Spettroscopia ultravioletta/visibile (UV-VIs)

Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

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Analytical Chemistry

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Ultraviolet-Visible (UV-Vis) Spectroscopy

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09:21 min

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August 24, 2015

Overview

Fonte: Laboratorio del Dr.B. Jill Venton – Università della Virginia

La spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis) è una delle tecniche analitiche più popolari perché è molto versatile e in grado di rilevare quasi tutte le molecole. Con la spettroscopia UV-Vis, la luce UV-Vis viene fatta passare attraverso un campione e viene misurata la trasmittanza della luce da parte di un campione. Dalla trasmittanza (T), l’assorbanza può essere calcolata come A=-log (T). Si ottiene uno spettro di assorbanza che mostra l’assorbanza di un composto a diverse lunghezze d’onda. La quantità di assorbanza a qualsiasi lunghezza d’onda è dovuta alla struttura chimica della molecola.

UV-Vis può essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare gruppi funzionali o confermare l’identità di un composto abbinando lo spettro di assorbanza. Può anche essere usato in modo quantitativo, poiché la concentrazione dell’analita è correlata all’assorbanza usando la legge di Beer. La spettroscopia UV-Vis viene utilizzata per quantificare la quantità di DNA o proteine in un campione, per l’analisi dell’acqua e come rivelatore per molti tipi di cromatografia. La cinetica delle reazioni chimiche viene misurata anche con la spettroscopia UV-Vis prendendo ripetute misurazioni UV-Vis nel tempo. Le misurazioni UV-Vis sono generalmente prese con uno spettrofotometro. UV-Vis è anche un rivelatore molto popolare per altre tecniche analitiche, come la cromatografia, perché può rilevare molti composti.

Tipicamente, UV-Vis non è la tecnica di spettroscopia più sensibile, perché non molta luce viene assorbita su una breve lunghezza del percorso. Altre tecniche di spettroscopia come la fluorescenza hanno una sensibilità più elevata, ma non sono così generalmente applicabili, poiché la maggior parte delle molecole non sono fluorescenti. UV-Vis ha una sensibilità simile ad altre misurazioni di assorbanza, come la spettroscopia infrarossa.

Principles

UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale perché la maggior parte delle molecole assorbirà nell’intervallo di lunghezze d’onda UV-Vis. L’UV si estende da 100-400 nm e lo spettro visibile da 400-700 nm. L’intervallo 100-200 nm è chiamato UV profondo. Le sorgenti luminose sono più difficili da trovare per questa gamma, quindi non viene utilizzata di routine per le misurazioni UV-Vis. I tipici spettrometri UV-Vis utilizzano una lampada al deuterio per l’UV che produce luce da 170-375 nm e una lampada a filamento di tungsteno per il visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.

Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa in uno stato energetico più eccitato. La luce visibile UV ha abbastanza energia per promuovere gli elettroni a uno stato elettronico più elevato, dal più alto orbitale molecolare occupato (HOMO) al più basso orbitale molecolare non occupato (LUMO). La differenza di energia tra l’HOMO e il LUMO è chiamata band gap. Tipicamente, questi orbitali sono chiamati bonding e anti-bonding. L’energia del fotone deve corrispondere esattamente al band gap affinché il fotone venga assorbito. Pertanto, le molecole con diverse strutture chimiche hanno diversi gap di banda energetica e diversi spettri di assorbimento. Le transizioni più comuni che rientrano nell’intervallo UV-Vis sono π-π* e n-π*. Gli orbitali Pi sorgono a causa di doppi legami e gli orbitali n sono per elettroni non leganti. Le stelle Pi sono orbitali pi anti-legame. Pertanto, il miglior assorbimento UV-Vis è da parte di molecole che contengono doppi legami. Gli orbitali Pi adiacenti l’uno all’altro che sono collegati, chiamati coniugazione, in genere aumentano l’assorbimento. Le transizioni Sigma-σ*, associate a singoli legami, sono ad alta energia e cadono nei raggi UV profondi, quindi sono meno utili per l’uso di routine. La comparsa di bande larghe o spalle sulla struttura UV-Vis è dovuta ai numerosi stati vibrazionali e rotazionali di una molecola, che portano a gap di banda di energia separati di energie leggermente diverse.

Per le molecole con assorbimento nella regione visibile, i composti appariranno spesso colorati. Tuttavia, un malinteso comune è che la lunghezza d’onda del picco di assorbimento (λ_max) per un composto sia il colore che appare. Un composto che appare rosso non ha molto assorbimento nella regione rossa dello spettro. Invece, il_{λ max} per un composto che sembra rosso è verde. Il colore di un composto sorge perché quelle lunghezze d’onda della luce vengono trasmesse selettivamente attraverso il campione e quindi non vengono assorbite. Una ruota dei colori è utile per determinare quale colore assorbirà un composto e quale intervallo sarà il λ_max,poiché il colore direttamente attraverso la ruota dal colore osservato è il colore che viene assorbito di più.

L’assorbimento segue la legge di Beer, A = εbC dove ε è il coefficiente di attenuazione molare, b è la lunghezza del percorso e C è la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è la caratteristica di un singolo composto da assorbire ad una data lunghezza d’onda e questa proprietà è dovuta a gruppi funzionali, coniugazione, ecc. Se un composto non ha un alto coefficiente di attenuazione, potrebbe essere etichettato con un gruppo appropriato per aumentare la sua assorbanza. La lunghezza del percorso è generalmente correlata alle dimensioni della cuvetta ed è di 1 cm negli spettrofotometri standard.

UV-Vis viene eseguito su una varietà di strumenti, dagli spettrofotometri tradizionali ai lettori di lastre più moderni. La lunghezza d’onda di assorbanza deve essere scelta, utilizzando un filtro o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa le lunghezze d’onda della luce spazialmente e quindi posiziona una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d’onda desiderata della luce. I monocromatori possono essere scansionati per fornire un intero spettro di assorbanza. In alternativa, uno strumento a matrice di diodi consente di trasmettere tutti i colori della luce attraverso il campione, quindi la luce viene separata in diverse lunghezze d’onda spazialmente e rilevata utilizzando fotodiodi. Gli strumenti a matrice di diodi raccolgono spettri completi più velocemente, ma sono più complicati e più costosi.

Procedure

1. Calibrare lo spettrometro

Accendere lo spettrometro UV-Vis e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato (circa 20 minuti) per stabilizzarle.
Riempire una cuvetta con il solvente per il campione e assicurarsi che l’esterno sia pulito. Questo servirà come un bianco e aiuterà a tenere conto delle perdite di luce dovute alla dispersione o all’assorbimento da parte del solvente.
Posizionare la cuvetta nello spettrometro. Assicurati di allineare correttamente la cuvetta, poiché spesso la cuvetta ha due lati, che sono pensati per la manipolazione (possono essere scanalati) e non sono pensati per far brillare la luce.
Prendi una lettura per lo spazio vuoto. L’assorbanza dovrebbe essere minima, ma qualsiasi assorbanza dovrebbe essere sottratta dai campioni futuri. Alcuni strumenti potrebbero memorizzare i dati vuoti ed eseguire automaticamente la sottrazione.

2. Eseguire uno spettro di assorbanza

Riempire la cuvetta con il campione. Per assicurarsi che il trasferimento sia quantitativo, sciacquare la cuvetta due volte con il campione e quindi riempirla di circa 3/4. Assicurati che l’esterno sia pulito da eventuali impronte digitali, ecc.
Posizionare la cuvetta nello spettrometro nella direzione corretta.
Coprire la cuvetta per evitare la luce ambientale.
Raccogliere uno spettro di assorbanza consentendo allo strumento di scansionare diverse lunghezze d’onda e raccogliere l’assorbanza. L’intervallo di lunghezze d’onda può essere impostato con informazioni sul campione specifico, ma un intervallo di 200-800 nm è standard. Uno strumento a matrice di diodi è in grado di raccogliere un intero spettro di assorbanza in un’unica esecuzione.
Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare il massimo di assorbanza (λ_max). Ripetere la raccolta di spettri per ottenere una stima dell’errore in λ_max.
Per creare una curva di calibrazione, raccogliere lo spettro UV-Vis di una varietà di campioni di concentrazione diversi. Gli spettrometri sono spesso limitati nell’intervallo lineare e non saranno in grado di misurare un valore di assorbanza superiore a 1,5. Se i valori di assorbanza per il campione sono al di fuori dell’intervallo lineare dello strumento, diluire il campione per ottenere i valori all’interno dell’intervallo lineare.

3. Esperimenti di cinetica con spettroscopia UV-Vis

UV-Vis può essere utilizzato per esperimenti di cinetica esaminando il cambiamento di assorbanza nel tempo. Per un esperimento di cinetica, prendere una lettura iniziale del campione.
Aggiungere rapidamente il reagente per avviare la reazione chimica.
Mescolare bene per mescolare con il campione. Se viene aggiunta una piccola quantità, questo potrebbe essere fatto in una cuvetta. In alternativa, mescolare il reagente con il campione e versarne rapidamente un po ‘in una cuvetta per una misurazione.
Misurare l’assorbanza al_massimo λ per l’analita di interesse nel tempo. Se si utilizza il reagente da misurare(cioè l’assorbanza sta salendo perché c’è meno reagente da assorbire), allora il decadimento indicherà l’ordine della reazione.
Utilizzando una curva di calibrazione, creare un grafico della concentrazione dell’analita rispetto al tempo, convertendo il valore di assorbanza in concentrazione. Da lì, questo grafico può essere adattato con equazioni appropriate per determinare le costanti di velocità di reazione.

La spettroscopia ultravioletta-visibile, o UV-Vis, è una delle tecniche analitiche più popolari in laboratorio.

Nella spettroscopia UV-Vis, la luce viene fatta passare attraverso un campione a una specifica lunghezza d’onda nello spettro UV o visibile. Se il campione assorbe parte della luce, non tutta la luce verrà attraversata o trasmessa. La trasmissione è il rapporto tra l’intensità della luce trasmessa e la luce incidente ed è correlata all’assorbanza. L’assorbanza può essere utilizzata in modo quantitativo, per ottenere la concentrazione di un campione. Può anche essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare un composto abbinando l’assorbanza misurata su una gamma di lunghezze d’onda, chiamata spettro di assorbanza, ai dati pubblicati. Questo video introdurrà la spettroscopia UV-Vis e ne dimostrerà l’uso in laboratorio nel determinare la concentrazione del campione e la cinetica di reazione.

Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa dal suo stato base in uno stato energetico superiore. La differenza di energia tra i due è il gap di banda. L’energia del fotone deve corrispondere esattamente al band gap affinché il fotone venga assorbito. La struttura chimica determina il gap di banda; quindi le molecole hanno ciascuna spettri di assorbanza unici.

L’assorbanza segue la legge di Beer, che afferma che l’assorbanza è uguale al coefficiente di attenuazione molare per la lunghezza del percorso e la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è correlato alla capacità del singolo composto di assorbire la luce di una specifica lunghezza d’onda. La lunghezza del percorso si riferisce alla distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, che in genere è di 1 cm per le cuvette standard. La legge della birra può essere utilizzata per calcolare la concentrazione del campione, se l’assorbimento è noto, o può essere utilizzata una curva di calibrazione.

UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale, poiché la maggior parte delle molecole assorbe la luce nell’intervallo di lunghezze d’onda UV-visibili. La gamma UV si estende da 100 a 400 nm e lo spettro visibile varia da 400 a 700 nm. Tuttavia, la maggior parte degli spettrofotometri non funziona nell’intervallo UV profondo di 100-200 nm, poiché le sorgenti luminose in questo intervallo sono costose. La maggior parte degli spettrofotometri UV-Vis utilizza una lampada al deuterio per la gamma UV, che produce luce da 170-375 nm, e una lampada a filamento di tungsteno per la gamma visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.

Poiché la sorgente luminosa è solitamente una lampada con ampi intervalli di lunghezze d’onda, la lunghezza d’onda di assorbanza specifica viene selezionata utilizzando filtri o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa spazialmente le lunghezze d’onda della luce e quindi posiziona una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d’onda desiderata della luce. Il monocromatore può essere scansionato su un intervallo di lunghezze d’onda per fornire un intero spettro di assorbanza. Questo rende la tecnica utile per quantificare e identificare una vasta gamma di molecole.

Ora che le basi della spettroscopia UV-Vis sono state delineate, diamo un’occhiata a un semplice esperimento UV-Vis in laboratorio.

Prima di iniziare la misurazione, accendere lo spettrofotometro e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo appropriato per stabilizzarle.

Preparare uno spazio vuoto riempiendo una cuvetta pulita con il solvente campione, quindi pulire l’esterno con carta priva di lanugine per rimuovere eventuali impronte digitali.

Assicurarsi che la cuvetta sia allineata correttamente con i lati scanalati fuori dal percorso del fascio e inserirla nello spettrofotometro. Fissare il coperchio per evitare che la luce ambientale penetri nel sistema.

Misurare l’assorbanza del bianco a una lunghezza d’onda o su un intervallo di lunghezze d’onda. Registrare o salvare l’assorbanza, in quanto deve essere sottratta dall’assorbanza del campione.

Quindi, scartare lo spazio vuoto e risciacquare la cuvetta due volte con il campione. Quindi, riempire la cuvetta di circa 3/4 piena di campione. Pulire nuovamente l’esterno della cuvetta, per assicurarsi che sia pulito e privo di impronte digitali.

Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro con l’orientamento corretto e fissare il coperchio.

Raccogliere una misura di assorbanza o uno spettro alla stessa lunghezza d’onda o intervallo di lunghezze d’onda del bianco. Sottrarre lo spettro vuoto o la misurazione, se lo strumento non lo fa automaticamente.

Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare il massimo di assorbanza, o λ_max.

Per quantificare la quantità di analita nel campione, creare una curva di calibrazione utilizzando un intervallo di concentrazioni di analita note. Per ulteriori informazioni su come costruire e utilizzare una curva di calibrazione, guarda il video di questa raccolta “Curve di calibrazione”.

La misurazione dell’assorbanza può anche essere utilizzata per calcolare la cinetica di reazione misurando l’aumento o la diminuzione della concentrazione di composti durante la reazione. Inizia prendendo una lettura iniziale del campione, colorante blu in questo caso, al massimo assorbanza prima della reazione.

Quindi, aggiungere rapidamente il reagente, candeggina in questo caso, per avviare la reazione chimica. Mescolare bene, in modo che si mescoli con il campione.

Misurare l’assorbanza al massimo dell’assorbanza nel tempo.

Viene mostrato lo spettro di assorbanza iniziale del campione di colorante blu. I colori di sfondo mostrano i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha un massimo di assorbanza a circa 630 nm.

La cinetica della reazione tra colorante blu e candeggina è stata misurata nel tempo. L’assorbanza del colorante blu diminuisce nel tempo, poiché reagisce con la candeggina. L’assorbanza raggiunge quasi lo zero dopo 300 s, indicando che la reazione è vicina al completamento. Per ulteriori informazioni su cinetica e reazioni, guarda il video di JoVE Science Education “Reaction Rate Laws”.

La spettroscopia UV-Vis è utilizzata pesantemente in molte aree di ricerca diverse per identificare o quantificare un campione.

Ad esempio, la spettroscopia UV-Vis viene utilizzata pesantemente in campo biologico per quantificare la quantità di proteine in un campione. Un test di Bradford viene spesso utilizzato per quantificare le proteine, con l’aiuto di un colorante. In primo luogo, viene preparata una curva di calibrazione delle concentrazioni proteiche note, in genere utilizzando l’albumina sierica bovina o BSA. Quindi la macchia blu Coomassie viene aggiunta a ciascuno degli standard e al campione. L’assorbanza del complesso proteina-colorante viene quindi misurata a 595 nm.

In alternativa, le proteine possono essere misurate direttamente dalla loro assorbanza a 280 nm. In questo esempio, la concentrazione proteica viene quantificata utilizzando uno spettrofotometro a volume ultra basso. Per molte proteine, un’assorbanza di 1 è correlata a una concentrazione di 1 mg/mL.

La spettroscopia UV-Vis viene anche utilizzata per quantificare la quantità di cellule batteriche in una coltura cellulare. Per questa misurazione, l’assorbanza, o densità ottica, viene misurata a 600 nm. Tipicamente, una misurazione OD₆₀₀ di 1 indica la presenza di 8 x 10⁸ cellule batteriche per ml. Misurare la densità cellulare durante la crescita della coltura consente la determinazione della curva di crescita batterica e può aiutare a identificare quando una coltura è nella sua fase di crescita esponenziale.

L’ossido di azoto e il biossido di azoto, o NO_x,sono un sottoprodotto dei gas di scarico delle automobili e possono essere dannosi per l’ambiente perché formano ozono troposferico dannoso. L’NO_x può essere misurato facendolo reagire con una soluzione di acido sulfanilico e naptil-etilendiammina. La soluzione risultante è una molecola di colorante azoico di colore rosa, la cui intensità è direttamente correlata alla concentrazione di NO_x. Questa concentrazione può quindi essere determinata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla spettroscopia UV-visibile. Ora dovresti capire le basi del funzionamento UV-Vis, come misurare un campione usando un UV-Vis e come correlare l’assorbanza alla concentrazione del campione.

Grazie per l’attenzione!

Results

UV-Vis può essere utilizzato per ottenere uno spettro di composti colorati. Nella Figura 1Aviene mostrato lo spettro di assorbanza di un colorante blu. Lo sfondo mostra i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha una_{λ massima} assorbanza nell’arancione/rosso. La Figura 1B mostra uno spettro di un colorante rosso, con λ_max in verde.

La cinetica può essere misurata da un grafico di assorbanza a una lunghezza d’onda nel tempo. La Figura 2 mostra un grafico dell’assorbanza di un colorante blu (a 630 nm) mentre reagisce con la candeggina.

Figura 1. Spettri di assorbanza UV-Vis. A. Il colorante blu #1 ha la massima assorbanza nell’arancione / rosso. B. Il colorante rosso #40 ha la massima assorbanza nel verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. UV-Vis per la cinetica. L’assorbanza del colorante blu #1 mentre reagisce con la candeggina. La curva può essere adattata con un decadimento esponenziale, indicando la cinetica del primo ordine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Applications and Summary

UV-Vis è utilizzato in molte analisi chimiche. Viene utilizzato per quantificare la quantità di proteine in una soluzione, poiché la maggior parte delle proteine assorbe fortemente a 280 nm. La Figura 3 mostra un esempio di spettri del citocromo C, che ha un’elevata assorbanza a 280 e anche a 450 a causa di un gruppo eme. UV-Vis è anche usato come tecnica standard per quantificare la quantità di DNA in un campione, poiché tutte le basi assorbono fortemente a 260 nm. Anche l’RNA e le proteine assorbono a 260 nm, quindi l’assorbanza ad altre lunghezze d’onda può essere misurata per verificare la ricerca di interferenze. In particolare, le proteine assorbono fortemente a 280 nm, quindi il rapporto di assorbanza a 280/260 può dare una misura del rapporto tra proteina e DNA in un campione.

La maggior parte delle analisi più semplici misurano l’assorbanza una lunghezza d’onda alla volta. Tuttavia, sono presenti più informazioni chimiche se le misurazioni vengono effettuate contemporaneamente a molte lunghezze d’onda. Gli strumenti a matrice di diodi catturano tutta la luce che viene trasmessa, dividono la luce in diversi colori usando un prisma o una griglia olografica, e quindi l’assorbanza a diverse lunghezze d’onda viene catturata su una matrice lineare di fotodiodi. Il vantaggio di questo metodo è che è utile per misurare molte molecole diverse contemporaneamente.

Figura 3. Spettro UV-Vis di una proteina. Il picco a 280 nm è indicativo di una proteina. Il picco a 450 è dovuto all’assorbanza del gruppo eme nel citocromo C.

Transcript

Ultraviolet-visible, or UV-Vis, spectroscopy is one of the most popular analytical techniques in the laboratory.

In UV-Vis spectroscopy, light is passed through a sample at a specific wavelength in the UV or visible spectrum. If the sample absorbs some of the light, not all of the light will be pass through, or be transmitted. Transmission is the ratio of the intensity of the transmitted light to the incident light, and is correlated to absorbance. The absorbance can be used in a quantitative manner, to obtain the concentration of a sample. It can also be used in a qualitative manner, to identify a compound by matching the measured absorbance over a range of wavelengths, called the absorbance spectrum, to the published data. This video will introduce UV-Vis spectroscopy, and demonstrate its use in the laboratory in determining sample concentration and reaction kinetics.

When a photon hits a molecule and is absorbed, the molecule is promoted from its ground state into a higher energy state. The energy difference between the two is the band gap. The energy of the photon must exactly match the band gap in order for the photon to be absorbed. The chemical structure determines the band gap; therefore molecules each have unique absorbance spectra.

Absorbance follows Beer’s Law, which states absorbance equals the molar attenuation coefficient times the path length and concentration. The molar attenuation coefficient is related to the individual compound’s ability to absorb light of a specific wavelength. Path length refers to the distance traveled by light through the sample, which is typically 1 cm for standard cuvettes. Beer’s law can be used to calculate sample concentration, if the absorptivity is known, or a calibration curve can be used.

UV-Vis is often called a general technique, as most molecules absorb light in the UV-visible wavelength range. The UV range extends from 100–400 nm, and the visible spectrum ranges from 400–700 nm. However, most spectrophotometers do not operate in the deep UV range of 100–200 nm, as light sources in this range are expensive. Most UV-Vis spectrophotometers use a deuterium lamp for the UV range, which produces light from 170–375 nm, and a tungsten filament lamp for the visible range, which produces light from 350–2,500 nm.

Since the light source is usually a lamp with broad wavelength ranges, the specific absorbance wavelength is selected using filters or a monochromator. A monochromator is a device that separates the wavelengths of light spatially, and then places an exit slit where the desired wavelength of light is. The monochromator can be scanned over a wavelength range to provide an entire absorbance spectrum. This makes the technique useful for quantifying and identifying a wide range of molecules.

Now that the basics of UV-Vis spectroscopy have been outlined, lets take a look at a simple UV-Vis experiment in the laboratory.

Before beginning the measurement, turn on the spectrophotometer, and allow the lamps to warm up for an appropriate period of time to stabilize them.

Prepare a blank by filling a clean cuvette with the sample solvent, and then wipe the outside with lint-free paper to remove any fingerprints.

Ensure that the cuvette is aligned properly with any grooved sides out of the beam-path, and insert it into the spectrophotometer. Secure the lid to prevent ambient light from entering the system.

Measure the absorbance of the blank at one wavelength, or over a wavelength range. Record or save the absorbance, as it must be subtracted from the absorbance of the sample.

Next, discard the blank and rinse the cuvette twice with sample. Then, fill the cuvette about ¾ full with sample. Wipe the outside of the cuvette again, to ensure that it is clean and free of fingerprints.

Place the cuvette in the spectrophotometer in the correct orientation, and secure the lid.

Collect an absorbance measurement or spectrum at the same wavelength or wavelength range as the blank. Subtract the blank spectrum or measurement, if the instrument does not automatically do so.

From the collected absorbance spectrum, determine the absorbance maximum, or λmax.

To quantify the amount of analyte in the sample, create a calibration curve using a range of known analyte concentrations. For more information on how to construct and use a calibration curve, please watch this collection’s video “Calibration Curves”.

The absorbance measurement can also be used to calculate reaction kinetics by measuring the increase or decrease in a compounds concentration throughout the reaction. Begin by taking an initial reading of the sample, blue dye in this case, at the absorbance maximum before the reaction.

Next, quickly add the reagent, bleach in this case, to start the chemical reaction. Stir it well, so that it mixes with the sample.

Measure the absorbance at the absorbance maximum over time.

The initial absorbance spectrum of the blue dye sample is shown. The background colors show the colors of light in the visible spectrum. The blue dye has an absorbance maximum at about 630 nm.

The kinetics of the reaction between blue dye and bleach was measured over time. The absorbance of blue dye decreases over time, as it reacts with the bleach. The absorbance reaches near zero after 300 s, indicating that the reaction has neared completion. For more information on kinetics and reactions, please watch the JoVE Science Education video “Reaction Rate Laws”.

UV-Vis spectroscopy is used heavily in many different research areas to identify or quantify a sample.

For example, UV-Vis spectroscopy is used heavily in biological fields to quantify the amount of protein in a sample. A Bradford assay is often used to quantify proteins, with the aid of a dye. First, a calibration curve of known protein concentrations is prepared, typically using Bovine Serum Albumin, or BSA. Then Coomassie blue stain is added to each of the standards and to the sample. The absorbance of the protein-dye complex is then measured at 595 nm.

Alternatively, proteins can be measured directly by their absorbance at 280 nm. In this example, protein concentration is quantified using an ultra low volume spectrophotometer. For many proteins, an absorbance of 1 correlates to a concentration of 1 mg/mL.

UV-Vis spectroscopy is also used to quantify the amount of bacterial cells in a cell culture. For this measurement, the absorbance, or optical density, is measured at 600 nm. Typically, an OD600 measurement of 1 indicates the presence of 8 x 108 bacterial cells per mL. Measuring the cell density throughout culture growth enables the determination of the bacterial growth curve, and can help to identify when a culture is in its exponential growth phase.

Nitrogen oxide and nitrogen dioxide, or NOx, is a by-product of automobile exhaust, and can be harmful to the environment because it forms damaging tropospheric ozone. NOx can be measured by reacting it with a solution of sulfanilic acid and napthyl-ethylenediamine. The resulting solution is a pink colored azo dye molecule, the intensity of which is directly correlated to NOx concentration. This concentration can then be determined using a UV-Vis spectrophotometer.

You’ve just watched JoVE’s introduction to UV-visible spectroscopy. You should now understand the basics of UV-Vis operation, how to measure a sample using a UV-Vis and how to correlate absorbance to sample concentration.

Thanks for watching!