2.12: Preparazione di cristalli per l'analisi mediante diffrazione dei raggi X

1. Preparazione del tubo di cristallo e del filtro

1. Posizionare un tubo NMR in un matraccio Erlenmeyer.
2. Preparare un filtro per pipette.
   1. Costruire il filtro posizionando un pezzo di salvietta senza lanugine (1 in. per 1 in.) nella pipetta, quindi utilizzare un'asta per incuneare saldamente la salvietta nella parte del collo di bottiglia della pipetta (Figura 1).
   2. Crea due filtri a pipetta per ogni tubo di cristallo necessario.

2. Aggiunta del campione al tubo di cristallo

1. Sciogliere il composto (tetrafenilporfirina, 10 mg) in 0,75 ml di solvente (diclorometano).
2. Con una pipetta, aggiungere delicatamente la miscela nella parte superiore del tubo, facendola passare attraverso il filtro.
   1. Le particelle vengono filtrate per evitare la creazione di siti di nucleazione, che possono portare a piccoli cristalli multipli invece dei singoli cristalli più grandi desiderati.
3. Una volta che il campione è stato posto nel tubo di cristallo, molto lentamente e delicatamente, aggiungere l'anti-solvente (1,5 ml di metanolo) al tubo attraverso una nuova pipetta filtrante. Lasciare che l'anti-solvente si strati lentamente sulla soluzione aggiunta in precedenza (Figura 2). Non utilizzare una lampadina per spingere il solvente attraverso la pipetta, ma lasciare che il solvente scorra attraverso il filtro da solo.
   1. Assicurarsi che il solvente di densità più elevata venga aggiunto prima al tubo di cristallo.
   2. Controllare che i due solventi siano miscibili l'uno con l'altro. Questo viene fatto prima dell'aggiunta del solvente.
4. Sigillare il tubo con un tappo NMR.

3. Crescita dei cristalli

1. Senza causare la miscelazione dei due solventi, posizionare i tubi di cristallo in un armadio dove non saranno disturbati.
2. Il tempo di cristallizzazione varierà con ogni composto, in genere i tubi di cristallo dovrebbero essere lasciati indisturbati per una settimana.
3. Dopo una settimana, ispezionare i tubi per la crescita dei cristalli.
   1. La crescita dei cristalli avviene tipicamente all'interfaccia dei due solventi.
   2. Ispezionare visivamente i tubi per la prova della crescita dei cristalli. Fare attenzione a non facilitare la miscelazione dei solventi, nel caso in cui il composto richieda più tempo per la formazione dei cristalli.
   3. Se sembra che si sia verificata la crescita dei cristalli, ispezionare ulteriormente i tubi utilizzando un microscopio.

4. Selezione dei cristalli

1. I cristalli di diffrazione a raggi X dovrebbero avere facce ben definite.
2. I cristalli che si sono raggruppati insieme dovrebbero essere evitati, se possibile.
3. Lasciare i cristalli nel tubo di cristallo fino al momento di raccogliere il cristallo, immediatamente prima di posizionare il cristallo sul diffrattometro.
   1. Mantenere i cristalli nel tubo assicurerà che i cristalli rimangano solvatati. La de-solvatazione può causare la rottura dei cristalli e ostacolare la diffrazione del cristallo.

Figura 1. Immagine del filtro pipetta. Un piccolo pezzo di salvietta senza lanugine è stato saldamente incastrato al collo di bottiglia della pipetta. Le soluzioni vengono passate attraverso questi filtri a pipetta prima di essere introdotte nel tubo di cristallo.

Figura 2. Una volta che la soluzione contenente il composto mirato viene posizionata nel tubo di cristallo, l'anti-solvente viene lentamente stratificato sopra facendolo passare attraverso un nuovo filtro a pipetta.

Per la determinazione della sua struttura è necessario un singolo cristallo. La qualità del cristallo influenza fortemente la qualità e l'accuratezza della determinazione strutturale.

Un singolo cristallo è un solido in cui la disposizione delle molecole si ripete in tutte e tre le dimensioni. La disposizione spaziale degli atomi all'interno del solido cristallino può essere determinata utilizzando la cristallografia a raggi X. In questa tecnica, un campione cristallino puro viene avvolto da un fascio di raggi X. Il cristallo diffrange i raggi X in uno schema distintivo correlato alla struttura e alla composizione molecolare dei cristalli. Se un cristallo si forma troppo rapidamente, le molecole possono essere disordinate, le impurità possono essere incorporate nel cristallo o possono formarsi due o più cristalli fusi invece di un singolo cristallo. Pertanto, sono necessari metodi specializzati con enfasi sulla crescita lenta per produrre cristalli di qualità sufficiente per la cristallografia a raggi X.

Questo video illustrerà le caratteristiche desiderate dei cristalli di qualità a raggi X, dimostrerà una procedura per la loro crescita e introdurrà alcune applicazioni di questa tecnica in chimica.

Gli elettroni diffondono i raggi X emettendo un'onda sferica di raggi X quando vengono colpiti. Se gli atomi sono disposti in modo ordinato, l'interferenza costruttiva tra le onde produce un caratteristico modello di diffrazione su un rivelatore di raggi X. Il cristallo viene ruotato all'interno del fascio per raccogliere i modelli di diffrazione da più angolazioni. Con modelli di diffrazione sufficienti, la struttura molecolare può essere derivata.

I cristalli di qualità a raggi X generalmente formano forme simmetriche e hanno facce lisce e riflettenti la luce. Se osservati al microscopio polarizzatore, saranno trasparenti, ma la maggior parte dovrebbe diventare scura quando ruotati di 90 gradi. Ciò indica una struttura altamente ordinata. Per far crescere questi cristalli viene spesso utilizzata la diffusione liquido-liquido. Questo impiega due solventi miscibili: un solvente a bassa densità, o precipitante, in cui il composto da ricristallizzare è insolubile; e un solvente ad alta densità in cui il composto è solubile. Tipicamente, il rapporto volumetrico tra precipitante e solvente è 2:1.

Il precipitante a bassa densità viene stratificato su una soluzione concentrata del composto nel solvente ad alta densità. Nel tempo, il composto diventa meno solubile man mano che il precipitante si mescola con la soluzione. Un'interfaccia solvente più piccola si traduce in una velocità di diffusione più lenta, producendo così cristalli più grandi e più puri. Ora che hai compreso i principi della coltivazione di cristalli di qualità a raggi X, esaminiamo una procedura per farli crescere mediante diffusione liquido-liquido.

Per iniziare, procurati l'attrezzatura necessaria che si trova nel protocollo di testo. Acquisire un solvente per il composto e un precipitante meno denso.

Per preparare un filtro per pipetta, posizionare un pezzetto di Kimwipe nella parte superiore di una pipetta di vetro e premere delicatamente la carta fino al fondo del corpo della pipetta utilizzando un'asta o lo stelo di un'altra pipetta, facendo attenzione a non forare la carta. Preparare due filtri per pipette. Inserirne uno nel tubo NMR. Se necessario, fissare il gruppo con un morsetto da laboratorio e un supporto ad anello. Sciogliere circa 10 mg del composto da ricristallizzare in 0,75 mL di solvente.

A questo punto, aggiungere con cautela la soluzione campione nel filtro della pipetta. Fissare un bulbo sulla parte superiore e strizzare lentamente per far passare la soluzione nel tubo NMR per rimuovere le impurità solide. Non lasciare che la lampadina si espanda nuovamente mentre è collegata, poiché l'aspirazione sposterà la carta da filtro.

Quindi, rimuovere il filtro della pipetta usato e posizionare il secondo filtro nella provetta NMR. Pipettare circa 1,5 mL di precipitante nella provetta. Lasciare che il solvente passi attraverso il filtro per gravità. D'ora in poi, fare attenzione a non disturbare il filtro durante eventuali manipolazioni. Una volta che tutto il precipitante è filtrato nel tubo, rimuovere il filtro e tappare il tubo. Mettilo in un armadio o in un altro luogo facilmente controllabile dove non verrà agitato.

Dopo almeno un giorno, ispezionare i tubi per la crescita dei cristalli. Se non sono presenti cristalli o se i cristalli sono molto piccoli, lasciare indisturbata la provetta del campione. Se i cristalli sono visibili, controllarne le dimensioni e la forma senza disturbare gli strati di solvente.

Se i cristalli sono grandi, ben definiti e non sono raggruppati insieme, ispezionare i cristalli al microscopio per verificare il loro potenziale di qualità a raggi X. Non rimuovere i cristalli dal tubo fino a quando il diffrattometro non è pronto per iniziare la scansione. Se le molecole di solvente sono incorporate nella struttura cristallina, lasciare asciugare il cristallo degraderà il cristallo. Utilizzando la cristallografia a raggi X, è stato verificato che la struttura molecolare di questi cristalli rosso-viola scuro è tetrafenilporfirina.

La cristallografia a raggi X è uno strumento analitico essenziale in chimica e biochimica.

I metodi di ricristallizzazione includono il riscaldamento e il raffreddamento, la diffusione liquido-liquido, la diffusione del vapore e l'evaporazione lenta. Nell'evaporazione lenta di un singolo sistema solvente, il composto viene disciolto in una piccola quantità di solvente e posto in un contenitore con un piccolo foro nel tappo. Man mano che il solvente evapora, la concentrazione aumenta fino a quando il composto inizia a cristallizzare.

La funzionalità delle proteine è spesso correlata alla loro struttura. Tuttavia, le proteine possono essere molto difficili da cristallizzare. Devono essere sviluppate tecniche specializzate per far crescere cristalli di proteine di qualità a raggi X. Qui, una goccia di soluzione proteica viene mescolata con una goccia di precipitante e questa miscela viene sigillata in una camera con precipitante puro. Man mano che il vapore del solvente si diffonde dalla goccia, la solubilità della proteina nella goccia diminuisce e la proteina cristallizza lentamente. Un'altra tecnica mescola la soluzione proteica e il precipitante sotto l'olio minerale. Utilizzando queste tecniche, una varietà di proteine può essere cristallizzata per l'analisi.

Nella diffrazione da polveri, ogni possibile orientamento spaziale è rappresentato simultaneamente nel campione. La diffrazione delle polveri non è così informativa sulla struttura come la diffrazione dei raggi X a cristallo singolo a causa della perdita di dati di struttura tridimensionale. Invece, la diffrazione da polveri eccelle nell'analisi di miscele di solidi cristallini e nella valutazione della cristallinità di strutture amorfe.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla coltivazione dei cristalli per la cristallografia a raggi X. Ora dovresti avere familiarità con le proprietà dei cristalli di qualità a raggi X, una procedura per coltivarli e alcune applicazioni di questa tecnica in chimica.

Grazie per l'attenzione!