Metodo delle aggiunte standard

Il metodo dell'aggiunta standard è una tecnica di analisi quantitativa utilizzata per ridurre al minimo gli effetti della matrice che interferiscono con i segnali di misurazione dell'analita.

Le concentrazioni di componenti sconosciute sono spesso chiarite attraverso una serie di tecniche analitiche, come la spettroscopia ottica, la spettrometria di massa e l'elettrochimica. Tuttavia, la misurazione può essere influenzata da altri componenti del campione, chiamati matrice, e causare la riduzione o l'aumento involontario del segnale, chiamati effetti matrice. Questi effetti possono distorcere i risultati e causare errori significativi nell'analisi.

Il metodo dell'aggiunta di standard può essere utilizzato per ridurre al minimo gli effetti della matrice sui segnali di misura. Questa operazione viene eseguita aggiungendo al campione volumi precisi di una soluzione di analita nota.

Questo video introdurrà le basi del metodo di aggiunta degli standard e dimostrerà come eseguire la tecnica in laboratorio utilizzando una misura di fluorescenza.

Gli effetti matrice possono verificarsi in campioni complessi in cui una serie di altre molecole interagiscono con l'analita. Ad esempio, ciò può verificarsi quando le molecole si legano o si agglomerano con l'analita, modificando così la sua capacità di emettere fluorescenza. Oppure la matrice può modificare la forza ionica della soluzione complessiva, modificando le proprietà specifiche dell'analita.

Per mitigare questi effetti utilizzando il metodo dell'aggiunta standard, viene aggiunto un intervallo di volumi di una soluzione standard di analita a volumi uguali del campione. I volumi della soluzione vengono quindi resi uguali utilizzando il solvente.

Quindi, il segnale viene misurato per i campioni con e senza l'aggiunta standard. I dati vengono tracciati come intensità rispetto alla quantità dello standard aggiunto al campione, piuttosto che come una classica curva di calibrazione. La concentrazione effettiva dell'analita in un dato pallone è definita dalla seguente equazione. La risposta strumentale sarà pari a una quantità costante di volte la concentrazione dell'analita. L'equazione risultante assume la forma lineare y=mx+b. Pertanto, quando il grafico viene estrapolato a assorbanza zero, l'intercetta è uguale alla concentrazione incognita del campione.

Il grafico del segnale deve essere lineare nell'intervallo di concentrazione di interesse. Inoltre, l'interferenza non deve variare al variare del rapporto tra analita e matrice del campione. Infine, la matrice stessa non dovrebbe generare alcun segnale di misura da sola.

Il seguente esperimento studia l'alluminio, una specie non fluorescente, facendolo reagire con 8-idrossichinolina, o 8HQ, per formare il complesso fluorescente ALQ3.

Viene misurata la fluorescenza del complesso di alluminio in un solvente organico e quindi correlata alla concentrazione della soluzione di alluminio originale. Questo approccio è comune nell'analisi degli ioni metallici.

Ora che sono state delineate le basi del metodo dell'addizione standard e spiegate le basi dell'esperimento, eseguiamo la tecnica in laboratorio.

Innanzitutto, preparare la soluzione madre di alluminio da 100 ppm in acqua, quindi utilizzarla per preparare una soluzione standard da 1 ppm.

Quindi, aggiungere 2 g di 8-idrossichinolina, o 8HQ, a un matraccio tarato da 100 ml.

Aggiungere con cautela 5,74 ml di acido acetico glaciale, quindi diluire fino a 100 ml con acqua deionizzata. Questo passaggio consente all'8HQ di dissolversi nella fase acquosa.

Successivamente, preparare il tampone aggiungendo 20 g di acetato di ammonio e 7 mL di idrossido di ammonio al 30% in un flacone contrassegnato da 100 mL e diluire. Verificare il pH con un indicatore di pH. Questo tampone aiuta a neutralizzare l'acido nella soluzione 8HQ quando combinato.

Altri reagenti necessari includono il solfato di sodio anidro e il cloroformio di grado spettrofotometrico.

Ora preparate i campioni, in questo caso estraendo il campione acquoso nella fase organica utilizzando l'estrazione liquido-liquido. Posizionare sei imbuti separatori da 125 ml sugli anelli del supporto ad anello all'interno della cappa. Assicurati che tutta la vetreria sia scrupolosamente pulita, poiché la vetreria sporca distorcerà i risultati. Etichettare in sequenza gli imbuti come "vuoto", "0", "1", "2", "3" e "4".

Utilizzando una pipetta, aggiungere 25 ml della soluzione di alluminio sconosciuta a ciascuno dei cinque imbuti separatori etichettati da "0" a "4". Preparare il bianco aggiungendo 25 ml di acqua deionizzata all'imbuto etichettato come "vuoto".

Quindi, aggiungere 1, 2, 3 e 4 ml della soluzione standard da 1 ppm agli imbuti numerati corrispondenti. Non aggiungere alcuna soluzione standard al grezzo o agli imbuti 0.

Aggiungere 1 mL della soluzione 8HQ e 3 mL di soluzione tampone a ciascuno dei 6 imbuti.

Eseguire un'estrazione liquido-liquido aggiungendo 10 ml di cloroformio a ciascun pallone. Agitare energicamente l'imbuto e di tanto in tanto sfiatare l'imbuto per rilasciare l'accumulo di pressione. Riposizionare l'imbuto nell'anello e lasciare che gli strati di liquido si separino.

Successivamente, raccogliere la fase di cloroformio in un becher da 100 ml pulito, asciutto ed etichettato. Poiché il cloroformio ha una densità maggiore dell'acqua, è lo strato inferiore dell'imbuto.

Trasferire l'estratto di cloroformio in un matraccio tarato da 25 ml e tappare ogni pallone per evitare l'evaporazione.

Eseguire una seconda estrazione liquido-liquido sulla soluzione acquosa rimanente, aggiungendo 10 mL di cloroformio a ciascun imbuto. Agitare l'imbuto, come prima, per trasferire l'analita rimanente nella fase di cloroformio. Non dovrebbe esserci più colore giallo nella fase acquosa superiore.

Ripetere la seconda estrazione per ogni imbuto, quindi raccogliere le fasi del cloroformio nei corrispondenti becher etichettati. Versare il cloroformio raccolto nei rispettivi matracci tarati e diluire fino al segno con cloroformio fresco.

Per rimuovere le tracce d'acqua, aggiungere circa 1 g di solfato di sodio anidro a ciascuno dei sei becher da 100 ml. Trasferire le soluzioni nei rispettivi becher e agitarle per facilitare la disidratazione del campione.

Decantare l'estratto di cloroformio in una cella fluorimetrica al quarzo.

Impostare il fluorimetro secondo le istruzioni del produttore e impostare la tensione a 400 V. Quindi, apri il programma di acquisizione dati sul computer.

Utilizzare il campione 2 per determinare le migliori lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione. Impostare la lunghezza d'onda di emissione a 500 nm ed eseguire una scansione di eccitazione da 335?435 nm, con una velocità di scansione di 2 nm/s.

Dal grafico di fluorescenza, determinare la lunghezza d'onda massima per l'eccitazione. Impostare lo strumento su quel valore di lunghezza d'onda di eccitazione, in questo caso 399 nm.

Quindi, determinare la lunghezza d'onda di emissione eseguendo una scansione da 450 a 550 nm. Dal grafico di fluorescenza risultante, determinare la lunghezza d'onda massima e impostare la lunghezza d'onda di emissione, in questo caso 520 nm.

Misurare ogni campione, compreso il bianco, alla lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione selezionata. Registra ogni lettura dell'intensità della fluorescenza.

Sottrarre la fluorescenza misurata del campione bianco da ciascuno degli altri 5 campioni.

Traccia l'intensità della fluorescenza di ciascuno dei cinque campioni rispetto alla quantità di alluminio aggiunta al campione. Determinare il valore dei minimi quadrati del grafico risultante, registrare la pendenza e l'intercetta.

Il grafico dell'intensità della fluorescenza rispetto alla quantità di alluminio aggiunto ha prodotto una linea dei minimi quadrati come mostrato. La quantità di alluminio nel campione può quindi essere calcolata utilizzando questa linea. Poiché la quantità di incognita aggiunta era di 25 ml, il valore determinato, 2,916 μg, è diviso per 25 ml. Questo dà un risultato finale di 0,117 ?g/mL, o 0,117 ppm. Questo è abbastanza vicino al valore noto di 0,110 ppm.

Ora, diamo un'occhiata ad alcune altre tecniche analitiche che possono avere risultati distorti a causa degli effetti matrice.

La spettroscopia di assorbimento atomico è un metodo analitico che misura l'assorbanza della luce da parte di un analita bersaglio nella fase gassosa. Per la maggior parte dei campioni, una semplice curva di calibrazione che mette in relazione l'assorbimento con la concentrazione del campione può fungere da metodo affidabile per quantificare una concentrazione sconosciuta.

Tuttavia, questa tecnica può perdere precisione se altri componenti della miscela interagiscono con l'analita target e sopprimono o migliorano l'assorbimento. In questo caso il metodo dell'addizione standard può essere utilizzato per tenere conto degli effetti di queste interazioni, specialmente nei campioni in cui la matrice non può essere rimossa prima dell'analisi.

La taratura dello strumento svolge un ruolo cruciale nell'accuratezza di una misura. Il metodo dell'aggiunta di standard è spesso utilizzato per facilitare la calibrazione di strumenti come l'ICP-MS. L'ICP-MS è un metodo comparativo, il che significa che la misurazione di un campione sconosciuto si basa sulla misurazione di uno standard chimico.

Pertanto, l'incertezza di una misurazione di un'incognita non può essere migliore dell'incertezza della calibrazione. Il metodo dell'aggiunta di standard può quindi essere utilizzato per creare una curva di calibrazione più accurata del metodo standard e tiene conto delle interazioni matriciali nel campione.

Molte molecole biologiche vengono analizzate utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni o HPLC. L'HPLC è una tecnica che separa e analizza miscele complesse in base alle proprietà delle molecole come polarità, carica e dimensioni. Il momento in cui l'analita lascia la colonna consente all'utente di identificare ogni componente della miscela.

Le molecole biologiche possono spesso interagire in una miscela e sono fortemente influenzate dalla matrice in cui sono sospese. Spesso, il metodo dell'addizione standard viene utilizzato per creare una curva di calibrazione che tiene conto di questi effetti.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al metodo dell'aggiunta di standard. A questo punto è necessario comprendere come eseguire la tecnica per tenere conto degli effetti matrice nell'analisi dei campioni.

Grazie per l'attenzione!