita di un marchio auricolare può essere problematica. Per aggirare questo problema, è necessario utilizzare una forma secondaria di identificazione come un codice di punzonatura sull'orecchio opposto all'etichetta. Una struttura dovrebbe standardizzare sia la scelta dell'orecchio da marcare che il codice da utilizzare sull'altro orecchio, e tutti i codici dovrebbero essere indicati sulla scheda della gabbia.

Ora impariamo come applicare correttamente un marchio auricolare, poiché un posizionamento errato può avere diverse sfortunate conseguenze. Dopo l'applicazione, discuteremo anche la rimozione del marchio auricolare, che di solito viene eseguita in caso di infezione dovuta all'applicazione del marchio.

Il primo passo è quello di selezionare una targhetta appropriata per gli animali da identificare. Qui, useremo una targhetta metallica per dimostrare la procedura sui topi. Assicurati di ordinare l'applicatore appropriato per le dimensioni e lo stile specifici dei marchi auricolari utilizzati. Rimuovere delicatamente l'etichetta dal supporto di cartone e orientarla nell'applicatore in modo che l'estremità con il foro sia posizionata sopra l'area dentellata dell'applicatore. L'estremità appuntita dell'etichetta deve essere opposta alla tacca.

Quando sei pronto per applicare il marchio auricolare, trattieni l'animale in modo che le orecchie siano facilmente accessibili. Gli animali possono avere meno probabilità di lottare se gli arti posteriori possono poggiare su una superficie come la parte superiore della gabbia o un piano di lavoro. Una volta che l'animale è stato trattenuto, posizionare la punta del marchio auricolare in profondità nella conca dell'orecchio in modo che i numeri del marchio siano rivolti verso la parte posteriore dell'animale. Quindi, premere con decisione l'applicatore per chiuderlo; Il marchio auricolare forerà l'orecchio e si bloccherà insieme. Quando si rilascia, l'orecchio etichettato cadrà dall'applicatore. Verificare che il tag sia stato posizionato e applicato correttamente. Se preferisci avere i numeri del marchio auricolare rivolti verso il naso dell'animale, posiziona la punta del marchio alla base del padiglione auricolare sul retro dell'orecchio e poi stringi per bloccare il tag in posizione.

Le targhette devono essere posizionate in modo tale da non causare una flessione dell'orecchio, interferire con la mobilità dell'animale o impigliarsi in qualsiasi parte della gabbia. Se l'etichetta è posizionata troppo vicino al bordo dell'orecchio, può essere facilmente strappata. Se posizionata troppo vicino alla testa, la pelle della zona del collo può impigliarsi nell'etichetta, creando irritazione, dolore e movimenti limitati, che possono quindi portare all'autotrauma. Occasionalmente, le targhette metalliche possono causare irritazione e gonfiore dell'orecchio. Questo spesso porta a infezioni del padiglione auricolare e il trattamento immediato dovrebbe includere la rimozione dell'etichetta.

Per rimuovere l'etichetta, inumidisci un applicatore con punta di cotone con una soluzione antisettica e usalo per rimuovere eventuali detriti intorno all'etichetta. Nei casi gravi di infezione, potrebbe essere necessario anestetizzare l'animale. Quindi, usando un tronchese, taglia la parte superiore dell'anello dell'etichetta da un bordo all'altro. È importante sottolineare che non tagliare la superficie piana in quanto ciò comprimerebbe l'etichetta, pizzicherebbe l'orecchio e causerebbe danni all'orecchio. Utilizzando gli emostatici, guidare delicatamente il marchio auricolare attraverso e fuori dall'orecchio. Sfilare l'etichetta in modo che l'estremità crimpata non passi attraverso causando traumi e allargamento del foro di perforazione. Una volta che l'etichetta è sparita, pulisci l'orecchio con un bastoncino applicatore di cotone imbevuto di antisettico e rimetti l'animale nella sua gabbia. Se c'è una secrezione purulenta dall'orecchio, può essere necessario un trattamento di follow-up e si raccomanda la consultazione con il personale veterinario per la valutazione.

Ora che sai come marcare gli animali da laboratorio usando marchi auricolari e punzoni, esaminiamo alcuni esperimenti in cui questi metodi possono essere utili. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo del codice del punzone dell'orecchio è che i punzoni possono fungere anche da campioni di tessuto per la genotipizzazione, riducendo così lo stress per gli animali causato dalla manipolazione ripetuta. Tuttavia, se si prevede di utilizzare i punzoni per la raccolta di campioni PCR, ricordarsi di immergere prima l'apparecchio in una soluzione decontaminante superficiale per almeno 3 minuti per rimuovere il DNA o l'RNA residui, quindi risciacquare con alcool prima dell'uso.

L'importanza della tecnica di identificazione aumenta ulteriormente se l'esperimento dura diversi giorni. Ad esempio, in questo esperimento gli scienziati hanno prima etichettato gli animali utilizzando una targhetta metallica e poi hanno iniettato nel nervo sciatico una sospensione di cellule tumorali transgeniche che esprimono la proteina luciferasi. Successivamente, al fine di quantificare la progressione del cancro, hanno analizzato gli animali utilizzando la bioluminescenza a uno, dieci e diciotto giorni dopo l'iniezione.

Hai appena visto la presentazione di JoVE che dimostra i due metodi di identificazione comunemente usati nei roditori: marchi auricolari e punzoni per le orecchie. Ora dovresti comprendere il codice del punzone per le orecchie, conoscere i diversi tipi di marchi auricolari per roditori disponibili in commercio e dovresti essere in grado di eseguire accuratamente queste procedure senza causare un significativo disagio agli animali.

Ricorda, ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi, che devono essere considerati in relazione alle tue esigenze sperimentali. Oltre a considerare il costo, la facilità della tecnica e il livello di dolore per gli animali dovrebbero essere alcune delle considerazioni principali nella scelta del metodo di identificazione appropriato. Come sempre, grazie per la visione!