2.11: Isolamento di batteri fecali da campioni d'acqua mediante filtrazione

1. Raccolta e lavorazione dei campioni d'acqua

1. Raccogliere diversi campioni di acqua da 1 L dalla fonte d'acqua di prova(ad esempio fontane d'acqua, piscine, serbatoi, sistemi di distribuzione dell'acqua, acque reflue grezze o trattate) e trasportare sul ghiaccio al laboratorio per l'analisi microbica.
2. Sterilizzare o disinfettare il gruppo del collettore di filtrazione a membrana prima dell'uso in autoclave, esposizione a radiazioni UV (2 min) o accensione a fiamma di etanolo.
3. Dopo il raffreddamento di tutte le parti, collegare correttamente il collettore a una pompa per vuoto e a un pallone per rifiuti di filtrazione sotto vuoto contenente candeggina.
4. La fiamma di etanolo sterilizza un paio di pinze e con esse rimuove un filtro a membrana sterile e grigliato dalla sua confezione. In genere vengono utilizzate membrane di 47 mm di diametro con una dimensione dei pori di 0,45 μm. Tuttavia, è possibile utilizzare diametri e dimensioni dei pori alternativi a condizione che la dimensione dei pori possa intrappolare sufficientemente i microrganismi bersaglio e che almeno il 70% dell'area del filtro sia composta da spazio dei pori.
5. Posizionare il filtro al centro dell'area di filtrazione a membrana del collettore e applicare un imbuto filtrante sterile all'unità e fissarlo in posizione.
6. Misurare un volume desiderato di acqua di prova(ad esempio 100 ml) e aggiungerlo all'imbuto (un segno di linea di 100 ml è visibile sull'imbuto).
7. Applicare un vuoto parziale [differenziale di pressione da 34 a 51 kPa (kiloPascal)] per prelevare il campione di prova attraverso il filtro. Il materiale solido sospeso totale, compresi i batteri e la materia organica in decomposizione, maggiore della dimensione media dei pori del filtro di 0,45 μm è intrappolato sul filtro. Particelle più piccole, inclusi virus e solidi disciolti come piccole quantità di materia organica e sali, passeranno attraverso la membrana e nel contenitore dei rifiuti contenente candeggina.
8. Dopo il passaggio completo del campione attraverso il filtro, sciacquare l'interno dell'imbuto con due o tre volumi da 20-30 ml di acqua sterile.
9. Spegnere il vuoto e rimuovere l'imbuto dal collettore alla chiusura del risciacquo finale.
10. Con una pinzedina sterilizzata a fiamma di etanolo, rimuovere immediatamente il filtro a membrana dall'unità e posizionarlo prontamente sul mezzo di crescita agarose appropriato per il microrganismo bersaglio(la Tabella 1 elenca i mezzi di crescita raccomandati e le condizioni di incubazione per ciascuno).
11. Applicare il filtro a membrana sulla superficie dell'agarose con un movimento a rullo per garantire il completo contatto della membrana con il mezzo di crescita ed evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
12. Sostituire l'imbuto di filtrazione utilizzato con un'unità sterile tra la lavorazione di ciascun campione e disinfettare l'etanolo del collettore in acciaio inossidabile per prevenire la contaminazione incrociata.

2. Enumerazione delle colonie

1. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le piastre di crescita dall'incubatore per l'enumerazione.
2. Idealmente, esegui i conteggi delle colonie con ingrandimento a bassa potenza utilizzando una fonte di luce bianca fredda.
3. Coliformi totali
   1. Le colonie coliformi totali sono tipicamente di colore da rosa a rosso scuro con una lucentezza superficiale metallica. La lucentezza stessa può coprire parzialmente o completamente la colonia. Le morfologie atipiche delle colonie coliformi totali possono essere rosso scuro, mucoide o nucleate senza lucentezza.
   2. Le colonie che sono rosa, blu, bianche o incolori mentre mancano di lucentezza sono considerate non coliformi.
4. Coliformi fecali
   1. Le colonie coliformi fecali appaiono come varie tonalità di blu.
   2. Le colonie coliformi non fecali sono di colore da grigio a crema.
5. Enterococchi fecali
   1. Le colonie di enterococchi fecali vanno dal rosa al rosso scuro.

3. Verifica della colonia

1. Coliformi totali
   1. Per una verifica presenza-assenza, tamponare l'intera membrana utilizzando un anello di inoculazione sterile. Per le colonie è preferibile verificarne almeno cinque ciascuna di morfologie tipiche e atipiche.
   2. Trasferire la colonia selezionata in un recipiente di vetro contenente brodo di lauril triptosio con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 35±0,5 °C per 48 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme.
2. Coliformi fecali
   1. Trasferire le colonie di colore blu in modo asettico in recipienti di vetro contenenti mezzo EC sterile con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 44,5 ± 0,2 °C per 24 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme fecale.
3. Enterococchi fecali
   1. Colpisci le colonie che caratterizzano la morfologia degli enterococchi fecali per l'isolamento in modo asettico sull'Agar per infusione cerebrale-cardiaca (BHIA) e incuba a 35 ± 0,5 °C per 24-48 ore.
   2. Trasferire la crescita da una colonia isolata su BHIA su due vetrini pre-puliti.
   3. Aggiungere da due a tre gocce di perossido di idrogeno al 3% agli strisci preparati sui vetrini. La rapida comparsa di bolle indica un risultato "catalasi positiva" e l'isolato non è un batterio streptococco fecale.
   4. Eseguire una colorazione di Gram per il test degli isolati come "catalasi negativa" (nessuna bolla osservata). Gli enterococchi fecali sono Gram-positivi, ovoidali e appaiono per lo più in coppie o catene corte.

Tabella 1. Mezzi di coltura di crescita comunemente utilizzati per la rilevazione di indicatori batterici fecali in campioni ambientali
¹ Come raccomandato dai metodi standard per l'esame delle acque e delle acque reflue (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22nd Edition, 2012)

La filtrazione a membrana e la successiva coltura dei batteri raccolti è una tecnica utile per valutare la qualità e la pulizia di una fonte d'acqua.

La qualità dell'acqua destinata all'uso in ambienti agricoli, ricreativi o domestici è di grande importanza, a causa del potenziale di focolai di malattie trasmesse dall'acqua. Se l'acqua è contaminata da materia fecale di animali o esseri umani, parassiti, batteri o virus patogeni possono essere diffusi a nuovi ospiti dopo la loro ingestione. Il monitoraggio delle fonti d'acqua per tali organismi patogeni è quindi fondamentale per garantire la salute pubblica.

L'enorme numero e la varietà di agenti patogeni oro-fecali che possono essere presenti in una fonte d'acqua rende poco pratico il test per ciascuno di essi in modo indipendente e regolare. Invece, i comuni saggi microbiologici per la qualità dell'acqua utilizzano batteri indicatori di coliformi. Per ulteriori informazioni su questo processo, vedere il video di questa raccolta sugli organismi indicatori.

Questo video illustrerà il processo di filtrazione su membrana su un campione di acqua ambientale, dimostrerà come coltivare diversi tipi di batteri indicatori fecali, tra cui coliformi totali, coliformi fecali ed entercocchi fecali, e descriverà come verificare la presenza di contaminazione fecale.

La tecnica di filtrazione a membrana utilizza una pressione negativa per prelevare campioni d'acqua attraverso un filtro e intrappolare i batteri. Il filtro è una membrana specializzata con una dimensione media minima dei pori di 0,45 μm che consente la cattura dei batteri, che in genere hanno una dimensione di circa 1 μm. Dopo la filtrazione, la membrana viene applicata ai terreni di crescita dell'agarosio e incubata in condizioni appropriate per coltivare i microrganismi bersaglio.

Questa tecnica è ideale per fonti a bassa torbidità come acqua potabile, piscine o laghi e bacini idrici. L'acqua ad alto contenuto di particolato può causare incrostazioni o intasamento del filtro, limitando il volume che può essere lavorato. Inoltre, la filtrazione a membrana non è pratica per fonti d'acqua contenenti un gran numero di batteri di fondo o non coliformi, come le acque reflue grezze, in quanto ciò può aumentare la difficoltà di enumerare i coliformi bersaglio durante la coltura e l'incubazione.

Una volta che i campioni batterici sono stati intrappolati nel filtro, possono essere trasferiti alle piastre di crescita per determinare i tipi di batteri indicatori presenti nei campioni d'acqua. La placcatura su diversi tipi di terreno seleziona diversi tipi di batteri e può consentire una rapida identificazione.

Dopo la crescita su piastre specifiche per coltura, è possibile effettuare un'ulteriore conferma dell'identità dei batteri indicatori utilizzando tecniche come il prelievo di colonie in terreni liquidi e l'utilizzo di tubi di Durham per catturare i gas, che dovrebbero essere prodotti solo in presenza di coliformi fecali o coliformi totali. Inoltre, i sospetti enterococchi fecali possono essere confermati da una combinazione di una colorazione di Gram positiva, insieme a un test negativo del perossido di idrogeno-catalasi.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base della filtrazione a membrana di campioni d'acqua, diamo un'occhiata a come viene eseguita questa procedura.

Per iniziare la procedura, raccogliere prima campioni d'acqua da fonti d'acqua di prova di interesse. Assicurarsi che i campioni siano raccolti in flaconi sterili da 1 litro. Una volta completata la raccolta, mettere i campioni sul ghiaccio e trasportarli in laboratorio per l'analisi microbica.

Per iniziare l'analisi, sterilizzare prima un collettore di filtrazione a membrana. Quindi, collegare il collettore a una pompa a vuoto e a un pallone di scarico della filtrazione contenente candeggina.

Sterilizzare le pinze a fiamma con etanolo e rimuovere una membrana grigliata sterile dalla confezione. Posizionare il filtro al centro dell'area di filtrazione a membrana del collettore e applicare un imbuto filtrante sterile all'unità, quindi fissarlo in posizione.

Misurare il volume desiderato di acqua di prova nell'imbuto. Applicare un vuoto parziale per aspirare il campione di prova attraverso il filtro. Il materiale solido sospeso, inclusi batteri e altre sostanze organiche, di dimensioni superiori a 0,45 μm rimarrà intrappolato sopra o all'interno del filtro, mentre le particelle più piccole, i virus e i solidi disciolti passeranno nel pallone di scarico contenente candeggina.

Dopo che il campione è passato attraverso il filtro, sciacquare l'interno dell'imbuto con 25 ml di acqua sterile 3 volte, lasciandola passare attraverso il filtro. Al termine del risciacquo finale, scollegare l'aspiratore e rimuovere l'imbuto dal collettore.

Quindi, sterilizzare a fiamma con etanolo le pinze e rimuovere immediatamente il filtro a membrana dall'unità. Posizionalo sulla piastra di crescita appropriata per il microrganismo bersaglio utilizzando un movimento rotatorio per garantire il completo contatto con la superficie ed evitare di intrappolare bolle d'aria.

Per l'elaborazione di ogni ulteriore campione, disinfettare il collettore in acciaio inossidabile e utilizzare un imbuto sterile per evitare la contaminazione incrociata. Infine, posizionare le piastre in un'incubatrice per il periodo di incubazione appropriato.

Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice per il conteggio. Se possibile, eseguire il conteggio delle colonie con un ingrandimento a bassa potenza utilizzando una fonte di luce bianca fredda. Per determinare i coliformi totali, identificare e contare le colonie che appaiono di colore dal rosa al rosso scuro e hanno una lucentezza superficiale metallica che copre completamente o parzialmente la colonia. Le colonie di coliformi totali atipiche possono apparire rosso scuro, mucoidi o nucleate senza lucentezza.

Le colonie che appaiono blu, bianche, incolori o rosa senza lucentezza sono considerate non coliformi e non devono essere incluse nel conteggio totale dei coliformi.

Le colonie di coliformi fecali appariranno come varie tonalità di blu e queste dovrebbero essere contate come una categoria separata. Le colonie di coliformi non fecali sono tipicamente di colore da grigio a crema e dovrebbero anche essere registrate in una categoria individuale. Infine, le colonie di enterococchi fecali varieranno di colore dal rosa al rosso scuro e dovrebbero essere contate separatamente.

Per verificare le colonie di coliformi totali, applicare un circuito di inoculazione sterilizzato e raffreddato a una singola colonia di interesse. Trasferire la colonia selezionata in un recipiente di vetro contenente brodo di lauriltriptosio e un tubo di Durham. Quindi, metti le colture in un'incubatrice. La presenza di torbidità insieme alla produzione di gas catturato dal tubo di Durham verifica che la colonia sia un coliforme totale.

Per la verifica dei coliformi fecali, trasferire asetticamente le colonie di colore blu in recipienti di vetro contenenti terreno EC sterile e una provetta di Durham. Mettere le provette inoculate in un'incubatrice. Dopo l'incubazione, gli inoculi torbidi in combinazione con la produzione di gas confermano che la colonia è un coliforme fecale.

Per confermare gli enterococchi fecali, trasferire asetticamente le colonie sospette con la morfologia corretta su piastre di agar per infusione cervello-cuore e incubare. Successivamente, trasferire la crescita da una colonia isolata su BHIA?su due vetrini sterili.

Aggiungere 2-3 gocce di perossido di idrogeno al 3% in uno dei vetrini. La rapida produzione di gas indica un batterio catalasi-positivo come il Citrobacter. I batteri enterococchi fecali sono negativi alla catalasi; pertanto, non si osservano bolle. Per le colonie catalasi-negative che non mostrano bolle, eseguire una colorazione di Gram. Come enterococchi fecali, questi dovrebbero apparire Gram positivi, di forma ovoidale ed essere raggruppati per lo più in coppie o catene corte.

Trovare uno di questi batteri indicatori in una fonte d'acqua indica la presenza di una contaminazione. Se nell'arco di un mese risulta che più del 5% dei campioni è contaminato, la fonte può essere considerata non idonea al consumo umano.

La filtrazione a membrana è comunemente utilizzata in una serie di applicazioni biologiche e gli organismi indicatori fecali possono essere rilevati anche da altre procedure sperimentali. Alcune di queste applicazioni sono esplorate qui.

La filtrazione a membrana può essere utilizzata anche per la cattura di virus da campioni d'acqua. Poiché i virus sono in genere presenti a livelli molto bassi, i campioni d'acqua devono essere concentrati per catturarli e analizzarli. I virus catturati possono quindi essere rilasciati dai filtri e identificati utilizzando tecniche come i saggi di infettività delle colture cellulari o la PCR.

La filtrazione a membrana viene utilizzata anche nella produzione di acqua ad alta purezza per uso industriale o di laboratorio. Molti settori richiedono acqua altamente purificata per i loro processi operativi e la filtrazione a membrana può servire a rimuovere i contaminanti, inclusi i metalli disciolti e i sali indesiderati dall'acqua. Può essere utilizzato anche nella desalinizzazione dell'acqua salata per produrre acqua potabile.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'identificazione degli organismi indicatori nell'acqua mediante filtrazione a membrana. A questo punto dovresti capire come filtrare i campioni d'acqua a membrana, come coltivare diversi tipi di batteri indicatori fecali dalla membrana e come confermarli come organismi indicatori. Grazie per l'attenzione!