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La spettroscopia ultravioletto-visibile, o UV-Vis, è una delle tecniche analitiche più diffuse in laboratorio.
Nella spettroscopia UV-Vis, la luce viene fatta passare attraverso un campione a una lunghezza d'onda specifica nello spettro UV-Vis, o visibile. Se il campione assorbe parte della luce, non tutta la luce passerà attraverso o verrà trasmessa. La trasmissione è il rapporto tra l'intensità della luce trasmessa e la luce incidente ed è correlata all'assorbanza. L'assorbanza può essere utilizzata in modo quantitativo, per ottenere la concentrazione di un campione. Può anche essere utilizzato in modo qualitativo, per identificare un composto abbinando l'assorbanza misurata su un intervallo di lunghezze d'onda, chiamato spettro di assorbanza, ai dati pubblicati. Questo video introdurrà la spettroscopia UV-Vis e dimostrerà il suo utilizzo in laboratorio per determinare la concentrazione del campione e la cinetica di reazione.
Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa dal suo stato fondamentale a uno stato di energia superiore. La differenza di energia tra i due è la banda proibita. L'energia del fotone deve corrispondere esattamente alla banda proibita affinché il fotone possa essere assorbito. La struttura chimica determina la banda proibita; Pertanto, ciascuna delle molecole ha spettri di assorbanza unici.
L'assorbanza segue la legge di Beer, che afferma che l'assorbanza è uguale al coefficiente di attenuazione molare moltiplicato per la lunghezza del percorso e la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è correlato alla capacità del singolo composto di assorbire la luce di una specifica lunghezza d'onda. La lunghezza del percorso si riferisce alla distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, che in genere è di 1 cm per le cuvette standard. La legge di Beer può essere utilizzata per calcolare la concentrazione del campione, se l'assorbività è nota, oppure può essere utilizzata una curva di calibrazione.
UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale, poiché la maggior parte delle molecole assorbe la luce nell'intervallo di lunghezze d'onda UV-visibili. La gamma UV si estende da 100 a 400 nm e lo spettro visibile da 400 a 700 nm. Tuttavia, la maggior parte degli spettrofotometri non funziona nell'intervallo UV profondo di 100-200 nm, poiché le sorgenti luminose in questo intervallo sono costose. La maggior parte degli spettrofotometri UV-Vis utilizza una lampada al deuterio per la gamma UV, che produce luce da 170-375 nm, e una lampada a filamento di tungsteno per la gamma visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.
Poiché la sorgente luminosa è solitamente una lampada con ampi intervalli di lunghezze d'onda, la lunghezza d'onda di assorbanza specifica viene selezionata utilizzando filtri o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa spazialmente le lunghezze d'onda della luce e quindi posiziona una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d'onda della luce desiderata. Il monocromatore può essere scansionato su un intervallo di lunghezze d'onda per fornire un intero spettro di assorbanza. Ciò rende la tecnica utile per quantificare e identificare un'ampia gamma di molecole.
Ora che sono state delineate le basi della spettroscopia UV-Vis, diamo un'occhiata a un semplice esperimento UV-Vis in laboratorio.
Prima di iniziare la misurazione, accendere lo spettrofotometro e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo adeguato per stabilizzarle.
Preparare uno spazio vuoto riempiendo una cuvetta pulita con il solvente del campione, quindi pulire l'esterno con carta priva di lanugine per rimuovere eventuali impronte digitali.
Assicurarsi che la cuvetta sia allineata correttamente con tutti i lati scanalati fuori dal percorso del fascio e inserirla nello spettrofotometro. Fissare il coperchio per evitare che la luce ambientale entri nel sistema.
Misurare l'assorbanza del bianco a una lunghezza d'onda o su un intervallo di lunghezze d'onda. Registrare o conservare l'assorbanza, in quanto deve essere sottratta dall'assorbanza del campione.
Quindi, scartare il bianco e sciacquare la cuvetta due volte con il campione. Quindi, riempire la cuvetta circa ? pieno di campione. Pulisci nuovamente l'esterno della cuvetta, per assicurarti che sia pulita e priva di impronte digitali.
Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro con l'orientamento corretto e chiudere il coperchio.
Raccogli una misura di assorbanza o spettro alla stessa lunghezza d'onda o intervallo di lunghezze d'onda del bianco. Sottrarre lo spettro bianco o la misura, se lo strumento non lo fa automaticamente.
Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare l'assorbanza massima, o ?max.
Per quantificare la quantità di analita nel campione, creare una curva di calibrazione utilizzando un intervallo di concentrazioni note dell'analita. Per ulteriori informazioni su come costruire e utilizzare una curva di calibrazione, guarda il video di questa raccolta "Curve di calibrazione".
La misurazione dell'assorbanza può essere utilizzata anche per calcolare la cinetica di reazione misurando l'aumento o la diminuzione della concentrazione di un composto durante la reazione. Iniziare effettuando una lettura iniziale del campione, in questo caso colorante blu, al massimo dell'assorbanza prima della reazione.
Quindi, aggiungi rapidamente il reagente, in questo caso la candeggina, per avviare la reazione chimica. Mescola bene, in modo che si mescoli con il campione.
Misurare l'assorbanza al massimo dell'assorbanza nel tempo.
Viene mostrato lo spettro di assorbanza iniziale del campione di colorante blu. I colori di sfondo mostrano i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha un'assorbanza massima di circa 630 nm.
La cinetica della reazione tra il colorante blu e la candeggina è stata misurata nel tempo. L'assorbanza del colorante blu diminuisce nel tempo, poiché reagisce con la candeggina. L'assorbanza raggiunge quasi lo zero dopo 300 s, indicando che la reazione è vicina al completamento. Per ulteriori informazioni sulla cinetica e le reazioni, guarda il video JoVE Science Education "Leggi della velocità di reazione".
La spettroscopia UV-Vis è ampiamente utilizzata in molte aree di ricerca diverse per identificare o quantificare un campione.
Ad esempio, la spettroscopia UV-Vis è molto utilizzata in campo biologico per quantificare la quantità di proteine in un campione. Un saggio di Bradford viene spesso utilizzato per quantificare le proteine, con l'aiuto di un colorante. In primo luogo, viene preparata una curva di calibrazione delle concentrazioni proteiche note, tipicamente utilizzando l'albumina sierica bovina, o BSA. Quindi la colorazione blu Coomassie viene aggiunta a ciascuno degli standard e al campione. L'assorbanza del complesso proteina-colorante viene quindi misurata a 595 nm.
In alternativa, le proteine possono essere misurate direttamente dalla loro assorbanza a 280 nm. In questo esempio, la concentrazione proteica viene quantificata utilizzando uno spettrofotometro a volume ultra basso. Per molte proteine, un'assorbanza di 1 è correlata a una concentrazione di 1 mg/mL.
La spettroscopia UV-Vis viene utilizzata anche per quantificare la quantità di cellule batteriche in una coltura cellulare. Per questa misurazione, l'assorbanza, o densità ottica, viene misurata a 600 nm. In genere, una misurazione OD600 di 1 indica la presenza di 8 x 108 cellule batteriche per mL. La misurazione della densità cellulare durante la crescita della coltura consente di determinare la curva di crescita batterica e può aiutare a identificare quando una coltura è nella sua fase di crescita esponenziale.
L'ossido di azoto e il biossido di azoto, o NOx, sono un sottoprodotto dei gas di scarico delle automobili e possono essere dannosi per l'ambiente perché formano dannoso ozono troposferico. Gli NOx possono essere misurati facendoli reagire con una soluzione di acido sulfanilico e naftil-etilendiammina. La soluzione risultante è una molecola di colorante azoico di colore rosa, la cui intensità è direttamente correlata alla concentrazione di NOx. Questa concentrazione può quindi essere determinata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla spettroscopia UV-visibile. A questo punto è necessario comprendere le nozioni di base del funzionamento UV-Vis, come misurare un campione utilizzando un UV-Vis e come correlare l'assorbanza alla concentrazione del campione.
Grazie per l'attenzione!
