Isolamento di batteri fecali da campioni d'acqua mediante filtrazione

1. Raccolta e lavorazione dei campioni d'acqua

1. Raccogliere diversi campioni di acqua da 1 L dalla fonte d'acqua di prova(ad esempio fontane d'acqua, piscine, serbatoi, sistemi di distribuzione dell'acqua, acque reflue grezze o trattate) e trasportare sul ghiaccio al laboratorio per l'analisi microbica.
2. Sterilizzare o disinfettare il gruppo del collettore di filtrazione a membrana prima dell'uso in autoclave, esposizione a radiazioni UV (2 min) o accensione a fiamma di etanolo.
3. Dopo il raffreddamento di tutte le parti, collegare correttamente il collettore a una pompa per vuoto e a un pallone per rifiuti di filtrazione sotto vuoto contenente candeggina.
4. La fiamma di etanolo sterilizza un paio di pinze e con esse rimuove un filtro a membrana sterile e grigliato dalla sua confezione. In genere vengono utilizzate membrane di 47 mm di diametro con una dimensione dei pori di 0,45 μm. Tuttavia, è possibile utilizzare diametri e dimensioni dei pori alternativi a condizione che la dimensione dei pori possa intrappolare sufficientemente i microrganismi bersaglio e che almeno il 70% dell'area del filtro sia composta da spazio dei pori.
5. Posizionare il filtro al centro dell'area di filtrazione a membrana del collettore e applicare un imbuto filtrante sterile all'unità e fissarlo in posizione.
6. Misurare un volume desiderato di acqua di prova(ad esempio 100 ml) e aggiungerlo all'imbuto (un segno di linea di 100 ml è visibile sull'imbuto).
7. Applicare un vuoto parziale [differenziale di pressione da 34 a 51 kPa (kiloPascal)] per prelevare il campione di prova attraverso il filtro. Il materiale solido sospeso totale, compresi i batteri e la materia organica in decomposizione, maggiore della dimensione media dei pori del filtro di 0,45 μm è intrappolato sul filtro. Particelle più piccole, inclusi virus e solidi disciolti come piccole quantità di materia organica e sali, passeranno attraverso la membrana e nel contenitore dei rifiuti contenente candeggina.
8. Dopo il passaggio completo del campione attraverso il filtro, sciacquare l'interno dell'imbuto con due o tre volumi da 20-30 ml di acqua sterile.
9. Spegnere il vuoto e rimuovere l'imbuto dal collettore alla chiusura del risciacquo finale.
10. Con una pinzedina sterilizzata a fiamma di etanolo, rimuovere immediatamente il filtro a membrana dall'unità e posizionarlo prontamente sul mezzo di crescita agarose appropriato per il microrganismo bersaglio(la Tabella 1 elenca i mezzi di crescita raccomandati e le condizioni di incubazione per ciascuno).
11. Applicare il filtro a membrana sulla superficie dell'agarose con un movimento a rullo per garantire il completo contatto della membrana con il mezzo di crescita ed evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
12. Sostituire l'imbuto di filtrazione utilizzato con un'unità sterile tra la lavorazione di ciascun campione e disinfettare l'etanolo del collettore in acciaio inossidabile per prevenire la contaminazione incrociata.

2. Enumerazione delle colonie

1. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le piastre di crescita dall'incubatore per l'enumerazione.
2. Idealmente, esegui i conteggi delle colonie con ingrandimento a bassa potenza utilizzando una fonte di luce bianca fredda.
3. Coliformi totali
   1. Le colonie coliformi totali sono tipicamente di colore da rosa a rosso scuro con una lucentezza superficiale metallica. La lucentezza stessa può coprire parzialmente o completamente la colonia. Le morfologie atipiche delle colonie coliformi totali possono essere rosso scuro, mucoide o nucleate senza lucentezza.
   2. Le colonie che sono rosa, blu, bianche o incolori mentre mancano di lucentezza sono considerate non coliformi.
4. Coliformi fecali
   1. Le colonie coliformi fecali appaiono come varie tonalità di blu.
   2. Le colonie coliformi non fecali sono di colore da grigio a crema.
5. Enterococchi fecali
   1. Le colonie di enterococchi fecali vanno dal rosa al rosso scuro.

3. Verifica della colonia

1. Coliformi totali
   1. Per una verifica presenza-assenza, tamponare l'intera membrana utilizzando un anello di inoculazione sterile. Per le colonie è preferibile verificarne almeno cinque ciascuna di morfologie tipiche e atipiche.
   2. Trasferire la colonia selezionata in un recipiente di vetro contenente brodo di lauril triptosio con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 35±0,5 °C per 48 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme.
2. Coliformi fecali
   1. Trasferire le colonie di colore blu in modo asettico in recipienti di vetro contenenti mezzo EC sterile con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 44,5 ± 0,2 °C per 24 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme fecale.
3. Enterococchi fecali
   1. Colpisci le colonie che caratterizzano la morfologia degli enterococchi fecali per l'isolamento in modo asettico sull'Agar per infusione cerebrale-cardiaca (BHIA) e incuba a 35 ± 0,5 °C per 24-48 ore.
   2. Trasferire la crescita da una colonia isolata su BHIA su due vetrini pre-puliti.
   3. Aggiungere da due a tre gocce di perossido di idrogeno al 3% agli strisci preparati sui vetrini. La rapida comparsa di bolle indica un risultato "catalasi positiva" e l'isolato non è un batterio streptococco fecale.
   4. Eseguire una colorazione di Gram per il test degli isolati come "catalasi negativa" (nessuna bolla osservata). Gli enterococchi fecali sono Gram-positivi, ovoidali e appaiono per lo più in coppie o catene corte.

Indicatore batterico fecale	Supporti consigliati (Temperatura di incubazione, tempo) 1
Coliformi totali	LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 h) M-Endo Medium (35 ± 5 °C, 24 h)
Coliformi fecali	m-FC Medium (44.5 ± 0.2 °C, 24 h)
Enterococchi fecali	m Enterococcus Agar (35 ± 0.5 °C, 48 h)

Tabella 1. Mezzi di coltura di crescita comunemente utilizzati per la rilevazione di indicatori batterici fecali in campioni ambientali
¹ Come raccomandato dai metodi standard per l'esame delle acque e delle acque reflue (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22nd Edition, 2012)